DE3110789A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-threonin - Google Patents
Verfahren zur fermentativen herstellung von l-threoninInfo
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Description
HOFFMANN · EITLI5 & PARTNER 3110789
DIPL.-ING. K. FOCHSLE ■ DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELIASTRASSE 4 · D-8000 M 0 N C H E N 81 . TE LE FON (089) »M087 · TELEX 05-29ί19 (PATH E)
34 790 o/fi
TANABE SEIYAKU Co.,Ltd. Osaka / Japan
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin
Die Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von L-Threonin.
Bei der fermentativen Herstellung von L-Threonin ist von den Mikroben, die nicht zum Genus Serratia gehören, bekannt,
Mutanten zu verwenden, die eine Aminosäure, die bei der L-Threonin-Biosynthese vorkommt, benötigen, oder die beständig
gegen einen Threonin-Metabolismus-Antagonisten sind (japanische Patentveröffentlichungen 26708/1970,
33195/1971, 34193/1971, 34194/1971 und 44876/1973). Von den Mikroben vom Genus Serratia ist auch bekannt,
Mutanten zu verwenden, die kein Threonin abbauendes Enzym haben, und die beständig gegenüber einem Threonin-Metabolismus-Antogonist
sind (japanische Patentveröffentlichung 48195/1977). Die üblichen Verfahren, bei denen
diese Mutanten verwendet werden, sind jedoch noch nicht befriedigend, große Mengen an L-Threonin zu bilden
und anzusammeln.
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Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren für die fermentative Herstellung
von L-Threonin zu zeigen. Diese Aufgabe und andere Ziele und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend
erläutert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin und ist dadurch
gekennzeichnet, daß man einen Methionin-Metabolismus-Antagonist-beständigen
Mutanten von Serratia marcescens mit einer L-Threonin-Produktivität in einer Brühe unter Bildung und Ansammlung von L-Threonin kultiviert,
und daß man das angesammelte L-Threonin aus der Brühe gewinnt. Man nimmt an, daß die Bildung und
Ansammlung von L-Threonin durch einen Methionin-Metabolismus-Antagonist-beständigen
Mutanten einer Mikrobe vom Genus Serratia gemäß der vorliegenden Erfindung
bisher noch nicht bekannt gewesen ist.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Mutanten haben die bakteriologischen Eigenschaften von Serratia
marcescens, wie sie in Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology 8th Edition, S. 326, beschrieben werden und weisen eine L-Threonin-Produktivität und eine Beständigkeit
gegenüber einem Methionin-Metabolismus-Antagonist auf (z.B. Ethionin, Norlcucin).
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Mutanten kann man
auch erhalten, indem man Mutationen in Elternstämmen, wie die bekannten L-Threonin-bildenden Mutanten von
Serratia marcescens, induziert. Beispiele für als Elternstämme geeignete Mutanten sind Mutanten, welche
Mutationseigenschaften aufweisen, wie die Notwendigkeit für verschiedene Aminosäure (z.B. Isoleucin, Lysin,
Methionin, Diaminopimelinsäure), eine Beständigkeit gegenüber Aminosäurenanalogen (z.B. Hydroxynorvalinr
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) , keine Threonin abbauenden Enzyme aufweisen (z.B. L-Threonin-Dehydrogenase,
L-Threonin-Deaminase) und dergleichen. Andere Mutanten, die keinen metabolistischen Einfluß auf die Threonin-Biosynthese
haben, beispielsweise eine "feedback"-Inhibierung von Threonin empfindlicher Aspartokinase und
Homoserin-Dehydrogenase, sind gleichfalls als Elternstämme geeignet. Besonders geeignete Beispiele der als
Elternstämme zu verwendenden bekannten Mutanten sind Serratia marcescens Stamm D-60, der keine Threonin abbauenden
Enzyme enthält (L-Threonin-Dehydrogenase und L-Threonin-Deaminiase) und der einen Isoleucin-Bedarf
aufweist (Journal of Baceriology, Band 135, Nr. 2, Seiten 318 - 323 (1978) ); Serratia marcescens Stamm
HNr53, der keine Threonin abbauenden Enzyme aufweist und ein Isoleucin-Bedürfnis und eine Hydroxynorvalin-Beständigkeit
aufweist (Applied and Environmental Microbiology, Band 35, Nr. 5, Seiten 834 - 840 (1978) );
Serratia marcescens Stamm AECr301, der keine Threonin abbauenden Enzyme enthält und ein Isoleucin-Bedürfnis
aufweist und sowohl Hydroxynorvalin- und S-2-AminoethyIcystein
beständig ist (ibid., Band 38, Nr. 5, Seiten 777 - 782 (1979) ); Serratia marcescens Stamm
T-570, der keine Threonin abbauenden Enzyme enthält und der ein Isoleucin-Bedürnis aufweist und Hydroxynorvalin-beständig
ist und keine "feedback"-Inhibierung von Threonin empfindlicher Aspartokinase und Homoserim-Dehydrogenase
aufweist (ibid. Band 38, Nr. 6, Seiten 1045 - 1051 (1979) ) .
