DE69620820T2

DE69620820T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin durch Fermentation und L-Homoserine als einzige Stickstoffquelle

Info

Publication number: DE69620820T2
Application number: DE69620820T
Authority: DE
Inventors: Masato Ikeda; Kuniki Kino; Yasuichiro Suga
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2016-05-31
Also published as: EP0745679B1; US5695972A; ATE216725T1; CA2177785C; EP0745679A1; JPH08322583A; JP3717970B2; DE69620820D1; CA2177785A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, wobei ein Fermentationsprozess verwendet wird. L-Isoleucin ist eine Aminosäure, welche hinsichtlich der Ernährung, sowohl beim Menschen wie auch bei Tieren, eine wichtige Rolle spielt, und wird als Arzneimittel, Nahrungsmittel, Futterzusatz und ähnliches verwendet.
Da Isoleucin vier optische Isomere besitzt, ist es sehr schwierig L-Isoleucin ausschließlich durch chemische Synthese oder durch eine Kombination von chemischer Synthese und enzymatischer Reaktion wirtschaftlich herzustellen. Deshalb wird die industrielle Herstellung von L-Isoleucin hauptsächlich durch einen Fermentationsprozess durchgeführt. Als Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, unter Verwendung eines Fermentationsprozesses, sind Vorstufen- Zugabe-Verfahren bekannt, wobei Vorstufen von L-Isoleucin wie DL-α-Aminobuttersäure, α-Ketobuttersäure und Threonin zu einem Fermentationsmedium oder zu einem mikrobiellen Reaktionssystem zugegeben und in L-Isoleucin umgewandelt werden (Japanische überprüfte Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 580660, 527566, 643776, etc.). Die vorstehend erwähnten Verfahren sind jedoch nicht vorteilhaft für die industrielle Herstellung, weil teure Ausgangsmaterialien erforderlich sind und nur geringe Ausbeuten (Erträge) erzielt werden.
Andererseits, als direkte Fermentationsverfahren, wobei L- Isoleucin direkt aus Zucker hergestellt und in einer Kulturbrühe angereichert wird, gibt es bekannte Verfahren, welche Mutanten verwenden, die aus Wildtyp-Stämmen von Mikroorganismen induziert wurden, die zu den Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Serratia, Arthrobacter und ähnlichen gehören. L-Isoleucin produzierende Mutanten beinhalten z. B. auxotrophe Stämme, welche Aminosäuren oder Nucleinsäuren benötigen (Japanische geprüfte Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 580660 und 1574935), Stämme, welche eine Resistenz-Mutation für Aminosäure-Analoge, Vitamine und ähnliches haben (Japanische geprüfte Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 845852, 1696479, 1696480; Japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 880308 und 130882/93), Stämme, welche sowohl eine auxotrophe Mutation als auch eine Aminosäure-Analog- Resistenzmutation haben (Japanische geprüfte Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 830432 und 1083787), Stämme, welche eine Mutation für Fluorpylvinsäure-Sensitivität haben (Japanische geprüfte Patentveröffentlichung - Nr. 1574934), Stämme mit einer verstärkten Fähigkeit unter Verwendung von L-Asparaginsäure als die einzige Stickstoffquelle zu wachsen (Japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 1765412), oder Stämme, welche eine Mutation für eine erniedrigte Substrataffinität für die Aminoacyl-t-RNA-Synthetase haben (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 330275/92). Darüber hinaus sind auch Transformanten bekannt, welche unter Verwendung von rekombinanten DNAs, einschließlich derjenigen Gene, die an der Biosynthese