DD298659A5 - Verfahren zum kultivieren von bakterien - Google Patents

Abstract

Zellen von Bakterien der Art Rhodococcus rhodochrous mit einer hohen Nitrilhydratase-Aktivitaet koennen erhalten werden in hoher Ausbeute durch Zusatz wenigstens einer der Verbindungen Harnstoff und dessen Derivate und Kobalt-Ionen zu einem Kulturmedium. Dies erfolgt bei der Praeparation von Bakterienzellen mit Nitrilhydratase-Aktivitaet durch Kultivieren von Rhodococcus rhodochrous-Bakterien, die in der Lage sind, Nitrilhydratase zu produzieren.{Zellen von Bakterien; Rhodococcus rhodochrous; Nitrilhydratase-Aktivitaet; Harnstoff; Kobalt-Ionen}

Description

worin R₅und R_ejeweils-H,-CH₃oder-C₂H₅sind; und

NH₂CSNH₂ III

und Kobalt-Ionen eingesetzt werden bei der Präparation von Bakterienzellen mit Nitrilhydrataseaktivität durch Kultivieren von Rhodococcus rhodochrous-Bakterien, die in der Lage sind, Nitrilhydratase zu produzieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Rhodococcus rhodochrous-Bakterium, das zur Produktion von Nitrilhydratase in der Lage ist, Rhodococcus rhodochrous Stamm J-1 (FERM BP-1478) ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Harnstoff zudem Kulturmedium hinzugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des gesamten Harnstoffs oder seiner Derivate in der Kultur 1 bis 30g/l beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Kobalt-Ionen 5 bis 15mg/l, bezogen auf CoCI₂, beträgt.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Produzieren von Zellen eines Mikroorganismus der Art Rhodococcus rhodochrous mit hoher Nitrilhydratase-Aktivität in hoher Ausbeute.

In den vergangenen Jahren sind in steigendem Maße Versuche unternommen worden, Mikroorganismen und Enzyme im Normalzustand oder im immobilisierten Zustand als Katalysatoren für verschiedene einfache oder komplexe chemische Reaktionen einzusetzen.

Von Hideaki Yamada, einem der Erfinder der vorliegenden Erfindung, sowie weiteren wurde festgestellt, daß Nitrilhydratase uls ein Enzym in der Lage ist, Nitrile zu hydrieren und man dabei zu den entsprechenden Amiden gelangt (Agric. Biol. Chem. 46,1165

Weiterhin wurde ein Verfahren zur Herstellung von Amiden vorgeschlagen, das insbesondere für die Herstellung von Amiden aus aromatischen Nitrilen geeignet ist (JP-Patentanmeldung Nr.231744/1988 und US-Patentanmeldung Ser. Nr. 243986). Bei dieser Situation würde ein Verfahren, das die Produktion von Zellen von Rhodococcus rhodochrous-Bakterien mit einer hohen Nitrilhydratase-Aktivität in hoher Ausbeute sichern kann, von bemerkenswertem Vorteil sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, das obige Problem zu lösen, indem zusätzliche spezielle Substanzen, d.h. Harnstoff oder dessen spezifische Derivate und Kobalt-Ionen zu oinem Kulturmedium bei der Kultivierung der Bakterien gegeben werden. Somit besteht das erfindungsgemäße Verfahren zur Kultivierung von Bakterien der Art Rhodococcus rhodochrous mit hoher Nitrilhydratase-Aktivität darin, zu einem Kulturmedium wenigstens eine der Verbindungen Harnstoff sowie Harnstoffderivate der folgenden Formeln I bis III zu geben:

R₁R₂NCONR₃R₄ I

worin Ri, R₂, R3 und R4 jeweils -H,-CH3 oder-C₂Hs sind, wobei nicht alle Substituenton -H sind;

R₅R₆NCOOC₂H₆ Il

wobei R₅ und R₆ jeweils-H,-CH₃ oder-C₂H₅ sind; und

NH₂CSNH₂ III

und Kobalt-Ionen bei der Präparation von Zellen von Bakterien zu geben, die eine Nitrilhydratase-Aktivität aufweisen, durch Kultivierung von Rhodococcus rhndochrous-Bakterien, die in der Lage sind, Nitrilhydratase zu produzieren. Die Zugabe von wenigstens einer der Verbindungen Harnstoff und spezielle Harnstoffderivate der Formeln I bis III und Kobalt-Ionen zum Kulturmedium während der Kultivierung von Rhodococcus rhodochrous-Bakterien steigert in bemerkenswertem Maße die Nitrilhydratase-Aktivität pro Einheit Kulturflüssigkeit.