Ein typisches Beispiel für einen erfindungsgemäß zu verwendenden
Mutanten ist Serratia marcescens Stamm Sr41-P-1O3. Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute,
Agency of Industrial Science and Technology, Japan (nachfolgend als FERM bezeichnet) am 25. Februar 1980
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unter der FERM-P No. 5413 und bei American Type Culture Collection,USA (nachfolgend als ATCC bezeichnet) am
10. Februar 1981 unter ATCC No. 31809 hinterlegt. Dieser
Mutant wurde aus Serratia marcescens Stamm AECr301 erhalten und ist beständig gegenüber Ethionin, einem
der Methionin-Metabolismus-Antogonisten.
Andere von den obigen bekannten L-Threonin bildenden Mutanten durch übliche Mutagenisierungsbehandlung
erhaltene Mutanten können erfindungsgemäß verwendet werden. Beispielsweise kann man einen Mutanten verwenden,
der erhalten wurde durch Bestrahlen des bekannten Mutanten mit Ultraviolettlicht oder durch Behandeln des Mutanten
mit einem Mutagen (z.B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin,
Ethylmethansulfonat) unter Ausbildung einer Beständigkeit gegenüber Methionin-Metabolismus-Antagonist,
worauf man den erhaltenen Mutanten bei 300C 2 bis 4 Tage auf Agarplatten (z.B. solchen mit Davis's Minimum-Medium)
, denen 1 bis 20 mg/ml eines Methionin-Metabolismus-Antagonist
zugegeben wurde, kultiviert und dann die entstandenen großen Kolonien zur Gewinnung des gewünschten
Mutanten herausnimmt. Genauer gesagt wird der gewünschte Ethionin-beständige Mutant wie folgt hergestellt:
Die Zellen des Elternstammes werden mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
nach dem von Adelberg et al in Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 18, Seiten
788 - 795 beschriebenen Verfahren zur Einleitung einer Mutation in den Zellen behandelt. Die erhaltenen Zellen
werden über Agarplatten mit einem Minimalmedium, enthaltend Glukose (0,5 w/v %), (NH4J2SO4 (0,1 w/v %),
KH2PO4 (0,3 w/v %) , K2HPO4 (O,7 w/v %), MgSO4-7H2O
(0,01 w/v %) und Isoleucin (0,01 w/v %), zu dem DL-Ethionin 10 mg/ml zugegeben wurden, verteilt und
die Platten werden 4 Tage bei 30° C inkubiert. Die
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erhaltenen großen Kolonien werden dann aufgenommen und der gewünschte Ethionin-beständige Mutant isoliert.
Erforderlichenfalls kann man die obigen Eigenschaften,
die das Aminosäure-Bedürfnis, die Beständigkeit gegenüber Aminosäure-Analogen oder der Mangel an einer Metabolismus-Beeinflussung
der Threonin-Biosynthese den so erhaltenen Mutanten verleihen, indem man übliche Mutagenisierungsbehandlungen
oder Umwandlungstechniken vornimmt. Die derart erhaltenen Mutanten können gleichfalls erfindungsgemäß
verwendet werden.
