JPH0292280A - Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ（し−
＾１ａｎ　ｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の製造
法およびスポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新菌株に関する。

〔従来の技術］ Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼは、し−アラニンに特異
的に作用し、下記式（１）の反応を触媒する酵素として
知られている。

Ｌ−アラニン　十　Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤ’　　；ニピルビン
酸　＋　ＮＨ；　＋ＮＡＤＨ＋　　Ｈ”故に、Ｌ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼはＮＡＤＨの減少を測定すること
により直接ピルビン酸あるいはアンモニウムイオンを定
量するのに利用され、またはピルビン酸等を原料として
有用なアミノ酸であるアラニンの製造に利用されてきた
（特開昭６０−１８４３９３号公報、特開昭６２−３６
１９６号公報）。従来のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
の製造法としては、サーマス属に属する菌株を使用した
製造法（特開昭５８−２１２７８２号公報、特開昭５９
−５５１８６号公報）、バチルス属に属する菌株を使用
した製造法（特開昭６０−１８０５８０号公報、特開昭
６（１−１８０５９０号公報）、ストレプトミセス属に
属する菌株を使用した製造法（特開昭５９−１３２８９
号公報）が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点及びその手段〕本発明
者らは、より安定性の価れた製造効率の良いＬ−アラニ
ンデヒドロゲナーゼの製造方法について鋭、窃研究した
ところ、まず熊本共の温泉地の泉源周辺の土壌より分離
したスポロラクトバチルス属に属する新菌株を見出し、
また該新菌株を培養し、その培養物を精製することによ
って製造効率の非常に良いＬ−アラニンデヒドロゲナー
ゼの製造法を見出した。

すなわち本発明は、スポロラクトバチルス属に属するＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、そ
の培養物からＬ−アラニンデヒドロゲナーゼを採取する
ことを特徴とするＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造
法であり、スポロラクトバチルス属に属し、少なくとも
４０℃で生育せず、４５℃１５２℃で生育する高温性菌
であるスポロラクトバチルス属に属する新菌株に関する
ものである。

まず、本発明のスポロラクトバチルス属に属する新菌株
について詳細な菌学的性質は以下の通りである。

Ａ、形態学的特徴 ■形および配列 端の丸いまっすぐ又はやや曲がった桿菌で、単独又は二
連、たまに短連鎖する。

■大きさ ０．６〜０．８　Ｘ２．０〜４．０μｍ。

■連動性 周毛で運動する。

■芽胞 形成するが、芽胞によって菌体は膨らまない。

■多形成 １５〜２０時間の培養でＴａｄｐｏｉｅ−１ｉｋｅ　ｃ
ｅｌｌ　　（オタマジャクシ状細胞）が出現し、培養を
続けると桿状細胞と球状細胞が混在する。

Ｂ、肉眼的観察 ５２”Ｃ，１〜３日間培養した結果は次の通りであった
。

■普通寒天斜面培地 生育は弱く、線状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）に生育し、透明
で黄土色を呈する。可溶性色素は産生しない。

■普通寒天平面培地 円形で金縁水平から丘状（ｆｌａｔ＝ｃｏｎｖｅｘ）で
滑らかな、小さなコロニーを形成する。透明で黄土色を
呈する。可溶性色素は産生しない。

■液体培地 生育は弱く、一様に混濁する。

■ＢＣＰミルク培地 変化なし。

Ｃ０生理学的生化学的性質 Ｃ＋：陽性、−：陰性、（＋） グラム染色 Ｋ　ＯＨ反応 抗酸性染色 カプセル形成 ＯＦテスト（Ｉ（ｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ）好気での生
育 嫌気での生育 生育温度　５２℃ ４５℃ ４０℃ 耐塩性　ＮａＣ１４度χ ０％ ２．０％ ３．５％ 生育ｐ　ＨｐＨ９，８ ｐｌ＋９．０ 二弱陽性〕 変化なし く＋） ｐＨ５，２ ｐＨ４，１ カタラーゼ産生 オキシダーゼ産生 ウレアーゼ産生 ゼラチン分解 デンプン分解 カゼイン分解 エスタリン分解 セルロース分解 インドール産生 硫化水素産生 アセトイン産生 Ｍｒ！テスト 硫酸塩還元 （利用性テスト） クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 ＋ 変化なし 変化なし ＋ プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 （糖より酸の産生） アドニトール Ｌ（＋）アラビノース セロビオース ヅルシトール メソ−エリスリトール フラクトース ガラクトース グルコース グリセリン イノシトール イヌリン ラクトース マルトース マンニトール マンノース メソビオース ＋ （±） 十 （＋） （＋） ラフィノース Ｌ（＋）ラムノース Ｄリポース　　　　　　　　　　　　　　＋サリシン Ｌソルボース ソルビトール デンプン　　　　　　　　　　　　　　　＋サッカロー
ス　　　　　　　　　　　　　士キシロース　　　　　
　　　　　　　　（＋）トレハロース　　　　　　　　
　　　　　＋グルコースより産生する酸　　　　　乳酸
、酢酸向、以上に用いた各培地および培養方法は次の通
りである。