Dieser Anstieg der Nitrilhydratase-Aktivität pro Einheit Kulturflüssigkeit ist vermutlich nachweisbar beim Anstieg der Zellkonzentration (d. h. Ausbeute) und/oder Zellaktivität (d. i. Ouantität der Nitrilhydralase in den Zellen). Bei der vorliegenden Erfindung ist die Zugabe von Harnstoff oder einem Derivat davon und Kobalt-Ionen spezifisch wirksam beim Anstieg der Zellaktivität.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung I. Rhodococcus rhodochrous-Bakterien

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Bakterien sind Rhodococcus rhodochrous-Bakterien, die Nitrilhydratase-Aktivität aufweisen und zur Nitrilhydrierung fähig sind, insbesondere gerade aromatische Nitrile, um die entsprechenden Amide zu produzieren. Ein spezifischos Beispiel solcher Bakterien ist Rhodococcus rhodochrous, Stamm J-1 (FERM BP-1478), offenbart in der JP-Patentanmeldung Nr. 231744/1988 und der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 243 986, auf die schon weiter oben hingewiesen wurde. Die Details zum Stamm J-1 sind in diesen Patentanmeldungen aufgeführt und sind die folgenden.

1. Herkunft und Hinterlegung

Der Stamm J-1 wurde durch die Erfinder aus Bodenproben aus Sakyo-ku, Kyoto, Japan isoliert und am 18. September 1987 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology beim Japanischen Ministerium für internationalen Handel und Industrie hinterlegt, wo es unter der Empfangsnummer FERM BP-1478 gemäß Budapester Vertrag registriert wurde.

2. Bakteriologische Merkmale

a) Morphologische Merkmale

(1) Form und Größe derZelle: 0,9-1,0 Mikrometer χ 3-10 Mikrometer

(2) Polymorphismus: Es wächst eine längliche, stäbchenförmige Zelle im Anfangsstadium der Kultivierung,

um einen geraden Stab mit Bruch zu bilden, der dann in eine kurze Bazillusform geteilt wird

(3) Motilität: immotil

(4) Sporenbildung: keine

(5) säurebeständige Eigenschaft: keine

(6) Kornfärbung: positiv

(7) heterophiler Granulocyt: beobachtet

b) Kulturmerkmale bet verschiedenen Kulturmedien (30X)

(1) Bouillon-Plattenkultur: Kreis mit 1 mm Durchmesser (48 Stunden), irregulär, glatt, ziemlich trocken an der

Oberfläche, flach, undurchsichtig und fahles Orangepink.

(2) Bouillon-Schrägkultur: Fäden mit glatter Oberfläche und leicht konvex, ziemlich trockener Querschnitt und

fahles Orangepink.

(3) Bouillon-Flüssigkultur: reichliches Wachstum mit Membranbildung. Die Kulturflüssigkeit wird vollständig trüb,

und mit zunehmendem Zell wachstum bildet sich ein Niederschlag.

(4) Bouillon-Gelierunpsstabkultur: gutes Wachstum an der Oberfläche einer trichterförmigen Bohrfläche, jedoch spärliches

Wachstum unter der Oberfläche. Gelatine wird nicht verflüssigt.

