JPH0466083A - α―グルコシダーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規な熱に安定なα−グルコシダーゼ及びそ
の製造法に係る、特にオリゴ糖例えばマルトトリオース
やマルトース、シュクロースからのグルコースやフルク
トースの生産に用いる好適な熱に安定なα−グルコシダ
ーゼおよびその製造法に関する。

［従来の技術］ α−グルコシダーゼは、酵母、糸状菌、細菌等が生産す
ることが知られている。現在、主に工業的に利用されて
いるのは真核側胞由来の酵素であるが、熱に安定性の高
いα−グルコシダーゼが求められている。かかる観点か
ら、細菌由来の熱に安定なα−グルコシダーゼの開発が
進められている。その結果、バチルス・サーモグルコシ
デイウス菌（Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ＝Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ　、、３１，８０７（１９７６））、バチルス・
ステアロサーモフィラス菌（５ｔａｒｃｈ／５ｔａｒｋ
ｅ、３９，２７Ｈ１９８７））から熱に安定なα−グル
コシダーゼが得られているが、いずれも細胞内に存在す
る酵素である。

ところで、細菌由来のα−グルコシダーゼはその基質特
異性から次の４グループに分けられている（澱粉科学、
３１．８７（１９８４））　。

１）エキソオリゴ−１，６−グルコシダーゼ、２）エキ
ソ−α−１，４−グルコシダーゼ、３）基質特異性の低
いα−グルコシダーゼ、４）マルトースに特異的なα−
グルコシダーゼ。

そのうち、バチルス・コアグランス、バチルス・サーモ
グルコシデイウス、バチルス・ステアロサーモフィラス
等由来の至適温度が比較的高いα−グルコシダーゼは、
１）、２）のグループに属する。これらは、いずれもｐ
−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを加水分
解する。近年、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシドを加水分解しない熱に安定なα−グルコシダー
ゼが好熱性のバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
）から得られている（Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、、３２，７４７（１９７６））が、可
溶性澱粉は分解できない、　　製以上のように、好熱性
細菌を中心に熱に安定なα−グルコシダーゼの生産に関
する報告が知られている。しかしながら、生成する酵素
の基質が限定されるため酵素の適用範囲が限られたり、
細胞内に蓄積される酵素であるため酵素を精製して用い
る際には細胞を破壊したり細胞内に由来する各種夾雑物
を除去するなどの操作を必要とし、酵素の安価供給が難
しくなるなど商業的には必ずしも満足すべき酵素が現在
までは得られていない。

また、高温例えば５０℃以上好ましくは６０℃以上で酵
素反応が行えられれば、反応液の微生物汚染を防止する
うえからも望ましく、また反応の効率化も図れることが
期待され、がかる＠Ａがら熱に安定な酵素が望まれる。

そこで、本発明の目的は澱粉、マルトトリオース、マル
トース、イソマルトース、シュクロース。

プルランなどに作用し、それらからグルコース、フラク
トースなどを効率的に生産できる熱に安定でかつ菌体外
に分泌される酵素及びその酵素製造法を提供することに
ある。即ち、６０℃以上に至適温度を有し、中性付近に
至適ｐＨを有し、澱粉。

マルトトリオース、マルトース、イソマルトース。

シュクロース、プルランなどの種々の基質を加水分解し
、グルコース、フラクトースなどを生成する産業上有用
な熱に安定でかつ菌体外に分泌されるα−グルコシダー
ゼ及びその製造法を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は、熱に安定でかつ菌体外に分泌され基質特
異性の広いα−グルコシダーゼを得ることを目的に、酵
素及び酵素生産用微生物の探索を行った。その結果、バ
チルス属に属する細菌バチルス・ステアロサーモフィラ
ス５Ｄ８０２菌株）が、熱に安定で基質特異性が広くか
つ菌体外に分泌される従来のα−グルコシダーゼと全く
異なる新規なα−グルコシダーゼを生成することを見い
出し、本発明に至った。