・基礎培地ニトリブトソイプロス（Ｄｉｒｃｏ　０３７
０−０１−１）に酵母エキス０．５χ添加。

・生育温度：４０℃１４５℃１５２℃で静置培養。

・生育ｐＨ：振盪培養。

・ゼラチン分解二基礎培地士ゼラチン０．４χ＋寒天１
．５χを用いシャーレで培養。

・ＢＣＰミルク培地：基礎培地＋　１０χをＢＣＰ（０
６２χ水溶液）１χを用いて振盪培養。

・カゼイン分解：基礎培地十スキムミルクＩＯＸ　＋寒
天１．５χを用いシャーレで培養。

・エスクリン分解：基礎培地十エスタリン１．０χ→−
寒天１．５２＋−クエン酸鉄アンモニウム（ＩＯＸ液）
１．０χを用いスラント培養。

・セルロース分解二基礎培地に濾紙片を入れ振盪培養。

・アセトイン産生二基礎培地士グルコース１．０χを用
い振盪培養。

・ＭＲテスト：アセトイン産生培地でＰ　Ｈ測定（ＭＲ
ｐＨ試験紙）。

・硫化水素産生：基礎培地で静置培養、検出には酢酸鉛
紙を用いた。

・硝酸塩の還元二基礎培地＋ＮａＮ０ｚ　Ｏ，１χで振
の培養。

・有機酸塩の利用二基礎培地士有機酸塩０．３χで振盪
培養、ｐｌ＋メーターでｐＨ測定。

・糖より酸の産生ニドリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎ）１．
７χ、ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎ）０．３Ｘ、　ＮａＣｌ
０．５Ｘ、酵母エキス（ｙｅａｓｔ　ｅｘ）０．５χ（
ｐｌ＋７．０）の培地に各々の糖を１．０χ添加し振盪
培養、ｐｌ！メーターでｐＨ測定。

・ウレアーゼ産生：基礎培地に濾過滅菌した尿素を添加
し振盪培養。

上記の菌学的性質から、本発明の新菌株の菌学的特徴は
、グラム陽性の微好気性の桿菌で、カタラーゼ陰性、グ
ルコースより主に乳酸・酢酸を産生ずる特徴を有し、か
つ少なくとも前記培地条件では４０℃で生育せず、４５
℃、５２℃で生育する高温性の菌であるといえる。

バーシーズ　マニュアル　システマティックバクテリオ
ロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻によれば
、芽胞を形成する細菌は６属記載されており、それら各
層の性状は以下の特徴を有する。

■バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属：好気又は通性嫌気
性でカタラーゼ陰性の桿菌 ■スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属：微好気性でカタラーゼ陰性の桿菌 ■クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属：１
１！気性でカタラーゼ陰性の桿菌 ■デスルホトマクラム（ＤｅｓｕｌｆｏＬｏｍａｃｕｌ
ｕｍ）属：嫌気性でカタラーゼ陰性の桿菌 ■スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属：好
気性でカタラーゼ陽性の球菌 ■オシロスピラ（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ）属：嬉気
性の大型桿菌 従って、前述の菌学的特徴を有する本菌株は、好気条件
では生育が悪く、微好気性であり、カタラーゼ陰性の桿
菌であることから、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏ
ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するものと判定さ
れる。スポロラクトバチルス属に属する菌種は、Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第２巻にはスポロラクトバチル
ス・イヌリヌス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ−ｉｎｕｌｉｎｕｓ）の一種が記載されているのみで
あり、また１９８８年第１巻までに出版されたインター
ナシボナル　ジャーナル　オブ　システマテインク　バ
クテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）に新種の報告はない。

そこで、５ｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃ口１ｕｓ　９ｉｎ
ｕｌｉｎｕｓ（Ｓ　０ｉｎｕｌｉｎｕｓ）と本菌株の菌
学的性質を比較すると次の通りである。

Ｓ　−１ｎｕｌｉｎｕｓ　　　本菌株 グルコースより産生 する酸の種類 力クラーゼ産生 オキシダーゼ産生 硝酸塩還元 インドール産生 （ｔＪ！より酸の産生） フラクトース グルコース イヌリン マルトース マンノース ラフィノース サッカロース トレハロース マンニトール 主に乳酸 乳酸、酢酸 十 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ソルビトール　　　　　　士 アラビノース キシロース ガラクトース　　　　　　　　　　　　（＋）ラクトー
ス メソビオース セロビオース デンプン　　　　　　　　　　　　　　−トグリセリン
　　　　　　　　　　　（＋）エリスリトール アドニトール ラムノース サリシン 生育温度　　　　　　　１５〜４０℃４５℃以上（＋：
陽性　　−：陰性　　（＋）二弱陽性）以上の比較から
、本菌株とＳ　　−１ｎｕｌｉｎｕｓとは、生育温度に
おいて明白な特徴的差異を有し、さらニクルコースより
産生ずる酸の種類について異なっている。よって本菌株
をスポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属に属する新菌株と同定し、スポロラクト
バチルス・エスピー（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　−５ｐ）　７８−３と命名し、工業技術院微
生物工業技術研究所に［微工研菌寄第１０２７３号（Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−１０２７３）Ｊとして寄託した。