(5)Litmus-Milch: kei	neVeränderu
c) Physiologische Eigenschaften
(1) Reduktion von Nitrat	positiv
(2) Denitrifizierung	negativ
(3) MR-Test	negativ
(4) VP-Test	negativ
(5) Bildung von Indol	positiv
(6) Hydrogensulfidbildung	positiv
(7) Hydrolyse von Stärke	negativ
(8) Verwendung von Citronensäure:
Kocur-Kulturmedium	negativ
Ohristensen-Kulturmedium	positiv
(9) Verwendung von anorganischen
Stickstoffquellen:
Nitrat	positiv
Ammoniumsalz	positiv
(10) Bildung von Pigmenten	negativ
(11) Urease	positiv
(12) Oxidase	negativ
(13) Catalase	positiv

(14) Hydrolyse von Cellulose negativ

(15) Wachsturnsbereich pHBbisiO.TemperaturiO-^rc

(16) Verhalten gegen Sauerstoff aerobisch

(17) Zersetzung von Tyrosin positiv

(18) Zersetzung von Adenin positiv

(19) Phosphatase positiv

(20) Hydrolyse von Tween 80 positiv

(21) O-F-Test 0 (schwach)

(22) Wärmeresistenz (in 10%iger entrahmter Frischmilch bel72°Cfür15Minuten): keine

(23) Bildung von Säure und Gas aus Zuckern:

Saure Gas

L-Arabinose - -

D-Xylose - -

D-Glucose +

D-Mannose - -

D-Fructose +

Maltose + -

Saccharose +

Lactose - -

Trehalose - -

D-Sorbitol +

D-Mannitol +

Glycerol +

(24) Wachstum in einer einzelnen Kohlenstoffquelle:

Inositol -

Maltose +

D-Mannitol +

Rhamnose -

D-Sorbitol +

m-Hydroxybenzoesöure +

Natriumadipat +

Natriumbenzoat +

Natriumeitrat +

Natriumlactat +

Testotetron +

L-Tyrosin +

Glycerol (1 %) (Masse/Vol) (+)

Trehalose (+)

p-Hydroxybenzoesäure

(1 %)(Masse/Vol) +

(+): leicht positiv

(25) Analyse von Fettsäure und Zellwand:

Die Zelle enthält ungesättigte und gesättigte verzweigtkettige Fettsäuren und Tuberkulostearinsäure. Die TLC von mycolischer Säure gibt einen einzelnen Spot.

Entsprechend der Charakterisierung der oben aufgeführten bakteriologischen Eigenschaften unter Einbeziehung von Bergy, Manual der systematischen Bakteriologie (1986), ist der Stamm J-1 ein aerobischer, gram-positiver, schwach säurebeständiger, Catalase-positiver und keine Endosporen bildender Bazillus ohne Flagellum. Dieser Stamm liegt in Form eines länglichen Bazillus vor, und ein Mycel im anfänglichen Wachstumsstadium wächst unter Verzweigung und wird dann zu einer kurzen Bazillusform geteilt. Im Hinblick auf diese Merkmale ist der Stamm J-1 zum Typ des Nocardia-Bakteriums zu rechnen. Die Analyse der Fettsäurezusammensetzung hat ergeben, c*iß das Bakterium ungesättigte und gesättigte geradkettige Fettsäuren enthält, einschließlich der Tuberculostearinsäure. Da die TLC von Mycolsäure einen einzelnen Spot mit demselben R_t-Wert wie das Standardbakterium Rhodococcus rhodochrous (IFO 3338) ergab, ist das Bakterium verschieden von jenen der Gattung Mycobacterium. Dieses Bakterium ist auch verschieden von Nocardia-Bakterien im Hinblick auf die Zusammensetzung (Anzahl der Kohlenstoffatome) dec Mycolsäure.

Als Ergebnis der Einbeziehung anderer biochemischer Eigenschaften wurde dieses Bakterium als Rhodococcus rhodochrous identifiziert.

