JPH02100674A

JPH02100674A - 細菌の培養法

Info

Publication number: JPH02100674A
Application number: JP63252645A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Yamada; 秀明山田; Toru Nagasawa; 長沢　透
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-10-06
Filing date: 1988-10-06
Publication date: 1990-04-12
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: DD298659A5; JPH0753103B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いロドコッカ
ス属ロドクロウス種の菌体を高収量で生産する方法に関
する。

近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して種々の単
位化学反応や複合化学反応の触媒として利用しようとす
る動きが盛んになってきている。

ニトリルヒドラターゼはニトリル類を水和して相当する
アミド類を生成させる酵素として、本発明者の中の山田
らにより見出されており（Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　４８１１８５　（１９８２）
参照〕、その具体的利用例としてニトリルヒドラターゼ
を有する細菌を用いてニトリル類からアミド類を製造す
る方法が提案されている〔特公昭５９−３７９５１号公
報参照〕。

さらに、本発明者らは先に、本発明のロドコッカス属ロ
ドクロウス種の細菌を用いた、特に芳香族ニトリル類か
らのアミド類の製造に適した、アミド類の製造方法を提
案している〔特願昭６３−７２７６６号明細書参照〕。

このような場合に、ニトリルヒドラターゼ活性の高いロ
ドコッカス属ロドクロウス種の細菌菌体が高収率で取得
できれば稗益するところは大きい。

〔発明の概要〕

要旨本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、該細
菌の培養に際して、培地中に特定の物質、すなわち尿素
およびコバルトイオン、を存在させることによって、こ
の目的を達成しようとするものである。

従って、本発明によるニトリルヒドラターゼ活性の高い
ロドコッカス属ロドクロウス種の細菌の培養方法は、ロ
ドコッカス属ロドクロウス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　）に属してニトリルヒドラ
ターゼを産生ずる能力を有する細菌を培養してニトリル
ヒドラターゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造するに際
し、培地中に尿素およびコバルトイオンを存在させるこ
と、を特徴とするものである。

効果培地中に尿素およびコバルトイオンを存在させてロドッ
コカッカス属ロドクロウス種の細菌の培養を行なうと、
単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性が極めて顕
著に増大する。

この単位培養液当りのトニリルヒドラターゼ活性の増大
は、菌体の濃度（すなわち、菌体の収量）および（また
は）菌体の活性（すなわち、菌体内のニトリルヒドラタ
ーゼの量）の増大に因るものと解される。

本発明において、尿素およびコバルトイオンの存在は特
に後者に有効である。

〔発明の詳細な説明〕

１、ロドコッカス属ロドクロウス種細菌本発明において
使用する細菌は、ニトリルヒドラターゼ活性を有し、ニ
トリル、特に芳香族ニトリル、を水和して対応アミドを
生成させることができるロドコッカス属ロドクロウス種
の細菌である。具体的には、例えば、前記特願昭６３−
７２７６６号明細書に記載のロドコッカス・ロドクロウ
スＪ−１株（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈ
ｒｏｕｓｊ−１）微工研条寄第１４７８号（ＦＥＲＮ　
ＢＰ−１４７８）を挙げることができる。この菌の詳細
は、前記特願昭６２−７２７６６号明細書に記載されて
いて、具体的には下記の通りである。

（１）由来および寄託Ｊ−１株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和６２年９月１８日に工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されて、ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１４７８号の受託番号を得ている。

（２）　　菌学的性質（ａ）形　態（１）細胞の形および大きさ（２）細胞の多形性の有無（３）運動性（４）胞子の有無（５）ダラム染色性（６）抗酸性（７）累乗小体（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養（２）肉汁寒天斜面培養（３）肉汁液体培養０．９〜１．０μ×３〜１０μ 培養初期に長稈状を呈し、提棒状で湾曲なくスナツピングを伴った発育を示し、のちに短桿菌状に断裂するなしなし陽性陰性認められる（３０℃）直径１ｍｍ（４８時間）円形、不規則、平滑で表面乾き
気味、扁平、不透明、淡オレンジピンク色糸状、表面平滑、断面はやや隆起状で乾き気味、淡オレンジピンク色菌膜を形成し、旺盛に発育する。生育するにしたがって、中程度の濁り、沈澱を生ずる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（５）リドマスミルク（ｃ）生理学的性質（１）硝酸塩の還元（２）脱窒反応（３）ＭＲテスト（４）ＶＰテスト（５）インドールの生成（６）硫化水素の生成（７）デンプンの加水分解（８）クエン酸の利用（９）無機窒素源の利用（１０）色素の生成（１１）ウレアーゼ（１２）オキシダーゼ表面に良く生育、穿刺部にそってロート状に発育するが、下層部にはほとんど発育しない。ゼラチンは、液化は認められない。

