JPH0516831B2

JPH0516831B2 -

Info

Publication number: JPH0516831B2
Application number: JP59004494A
Authority: JP
Inventors: Sawao Murao; Toyokazu Nishino
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-01-12
Filing date: 1984-01-12
Publication date: 1993-03-05
Also published as: US4732857A; JPS60149382A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はストレプトミセス属に属する菌株を培
養して、アスパラギン酸アミノトランスフエラー
ゼ（EC 2.6.1.1、系統名＝Ｌ−Aspartate：２−
oxoglutarate aminotransferase、別名＝
Glutamic−oxaloacetic transaminase、以下
「AST」という）アイソザイムを阻害する活性を
有するプロテアーゼを製造する方法に関する。さ
らに詳しくは、細胞質性のASTアイソザイムの
みを特異的に阻害するプロテアーゼの製造法に関
する。 ASTアイソザイムは肝臓、心筋、脳、骨格筋、
腎臓などに存在し、次の反応を触媒する酵素とし
て知られている。Ｌ−アスパラギン酸＋２−オキソグルタン酸オキザロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸 ASTアイソザイムには、局在性を異にする細
胞質性のASTアイソザイム（以下「ｓ−AST」
という）とミトコンドリア性のASTアイソザイ
ム（以下「ｍ−AST」という）の二種類のアイ
ンザイムが存在し、これらの分割定量は肝炎、心
筋梗塞などの臨床診断法として有用である。本発明者らはASTアイソザイムの分割定量を
目的として、これらアイソザイムの阻害物質を検
索したところ、本発明者らが土壌よりスクリーニ
ングして見いだしたストレプトミセス属に属する
菌株が、ｓ−ASTは阻害するがｍ−ASTを全く
阻害しない物質を生産することを知つた。さらに
この物質を精製単離してその理化学的性質を検討
したところ、意外にもセリンプロテアーゼに分類
される酵素であることが分かつた。従来ASTア
イソザイムのプロテアーゼによる感受性の差異を
明確にした例はなく、本発明者らの報告が最初で
ある。本発明は上記知見により完成されたもの
で、本発明の方法により得られた物質（以下単に
「ポロテアーゼ」という）はASTアイソザイムの
分割定量に有用であることを確認した。本発明に用いる微生物としては細胞質性の
ASTアイソザイム阻害活性を有するプロテアー
ゼを産生する能力のあるストレプトミセス属に属
する菌株であれば何れでもよいが、好適には本発
明者らが土壌よりスクリーニングして見いだした
ストレプトミセス属に属するNo.9722株が示され
る。No.9722株は次の菌学的性質を有する。 (a) 形態基生菌糸から1μ内外の気菌糸を伸張しその
先端に開放型らせん状胞子の連鎖がみられる。
気菌糸は単純分枝で車軸分枝はみられない。胞
子の形態は楕円形ないし円筒形で表面構造は平
滑であり、その連鎖数は10胞子以上である。胞
子の大きさは0.6〜1.2μ×0.7×1.8μである。鞭
毛胞子、菌核、胞子のうは認られめない。 (b) 各倍地における生育状態第１表に示す（培養期間14〜21日）。