II. Harnstoff und dessen Derivate

In der vorliegenden Erfindung zeigen Harnstoff und Harnstoffderivate der oben erläuterten Formeln I bis III eine Funktion als Enzymerzeuger, wobei es allerdings nach den bisherigen Kenntnissen, nämlich daß typische Enzymerzeuger Nitrile oder Amide sind - unter anderem Crotonamid-völlig unerwartet war, daß Harnstoff und seine Derivate auf wirksame Weise Nitrilhydratase erzeugen können. Überraschenderweise zeigen Harnstoff und dessen Derivate, wenn sie allein und nicht in Kombination mit

anderen Enzymerzeugern eingesetzt werden, eins wesentlich höhere Wirksamkeit als übliche Enzymerzeuger. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahron industriell vom ökonomischen Standpunkt vorteilhaft angewandt werden, da Harnstoff wenigerteuer als andere ciu_rnerzeugei i-;t.

Beispiele für Verbindungen der Formel I bei den in der vorliegenden Erfindungen eingesetzten Harnstoffderivaten sind Methylharnstoff, Ethy !harnstoff, 1,1-Dimethy !harnstoff und 1,3-Dimethy !harnstoff.

Beispielhafte Verbindungen für solche der Formel Il sind Urethan und Methylurethan.

Die Verbindung der Formel III ist Thioharnstoff.

Harnstoff oder dessen Derivate werden zum Kulturmedium auf einmal zur gleichen Zeit oder nacheinander hinzugegeben. Der hier benutzte Begriff „nacheinander" bedeutet sowohl „kontinuierlich" als auch in „zunehmender Menge".

III. Kobalt-Ionen

Nitrilhydratase kann man nicht einfach durch Zusatz von Harnstoff oder dessen Derivaten zum Kulturmedium erhalten. Es ist wichtig, daß erfindungsgemäß dem Kulturmedium auch Kobalt-Ionen hinzugegeben werden (das Vorhandensein von Kobalt-Ionen ist für die Produktion von Nitrilhydratase durch das erfindungsgemäße Bakterium wesentlich, wie in der bereits vorher genannten JP-Patentanmeldung 231744/1988 und US-Patentanmeldung Ser. Nr.243986 ausgeführt). Gewöhnlich bilden sich Kobalt-Ionen bei Zusatz einer wasserlöslichen Kobaltverbindung zum Kulturmedium, das ein wäßriges ist. Die wasserlöslichen Kobalt-Verbindungen sind in chemischen Nachschlagewerken aufgeführt, so daß der Fachmann loicht die geeigneten auswählen kann und eine dieser Verbinungen einsetzen kann.

Typische Beispiele für Kobalt-Verbindungen sind solche, in denen Co²⁺ oder Co³⁺ auftritt, insbesondere Co²⁺, wie Kobaltchlorid, Kobaltsulfat, Kobaltacetat, Kobaltbromid und Kobaltborat.

Darüber hinaus können auch Vitamin Bu und metallisches Kobalt als Kobaltquellen verwendet werden. Vitamin Bi] enthält Kobalt in Form einer· Komplexes, der durch Autoklavenbehandlung ionisiert wird, während metallisches Kobalt durch die Oxydationsfunktioi, dor Mikroorganismen während der Kultivierung ionisiert wird.

IV. Kultivierung/Produktion von Nitrilhydratase

Das Rhodococcus rhodochrous-Bakterium der vorliegenden Erfindung kann unter beliebigen, für den vorliegenden Zweck geeigneten Bedingungen kultiviert werden, mit der Ausnahme, daß Harnstoff oder dessen Derivate und Kobalt-Ionen zum Kulturmedium hinzugegeben sind.

Beispielsweise werden vorher bestimmte Mengen an Harnstoff oder dessen Derivaten und Kobalt-Ionen zu dem unten aufgeführten Grundmedium hinzugesetzt. Die Kultivierung kann bei einer Temperatur von etwa 15 bis 50°C durchgeführt werden, vorzugsweise bei etwa 20 bis 45⁰C und insbesondere bei etwa 3O⁰C bei einem pH von 7 bis 9 über etwa 30 Stunden oder länger, vorzugsweise über 40 Stunden oder länger (bis zu beispielsweise 120 Stunden).

Die Gesamtkonzentration des Harnstoffs oder die von dessen Derivaten liegt bei etwa 1 bis 30g/l, vorzugsweise bei etwa 2 bis 20g/l und insbesondere bei etwa 5 bis 15g/l, während die Konzentration von Kobalt-Ionen etwa 5 bis 15mg/l beträgt, bezogen auf CoCI₂.

