JPH0574353B2

JPH0574353B2 -

Info

Publication number: JPH0574353B2
Application number: JP19386885A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Sakashita; Tetsuji Nakamura; Ichiro Watanabe
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd; Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd; Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1985-09-04
Filing date: 1985-09-04
Publication date: 1993-10-18
Also published as: JPS6255098A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は光学活性α−オキシ酸の製造法に関す
る。より詳しくは特定の微生物が産生する酵素の
作用により、DLまたはＬ−α−オキシ酸アミド
からＬ−α−オキシ酸を製造する方法に関する。光学活性α−オキシ酸は医薬品などの原料とし
て、あるいはジアステレオマー形成による光学分
割剤として有用な物質である。従来の技術光学活性α−オキシ酸の製造は、糖密等を原料
とした発酵による方法、酵母の培養液中にDL−
α−オキシニトリルを加えてＬ−α−オキシ酸を
生産する方法〔特開昭49−42886号公報〕、微生物
によるα−オキシ酸の立体選択的な酸化反応によ
る方法〔西独特許公開第2832230号公報〕、Ｌ−ア
ミノ酸を亜硝酸でジアゾ化後オキシ化する方法、
α−ハローカルボン酸をデハロゲナーゼにより立
体選択的に脱ハロゲン化後オキシ酸に変換する方
法〔特開昭59−31690号公報〕および不斉触媒に
よるピルビン酸類の立体選択的な還元による方法
〔Tet.Lett.（48）4351（1976）などが知られてい
る。しかしながら、これらの方法にも種々の欠点が
ある。例えば、培養液中で生産するものについて
は、目的生成物の分離、精製が難しく、酸化反応
を利用して生産する場合には補酵素の再生を考慮
しなければならず、この他反応系が複雑であつた
り、Ｌ−アミノ酸を原料とする場合のように原料
が高価である点などが挙げられる。発明の概要かかる状況から、本発明者らは、特に化学合成
で容易かつ安価に製造できるα−オキシ酸アミド
を原料とし、これから微生物学的方法により対応
する光学活性α−オキシ酸を得るべく鋭意検討し
た結果、エンテロバクター属およびシユードモナ
ス属に属する微生物が産生する酵素がα−オキシ
産アミドのＬ−体だけを選択的に加水分解し得る
ことを見出し、本発明を完成するに到つた。すなわち、本発明は、エンテロバクター
（Enterobacter）属またはシユードモナス
（Pseudomonas）属の微生物が産生するＬ−α−
オキシ酸アミド加水分解活性を有する酵素の作用
により、一般式