変化しない陽性陰性陰性陰性陽性陽性陰性コーサーの培地：陰　性クリステンセンの培地：陽　性硝酸塩：陽　性アンモニウム塩：陽　性陰性陽性陰性（１３）カタラーゼ　　　　　　陽　性（１４）セルロ
ースの加水分解　　陰　性（１５）生育の範囲　　　　
　　　ｐＨ：５〜１０温度：１０〜４１℃ （１６）酸素に対する態度　　　　好気性（１７）チロ
シンの分解　　　　陽　性（１８）アデニンの分解　　
　　　陽　性（１９）ホスファターゼ　　　　　陽　性
（２０）Ｔｗｅｅｎ８０加水分解　陽　性（２１）　Ｏ
−Ｆテスト　　　　　　Ｏ（弱い）（２２）耐熱性（１
０％スキムミルク中７２℃、１５分）なしく２３）糖から酸およびガスの生成Ｌ−アラビノースＤ−キシロースＤ−グルコースＤ−マンノースＤ−フラクトース麦芽糖酸の生成＋＋＋ガスの生成ショ糖乳糖トレハロースＤ−ソルビットＤ−マンニットグリセリン（２４）単一炭素源としての生育イノシトール麦芽糖Ｄ−マンニットラムノースＤ−ソルビットｍ−ハイドロキシ安息香酸アジピン酸ナトリウム安息香酸ナトリウムクエン酸ナトリウム乳酸ナトリウムテストテトロンＬ−チロシングリセール（１％）　（Ｗ／Ｖ）＋＋＋＋＋＋トレハロース　　　　　　　　（＋）（＋）弱いが陽性である。

（２５）脂肪酸と細胞壁分析　　　不飽和、飽和直鎖脂
肪酸、およびラベルクロステアリン酸を含む。ミコール酸のＴＬＣは単一スポットを与える。

以上の菌体的性質をバージ−の細菌分類書（Ｂｅｒｇｙ
’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ’　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）（１９８Ｂ）に基づいて
分類すると、Ｊ−１株は、好気性、グラム陽性、弱抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であり、
鞄毛を着生しない。また、発育の初期過程で長桿菌状で
菌糸状を呈し、枝分れ（Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　）を伴な
った発育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカ
ルデイア型の細菌に属するものと認められる。

脂肪酸組成の分析は、ラベルクロステアリン酸を含む不
飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のＴＬＣは
標準画Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
（ＩＦｏ　３３３８）と同じＲｆを示す単一スポットを
与えることから、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属とは区
別される。

またミコール酸の組成（炭素数）からＮｏｃａｒｄｉａ
属とは区別される。その他生化学的諸性質の検討から、
本菌はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｏｕｓ
と認められる。

２、尿素本発明において尿素は酵素誘導剤として作用するが、本
発明のようなニトリルヒドラターゼの誘導に尿素が有効
であることは、従来の知見からは全く意外なことである
。しかも、その効果が、特に尿素を他の酵素誘導剤と併
用せず単独に用いた場合、従来の酵素誘導剤に比べては
るかに高いことは驚くべきことである。また、尿素は他
の酵素誘導剤に比べて安価であるため、本発明を工業化
するに際して経済的に有利である。

尿素を培地中に存在させるには、これを培地に一時に、
あるいは逐次的に添加する。「逐次的」とは、連続的ま
たは間歇的いずれをも意味するものである。

３、コバルトイオン上記の酵素誘導剤である尿素を培地に存在させてもニト
リルヒドラターゼは得られないので、本発明では培地に
コバルトイオンを存在させることが必須である（本発明
の細菌のニトリルヒドラターゼの産生にコバルトイオン
の存在が必須であることは、前記特願昭６３−７２７６
６号明細書に記載の通りである）。

コバルトイオンは、培地が水性であるところより、水溶
性コバルト化合物を培地に添加することによって生成さ
せることがふつうである。水溶性のコバルト化合物は化
学辞典類の明らかにするところであり、適当なものを選
択使用することは当業者にとって容易であろう。代表的
なコバルト化合物は例えばＣｏ”＋またはｃｏ＋＋＋を
与えるもの、特に、ＣＯを移入るもの、であって、具体
的には塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭
化コバルト、硼酸コバルトを例示することができる。

この他、本発明ではビタミンＢ１２および金属コバルト
もコバルト源として使用することができる。

ビタミンＢ１２中にはコバルトが錯体として含まれてお
り、培養の際イオン化する。また、金属コバルトは培養
中機生物による酸化力でイオン化する。

４、培養／ニトリルヒドラターゼの産生本発明のロドコ
ッカス属ロドクロウス種細菌の培養は、培地に尿素およ
びコバルトイオンを存在させるということを除けば、他
の条件に関してはそれが合目的的なものである限り制限
はない。

例えば、下記のような基本培地に尿素およびコバルトイ
オンを所定量存在させて１５〜５０℃程度、好ましくは
２０〜４５℃程度、特に好ましくは３０℃前後、の温度
で、ｐＨ７〜９で、約３０時間以上、好ましくは４０時
間以上（上限は、例えば１２０時間）、培養を行なえば
よい。