Grundmedium:	Menge (in einem Liter Medium)	* Zusammensetzung (in 11 Lösung)	2.0 ug
Kulturmedium A	13,4 g	Biotin	0,4 g
Komponente	6,5 g	Calciumpantothenat	2,0 g
K2HPO4	1,0g	Inositol	0,4 g
KH2PO4	0,2 g	Nikotinsäure	0,4 g
NaCI	0,1ml	Thlaminhydrochlorid	0,4 g
MgSO4-7 H2O	Ausgleich (pH 7,0)	Pyridoxinhydrochlorid	0,2 ng
Vitamingemisch·	p-Aminobenzoesäure	0,2 mg
Destilliertes Wasser	Riboflavin	0,01 ng
	Folsäure	Ausgleich
	destilliertes Wasser
Kulturmedium B	0,5 g
KHaPO4	0,5 g
K2HPO4	0,5 g
MgSO4-7 H2O	3,0 g
Hefeextrakt	Ausgleich (pH 7,2)
Destilliertes Wasser

Kulturmedium C	10g
Glukose	0,5 g
K2HPO*	0,5 g
KH2PO4	0,5 g
MgSO4-7H2O	1,0g
Hefeextrakt	7,5 g
Pepton	Ausgleich (pH 7,2)
destilliertes Wasser

V. Experimentelle Beispiele

Messung und Definition der Enzymaktivität

(1) Methode zur Messung der Nitrilhydratase-Aktivität

Die Nitrilhydratase-Aktivität wurde wie folgt bestimmt: 2 ml einer Reaktionslösung, die 1,0 ml Benzonitril (2OmM), 1,0 ml 3-Cyanpyridin (1 M) oder 1,0ml Acrylnitril (1 M) als ein Substrat; 0,5ml Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0); und eine vorher bestimmte Menge an Bakteriumzellen (isoliert aus einer Kühlflüssigkeit) enthielt, wurde bei 20°C für einen vorausbestimmten Zeitraum zur Reaktion gebracht. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,2 ml 1 N HCI beendet.

(2) Definition der Nitrilhydratase-Aktivität

Die Aktivität wurde bestimmt als spezifische Aktivität (S.A.) und als Gesamtaktivität (T. A.) wie weiter unten definiert.

S.A.: Mikromol Produktamid pro mg Zellen pro Minute

T.A.: Mikromol Produktamid pro ml Kulturmedium pro Minute

Beispiel 1

Vorher bestimmte Mengen an Harnstoff wurden jeweils zu dem oben aufgeführten Grundmedium C gegeben, das 10 mg/l CoCI₂ enthielt. Zu jeweils 60ml des erhaltenen Kulturmediums wurden 4ml einer Vorkulturflüssigkeit von Rhodococcuä rhodochrous, Stamm J-1 (FERM BP-1478) (erhalten unter Verwendung des Grundmediums C) gegeben und die Kultur bei 28°C über 96 Stunden geschüttelt.

Zu Vergleichszwecken wurde die Kultur in ähnlicher Weise in einem Medium gehalten, das entweder Harnstoff oder CoCI₂ allein enthielt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Aus der Tabelle ist zu entnehmen, daß die Zugabe von Harnstoff und CoCI₂ wesentlich ist für eine gesteigerte Produktion von Nitrilhydratase.

Beispiel 2

Stamm J-1 wurde Kulturbedingungen ähnlich wie im Beispiel 1 bei 28"C über 48 bis 120 Std. im Grundmedium C in Anwesenheit von 10 mg/l CoCI₂ unterworfen, während vorherbestimmte Mengen von Enzymerzeugern (Harnstoff und Crotonamid) hinzugegeben bzw. nicht hinzugegeben wurden (siehe Tabelle 2).

In Tabelle 2 sind T. A.- und S. A.-Werte aufgeführt, die während der Aktivitätsmessungen bei Auftreten der maximalen T. A.-Werte aufgezeichnet worden sind.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Verwendung von Harnstoff allein als Enzymerzeuger schon eine Wirksamkeit auf die erhöhte Produktion von Nitrilhydratase ausübt.