〔式中、Ｒはアルキル基（炭素数１〜４）、フエニル基、アラルキル基または置換基を有するこれらの基を表す。〕

で示されるDL−またはＬ−α−オキシ酸アミド
から対応するＬ−α−オキシ酸を生成せしめるこ
と、を特徴とする光学活性α−オキシ酸の製造法
を要旨とするものである。本発明で使用するDL−α−オキシ酸アミドは、
合成の容易なα−オキシニトリルからMnO₂触媒
等を用いる接触水和法、あるいはα−オキシ酸エ
ステルにアンモニアを作用させる方法などにより
容易に得ることが可能であるが、このDL−α−
オキシ酸アミドあるいはまたＬ−α−オキシ酸ア
ミドから光学活性α−オキシ酸を製造することに
ついての報告は身あたらない。発明の具体的説明本発明において使用される微生物は、本発明者
らが各地の土壌、汚泥等より新たに分離、見出し
たものであり、具体的には例えば、エンテロバク
ター・クロアツセイＮ−7901、シユードモナス
SP.N−7131およびシユードモナスSP.N−2211を
挙げることができる。これらの微生物は、それぞれ微工研条寄第873
号（エンテロバクター・クロアツセイＮ−7901）、
同第874号（シユードモナスSP.N−7131）および
同第875号（シユードモナスSP.N−2211）として
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄
託されており、菌学的性質はそれぞれ以下の通り
である。Ｎ−7901菌株 (1) 形態桿菌 0.8〜1.2×1.0〜1.5μｍ鞭毛周毛１本以上運動性＋グラム染色性陰性 (2) 生理学的性質硝酸塩の還元＋脱窒反応 − MRテスト − VPテスト＋インドールの生成 − 硫化水素の生成 − クエン酸塩の利用＋色素の生成 − ウレアーゼ − オキシダーゼ − カタラーゼ＋ PH４〜10至適温生育の範囲度 35〜37℃ 酸素に対する態度通性嫌気性Ｏ−ＦテストＦ糖類から酸およびガスの生成酸の生成ガスの生成アドニトール − − アラビノース＋＋キシロース＋＋グルコース＋＋マンノース＋＋フラクトース＋＋ガラクトース＋＋マルトース＋＋シユークロース＋＋ラクトース＋＋ラフイノース＋ラムノース＋グリセリン＋＋ソルビトール＋＋マンニトール＋＋イノシトール − − ズルシトール − ダルシトール − ＋ (3) その他デンプンの分解 − ゼラチンの分解 − 尿素の分解弱マロン酸塩の利用＋リジンの脱炭酸反応 − オルニチンの脱炭酸反応＋フエニルアラニンの脱アミノ反応 − アルギニンジヒドロラーゼ＋ β−ガラクトシダーゼ＋シアン化カリウムの耐性＋Ｎ−7131菌株 (1) 形態桿菌鞭毛極毛１本以上運動性＋芽胞認めずグラム染色性陰性 (2) 生理学的性質脱窒反応＋インドールの生成 − 硫化水素の生成 − クエン酸塩の利用＋色素の生成水溶性色素 − 蛍光色素 − ウレアーゼ＋オキシダーゼ＋カタラーゼ＋ 40℃で生育 − Ｏ−ＦテストＯ糖類から酸およびガスの生成酸の生成ガスの生成キシロース＋グルコース＋ − マンノース＋ガラクトース＋ラクトース − マンニトール＋資化性グルコース＋フラクトース＋Ｌ−アラビノース＋シユークロース − マロイネイト − エタノール − トレイハロース − meso−イノシトール − β−アラニン＋ DL−アルギニン＋ (3) その他デンプンの分解 − ゼラチンの分解 − 尿素の分解 − ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積＋アルギニンヒドラーゼ − アミノペプチダーゼ＋ 6.5％NaFl存在下での生育 − Ｎ−2211菌株 (1) 形態桿菌鞭毛極毛運動性＋芽胞認めずグラム染色性陰性 (2) 生理学的性質脱窒反応弱インドールの生成 − 硫化水素の生成 − クエン酸塩の利用＋色素の生成水溶性色素
弱蛍光色素 − ウレアーゼ＋オキシダーゼ＋カタラーゼ＋ 40℃での生育 − Ｏ−ＦテストＯ糖類より酸およびガスの生成酸の生成
ガスの生成キシロース＋グルコース＋
− マンノース＋ガラクトース＋ラクトース − マンニトール弱資化性グルコース＋フラクトース＋Ｌ−アラビノース＋シユークロース − マロイネイト − エタノール − トレハロース − meso−イノシトール弱 β−アラニン弱 DL−アルギニン − (3) その他デンプンの分解 − ゼラチンの分解 − 尿素の分解＋ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積弱アルギニンヒドラーゼ − アミノペプチダーゼ＋ 6.5％NaFl存在下での生育 − 以上の菌学的性質をバージエーゼ・マニユア
ル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリオロジ
ー第８版（Bergy's Manual of
Determinative Bacteriology 8th. ed.）に従
つて検索すると、Ｎ−7901菌株はエンテロバク
ター・クロアツセイと、Ｎ−7131およびＮ−
2211菌株はシエードモナス属に属する細菌とそ
れぞれ同定された。なお、Ｎ−7131菌株は細胞
内にポリ−β−ヒドロキシブチレートを蓄積
し、40℃での生育およびアルギニンジヒドラー
ゼが共に陰性、脱窒反応は陽性を示し、糖の資
化性等に非典型的性状が認められたが、本菌は
シユードモナス・ソラナシエラムまたはその近
縁種と思われる。上記微生物を培養して本発明の酸素を生成せ
しめるには、炭素源、窒素源、無機塩および有
機栄養源を含有する通常の培地を用い好気的に
該微生物の培養を行えばよい。炭素源としてはグルコース、フラクトース、
シユークロース、マルトース等の糖類、酢酸、
クエン酸の有機酸その他が適宜使用でき、その
使用量は通常培地中に0.1〜10％（重量％、以
下同じ）である。窒素源としてはペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の一般天然
窒素源の他に各種の無機酸または有機酸のアン
モニウム塩等が使用できる。無機塩類としては
KH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、NaCl、
CaCl₂、MgSO₄、7H₂OおよびFe、Mn、Zn、
Co等の重金属イオンが必要に応じて適宜使用
される。なお、この際、高い酵素活性を誘導さ
せるため炭素数２〜５の脂肪族アミド（例え
ば、アセトアミド、プロピオンアミド、ブチル
アミド、サクシノアミド等）を少量添加するこ
とが効果的であり、その添加量は使用する微生
物によつて若干異なるが通常培地中に0.01％以
上、とりわけ0.1〜0.5％程度とするのが好まし
い。培養はPH５〜10、温度20〜40℃の範囲で１〜
５日間好気的に行う。本発明は、微生物が産生する酵素の作用を利
用するものであるが、その酵素作用は上記のよ
うに培養して得た微生物の培養液、分離生菌
体、または菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌
体抽出物等）、さらには常法に従つて菌体また
は菌体処理物をポリアクリルアミド、カラギー
ナン等で固定化した菌体等いずれの使用によつ
ても得ることが可能で、これらの使用形態は全
て本発明に適用し得る。本発明に使用されるDL−またはＬ−オキシ
酸アミドは、前記一般式中、Ｒがアルキル基
（炭素数１〜４）、フエニル基、アラルキル基ま
たは置換基を有するこれらの基で表される化合
物であり置換基としてはメルカプト基、ヒドロ
キシル基、アミノ基、カルボキシル基、フエニ
ル基、インドリル基、ピリジル基、イミダゾリ
ル基等である。加水分解反応は、通常、これらDL−または
Ｌ−オキシ酸アミド濃度0.5〜50％（反応基質
溶液はスラリー状であつてもよい）、微生物等
の使用量は乾燥菌体として反応液当たり0.01〜
10％、反応温度20〜60℃、PH６〜11、反応時間
0.1〜100時間の範囲で行う。かくして、反応液中に生成、蓄積したＬ−オ
キシ酸は、イオン交換法、その他公知の方法を
組合せて分離、精製し取得することができる。また、原料としてDL−α−オキシ酸アミド
を使用した場合、Ｌ−α−オキシ酸を分離した
後の反応液からＤ−α−オキシ酸とすることも
できる。さらに、Ｌ−α−オキシ酸アミドは酸
または塩基によりラセミ化させたり、酸化、還
元によりピルビン酸誘導体を経てラセミ化させ
た後、再び加水分解反応へ戻してＬ−α−オキ
シ酸を得る原料とする。以下、実施例によつて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの例のみに限定される
ものではない。実施例１下記の組成の培地を使用し、30℃で48時間Ｎ
−7901菌の振盪培養を行つた。シユークロース１％肉エキス 0.5％無機塩類MgSO₄・7H₂O 0.01％ FeSO₄・7H₂O 0.001％ MnSO₄・4H₂O 0.001％ CaCl₂・2H₂O 0.001％ ZnSO₄・7H₂O 0.0001％プロピオンアミド 0.5％ PH６この培養液１mlを第１表に示しDL−α−オキ
シ酸アミドの0.05％水溶液〔Tris−HCl緩衝液
（PH９）〕の９mlに加え、30℃で20分反応させた
後、濃塩酸にて酸性として反応を停止させた。こ
の反応液を除菌フイルターを用いて除菌後、高速
液体クロマトグラフイーにて分析し、生成したα
オキシ酸の立体化学を標準品と比較し光学収率
（Ｌ−α−オキシ酸／生成α−オキシ酸）を算出
した。