本発明のα−グルコシダーゼを生成するバチルス・ステ
アロサーモフィラス菌株（バチルス５Ｄ８０２）は工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託している（微工研菌
寄第１１５３５号）。

本菌の菌学的性質は以下の表に示す通りである。

試験項目　　　試験結果 形　　　　　態 ダラム染色 芽　　　　胞 胞子嚢 形 位置 カタラーゼ 桿菌 ＋ わずかに膨出 楕円形 端室〜亜端立 ＋ 運動性 ｖ−Ｐ反応 嫌気下での生育 澱粉分解 ゼラチン液化 卵黄反応 グルコースより酸の産生 グルコースよりガスの産生 ｐＨ５，７での生育 ３０℃での生育 ４０℃での生育 ５０℃での生育 ５５℃での生育 ６５℃での生育 クエン酸塩の利用 ５％ＮａＣ１存在下での生育 ７％ＮａＣ１存在下での生育 硝ｌＩ！塩還元 ＋ ＋ ＋ ＋ 糖 酸の産生 ガスの産生 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−マンノース Ｄ−フルクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 ショ糖 乳糖 トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット イノジット グリセリン グルコース 澱粉 ＋ ＋ ＋ ＋ 十 糖からの酸及びガスの産生 これらの性質より、 「バージニーズ・マニュア ル・オブ・デターミネーティブ・バクテリオロジー」第
８版に基づき本菌をバチルス・ステアロサーモフィラス
と同定した。

しかしながら、これまでにバチルス・ステアロサーモフ
ィラスと同定された微生物の中でα−グルコシダーゼを
菌体外に生産するものは知られていない、従って、本発
明に用いる熱に安定なα−グルコシダーゼ生産菌株は新
規なものであると考えた。

次に、本発明なる熱に安定なα−グルコシダーゼの酵素
特性について記す。

■　バチルス・ステアロサーモフィラス例えば５Ｄ８０
２菌株を適当な培地に接種し、生育温度４０℃〜６５℃
にて、１０時間〜６０時間、好気的に培養したところ、
培地中にα−グルコシダーゼが蓄積し培養が進むに従い
α−グルコシダーゼの培地中への蓄積が増加してきた。

培養液〔例えばグルコース２％、硫酸アンモニウム０．
　５％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム
０゜０２％、酵母エキス０．０２％を含む培地（ｐＨ７
に調！ＩＩ）２０００ｍｌを滅菌後、内容積５０００ｍ
ｌの培養槽に分注し、好気的に５５℃でバチルス５Ｄ８
０２菌株を培養せしめた〕を採取し、６０００ｒｐｍで
遠心分離し菌体を除去する。この上澄液にα−グルコシ
ダーゼ・活性が顕著に認められ、菌体面分にはわずかの
活性しか認められない。さらにこの上澄液を用い、硫酸
アンモニウム沈澱（２０％〜６０％飽和画分）さらには
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル渡過クロマトグラ
フィー等を適宜利用して酵素を精製取得できる。

これらのことより、本発明のα−グルコシダーゼは菌体
外に分泌される酵素であると考えられる。

なお、α−グルコシダーゼ活性は以下のように測定した
。酵素溶液０．０１ｍ１と０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）０．４ｍｌと２％可溶性澱粉０．５ｍｌを混
合し、６５℃、３０分反応後。

５分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、この反
応停止液から０．１ｍｌを採取し、グルコース検査試薬
（グルコースＢ−テストワコー；和光線薬工業（株））
を３　ｍ　ｌ加え、３５℃、　　３０分反応させた後、
５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定した。

また、可溶性澱粉の代わりにＰ−ニトロブエニルーα−
Ｄ−グルコピラノシドを用いる場合は、反応溶液中に最
終濃度が０゜１％になるように調整し反応させ、４００
ｎｍでの吸光度を測定した。そして、１分間当り１μｍ
Ｏ１のｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド
を加水分解する酵素量を１単位とした。