Tabelle 1

CoCI2	Harnstoff	(mg/l)	Zellkon	Harnstoff	Benzonitril	S.A.	3-Cyanpyridin	S.A.	Acrylnitril	S.A.
		10	zentration	(g/l)		0,02		0,16		0,70
(mg/l)	(g/l)	10	(mg/ml)	_	T. A.	0,02	T. A.	0,18	T. A.	0,78
0	0	10	4,61	-	0,11	0,21	0,75	0,70	3,59	3,35
0	7,5	10	5,53	-	0,11	4,87	1,00	7,66	4,31	36,5
10	0	10	5,28	5,0	1,09	13,0	3,70	32,2	17,7	154
10	2,0	5,17	7,5	25,2	42,1	39,6	104	189	497
10	5,0	5,03	65,6	39,4	162	99,7	774	477
10	7,5	4,99	210	44,9	519	121	2480	578
10	10	4,72	186	40,9	471	91,7	2250	438
10	15	4,26	191		515		2460
10	20	3,96	162	Crotonamid	363		1740
Tabelle 2				(g/l)		S.A.
Kulturmedium CoCI2		2,0	Benzonitril	6,0
		4,0	T. A.	6,1
C	7,5	23,2	5,8
C	2,0	24,6	6,5
C	-	16,6	42,2
C		32,6
C		213

Beispiel 3 Vorausbestimmte Mengen an Hai nstoffderivaten wurden jeweils zu dem oben aufgeführten Grundmedium C gegeben, das IOrr.g/1 CoCI₂ enthielt. Zu jev.eils 60ml des erhaltenen Kulturmediums wurden 4ml einer Vorkulturflüssigkeit des Rhodococcus

rhodochrous-Stammes J-1 (FERM BP-1478) (erhalten unter Verwendung des Grundmediums C) gegeben und bei 28°C für

96 Stunden eine Schüttelkultur angesetzt.

Zu Vergleichszwecken wurden in ähnliche! Weise eine Kultur in einem Medium angesetzt, die Methylharnstoff all :i«i oder CoCi]

allein enthielt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt, in der T. A,- und S. A.-Wertβ enthalten sind, die man erhielt bei Aufzeichnung der

maximalen T. A.-Werte während der Aktivitätsmessungen. In dieser Tabelle sind zum Vergleich die Ergebnisse genannt, die manfür 7,5g/l Harnstoff erhalten hatte. Aus der Tabelle ist ersichtlich, dtß sowohl die Verwendung von Harnstoffderivaten als auchdie von CoCI₂ für eine Steigerung der Nitrilhydrataseproduktion wesentlich ist.

Tabelle 3

CoCI2	Enzymerzeuger	Menge an	Zell	3-Cyanpyridin	S.A.
		Enzymerzeuger	konzentration		0
(mg/l)		(g/l)	(mg/ml)	T. A.	0,65
O	Methylharnstoff	7,5	4,78	0	40,2
10	-	0	4,94	3,20	42,5
10	Methylharnstoff	7,5	5,72	230	23,3
10	Ethylharnstoff	7,5	5,76	245	25,0
10	1,1-Dimethylharnstoff	7,5	6,44	150	26,8
10	1,3-Dimethylharnstof f	7,5	4,16	104	20,2
10	Methylharnstoff	7,5	6,19	166	104
10	Thioharnstoff	7,5	1,99	40,2
10	Harnstoff	7,5	4,99	519

Claims (1)

1. Verfahren zur Kultivierung von Bakterien der Art Rhodococcus rhodochrous, dadurch gekennzeichnet, daß zu einem Kulturmedium wenigstens eino der Verbindungen Harnstoff und Harnstoffderivate der Formeln I bis III

R₁R₂NCONR₃R₄ I

worin R₁, R₂, R3 und R₄JeWeUs-H₁-CH₃ oder-C₂H_Bsind und alle Substituenten nicht-H sein können;

RrR₆NCOOC₂H₅ Il