von Isoleucin oder Threonin beteiligt sind, hergestellt wurden (Japanische überprüfte Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 1686419, 1840487, 1994519, 1848236, 2536570 und 2748418). EP-A-0 595163, EP-A- 0557996, EP-A-0542487, FR-A-2003908, US-A-3 262861 und DE-A- 1910427 offenbaren Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin durch Fermentation, welche die Züchtung eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Escherichia gehört, umfassen, wobei die verwendeten Escherichia-Stämme spezifische Medien mit unterschiedlichen Stickstoffquellen für die Herstellung von L- Isoleucin benötigen.
In der letzten Zeit hat die Nachfrage nach der Verwendung von L-Isoleucin in Arzneimitteln, Lebensmitteln, Nahrungsmittelzusätzen und usw. zugenommen. Aus diesem Grund besteht der nachhaltige Wunsch, Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin zu verbessern. Demgemäß ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein industriell leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin bereitzustellen, welches als Arzneimittel, Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz verwendet werden kann.
Mikroorganismen, welche zu der Gattung Escherichia gehören, können in einem Medium, welches L-Homoserin als einzige Stickstoffquelle enthält, gar nicht oder nur sehr schlecht wachsen. Bis heute ist kein Verfahren zur Produktion von L-Isoleucin bekannt, bei welchem ein Mikroorganismus, der zu der Gattung Escherichia gehört, verwendet wird, welcher die Fähigkeit erworben hat in dem vorstehend erwähnten Medium schnell zu wachsen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, umfassend: Auswählen eines Mikroorganismus aus der Art Escherichia coli auf einem Agarmedium, bestehend aus 0,5% Glucose, 0,02% L-Homoserin, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/l Calciumchlorid und 2% Agar mit einem pH-Wert von 7,2, mit der Maßgabe, dass, wenn der Mikroorganismus auxotroph ist, die erforderliche auxotrophe Verbindung dem Agarmedium zugesetzt wird, welcher Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 0,6 mm bildet, wenn er 3 bis 7 Tage bei 30-35ºC gezüchtet wird; seine Züchtung in einem Nährmedium; Produzieren und Anreichern von L-Isoleucin in dem Nährmedium unter Verwendung des Mikroorganismus; und Gewinnen von L-Isoleucin daraus. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus der Art Escherichia coli, welcher fähig ist, auf einem Agarmedium zu wachsen, welches aus 0,5% Glucose, 0,02% L-Homoserin, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/l Calciumchlorid und 2% Agar besteht, mit einem pH-Wert von 7,2, mit der Maßgabe, dass, wenn der Mikroorganismus auxotroph ist, die erforderliche auxotrophe Verbindung dem Agarmedium zugesetzt wird, wobei Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 0,6 mm gebildet werden, wenn dieser 3 bis 7 Tage bei 30- 35ºC gezüchtet wird, und die Fähigkeit zur Produktion von L- Isoleucin in einem Nährmedium besitzt. Hierin nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in Einzelheiten beschrieben.
