JPH01265896A - Ｄ−α−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は、Ｄ−α−アミノ酸の製造法に関する。更に詳
しくは、ＤＬ−α−アミノ酸アミドを生化学的に不斉加
水分解して対応するＤ−α−アミノ酸を選択的に生成せ
しめることによりＤ−α−アミノ酸を製造する方法に関
するものである。

Ｄ−α−アミノ酸は、抗生物質の原料、殺菌剤の原料お
よび各種工業薬品の中間体として重要なものである。

［従来の技術］ 従来、ＤＬ−α−アミノ酸アミドを生化学的に不斉加水
分解して対応するＤ−α−アミノ酸を製造する方法とし
ては、ＤＬ−α−アミノ酸アミドにＬ−α−アミノ酸ア
ミドを選択的に加水分解する酵素（Ｌ−アミダーゼ）含
有物を作用させてＬ−α−アミノ酸を得、次いで未反応
のＤ−α−アミノ酸アミドを分離したのちにＤＬ−アミ
ダーゼ含有物を作用させる方法が知られている（たとえ
ば、特公表昭５６−５００３１９号）。

しかしながら、この方法は、Ｄ−α−アミノ酸とほぼ等
量のＬ−α−アミノ酸が併産されるという欠点を有して
いる。

また、Ｄ−α−アミノ酸アミドを酵素的に加水分解して
対応するＤ−α−アミノ酸を得る方法も知られている（
たとえば、特開昭６０−１８４３９２号および特開昭６
１−９６９８９号）。　しかしながら、これらの方法で
はＤＬ−α−アミノ酸アミドを予め分割して得られたＤ
−α−アミノ酸アミドを原料としなければならないとい
う煩雑さがあった。

本発明者等は、ＤＬ−α−アミノ酸アミドを原料とし、
このＤＬ−α−アミノ酸アミドから直接にＤ−α−アミ
ノ酸を工業的に有利に製造する方法の開発を目的として
検討を進め、先にロドコッカス属に属する微生物がＤＬ
−α−アミノ酸アミドの加水分解において、Ｄ−α−ア
ミノ酸アミドのみを選択的に加水分解する活性を有する
ことを見出した（特願昭６ｌ−２４４０２３）。

しかしながら、この酵素は反応液内において実用上、十
分に活性が高くはなくＤ−α−アミノ酸の収率が低く、
かつ安定性も低く、活性が長時間保持されず、工業的に
は未だ充分に満足し得なかった。

［問題を解決するための手段・作用］ 本発明者らは、これらの欠点を解消すべくさらに研究を
進めた結果、反応液中にメルカプト基を有する化合物を
存在させることにより、該酵素の安定性を大きく増大せ
しめることが出来ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、 　Ｈｘ 一般式が　　ＲＣＨＣ：　ＯＮ　Ｈ２（ただし、式中Ｒ
は低級アルキル基、置換低級アルキル基、フェニル基、
置換フェニル基、フリル基、ピリジル基、チアゾリル基
、イミダゾリル基またはインドリル基を示す）で示され
るＤＬ−α−アミノ酸アミドに、Ｄ−α−アミノ酸アミ
ド加水分解酵素を作用させ、該ＤＬ−α−アミノ酸アミ
ドに対応するＤ−α−アミノ酸を製造せしめる際に、反
応液中にメルカプ１〜基を有する化合物を存在せしめる
ことを特徴とするＤ−α−アミノ酸の製造方法である。

本発明の一般式で示されるＤＬ−α−アミノ酸アミドの
Ｒの低級アルキル基および置換低級アルキル基の低級ア
ルキル基には特に制限はないが、たとえばメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよ
びｓｅｃ　−ブチルなどのＣ１〜Ｃ４の直鎖または分枝
した低級アルキル基が好適である。また、置換低級アル
キル基および置換フェニル基のそれぞれに含まれる置換
基は、たとえば、ヒドロキシ、メトキシ、メルカプト、
メチルメルカプト、アミノ、グアニル、カルボキシル、
カルボフサミド、ハロゲン、フェニル、ヒドロキシフェ
ニル、イミダゾリルおよびインドリルなどである。

本発明の一般式で示されるＤＬ−α−アミノ酸アミドの
代表例として、アラニンアミド（Ｉ）　Ｌ−”を省略。

以下同様）、バリンアミド、ロイシンアミド、イソロイ
シンアミド、セリンアミド、スレオニンアミド、システ
ィンアミド、シスチンアミド、メチオニンアミド、リジ
ンアミド、アルギニンアミド、アスパラギンアミドグル
タミンアミド、フェニルグリシンアミド、フェニルアラ
ニンアミド、チロシンアミド、トリプトファンアミドお
よびヒスチジンアミドなどがある。

本発明に使用される微生物は、Ｄ−α−アミノ酸アミド
を加水分解する活性を有するものであればよく、特に制
限はなく、たとえばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　
、バクテリジウム属（Ｂａｃｔｅ−ｒｉｄｉｕＩｌｌ）
　、ミクロコツカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ブ
レビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
　、アクロモバクタ−属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
）　＋アルカリ土類金属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　
＋　クルチア属（にＵ−ｒｔｈｉａ）　、ロドコッカス
属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　、シュードモナス属（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、およびセラチア属（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ）等のそれぞれに属する微生物がある。