本発明のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法におい
て使用されるスポロラクトバチルス属に属するＬ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼ生産菌としては、上記のスポロラ
クトバチルス・エスピー７８−３はその一例であり、こ
の菌株に限らず、スポロラクトバチルス属に属するＬ−
アラニンデヒドロゲナーゼを製造する菌はすべて本発明
のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造において使用で
きる。

本発明のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼを製造する方法
においては、スポロラクトバチルス属に属するＬ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼ生産菌を使用することができ、例
えば前述のスポロラクトバチルス属に属する新菌株を生
産菌として挙げることができる。スポロラクトバチルス
属に属するＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌の培養
にあたっては、抗生物質および酵素等の生産に使用され
る通常の方法で培養することができる。その培養の形態
は液体培養でも固体培養でもよいが、工業的にはスポロ
ラクトバチルス属に属するＬ−アラニンデヒドロゲナー
ゼ生産菌をその生産用培地に接種し、深部通気攪拌培養
を行うのが望ましい。

培地の栄養源としては、該生産菌の培養に通常用いられ
るものを広く使用することができる。炭素源としては同
化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース
、サッカロース、ラクトース、ガラクトース、マルトー
ス、マンニトール、ソルビトール、デキストリン、糖蜜
、可溶性澱粉等の炭水化物類、各種有機酸類、大豆油、
オリーブ油等の植物性油脂、ラード、鶏油等の動物性油
脂等を使用できる。窒素源としては、利用可能な窒素化
合物であればよく、例えば、ペプトン、粉末酵母エキス
、肉エキス、大豆粉、カゼイン、脱脂綿実粉等を使用で
きる。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、
カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲン
等の種々の塩類またはコーンスチプリカー、各種ビタミ
ン類等が必要に応じて使用される。

培養温度は、スポロラクトバチルス属に属するＬ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼ生産菌が発育し、本酵素を生産す
る範囲内で適宜変更し得るが、４５〜６０゛Ｃ１特に５
２゛Ｃ付近が好ましい。培養時間は培養条件によって異
なるが、本酵素が最高力価に達する時期を見計らって適
当な時期に培養を終了すればよく、１〜３日間が好まし
い。

かくして得られたスポロラクトバチルス属に属するＬ−
アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌の培養物からＬ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼを採取するのであるが、本酵素は
その菌体内に含有されるので、得られた培養物から濾過
または遠心分離等の手段により集菌し、この菌体を超音
波処理、フレンチプレス処理、ガラスピーズ処理、凍結
破砕処理等の機械的破壊手段やりゾチーム等の酵素的破
壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合わせて、粗
製のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ含有液が得られる。

次いで、この粗製のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ含有
液から公知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いる
ことによりさらに精製されたＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼを得ることができる。

例えば、粗製のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ含有液に
、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパツー
ル等の有機溶媒を添加する分別沈澱法、硫安、硫酸ナト
リウム、リン酸カリウム、アルミニウム等を添加する塩
析沈澱法により本酵素を回収すればよい。さらにこの沈
澱物は、分子篩、各種のクロマトグラフィー法、電気泳
動法あるいは超遠心分析法を適宜組合せ用いて、必要に
応じて精製すればよく、その精製手段としては、目的と
するＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの性質を利用した手
段を用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝
液に溶解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さら
にＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥ
ＡＥ−セファロース、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５
０（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−）ヨバール（東洋
曹達社製）等のイオン交換樹脂や、セファデックスＧ１
００、Ｇ−７５、セファクリルＳ−２００等のゲル濾過
剤による分子篩クロマトを行えばよく、またこれらの手
段を適宜組み合わせて用いて精製すればよく、その後必
要に応して糖類、例えばマンニトール、サッカロース、
ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタミン酸、グリ
シン等、ペブタイドまたは蛋白質として牛血清アルブミ
ン等の安定剤を添加し、凍結乾燥等の処理により精製さ
れたＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの粉体を得ることが
できる。このようにして得られたＬ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼは、溶液中でも非常に安定なものであった。

以上の如くして得られたＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
の性状は以下の通りである。

■分子量；　２４５，０００±２５，０００　［ポリビ
ニルゲル（商品名：　ＴＳＫ３０００ＳＷ（０，７５Ｘ
６０ｃ＋ｗ）東洋曹達■社製）のカラムを用い、０．２
ＭＮａＣ１を含む５０５Ｍリン酸カリウムバッファー（
ｐＨ６，５）を移動層とするゲル濾過法により測定ｌ ■等電点；　Ｐ　Ｈ４，６±０．５（キャリアアンフオ
ライトを用いる焦点電気泳動法により４℃１７００Ｖの
定電圧で４０時間通電した後、各両分の酵素活性を測定
した） ■Ｋ　ｍａｌ　；　０．８４ｍＭ　（ピルビン酸の測定
の場合）２０．０１＠Ｍ　（Ｎ　Ｈ４の測定の場合）１
１．０μＭ（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの測定の場合）■熱安定性
；本酵素液（１，０υ／ｒｎｌ）を２０ＩＩＭトリスー
塩酸バッファー（ｐＨ８，０）で調整し、１５分間の加
熱処理後その残存活性を後記の酵素活性測定法に従って
測定した結果、第１図の結果が得られ酵素活性は少なく
とも６５℃までは安定であった。