Als ein Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, solange er zu der Art Escherichia coli gehört und in einem Medium wachsen kann, welches L-Homoserin als einzige Stickstoffquelle enthält. Genauer kann solch ein Mikroorganismus, welcher zu der Art Escherichia coli gehört, verwendet werden, welcher Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 0, 6 mm auf dem nachstehend beschriebenen L-Homoserin-Minimalagar-Plattenmedium ausbildet, wenn er 3 bis 7 Tage bei 30-35ºC gezüchtet wird. Das vorstehend erwähnte "L-Homoserin-Minimalagar-Plattenmedium" wird erhalten, indem Agar zu einem modifizierten Minimalmedium (hierin nachfolgend als "L-Homoserin-Minimalmedium" bezeichnet) gegeben wird, in welchem die Stickstoffquellen mit L-Homoserin ersetzt wurden, und welches L-Homoserin in einer Konzentration von 0,01 - 0,1% als die einzige Stickstoffquelle enthält. Beispiele für solche Mikroorganismen beinhalten Escherichia coli H-9146 und H-9156. Der erfindungsgemäße L- Isoleucin produzierende Stamm kann aus denjenigen Mikroorganismen ausgewählt werden, welche auf dem L-Homoserin- Minimalagar-Plattenmedium schneller wachsen als die Elternstämme. Mikroorganismen, welche solche Eigenschaften besitzen, können unter Verwendung bekannter mutagenisierender Behandlungen, Zellfusion, Transduktion, oder anderen Gen- Rekombinationstechniken erhalten werden. Zusätzlich können diese Mikroorganismen auch andere Eigenschaften besitzen, welche die L-Isoleucin-Produktivität verbessern, wie Auxotrophie, Wirkstoffresistenz und Wirkstoffsensitivität.
Die Herstellung von L-Isoleucin unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus kann nach herkömmlichen Verfahren zur Bakterienzüchtung durchgeführt werden. Als das verwendete Medium kann jedes synthetische oder natürliche Medium verwendet werden, solange es in angemessener Weise Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und Spuren anderer Nährstoffe, welche für den jeweils verwendeten Stamm erforderlich sind, enthält.
Als Kohlenstoffquelle können Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose, Molassen, Cellulose- Hydrolysate, Zucker-Roh-Hydrolysate, Stärke-Hydrolysate; organische Säuren wie Brenztraubensäure, Essigsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure und Milchsäure; und Alkohole wie Glycerin, Propanol und Ethanol, verwendet werden. Als Stickstoffquelle können Ammoniak, Ammoniumsalze von unterschiedlichen anorganischen Säuren und organischen Säuren wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat; andere Stickstoff-enthaltende Verbindungen; Amine, Pepton, Fleisch-Extrakt, Hefe-Extrakt, Trypton, Maisquellwasser, Casein-Hydrolysate, Sojabohnen-Kuchen, Sojabohnen-Kuchen-Hydrolysate, unterschiedliche kultivierte Zellen von Mikroorganismen, deren verdaute Produkte, etc. verwendet werden.
Als anorganische Verbindungen können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, etc. verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wird unter aeroben Bedingungen durch Schüttelkultur, submers-belüftete, gerührte Kultur oder auf ähnliche Art und Weise bei 20-40ºC, vorzugsweise bei 28-37ºC gezüchtet. Der pH-Bereich des Mediums liegt zwischen 5 und 9. Vorzugsweise wird er nahezu neutral erhalten. Die Einstellung des pH-Wertes wird mit Calciumcarbonat, anorganischen oder organischen Säuren, alkalischen Lösungen, Ammoniak, einer pH-puffernden Lösung, etc. durchgeführt. Gewöhnlich wird L-Isoleucin durch eine 1 bis 7-Tage-Kultur hergestellt und in der Kultur angereichert. Nach Vervollständigung der Züchtung werden Präzipitate wie Zellen durch Zentrifugation etc. aus der Kultur entfernt. Durch Verwendung einer Kombination von Ionenaustausch- Behandlung, Konzentration, Aussalzen oder ähnlichem kann L- Isoleucin aus dem Überstand gewonnen werden. Erfindungsgemäß wird L-Isoleucin leistungsfähig industriell produziert.
Mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung im Nachfolgenden ausführlicher beschrieben.