■作用 α−グルコシド結合を加水分解してグルコースを生成す
る。

■基質特異性 可溶性澱粉（関東化学（株）Ｉ［）、プルラン。

マルトース、マルトトリオース、イソマルトース、シュ
クロース、ツラノース、フェニル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド、Ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド、グリコーゲンを基質として分解活性を調べたところ
、いずれの場合も顕著なグルコースの生成が認められた
。以上より、本酵素は基質特異性の広いα−グルコシダ
ーゼと考えられた。尚、反応生成物は、前述の方法と薄
層クロマトグラフ法と高速液体クロマトグラフ法で調べ
、確かにグルコースが生成されていることが認められた
。

■作用ｐＨ 可溶性澱粉を基質として各種ｐＨ（リンａｍ衝液；ｐＨ
６，１〜７．７）、６０℃で測定したところ、至適ｐＨ
は６．８付近であった。さらにｐＨ６，３〜７．０の範
囲で最高活性の８０％以上の活性が認められた。

■作用温度 可溶性澱粉を基質としてｐＨ６，５、各種温度（４０℃
〜８０℃）で反応させたところ、至適温度は６０℃〜６
５℃であった。また、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性
の約６０％以上を示した。

■熱安定性 ｐＨ６，５，各種温度で３０分処理したところ、６５℃
までは安定で初期の活性のほぼ８０％以上の活性を維持
し、熱に安定であった。その結果は以下の表に示す。

■分子量 本酵素の分子量は、正確には決定されていないが、セフ
ァデックスＧ−１５０を用いたゲル濾過法から４０００
０〜５ｏｏｏｏの範囲であった。

次に本発明に用いられる培地について説明する。

本発明に用いられる培地には、安価に入手し得る公知の
各種材料を使用することが出来る。例えば、窒素源とし
ては、コーン・ステイープ・リカーポリペプトン、大豆
粉、フスマエキス、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸液
などであり、炭素源としては、水飴、マルトース、各種
澱粉、可溶性澱粉、澱粉液化液、デキストリン、プルラ
ン等である。

また、これらの炭素源や窒素源の他に各種の塩、例えば
マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩などの無
機塩や各種ビタミンを必要により添加する。

本発明の上記方法において使用するのに適した培地は、
例えばグルコース２％、硫酸アンモニウム０．　５％、
リン１ｍ２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０
２％、Ｗ＃母エキス０．０２％を含有する液体培地であ
る。

また、本発明の方法で使用する微生物の生育ｐＨは弱酸
性から弱塩基性の範囲であるので、適当なＰＨ調整剤を
用いて培地のＰＨを調整する必要がある。そのために種
々の緩衝液を用いることが出来ルカ、０．２％〜１％程
度の炭酸カルシウムなどを用いることが特に便利である
。

次に、本発明の新規な熱に安定なα−グルコシダーゼの
精製法について説明する。バチルス・ステアロサーモフ
ィラス例えば５Ｄ８０２菌株のような新規な熱に安定な
α−グルコシダーゼ生産菌を適当な培地に摂取し、その
生育温度の観点から約り０℃〜約７０℃まで、好ましく
は５５℃付近、１０時間〜６０時間、好気的に培養する
ことにより培養液中に菌体外分泌型酵素としてα−グル
コシダーゼと同定された酵素が蓄積される。培養後、培
養上澄液に蓄積される菌体外に分泌される酵素は、粗酵
素液として遠心分離（６０００ｒｐｍ）により菌体を除
去することにより得られる。この粗酵素液をそのまま用
いることが経済的で有利であるが、これを更にｗ製して
使用することもできる。精製のために、例えば硫酸アン
モニウム等の塩析、エタノール、アセトン、イソプロパ
ツール等による溶媒沈澱法、限外減退法、イオン交換ク
ロマトグラフ法等による一般的な酵素精製法を用いるこ
とが出来る。