これらのうち、実用上、ロドコッカス属に属するロドコ
ッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏ−ｃｃｕｓ　
ｃｒｙＬｈｒｏｐｏｌｊｓ）が特に好ましい。

ロドコッカス・エリスロポリスに属する代表例として、
ロドコッカス・エリスロポリス　ＮＲ−２３（微工研菌
寄第　８９３７　号）および同ＮＲ−２８（微工研菌寄
第　８９３８　号）などがある。　これらの菌株は、本
発明者らが分離・同定した新菌株である。

これら微生物を増殖させるための培養に当たって用いら
れる栄養培地としては、これらの細菌が資化し得る炭素
源を少なくとも含有していることを要し、さらに適量の
窒素源および無機塩などを含有する培地であれば良く、
合成培地および天然培地のどちらでも良く、特別な培地
を必要としない。

炭素源としては、これらの細菌が資化し得る炭素源であ
れば良く特に制限はなく、たとえば糖蜜、ペグ１〜ン、
肉エキス、およびコーンステイープ、リカーなどの天然
物、ならびにグルコース、フラグ１〜−ス、シュクロー
ス、ソルビ１〜−ル、グリセリンおよびマンニ１ヘール
等の糖類、メタノール、エタノールおよびｎ−プロパツ
ールなどのアルコール類、酢酸、クエン酸およびこはく
酸等の有機酸１等を用いることができる。

窒素源としては、たとえばアンモニウム塩。

硝酸塩などの無機窒素化合物および／または、たとえば
尿素、コーンステイープ・リカー、カゼイン、ペプトン
、酵母エキスなどの有機窒素含有物質が用いられる。

無機成分としては、たとえばカルシウム塩。

マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩。

リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩。

モリブデン塩、コバル＋へ塩、はう素化合物およびよう
素化合物が用いられる。

高い酵素活性を得るために培地へＤ−α−アミノ酸アミ
ドもしくはＤＬ−α−アミノ酸アミドを添加することも
効果的である。　この際に添加されるα−アミノ酸アミ
ドは本発明の一般式で示されるα−アミノ酸アミドであ
ればいずれでも良いが、目的とするＤ−α−アミノ酸に
対応するα−アミノ酸アミドを用いることが特に好まし
い。　添加されるα−アミノ酸アミドの培地中での濃度
は、通常はＯ１Ｌ〜１０重量％、好ましくは０．２〜２
重量％とされる。

培養条件は、使用される菌株によって異なり、各菌株に
とって生育、増殖およびＤ−α−アミノ酸アミドの選択
的加水分解酵素の生産に適した培養条件を選択すれば良
い。　たとえば、通常は、培養温度　２０〜４２℃、好
ましくは２５〜４０℃、ｐ１１５〜９．好ましくは６〜
８である。

このようにして培養して、増殖させた微生物をＤ−α−
アミノ酸アミド加水分解酵素（Ｄ−アミダーゼ）として
、前記の一般式で示されるＩ）　Ｌ−α−アミノ酸アミ
ドに作用させるには、液体培地に微生物を培養して、得
られた培養液、この培養液から分離した菌体、菌体破砕
物、または培養液もしくは菌体から分離した酵素（Ｄ−
アミダーゼ）の粗製酵素、精製酵素、酵素含有抽出物あ
るいはその濃縮物、および、常法に従って固定化された
菌体または酵素（以１ζ菌体以外のものを″菌体処理物
″と記すこともある）等の状態で作用させる。

本発明で使用されるメルカプ１−基を有する化合物とし
ては、水溶性であれば有機化合物であっても無機化合物
であっても良く、特に制限はないが、好ましくは　２−
メルカプトエタノール、システィン、グルタチオンおよ
びジチオスレイ１〜−ル等である。

本発明の方法においては、通常は前記のＤＬ−α−アミ
ノ酸アミド、菌体および／または菌体処理物を、たとえ
ば水などの水性媒体に添加した反応液にメルカプト化合
物を添加して、不斉加水分解反応は進行せしめられる。

　しかして、前記の培養液にＤＬ−α−アミノ酸アミド
を添加して、反応液とすることもできる。

加水分解反応の条件は、微生物の種類、酵素の加水分解
活性の強さ、ＤＬ−α−アミノ酸アミドの種類、メルカ
プト基を有する化合物の種類等によって異なり、−概に
特定し得ないが、通常はたとえば、反応液中のＤ　Ｌ−
α−アミノ酸アミド濃度は１〜４０重量％、メルカプ１
−基を有する化合物の濃度は１０−”〜Ｊ、　Ｏ−２Ｍ
ｏｌル、ＤＬ−α−アミノ酸アミドに対する微生物の使
用量は乾燥菌体として重量比０．００５〜１０、反応温
度Ｏ〜７０℃、およびｐＨ５〜１３の範囲である。