Beispiel 1 Erwerb L-Isoleucin produzierender Mutanten, welche in der Lage sind, in dem L-Homoserin-Minimalmedium schnell zu wachsen.

L-Isoleucin produzierende Mutanten, welche in der Lage sind, in dem L-Homoserin-Minimalmedium schnell zu wachsen, wurden aus 2 Elternstämmen induziert. Kurz, als die Elternstämme wurden der nicht-Aminosäure produzierende Stamm Escherichia coli ATCC 11105 [J. Bacteriol., 60, 17 (1950)], welcher keine mutagenisierende Behandlung erhalten hat, um seine Aminosäure-Produktivität zu verbessern, und welcher keine nachweisbare Menge an Aminosäuren in der Kultur produziert, und der L-Isoleucin produzierende Stamm Escherichia coli H-8683 (FERM BP-4052) verwendet.
Beide Stämme, sowohl ATCC 11105 als auch H-8683, wurden nach bekannten Verfahren mit N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin (0,5 mg/ml) als ein Mutagen bei 33ºC für 30 Minuten behandelt. Dann wurden die behandelten Stämme auf dem L-Homoserin-Minimalagar-Plattenmedium (pH 7,2) (0,5% Glucose, 0,02% L-Homoserin, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/l Calciumchlorid und 2% Agar), ergänzt mit 20 mg/l DL-Methionin, welches eine auxotrophe Aminosäure ist, ausplattiert. Die Zellen wurden bei 33ºC für 4-7 Tage inkubiert und große gewachsene Kolonien wurden als Mutanten abgetrennt, welche die Fähigkeit erworben haben, in einem Medium, welches L-Homoserin als die einzige Stickstoffquelle enthält, schnell zu wachsen.
Diejenigen Mutanten, welche von ATCC 11105 induziert worden waren, wurden einem L-Isoleucin-Produktionstest unterzogen, welcher gemäß dem nachfolgend beschriebenen Biotest durchgeführt wurde. In sieben Stämmen von den 100 Mutanten, die getestet wurden, wurde ein kreisförmiger Wachstumsbereich (Hof) (welcher durch das Wachstum des CGSC3516-Stamms erzeugt wurde und welcher die Produktion von L-Isoleucin zeigt) beobachtet. Aus diesen Hof bildenden Mutanten wurde diejenige Mutante ausgewählt, welche den größten Hof bildete, und als Escherichia coli H-9146 bezeichnet.

[L-Isoleucin-Produktionsnachweis durch Biotest]

Das L-Isoleucin-Auxotroph, Escherichia coli CGSC3516 (ilvE316, trp-3, his-4, thi-1) [J. Bacteriol., 98, 1179 (1969)], wurde für 24 Stunden in einem natürlichen Medium (pH 7,2) (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) gezüchtet. Die Zellen wurden zentrifugiert und dann mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Diese Arbeitsschritte wurden zweimal wiederholt. Danach wurden die Zellen für den Produktionsnachweis mit einem Agarmedium vermischt (0,5% Glucose, 0,2% Ammoniumchlorid, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/l Calciumchlorid, 20 mg/l L-Valin, L-Leucin, L-Tryptophan, L- Histidin und DL-Methionin, 1 mg/l Thiaminchloridsalz und 2% Agar) (pH 7,2), um ein Plattenmedium herzustellen, welches den CGSC3516-Stamm in einer Endkonzentration von 106 Zellen pro ml enthält. Ein Stamm, der auf seine L-Isoleucin-Produktivität getestet werden sollte, wurde auf diesem Plattenmedium ausplattiert und dann für einen Tag bei 33ºC gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die L-Isoleucin-Produktivität auf der Grundlage der Größe der kreisförmigen Wachstumszone, die sich durch den CGSC3516-Stamm um den Test-Stamm herum gebildet hat, ausgewertet. Andererseits wurden die Mutantenstämme, welche von dem L-Isoleucin produzierenden Stamm A-8683 induziert wurden, einem L-Isoleucin-Produktionstest unterzogen, welcher auf ähnliche Art und Weise durchgeführt wurde (unter Verwendung eines dicken Teströhrchens) wie diejenige, die im Beispiel 3 beschrieben ist. 100 Mutanten wurden getestet und als Ergebnis zeigten etwa 8% der Mutanten im Vergleich zu dem Ausgangsstamm eine verstärkte L-Isoleucin-Produktivität. Aus diesen Mutantenstämmen wurde diejenige Mutante ausgewählt, welche die größte Menge an L-Isoleucin produzierte und als Escherichia coli H-9156 bezeichnet.
Beide Escherichia coli-Stämme, H-9146 und H-9156, wurden mit den Hinterlegungsnummern FERM BP-5055 bzw. FERM BP-5056 nach den Richtlinien des Budapester Vertrages bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, am 28. März 1996 hinterlegt.