［発明の効果］ 本発明の方法により製造せる新規な熱に安定なα−グル
コシダーゼを可溶性澱粉の加水分解に用いれば、従来行
ってきたようなｐＨの調整（現在。

澱粉の液化は主にｐＨ６〜７で行われているが、糖化工
程では糖化酵素の至適ｐＨが４〜５であるため酸性にｐ
Ｈを調整している。）が不用となる。

さらに１本酵素をシュクロース、プルラン、イソマルト
ース、マルトースなど種々の糖類に作用させることで、
グルコースやフルクトースを容易に生産できるなど、広
範な原料からのグルコースヤフルクトースなどの単糖製
造に用いることができる。さらに、至適温度が６０℃〜
６５℃であるため、通常中性領域かつ５０℃以下で澱粉
糖のような単糖生産反応を実施した場合には、微生物汚
染に伴う様々な障害が知られているが、本酵素を用いる
ことで高温条件下で生産反応を行えるため、このような
障害から逃れることができ、また反応効率のアップが図
れると考えられる。

かくして１本発明によって経済的に有利に単糖の生産等
に用いる酵素ならびにその酵素の製造法が提供される。

［発明の実施例］ 以下、実施例に従って本発明の新規な熱に安定な単糖の
製造等に用いるα−グルコシダーゼ及びその製造法につ
き具体的に説明する。しかしながら１本発明の範囲は以
下の実施例によって何等制限されるものでない。

実施例１ バチルス５Ｄ８０２菌株を５００　ｍ　ｌ容の三角フラ
スコのグルコース２％、硫酸アンモニウム０゜５％、リ
ン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％
、酵母エキス０．０２％を含む培地（ｐ　Ｈ７）　１０
０　ｍ　ｌに植菌し、５５℃、２０時間、１８Ｑｒｐｍ
で回転振とう培養した。次に、培養液を６０００ｒｐｍ
、４℃で３０分間遠心分離して菌体を除去し、粗酵素液
８７　ｍ　ｌを得た。

尚、上澄液の活性はマルトースを基質として１分間に１
　ｍ　ｇのグルコースを生成する酵素量を１単位とした
とき、０．１単位／ｍｌであった。

実施例２ 実施例１に示した培養上澄液に、硫酸アンモニウムを２
０〜６０％飽和となるように添加し、生成した粗酵素沈
澱を２０　ｍ　Ｍのリン酸カリウム緩衝液に溶解後、透
析した。該サンプルをイオン交換クロマトグラフィー（
ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０、ファルマシアＩＩ
）を行い、０〜０゜５Ｍの塩化ナトリウム５００　ｍ　
ｌで溶出を行った。

このイオン交換クロマトグラフィーでグルコシダーゼ活
性が認められる部位を限外減退濃縮後、ゲル減退クロマ
トグラフィー（セファデックスＧ−１５０、ファルマシ
ア製）を行った。ゲル濾過におけるグルコシダーゼ活性
を有するピークの比活性は上澄液の比活性に比べ約３０
倍に向上した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス属細菌が生産する菌体外に分泌する以下の
   性質を有する熱に安定なα−グルコシダーゼ； ［１］作用 α−グルコシド結合を加水分解してグルコースを生成す
   る。 ［２］作用ｐＨ 至適ｐＨは６．８付近で、ｐＨ６．３〜７．０の範囲で
   最高活性の約８０％以上を示す。［３］作用温度 至適温度は６０℃〜６５℃付近で、５０℃〜７０℃の範
   囲で最高活性の約６０％以上を示す。 ［４］基質特異性 可溶性澱粉、マルトース、イソマルトース、マルトトリ
   オース、プルラン、シユクロース、ツラノースなどに作
   用しグルコースを遊離する。 ［５］安定性 ｐＨ６．５において６５℃、３０分間保持したとき、当
   初における活性の少なくともほぼ８０％を保持すること
   ができる。 ２、バチルスＳＤ８０２、またはその変異株からなる菌
   株を培養し、培養物から特許請求の範囲第１項記載のα
   −グルコシダーゼを回収することを特徴とする熱に安定
   なα−グルコシダーゼの製造法。