【表】

【表】 (c) 生理的性質生育温度範囲 Bnnetis brothを用いた温度勾配培養装置
での生育試験の結果、10〜36℃で生育した。ゼラチンの液化：陽性スターチの加水分解：陽性脱脂牛乳の凝固：陰性脱脂牛乳のペプトン化：陽性メラニン様色素の生成：陽性 (b)炭酸源の同化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天
培地上）Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラ
ビノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンニツト、サリ
シン、シユークロースを利用する。イノシツ
ト、ラフイノースを利用しない。以上からNo.9722株の性状を要約すると、気菌糸
はらせん糸を形成し、胞子表面構造は平滑であ
る。気菌糸の色は茶灰色から灰味オリーブであ
る。メラニン様色素の産生は陽性で一部の培地で
赤紫色の可溶性色素を生産する。以上の菌学的性
質を示す菌種について、バージエイズ・マニユア
ル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版（1957年）、同第８版
（1974年）、シヤーリングとゴドリーブのISP（イ
ンターナシヨナル・ストレプトミセス・プロジエ
クト）報告（1968年、1969年および1972年）およ
びワツクスマン著、ジアクチノミセテス（The
Actinomycetes）第２巻（1961年）を参考に検索
すると、No.9722株に最も近縁するものとしてスト
レプトミセス・ビオラセオクロモゲネス
（Streptomyces violaceochromogenes）が挙げ
られる。即ち、気菌糸の色調が灰色でらせん糸を
形成すること、赤紫色の可溶性色素を生産するこ
と、胞子表面が平滑であること、メラニン様色素
の生成が陽性であること（ペプトン・イースト・
鉄寒天培地で陽性、チロシン寒天培地で陰性）な
どの点がよく一致している。糖の利用性について
は、イノシツトとラフイノースを利用しない点が
異なつている。以上のように、No.9722株はストレプトミセス・
ビオラセオクロモゲネスと糖の利用性について若
干の相違があるものの異なる菌種と考えられる程
の相違ではなく、ストレプトミセス・ビオラセオ
クロモゲネスと種を同じくするものと判断し、ス
トレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスNo.9722
と命名した。本菌株は、通産省工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第7362号（FERM
Ｐ−7362）として寄託されている。なお、本寄託
菌株はブダペスト条約に基づく寄託に移管され、
受託番号FERM BP−646として同寄託機関に寄
託されている。本発明法によりプロテアーゼを製造するには、
まずストレプトミセス属に属するプロテアーゼ生
産菌株を栄養培地に培養して、培養物中にプロテ
アーゼを蓄積せしめる。培養方法は、放線菌の一
般的な培養方法が用いられる。例えば、使用する
栄養培地としては、微生物が資化し得る炭素源、
窒素源および無機物などを含む合成培地または天
然培地が用いられる。炭素源としてはグルコー
ス、フラクトース、マルトース、シユクロース、
糖蜜、澱粉、デキストリン、有機酸およびグリセ
リンなどが使用される。窒素源としては麦芽エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、肉エキ
ス、コーンスチープリカー、カゼイン、アミノ酸
などの有機窒素源、および硝酸塩、アンモニウム
塩などの無機窒素源が使用される。無機物として
はカリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシ
ウム、亜鉛、鉄などの無機塩が必要に応じて使用
される。培養中の発泡を抑えるために、界面活性
剤、シリコン、植物油などの消泡剤を添加するこ
ともできる。培養は、通常振盪または通気撹拌下好気的条件
のもとにおこなうのがよい。培養温度は菌が生育
しプロテアーゼが生産される範囲内であればいず
の温度でもよいが、好ましくは20〜35℃である。
培地のPHは通常６〜９の範囲が好ましい。培養時
間はプロテアーゼの生産が最大に達する時間を選
べばよく、通常30〜50時間である。以上のようにして得られた培養物から本発明の
プロテアーゼを採取するには、その理化学的性質
を利用して、公知の蛋白質の精製法を適宜組み合
わせて行うことができる。例えば、培養物をろ過
もしくは遠心分離して菌体を除いたのち、硫安、
硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノール、
メタノール、アセトンなどを用いた有機溶媒沈
澱、活性炭、シリカゲル、アルミナ、ヒドロキシ
アパタイト、セルロースなどを用いた吸着クロマ
トグラフイー、イオン交換樹脂、イオン交換セル
ロース、イオン交換セフアデツクスなどを用いた
イオン交換クロマトグラフイー、セフアデツク
ス、バイオゲルなどを用いたゲルろ過および電気
泳動、限外ろ過、透析などの公知の方法を任意の
順序で適宜組み合せ、または繰り返すことにより
精製する。本発明のプロテアーゼは次の理化学的製質を有
する。作用：ｓ−ASTを阻害するｍ−ASTは阻害
しない。カゼイン等の蛋白質の水解反応を触媒
する。基質特異性：カゼイン、ヘモグロビン、アゾ
コール、アルブミンに作用する。至適PH：トリス塩酸緩衝液（PH７〜９）およ
びグリシン−水酸化ナトリウム衝撃液（PH10〜
12）に溶解したカゼイン（1.33％）を基質とし
て測定したところ、至適PHは11.6付近であつ
た。安定PH：37℃、14時間処理したところ、PH５
〜６の範囲で安定であつた。至適温度：PH9.5で10分間反応したところ、
至適温度は75℃であつた。温度安定性：PH8.5において、各温度で10分
間処理したところ、55℃で100％、65℃で85％
の活性が残存していた。分子量：17500〜18000（SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による。）等電点：9.8（焦点電気泳動法による。）阻害剤：フエニルメチルスルホニルフルオラ