■至適温度；　０．１５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ
ー（ｐＨ１０，５）を用い、後記の酵素活性測定法に従
い、第２図に示す各温度での反応後、反応におけるＮＡ
ＤＨの減少を波長３４０ｎｍで吸光度測定した結果は第
２図に示す通りであり、６５℃で最大の活性を有してい
た。

■ｐＨ安定性；本酵素液（１，ｏｔｌ／　ｍｌ）を、４
抛ｈの酢酸バッファー（ｐＨ５，０〜６．０、第３図の
−Δ）、リン酸バッファー（ｐｌ＋６．０〜８．０、第
３図の一〇−）、トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７，５
〜９．０、−・−）、グリシン−ＮａＯ１ｌバッフｙ−
（ｐＨ８，５〜９．５、−ロー）の各バッファーで調整
し、８０℃で１５分間加熱処理した後、その残存活性を
後記の酵素活性測定法に従って測定した結果、第３図の
結果が得られ、酵素活性はｐＨ６，０〜７．５の範囲で
安定であった。

■至適ｐＨ；後記の酵素活性測定法に従い、バッファー
として４０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６，５〜７．
５、第４図の一〇−）、トリス−塩酸バッファー（ｐｌ
＋７．５〜９，０、第４図の−・−）、グリシン−Ｎ　
ａ　ＯＩｔバッフｙ　−（ｐＨ９，０〜１０．５、第４
図のロー）の各バッファーを用い、基質と酵素を反応せ
しめた後、ＮＡＤＨの減少を波長３４０ｎｍで吸光度測
定した結果は第４図の通りであって、至適ｐＨはｐＨ９
，０付近であった。

尚、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌として本発明
の新菌株であるスポロラクトバチスル・エスピー７８−
３を使用して、本発明の製造方法により得られるＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼの生産力価を測定したところ、
高活性であり培養・精製が非常に容易であった。尚、本
発明の製造方法により得られるＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼの活性測定法は次の通りである。

〔反応液組成〕

〔活性測定〕 上記の反応液１ｄを１ＩＲ１容石英セルに入れ、３７℃
・５分間ブレインキュベートした後、５０ｍＭ　）リエ
タノールアミンバッファ−（ｐＨ８，５）で適当に希釈
した酵素液０．０２ｍを添加して攪拌し反応を開始する
０次いで反応におけるＮＡＤＨの減少を経時的に波長３
４０ｎ−にて吸光度測定し、グラフの直線部分の２分〜
５分後について、以下の計算式で活性を求めた。

６．２２　　　　　　　　Ｔ　　　　　Ｏ，０２Ｔ；反
応時間（分）、Ｘ；希釈倍 以上の通り、本発明はスポロラクトバチルス属に属する
Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌による生産効率の
非常に良い安定したＬ−アラニンデヒドロゲナーゼゲナ
ーゼの製造方法を提供するものである。

さらに、本発明で得られたＬ−アラニンデヒドロゲナー
ゼを下記の酵素反応を利用して各種の分析・定量に用い
ることができる。

ピルビン酸＋ＮＨＱ　十ＮＡＤＨ＋Ｈ”尚、上記反応の
酸化的脱アミノ化反応（■）の最適ｐＨはｐＨ１０，５
であり、還元的アミノ化反応（■）の最適ｐＨはｐ　Ｈ
９，０である。

上記反応■から明らかなように、本発明で得られるＬ−
アラニンデヒドロゲナーゼの基質であるアラニンをＮＡ
ＤＨの生成を吸光度測定することにより定量できる。ま
た、上記の反応■から明らかなように、本発明で得られ
るＬ−アラニンデヒドロゲナーゼによってピルビン酸あ
るいはアンモニウムイオンを、ＮＡＤＨの減少を吸光度
測定することにより定量できる。故に、直接ピルビン酸
、あるいはアンモニウムイオンを測定できるばかりでな
く、例えばその前駆反応でアンモニウムイオンかピルビ
ン酸を生成する酵素の酵素活性または、その前駆反応に
関与する基質の定量を対応する）ｉＥ質の存在下で測定
することができる。このような酵素についてアンモニウ
ムイオンを生成するものとしては以下に挙げる酵素が例
示できる。