加水分解反応で生成するＤ−α−アミノ酸は、たとえば
反応生成液から遠心分離などの常法により微生物を除き
、さらに必要に応じて限外濾過などの方法によって酵素
を除いた後、減圧濃縮後エタノールを加えてＤ−α−ア
ミノ酸を析出させ、このＤ−α−アミノ酸を濾取する、
などの方法により容易に分離することができる。

Ｄ−α−アミノ酸分離後の残存Ｌ−α−アミノ酸アミド
は、それ自体公知の方法、たとえば酸あるいはアルカリ
で加水分解することにより対応するＬ−α−アミノ酸を
得ることができる。

また　、Ｌ−α−アミノ酸アミドをラセミ化した後、必
要に応じて未反応のＤＬ−α−アミノ酸とともに反応系
へ循環することにより、ＤＬ一α−アミノ酸アミドから
高収率でＤ−α−アミノ酸を′ｆｊ５造することも可能
である。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれ
のみに限定されるものではない。

実施例　１ グルコース　ｌｏｇ、ポリペプトン　１．　Ｏｇ、酵母
エキス　Ｌｏｇを純水ＩＱに溶解し、ｐＨを７．０に調
整した培地１００ｄをＩＱ容三角フラスコに入れ、１ｋ
ｇ／ｃＪＧで２０分間殺菌した培地に、同様な培地で前
培養したロドコッカス・エリスロポリス　ＮＲ−２８（
微工研菌寄第　８９３８　号）の培養液を１−植菌し、
３０℃で４８時間振どう培養を行い、培養液を１８００
０　ｒρｍ　で１０分間遠心分離し、菌体を得た。

純水１００　ｍＱに前記菌体を乾燥菌体重量換算で２０
ｍｇを＠濁した液１０ＴＩＬＱ、ｐＨ７に調製した１０
重量％　Ｄ　Ｌ−バリンアミド水溶液２０ｍＱおよび各
種メルカプト基を有する化合物４×１０−’Ｍ／Ｌ溶液
１溶液１．奮 うしつつ反応を行い、反応液中のＤ−バリン生成量の経
時変化を高速液体クロマトグラフィで分析した。　結果
を表１に示す。

表１ 実施例　２ 培地を次の組成とし、メルカプ１−基を有する化合物と
してシスティンを用い、濃度を種々変えた以外は実施例
１と同様にして行った。

グルコース　　　　　　　１．０ｇ ペプトン　　　　　　　　５ｇ 肉エキス　　　　　　　　１ｇ 酵母エキス　　　　　　　５ｇ Ｋ　Ｈ　ｚ　Ｐ　０　４　　　　　　　　１　　　ｇＭ
　ｇ　Ｓ　Ｏ　４・７　Ｈ２Ｏ　　　　０　、　４　ｇ
Ｆ’ｅＳＯ．”　　７Ｈ　２０　　　　　　　０．　　
　０１ｇＭｎＣ１ｚ”４Ｈ２０　　　０’．ＯｌｇＤ　
Ｌ−バリンアミド　　５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　ＩＱｐ　Ｔ（　　　
　　　　　　　７ 結果を表２に示す。　　　　　　（以下余白）表２ （以下余白） 実施例　３ 添加システィンの反応液中濃度　Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ／
Ｉ１、反応温度　２０℃とし、各種菌株を用いた以外は
実施例２と同様に行った。

結果を表３に示す。

−Ｈ段コニジスティン無添 加３　　　　　　　　　　　　　　　　下段ニジスティ
ン添加実施例　４ 添加システィンの反応液中濃度　１　Ｘ　ｉ　Ｏ−’Ｍ
　／　Ｌとし、反応原料に各種ＤＬ−α−アミノ酸アミ
ドを用いた以外は実施例２と同様に行った。　結果を表
４に示す。

（以下余白） 」二股ニジスティン’！’ｍｉｎ 表４　　　　　　　　　　　　　　　　　下段ニジステ
ィン添加［発明の効果］ 本発明の方法によって、Ｄ−α−アミノ酸アミド加水分
解酵素の活性および安定性をそれぞれ高めることにより
、ＤＬ−α−アミノ酸アミドから、有用な多くのＤ−α
−アミノ酸を容易に、しかも効率良く製造することが可
能となった。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者　長野和吉 代理人　　弁理士　　小　堀　貞　文

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式が▲数式、化学式、表等があります▼（ただし、 式中Ｒは低級アルキル基、置換低級アルキル基、フェニ
   ル基、置換フェニル基、フリル基、ピリジル基、チアゾ
   リル基、イミダゾリル基またはインドリル基を示す）で
   示されるＤＬ−α−アミノ酸アミドに、Ｄ−α−アミノ
   酸アミド加水分解酵素を作用させ、該ＤＬ−α−アミノ
   酸アミドに対応するＤ−α−アミノ酸を製造せしめる際
   に、該反応液中にメルカプト基を有する化合物を存在せ
   しめることを特徴とするＤ−α−アミノ酸の製造法。