イドにより阻害される。EDTAでは阻害され
ない。物質の色、形：白色、菱面体結晶上述のように、本発明の物質はプロテアーゼで
あり、より詳しくはセリンプロテアーゼに分類さ
れるプロテアーゼである。次に本発明のプロテアーゼのASTアイソザイ
ム阻害活性の測定法を説明する。0.1mg／ml牛血
清アルブミンおよび4μMピリドキサールリン酸
を含む50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.5）に、ｓ
−AST（ブタ心臓起源、Y.Morinoら、J.
Biochem.、第82巻 847−852頁、1977年、方法
に準じ調製）を溶解した溶液0.5ml（ｓ−ASTを
50Karmen単位含む）とプロテアーゼの溶液0.5
mlを混合して、あらかじめ25℃、15分間予熱した
のち、20ｍＭアスパラギン酸、10ｍＭ２−オキ
ソグルタル酸、0.2ｍＭ NADHおよびリンゴ酸
脱水素酵素（オリエンタル酵母社製）0.5μを含
む50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）3.0mlと混合
して25℃にて反応せしめ、340nｍにおける吸光
度の１分間当りの減少を測定する。この測定値
と、プロテアーゼを除いて、上記と同じ方法で操
作したときの吸光度を比較したとき、後者の値を
50％不活性化せしめるプロテアーゼの量を１単位
とした。次ぎに、本発明のプロテアーゼが有するAST
アイソザイム阻害活性の試験例を説明する。即
ち、上述の阻害活性の測定法において、プロテア
ーゼの重量およびプロテアーゼ活性を種々変化さ
せてASTアイソザイムの残存活性を測定した。
但し、ｓ−ASTに代えてｍ−AST（前記ｓ−
ASTの調製法の項の文献に準じて調製した）を
使用した場合の試験も同様に実施した。ここにお
いて、プロテアーゼ活性とは、基質カゼインとプ
ロテアーゼを37℃、10分間反応せしめた後、トリ
クロロ酢酸可溶性画分にフオーリン試薬を加え
て、生じた青色の660nｍにおける吸光度を測定
し、そのOD値を活性単位として表したものであ
る。結果は、第１図および第２図に示すように、
本発明のプロテアーゼはｓ−ASTは阻害するも
ののｍ−ASTは全く阻害しないことがわかる。以下実施例を以て本発明を詳細に説明する。実施例１グルコース1.0％、ポリペプトン、1.0％、肉エ
キス1.0％、塩化ナトリウム0.3％、アデカノール
（消泡剤、旭電化社商標）0.02％から成る組成の
培地（PH7.0）100mlを500ml容の坂口フラスコに
入れ、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネ
スNo.9722（FERM BP−646）の斜面寒天培養株
を１白金耳接種して、30℃で40時間往復振盪培養
し種培溶液とした。上記と同じ組成の培地18を
30容のジヤーフアーメンターに入れ、種培養液
を接種して、通気量９／分、撹拌回転数
300rpm、内圧0.5Kg／cm²、温度28℃で40時間培養
した。培養液をろ過して菌体を除き、得られたろ液に
硫安を80％飽和となるように加え、一晩放置し
た。遠心分離により沈澱を集め、50ｍＭ酢酸緩衝
液（PH4.0）に溶解した後、セロフアンチユーブ
を用いて同緩衝液に透析した。次に同じ緩衝液で
平衡化したSP−セフアデツクスＣ−50（フアルマ
シア社製）カラム（4.8cmφ×28cmＬ）に吸着さ
せた後、０〜0.6Mの塩化ナトリウム濃度勾配に
より溶出した。0.25〜0.3Mの塩化ナトリウムで
溶出された活性画分を集め、硫安を80％飽和とな
るように加え、生成した沈澱を遠心分離により集
めた。沈澱を40ｍＭホウ酸−水酸化カリウム緩衝
液（PH9.7）に溶解して、同緩衝液に透析した後、
同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セフアデツクス
Ａ−25（フアルマシア社製）カラム（2.0cmφ×10
cmＬ）に吸着させた。プロテアーゼはこの樹脂に
弱い吸着能を示すだけで、引続き同じ緩衝液を流
すことにより溶出された。溶出液に硫安を80％飽
和となるように加えた後、生成した沈澱を遠心分
離により集めた。沈澱を40ｍＭホウ酸−水酸化カ
リウム緩衝液（PH9.7）に溶解して、同緩衝液に
透析し、透析中に生じた沈澱は遠心により除いた
後、得られた酵素液を低温で放置することにより
プロテアーゼの結晶を析出させた。上記各精製の
ステツプにおけるASTアイソザイム阻害活性、
蛋白量（280nｍにおける吸光度で表す）、比活性
（阻害活性／蛋白量）およびASTアイソザイム阻
害活性の収率を第２表に示す。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプロテアーゼの使用量（重
量）とASTアイソザイム阻害活性の関係を表す
図であり、第２図は同じくプロテアーゼ活性と
ASTアイソザイム阻害活性の関係を表す図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１ストレプトミセス属に属し細胞質性のアスパ
ラギン酸アミノトランスフエラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼを生産する能力の
ある菌株を栄養培地に培養して細胞質性のアスパ
ラギン酸アミノトランスフエラーゼアイソザイム
阻害活性を有するプロテアーゼを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とするアスパラギ
ン酸アミノトランスフエラーゼアイソザイム阻害
活性を有するプロテアーゼの製造法。２ストレプトミセス属に属する菌株がストレプ
トミセス・ビオラセオクロモゲネスである特許請
求の範囲第１項記載のアスパラギン酸アミノトラ
ンスフエラーゼアイソザイム阻害活性を有するプ
ロテアーゼの製造法。３ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネス
がストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスNo.
9722（FERM BP−646）である特許請求の範囲
第２項記載のアスパラギン酸アミノトランスフエ
ラーゼアイソザイム阻害活性を有するプロテアー
ゼの製造法。