【表】実施例２下記の組成の培地を使用し、30℃で48時間Ｎ−
2211菌の振盪培養を行つた。グリセロール１％酵母エキス 0.05％無機塩類MgSO₄・7H₂O 0.01％ FeSO₄・7H₂O 0.001％ MnSO₄・4H₂O 0.001％ CaCl₂・2H₂O 0.001％ ZnSO₄・7H₂O 0.0001％イソブチルアミド 0.5％ PH７以下、実施例１において反応時間を２時間とし
た以外、実施例１と同様の操作を行い第２表に示
す結果を得た。

【表】実施例３下記の組成の培地を使用し、30℃で48時間Ｎ−
7131菌の振盪培養を行つたグリセロール１％肉エキス 0.5％無機塩類MgSO₄・7H₂O 0.01％ FeSO₄・7H₂O 0.001％ MnSO₄・4H₂O 0.001％ CaCl₂・2H₂O 0.001％ ZnSO₄・7H₂O 0.0001％イソブチルアミド 0.5％ PH７以下、原料としてDL−ラクトアミドを使用し
て実施例２と同様の操作を行つた結果、収率（仕
込DL−体基準）20％で光学収率100％のＬ−乳酸
が得られた。

Claims

【特許請求の範囲】１エンテロバクター（Enterobacter）属また
はシユードモナス（Pseudomonas）属の微生物
が産生するＬ−α−オキシ酸アミド加水分解活性
を有する酵素の作用により、一般式【化】〔式中、Ｒはアルキル基（炭素数１〜４）、フエ
ニル基、アラルキル基または置換基を有するこれ
らの基を表す。〕で示されるDL−またはＬ−α−オキシ酸アミド
から対応するＬ−α−オキシ酸を生成せしめるこ
と、を特徴とする光学活性α−オキシ酸の製造
法。