Die für die Herstellung von L-Threonin gemäß der Erfindung zu verwendenden Brühen enthalten vorzugsweise
10 bis 20 w/v % einer Kohlenstoffquelle, wie Saccharide
(z.B. Glukose, Saccharose oder Melasse), organische Säuren (z.B. Fumarsäure, Zitronensäure), Alkohole
(z.B. Glyzerin) sowie 1 bis 2 w/v % einer Stickstoffquelle wie organische Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumacetat),
anorganische Ammoniumsalze (Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid)
, Harnstoff und dergleichen und 0 bis 1 w/v % eines organischen Nährmittels, wie Maismaische, Pepton,
Hefeextrakt und dergleichen. Weiterhin kann eine geringe Menge an Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat und dergleichen
zu der Brühe gegeben werden. Kalziumkarbonat oder, sofern erforderlich, Ammoniak kann auch zu der Brühe gegeben
werden, um den pH bei 6 bis 8 zu halten. Weiterhin kann man gewünschtenfalls zu der Brühe eine Substanz, die
bei der Threonin-Biosynthese vorkommt, wie L-Asparginsäure, L-Homoserin, L-Lysin, L-Methionin, L-Isoleucin
und dergleichen zugeben.
Erfindungsgemäß werden große Mengen an L-Threonin in
der Brühe angesammelt, indem man den obigen Methionin-
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Metabolismus-Antagonist-beständigen Mutanten in die Brühe inokuliert und 2 bis 6 Tage unter Bedingungen,
bei denen Sauerstoff ausreichend zur Verfügung steht, z.B. unter heftigem Schütteln, bei 25 bis 320C inkubiert.
Nach Beendigung der Fermentierung bildet sich L-Threonin und sammelt sich in der Brühe an. L-Threonin
kann dann einfach aus der Kulturbrühe durch einfaches Abtrennen isoliert und durch übliche Reinigungsverfahren,
z.B. unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, gereinigt werden.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.
Eine Brühe (pH 7,0, 15 ml) enthaltend Saccharose
> (17,5 w/v %), K3HPO4 (0,1 w/v %), MgSO4-7H2O (0,1 w/v %),
(NH4J3SO4 (0,05 w/v %), Harnstoff (1,75 w/v %),
Ί Maismaische (0,1 w/v %), L-Methionin (0,1 w/v %) und
Kalziumkarbonat (1 w/v %) wurde in einen 500 ml Schüttelkolben eingefüllt und durch Autokiavisieren sterilisiert
(Saccharose und L-Methionin wurden getrennt sterilisiert und aseptisch in die Brühe eingebracht).
Getrennt wurde Serratia marcescens Stamm Sr41-P-iO3
(FERM-P No. 5413, ATCC No. 3Ί8Ο9) 20 Stunden bei
30°C in einer Brühe, die Saccharose (12,5 w/v %) ,
K2IiPO4 (0,1 w/v %) , MgSO4-7H2O (0,1 w/v %) , (NH4J2SO4
(0,05 w/v %), Harnstoff (1,5 w/v %), Maismaische
(0,1 w/v %), L-Methionin (0,1 w/v %) und Kalziumkarbonat
(1 w/v %) inkubiert und als Irnkulum verwendet.
Die Kultur des Stammes Sr41-P-1O3 (0,5 ml) wurde in die vorerwähnte Brühe inokuliert und 120 Stunden unter
Schütteln (140 Umdrehungen pro Minute mit einem Schlag von 7 cm) bei 300C inkubiert. Nach dem Inkubieren
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sammelte sich L-Threonin in einer Konzentration von
45,4 mg/ml in der Brühe an (L-Threonin wurde durch Ninhydrinreaktion auf einem Papierchromatogramm der
Brühe nachgewiesen und wurde durch Bioassay unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides Stamm P-60
bestimmt).
Die erhaltene Brühe (1 Liter) wurde gesammelt, erwärmt und filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Säule aus
Ionenaustauschharz in der Η-Form (Amberlite IR-120)
zum Adsorbieren von L-Threonin geschickt. Die Säule wurde dann mit Wasser gewaschen und mit 5 %-igem wäßrigen
Ammoniak eluiert. Die !.-Threonin enthaltende Fraktion
wurde gesammelt, unter vermindertem Druck konzentriert, mit Holzkohle behandelt und dann filtriert. Methanol
wurde zu dem Filtrat gegeben und die erhaltenen Rohkristalle wurden aus wäßrigem Methanol umkristallisiert,
wobei man 35 g L-Threonin erhielt. Wenn man Serratia marcescens Stamm AECr3O1 für Vergleichszwecke unter den
gleichen Bedingungen kultivierte, sammelte sich L-Threonin in einer Konzentration von 9,0 mg/ml in der Brühe
an.