ＥＣ，３，５，１，１アスパラギナーゼ（＾ｓｐａｒａ
ｇｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，２グルタミナーゼ（
Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，３ω−ア
ミダーゼ（ω−Ａｍｉｄａｓｅ）ｌＥｃ、３．５．１．
４　　アミダーゼ（Ａｍｉｄａｓｅ）１：ｃ、３．５．
１．５　　ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ）ＥＣ，３，５，
１，６β−ウレイドプロピナーゼ（β−Ｏｒｅｉｄｏｐ
ｒｏｐｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，１，７ウレイドブロピナーゼ（Ｌｌｒｅ
ｉｄｏｐｒｏｐｉｎａｓｅ） ［ＩＣ，３，５，１，１２ビオチニダーゼ（Ｂｉｏｔｉ
ｎｉｄａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，１９ニコチンアミダ
ーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄａｓｅ） ＥＣ，３，５，１，２０シトルリナーゼ（ＣｉＬｒｕｌ
ｌｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，２９α−（アセトア
ミドメチレン）スクシネートヒドラーゼ（ｃｒ−（Ａｃ
ｅｔａｍｉｄｏ＋＊ｅｔｙｌｅｎｅ）ｓｕｃｃｉｎａｔ
ｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，３０５−
７ミノバレルアミダーゼ（５−Ａｓｉｎｏｖａｌｅｒａ
ｓｉｄａｓｅ） ＥＣ，３，５，１，３５０−グルタミナーゼ（ローＧｌ
ｕｔａｍｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，３８グルタミ
ン−（アスパラギン）アーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎ−（ａ
ｓｐａｒａｇｉｎ）ａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，４２ニ
コチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎ
ａｍｉｄｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　ａｍｉｄａｓｅ）
ＥＣ，３，５，１，４３ペプチジル−グルタミナーゼ（
Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｕｔａｓｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，１，４４ウルタミニルーペブタイドグル
タミナーゼ（１１：１ｕｔａｓｉｎｙｌ−ｐｅｐｔｉｄ
ｅ　ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，１，４５
ウレアーゼ（Ｌｌｒｅａｓｅ）ＥＣ，３，５，３，５ホ
ルムイミノアスパルテイトデイミナーゼ（Ｆｏｒｍｉｍ
ｉｎｏａｓｐａｒａｒｔａｔｅ　ｄｅｉ＋＊１ｎａｓｅ
）ｌＥｃ、３．５．３．６　　アルギニンデイミナーゼ
（Ａｒｇｉｎｉｎｅｄｅｉｍｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，３，７グアニジノブチラーゼ（Ｇｕａｎ
ｉｄｉｎｏｂｕｔｙｒａｓｅ） ＥＣ，３，５，３，９アラントエイトデイミナーゼ（Ａ
ｌｌａｎｔｏａｔｅ　ｄｅｉｍｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，１−シチジンデアミナーゼ（Ｃｙｔ
ｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，２アデノシンデアミナーゼ（＾ｄｅ
ｎｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ） ＥＣ３３，５，４，３グアノシンデアミナーゼ（Ｇｕａ
ｎｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，４アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅ
ｎｏｓｉｎｅｄｅａｓｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，５シチジンデアミナーゼ（Ｃｙｔｉ
ｄｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，６＾ＭＰデアミナーゼ（ＡＭＰ　ｄ
ｅａｍｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，４，７ＡＩ）Ｐデア
ミナーゼ（ＡＤＰ　ｄｅａｍｉｎａａｅ）ＥＣ，３，５
゜４．８　　アミノイミダソ゛ラーゼ（Ａｓｉｎｏｉａ
ｉｄａｚｏｌａｓｅ） ［ｉＣ，３，５，４，ｌｌプテリンデアミナーゼ（Ｐｔ
ｅｒｉｎ　ｄｅａｎｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，１２ｄＣＭＰデアミナーゼ（ｄＣＭ
Ｐ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，４，１３ｄＣ
ＴＰデアミナーゼ（ｄＣＴＰ　ｄｅａｓ＋１ｎａｓｅ）
ＥＣ，３，５，４，１４デオキシシチジンデアミナーゼ
（Ｄｅ。

ｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）ＥＣ，３
，５，４，１５グアノシンデアミナーゼ（Ｇｕａｎｏｓ
ｉｎｅｄｅａａｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，１７アデノシン（ホスフェート）デ
アミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
）ｄｅａｎｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，４，１８ＡＴＰ
デアミナーゼ（＾ＴＰ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）ＥＣ，３
，５，４，２０ビリチアミンデアミナーゼ（ＰｙｒｉＬ
ｈｉａｍｉｎ　　ｄｅａｍｉｎａａｅ） ＥＣ，３，５，４，２１クレアチニンデアミナーゼ（Ｃ
ｒｅａｔｉｎｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，４，２２１−ピロリン４−ヒドロキシ２
−カルボキシレートデアミナーゼ（１−Ｐｙｒｒｏｌｉ
ｎｅ４−ｈｙｄｒｏｘｙ　　２−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔ
ｅ　　ｄｅａｓｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，４，２３プ
ラスチシジン＝Ｓ−デアミナーゼ（ＢＩａｓｔｉｃｉｄ
ｉｎ−５ｄｅａｍｉｎａｓｅ）１ミＣ，３，５，４，２
４セピアプテリンデアミナーゼ（Ｓｅｐｉａｐｔｅｒｉ
ｎ　ｄｅａｓｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，５，１ニトリラーゼ（Ｎｉｔｒｉｌａｓ
ｅ）ＥＣ，３，５，５，２リシニンニトリラーゼ（Ｒ４
ｃｉｎｉｎｅ　ｎ１ｔｒｉｌａｓｅ） ＥＣ，３，５，５，３シアネートヒドラーゼ（Ｃｙａｎ
ａｔｅ　ｈｙｄｏｒｏｌａｓｅ） 例えば、ＥＣ，３，５，４，４アデノシンデアミナーゼ
（＾ｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）の酵素活
性を測定する場合、従来は以下の酵素反応に基づいて生
成するアンモニウムイオンをＣｈａｎｅｙ＆Ｍａｒｂａ
ｃｈの方法およびアンモニウムイオンをグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，４，１，３）反応に導き、Ｎ
　Ａ　Ｄ　Ｈの減少を測定することにより行っていたが
、その際、生成するアンモニウムイオンを本発明により
得られるＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの酵素反応に導
き、ＮＡＤＨの減少を波長３４０ｎ−で測定することに
よりアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄ
ｅａｍｉｎａｓｅ）の酵素活性を測定することが可能で
ある。

■アデノシン＋Ｈ，Ｏ□　イノシン十ＮＨ’令 ■ピルビン酸十ＮＨ二十Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ＋　Ｈ９Ｌ−ア
ラニン＋Ｈ，Ｏ＋ＮＡＤ また、その酵素反応において尿素を生成する酵素の酵素
活性を測定する場合は、生成される尿素にウレアーゼを
作用させ、その生成物であるアンモニウムイオンをＬ−
アラニンデヒドロゲナーゼ反応の系に導き直接定量する
ことにより測定することが可能である。

酵素反応において尿素を生成する酵素としては以下の酵
素が例示できる。

ＩＥＣ，３，５，２，１パルピッラーゼ（Ｂａｒｂｉ　
ｔｕｒａｓｅ）ＥＣ，３，５，３，１アルギナーゼ（Ａ
ｒｇｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，３，２グリコシアミナ
ーゼ（Ｇｌｙｃｏｃｙａｍｉｎａｓｅ） ＥＣ，３，５，３，３クレアチナーゼ（Ｃｒｅａｔｉｎ
ａｓｅ）ＥＣ，３，５，３，４アラントイカーゼ（ＡＩ
ｌａｎＬｏｉｃａｓｅ）ＥＣ，３，５，３，７グアニジ
ノブチラーゼ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｏｂｕｔｙｒａｓｅ） ＥＣ，３，５，３，１００−アルギナーゼ（ローＡｒｇ
ｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，３，１１アルギナーゼ（Ａ
ｇｍａｔｉｎａｓｅ）ＥＣ，３，５，３，１４アミジノ
アスパルティト（八−１ｄｉｎ。

ａｓｐａｒｔａｓｅ） 例えば、ＥＣ，３，５，３，１アルギナーゼ（Ａｒｇｉ
ｎａｓｅ）の酵素活性を測定する場合、以下の酵素反応
に基づいて生成する尿素にウレアーゼを作用させ、その
生成物であるアンモニウムイオンを本発明のＬアラニン
デヒドロゲナーゼ反応の系に導き、ＮＡＤＨの減少を波
長３４０ｎ−で測定すればよい。

■アルギニン＋Ｈ，Ｏ−−→リシン＋尿素■ＡＴＰ＋尿
素＋Ｈｔ　Ｏ−一一− Ａ　Ｄ　Ｐ　＋　Ｐ　ｉ　＋　ＣＯｔ　＋　２　Ｎ　Ｈ
”今 ■ピルビン酸＋ＮＪ　＋ＮＡＤＨ＋Ｈ’　　−Ｌ　　７
　ラＱ　７　＋　Ｈｚ　Ｏ＋　Ｎ　Ａ　０以上の如くＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼを用いて種々の分析・定量
が可能である。

〔実施例〕

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明は何ら実施例によって限定されるものではない。

実施例１ スポロラクトバチルス・エスピー７８−３の培養（１）
　　ペプトン（極東製薬）１．Ｏχ酵母エキス（極東製
薬）０．５χ グルコース　　　　　　　　　１．０χアラニン　　　
　　　　　　２．０ｚ ＫＨよＰｏ、　　　　　　　　　０．３χＭｇ５ｏａ　
　・７　Ｈ，ＯＯ，０５χＣａ　Ｃ１ｇ　　・２　Ｈｘ
ＯＯ，０２χ（ｐＨ７，０） 上記組成からなる液体培地１００　ｍを５００　ｍ容三
角フラスコに注ぎ、１２０　’Ｃで２０分間加熱滅菌し
た後、これにスポロラクトバチルス・エスピー７８−３
−白金耳を接種し、５０℃−１２Ｏｒ、ｐ、腸の振盪培
養で２４時間培養し、培養物１００　ｄを得た（比活性
５０Ｕ／１ＩＩｌ）。