培地中の尿素の濃度は１〜３０ｇ／リットル、好ましく
は２〜２０ｇ／リットル、より好ましくは５〜１５ｇ／
リットル、程度およびコバルトイオンの濃度はＣ。

トル程度である。

基本培地：培地Ａ成　　　　　分に２ＨＰＯ４Ｈ２ＰＯ４ａＣ１ＣＩ　２換算で５〜１５ｍｇ／リツ量（培地１リツトル中）１３．４ｇ６．５ｇ１．０ｇ０．２ｇ０．１ｍｌ残部（ｐＨ７，０）トル中）ＭｇＳ０　　・７Ｈ２０ビタミン混合物本１蒸留水零１組成ビオチンパントテン酸カルシウムイノシトールニコチン酸塩酸チアミン塩酸ピリドキシンｐ−アミノ安息香酸リボフラビン（溶液１リツ２、０ｇｇ０．４ｍｇ２．０＋ｎｇ０．４ｍｇ０．４ｍｇ０．４ｏ＋ｇ０．２ｎｇ０．２ｍｇ葉酸蒸留水培地Ｂ２ＨＰ０４Ｈ２ＰＯ４Ｍｇ５０　　・７Ｈ２０イーストエキス蒸留水培地Ｃグルコースに２ＨＰＯ４Ｈ２ＰＯ４Ｍｇ５Ｏ−７Ｈ２０イーストエキスペプトン蒸留水０．０１ｎｇ残部０、５ｇ０．５ｇ０、５ｇ３．０ｇ残部（ｐＨ７，２）０ｇ０．５０、５１．０７、５残部（ｐＨ７，２）５、実験例活性の測定および定義（１）ニトリルヒドラターゼ活性の測定法ニトリルヒド
ラターゼ活性は、基質としてベンゾニトリル（２０ｍＭ
）　　１．　０ｍｌ、３−シアノピリジン（ＩＭ）１．
０ｍｌまたはアクリロニトリル（ＩＭ）１．０ｍｌ、リ
ン酸カリウムバッファー（０，１Ｍ５ｐＨ７，０）０．
５ｍｉおよび所定量の菌体（培養液から分離したもの）
を含む反応混合液２ｍｌについて、２０℃で所定時間反
応を行なわせてから０．２ｍｌのＩＮ　　ＨＣＩを添加
して反応を停止させることによって測定した。

（２）活性の定義活性は、比活性（Ｓ、Ａ、）および全活性（Ｔ、Ａ、）
について調べた。これらは、下記の通り定義される。

Ｓ、　Ａ、　　：μモル各アミド／　ｍｇ−菌体・分子
、　Ａ、　　：μモル各アミド／ｍｌ−培地・分実施例
ＩＣｏ　Ｃ１２１０ｍｇ／リットルを含む前記基本培地Ｃ
に所定量の尿素を添加し、それぞれの培地６０ｍ１にロ
ドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＮ　ＢＰ−
１４７８）の前培養液（前記基本培地Ｃ使用）４ｍｌを
加えて、２８℃で９６時間振盪培養を行なった。

なお、比較のため、尿素またはＣｏ　Ｃ１２のみを添加
したものについても同様に培養を行なった。

結果を表−１に示した。

これより、尿素およびＣｏ　Ｃｌ　２両者の添加がニト
リルヒドラターゼの生産増大に必須であることが分かる
。

実施例２前記培地Ａ、ＢおよびＣについて、表−２に示すように
ＣｏＣ１゜および酵素誘導剤（尿素、アセトニトリル、
クロトンアミド）を所定量添加あるいは添加せずに、実
施例１と同様にしてＪ−１株の培養を２８℃で４８〜１
２０時間行なった。

表−２には、その間の活性の測定において、それぞれ最
高の全活性（Ｔ、　Ａ、　）が得られたときの数値を示
した。

これより、酵素誘導剤として尿素の単独使用がニトリル
ヒドラターゼの生産増大に極めて有効であることが分か
る。

＊活性測定に使用した基質（以下、同じ）事件の表示昭和年特許願第発明の名称細菌の培養法３　補正をする者事件との関係山　　川

Claims

【特許請求の範囲】１、ロドコッカス属ロドクロウス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）に
属してニトリルヒドラターゼを産生する能力を有する細
菌を培養してニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する細
菌菌体を製造するに際し、培地中に尿素およびコバルト
イオンを存在させることを特徴とする、ロドコッカス属
ロドクロウス種の細菌の培養法。２、ロドコッカス属ロドクロウス種に属してニトリルヒ
ドラターゼを産生する能力を有する細菌が、ロドコッカ
ス属ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭＢＰ−１４７８）
である、請求項１記載の細菌の培養法。３、培地中の尿素の濃度が１〜３０ｇ／リットルである
、請求項１〜２のいずれか１項記載の細菌の培養法。４、培地中のコバルトイオンの濃度がＣｏＣｌ＿２換算で５〜１５ｍｇ／リットルである、請
求項１〜３のいずれか１項記載の細菌の培養法。