REFERENZ-BEISPIEL
Jeder der in der folgenden Tabelle 1 gezeigten Stämme wurde 20 Minuten auf Nähragar-Schrägkulturen kultiviert
und die darauf gebildeten Zellen wurden geerntet und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen
wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und in ein Minimalmedium (3 ml) mit folgender Zusammensetzung:
Glukose 0,5 w/v %, (NH4J2SO4, 0,1 w/v %; KH2PO4, 0,3 w/v %
K2HPO4, 0,7 w/v %; MgSO4·7Η2Ο, 0,01 2w/v % und L-Isoleucin,
0,01 w/v %, dem DL-Ethionin in einer Konzentration von 0, 1 oder 10 mg/ml zugesetzt worden war, inokuliert
und 20 Stunden bei 30°C inkubiert. Das Wachstum jedes
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einzelnen Stammes wurde beobachtet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Aus Tabelle 1 geht hervor, daß das Wachstum von Serratia marcescens Stamm Sr41-P-1O3 (FERM-P No. 5413, ATCC No.
31809) gemäß der Erfindung in keinem Fall in Gegenwart von Ethionin in hoher Konzentration inhibiert wurde.
Dies zeigt, daß der Stamm eine hohe Ethionin-Resistenz hatte.
Relatives Wachstum (%)*
Stamm | DL-Ethionin-Konzentration (mg/ml) |
1 | 10 |
Serratia marcescens AECr301 |
0 | 24 | 5 |
Serratia marcescens Sr41-P-1O3 |
100 | 103 | 107 |
100 |
Das relative Wachstum (%) wird ausgedrückt,indem
man die Absorption der einzelnen Brühen bei 6 60 nrn nach der Kultivierung bestimmt und hinsichtlich
eines jeden Stammes das Verhältnis der Absorption der Brühe, enthaltend DL-Ethionin zu einer kein
DL-Ethionin enthaltenden Brühe, wobei letztere mit 100 % eingesetzt wird, bestimmt.
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Claims (7)
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin/ dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Methionin-Metabolismus-Antagonist-beständigen Mutanten von Serratia marcescens mit L-Threonin-Produktivität
in einer Brühe kultiviert und L-Threonin darin ansammelt und das angesammelte L-Threonin aus der Brühe
gewinnt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Methionin-Metabolismus-Antagonist-beständige
Mutant Serratia marcescens Stamm Sr41-P-iO3 (Ferm-P No. 5413, ATCC No. 31809) ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Kultivierung
beim pH 6 bis 8 durchgeführt wird.
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4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet , daß die Kultivierung bei 25 bis 370C durchgeführt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet , daß die Kultivierung unter Bedingungen, bei denen eine gute Sauerstoffzufuhr
erfolgt, durchgeführt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet , daß die Brühe 10 bis 20 w/v % einer Kohlenstoffquelle, 1 bis 2 w/v %
einer Stickstoffquelle und 0 bis 1 w/v % eines organischen Nährmittels enthält.
7. Verfahren zur fermentativen Herstellung von
L-Threonin, dadurch gekennzeichnet,
daß man Serratia mearcescens Stamm Sr41-P-1o3 (FERM-P No. 5413, ATCC No. 31809) bei 25 bis 370C 2 bis 6 Tage
in einer Brühe, enthaltend 10 bis 20 w/v % einer Kchlenstoffquelle,
1 bis 2 w/v % einer Stickstoffquelle und 0 bis 1 w/v % eines organischen Nährmittels bei einem
pH von 6 bis 8 unter Bedingungen, bei denen eine gute Sauerstoffzufuhr erfolgt, kultiviert und L-Threonin
darin bildet und ansammelt und daß man das angesammelte L-Threonin aus der Brühe gewinnt.
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8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
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8364 | No opposition during term of opposition | ||
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