（１１）　　　ポリペプトン（成田薬品）１．０χ酵母
エキス（極東製薬）０．２χ 可溶性デンプン　　　　　　１．０χ アラニン　　　　　　　　　２．０χ ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　０．３χＭ　ｇ　Ｓ　
Ｏａ　　・７　Ｈ，ＯＯ，０５χＣａ　Ｃｌ　ｚ　　・
２　ＨｔＯＯ，０２χ（ｐＨ７，０） 上記組成からなる液体培地２０１を３０１容のジャーフ
ァメンターに注ぎ、加熱滅菌した後、これに前記（ｉ）
の前培養で得た培養物１００ｄを種母として移植し、５
０℃・通気量２０２／分・内圧０．２ｋｇ／ｃ−・撹拌
速度１５０ｒ、ｐ、−の条件で１６時間培養し、培養物
１９２を得た。

実施例２ 酵素の精製 実施例１の培養（ｉｉ）で得た培養液１９１を遠心分離
で集菌した後、４０−ｈリン酸バッファー（ｐＨ７゜０
）、０．１χリゾチーム５Ｉｌを加え、３７℃・３０分
間で可溶化した後に、ｐＨを７．０に調整し、７０’Ｃ
・３０分間加熱処理を行った。直ちに冷却し、沈殿物を
遠心除去した上清４５０（ｌｄを得た（比活性３０４ｕ
／ｌ１１）、上清に当容量のア七トンを添加攪拌し、遠
心分離した沈殿を得た。沈殿に４０＋ｓＭリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７，０）　１１を添加攪拌した後に沈殿物を
遠心除去した上清を得た。４０＋＊Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７，０）で緩衝化したＤＥＡ已セファロースＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）　５００　ｄにこの上清を
流した後、０．２ＭＫ　ＣＩを含む４０ｍＭリン酸バフ
ファー（ｐＨ７，０）　５００−で溶出された酵素液に
１５６ｇの硫安を添加攪拌し、後に遠心分離して沈殿を
得た。沈殿を４０＋ｍＭリン酸バッファー（ρ１１７．
０　’）　２００−で溶解した溶液に３５ｇの硫安を溶
解し３０χ飽和硫安溶液とし、これを３０χ飽和硫安で
緩衝化しておいたオクチルセファロースＣＬ−４８１０
０ｄ　（ファルマシア社製）に流し、同様のバッファー
５０（ｌｄでカラムを洗浄した後に２０χ飽和硫安溶液
２００ｄを流し、得た酵素液を４０−６リン酸バツフア
ー（ｐＨ７，０）　１ＯＮに対して一昼夜２回透析を繰
り返し、酵素液２５０ｄ（比活性２７５００／ｄ、回収
率５０．３χ）を得た。

参考例１ Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを用いたアンモニウムイ
オンの定量 反応液組成 トリス塩酸バッファー（ｐＨ８，５）　　　５０ｄＢＳ
Ａ　（シグマ社製）　　　　　　　　Ｏ，ＤＮＡＤＨ（
オリエンタル酵母■製）　　０．２ｍＭピルビン酸ナト
リウム　　　　　　　１０ｍＭＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼ　　　３．７５ＵＮ　ａ　ＣＩ　　　　　　　　
　　　　　　　５０ｍＭ上記反応液ｌ−に１０ｍＰＩＮ
　Ｈａ　Ｃｌをそれぞれｌμｌ（第５図の一口−）、２
．５μ！（第５図のΔ−）、５μｌ（第５図の−・−）
、ｌＯμｌ（第５図の一〇−〕添加し、経時的に波長３
４０ｎｍの減少を測定した（第５図）、７分目から８分
目の１分間の波長３４０ｎｍの減少を第６図に示したが
、原点を通る直線が得られた。

参考例２ Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを用いた尿素の定量 反応液組成 トリス塩酸バッファー（ｐＨ８，５）　　　５０ｆｆｉ
ＭＢＳＡ　（シグマ社製）　　　　　　　　０．１χＮ
　　ａ　　Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　５０ｍＭＮＡＤＨ（オリエンタル
酵母■製）　　０．２ｍＭピルビン酸ナトリウム　　　
　　　　１０＋ａＭＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ　　
　Ｓ、ＯＵウレアーゼ（ｊａｃｋ　ｂｅａｎ製）２５Ｕ
上記反応液３−に５０ｖｂｇ／　ｄｉ尿素をそれぞれ４
μ２．８μ！、１２μ！、２０μ２．４０μ！添加し、
経時的に波長３４Ｏｎ＋＊の減少を測定し、７分目から
８分目の１分間の波長３４０ｎａ＋の減少を第７図に示
したが、原点を通る直線が得られた。

参考例３ Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを用いたアデノシンデア
ミナーゼ活性の測定 反応液組成 トリス塩酸バッファー（ｐＨ８，５）　　　５０ａ＋Ｍ
ＢＳＡ　（シグマ社製）０．１χ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母■製）　　０．２ａＭピル
ビン酸ナトリウム　　　　　　　１０ｍＭＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼ　　２０．ＯＵＮ　ａ　Ｃｌ　　　　
　　　　　　　　　　　５０ｍＭ上記反応Ｈ１ｄにアデ
ノシンデアミナーゼをそれぞれ０．４ｍＬＩ、０．８ａ
＋Ｕ、２ｍＵ添加し、３７℃−１ｏ分間インキュヘート
の後、１１１１Ｍアデノシン１００ｕｆｆｉを添加し、
波長３４０ｎｍの減少を経時的に測定し、その結果を第
８図に示した。１６６分目ら１７７分目１分間の波長３
４０ｎｍｓの減少を第９図に示したが、よい直線性を示
した。

尚、反応液のｐ　１１は８〜１０、好ましくは８．５〜
９．５の緩衝液である。ＮＡＤＨの濃度は０．０１＋１
Ｍ〜０．６ＩＩＭ、好ましくは０．２〜０．３ｍＭであ
る。ピルビン酸の濃度は０．５ｍＦＩ〜０．５Ｍ、好ま
しくは５〜２０醜Ｈである。Ｌ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼは０．１〜５００１１／　ｄ、好ましくは１０〜３
０１Ｊ＃ｌ、時によっては乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）阻害剤、例えばオキザミン酸、シュウ酸等を１０〜
７０ｍＭ添加すると血清中Ｌ　Ｄ　Ｈの影響を受けない
。

［発明の効果］ 本発明によれば、Ｌ−アラニンデヒドロゲナ−ゼが高力
価に生産されるので、本酵素の醗酵法による製造法とし
て有効な方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の製造法で得られるＬ−アラニンデヒ
ドロゲナーゼの熱安定性を示し、免２図は本酵素の至適
温度を示し、第３図は本酵素のｐＨ安定性を示し、第４
図は本酵素の至適ｐＨを示す。また第５図はアンモニウ
ムイオンを定量する場合、ＮＨ，Ｃ１１度を変化させた
場合のレイトアッセイを示し、第６図はアンモニウムイ
オンの定量曲線を示す、第７図は尿素の定量曲線を示す
。 第８図はアデノシンデアミナーゼの酵素活性を測定する
場合、アデノシンデアミナーゼ濃度を変化させた場合の
レイトアッセイを示し、第９図はアデノシンデアミナー
ゼの標！ｆ！ＯＩＩ線を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）スポロラクトバチルス属に属するＬ−アラニンデ
   ヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物から
   Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを採取することを特徴と
   するＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法。
2. （２）スポロラクトバチルス属に属するＬ−アラニンデ
   ヒドロゲナーゼ生産菌がスポロラクトバチルス・エスピ
   ー（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ）７
   ８−３である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
3. （３）スポロラクトバチルス属に属し、少なくとも４０
   ℃で生育せず、４５℃、５２℃で生育する高温性菌であ
   ることを特徴とするスポロラクトバチルス属に属する新
   菌株。
4. （４）グルコースを資化し、乳酸及び酢酸を産生する特
   許請求の範囲第３項記載の新菌株。
5. （５）少なくとも下記の菌学的特性を有する特許請求の
   範囲第３項または第４項記載の新菌株。 〔＋：陽性、−：陰性、（＋）：弱陽性〕 ［１］形態学的性質の特徴 形状：桿菌 連動性：＋ グラム染色：＋ 周毛：＋ 胞子：＋ 抗酸性： １５〜２０時間培養でＴａｄｐｏｉｅ−ｌｉｋｅ　ｃｅ
   ｌｌ（オタマジャクシ状細胞）が出現する。 ［２］各培地における生育状態 ｉ）普通寒天斜面培地 生育：弱く、線状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）に生育する。 色：透明で黄土色を呈する。 可溶性色素：産生しない。 ｉｉ）普通寒天平面培地 生育：弱く、円形で金縁水平から丘状（ｆｌａｔ〜ｃｏ
   ｎｖｅｘ）の滑らかで小さなコロニーを形成する。 色：透明で黄土色を呈する。 可溶性色素：産生しない。 ｉｉｉ）液体培地 生育は弱く、一様に混濁する。 ｉｖ）ＢＣＰミルク培地 変化なし。 ［４］生化学的性質の特徴 好気での生育（＋） 嫌気での生育− カタラーゼ産生− グルコースより主に乳酸・酢酸を生成する。 ［５］糖より酸の産生 イヌリン− ラフィノース− マンニトール− ソルビトール− ガラクトース（＋） デンプン＋ グリセリン（＋）
6. （６）該新菌株が、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ産生
   能を有する特許請求の範囲第３項、第４項または第５項
   記載の新菌株。
7. （７）スポロラクトバチルス・エスピー（Ｓｐｏｒｏｌ
   ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ）７８−３（微工研菌
   寄第１０２７３号；ＦＥＲＭＰ−１０２７３）である特
   許請求の範囲第６項記載の新菌株。