Beispiel 2 Vergleichender Wachstumstest auf dem L- Homoserin-Minimalagar-Plattenmedium

Die zwei Mutanten H-9146 und H-9156, welche im Beispiel 1 erhalten wurden, und die entsprechenden Ausgangsstämme ATCC 11105 und H-8633 wurden einem kompetitiven Wachstumstest auf (20 mg/l Methionin enthaltendem) L-Homoserin-Minimalagar- Plattenmedium, welches in Beispiel 1 beschrieben wurde, unterzogen, wobei das Medium L-Homoserin als die einzige Stickstoffquelle enthielt. Jeder dieser vier Stämme wurde für 24 Stunden auf dem natürlichen Medium gezüchtet. Danach wurde jeder Stamm in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde auf dem Agar-Plattenmedium in einer Konzentration von 1 bis 10 Zellen/cm² ausplattiert und für 5 Tage bei 33ºC inkubiert. Dann wurde das Wachstum jedes Stammes auf der Grundlage der Größen der gebildeten Kolonien verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beide Ausgangsstämme, ATCC 11105 und H-8683, wuchsen sehr schlecht auf dem vorstehend erwähnten L-Homoserin-Minimalagar- Plattenmedium, welches L-Homoserin als die einzige Stickstoffquelle enthielt, und bildeten nur Kolonien aus, die kleiner als 0,5 mm im Durchmesser waren. Sowohl H-9146 als auch H-9156 bildeten jedoch klare Kolonien auf dem gleichen Agar-Platten-Medium, welche größer als 1 mm im Durchmesser waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die beiden Mutantenstämme H-9146 und H-9156 die Fähigkeit erworben haben, unter Verwendung von L-Homoserin als die einzige Stickstoffquelle, schnell zu wachsen. Tabelle 1
++; sehr gutes Wachstum, Koloniegröße 3 mm
+; gutes Wachstum, 1 mm Koloniegröße 3 mm
±; schlechtes Wachstum, Koloniegröße 0,5 mm
kein Wachstum, keine Koloniebildung

Beispiel 3 L-Isoleucin-Produktionstest

Ein L-Isoleucin-Produktionstest wurde mit den beiden Mutanten H-9146 und H-9156, welche beide im Beispiel 1 erhalten wurden, und ihren Ausgangsstämmen ATCC 11105 und H- 8683 wie folgt durchgeführt.
Jeder dieser vier Stämme wurde in ein dickes Teströhrchen überimpft, welches 6 ml eines Aussaat-Kulturmediums (2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,25% NaCl, 130 mg/l DL- Methionin und 1% Calciumcarbonat) (pH 7,0) enthielt und für 16 Stunden unter Schütteln bei 3 0ºC gezüchtet. 1/10 ml jeder c 0,2% Maisquellwasser, 1,6% Ammoniumsulfat, - 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 100 mg/l DL-Methionin, 4% Magnesiumphosphat und 1% Calciumcarbonat) (pH 7,0) überimpft und dann für 48 Stunden unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet. Danach wurde die Menge an L-Isoleucin, die sich in der Kultur angereichert hatte, durch HPLC bestimmt.
Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Mutante H-9146, welche von dem nicht-Aminosäure produzierenden Stamm ATCC 11105 induziert wurde, zeigte, dass sie die Fähigkeit erworben hat, eine außerhalb der Zellen in der Kulturbrühe nachweisbare Menge von L-Isoleucin herzustellen. Eine andere Mutante H- 9156, welche von dem L-Isoleucin produzierenden Stamm H-8683 induziert wurde, zeigte eine verstärkte Fähigkeit, L-Isoleucin zu produzieren. H-9156 konnte etwa 13% mehr L-Isoleucin anreichern als der Ausgangsstamm. Infolge dessen ist klar geworden, dass unter Verwendung der Verfahren, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, eine Mutante, welche eine verstärkte L- Isoleucin produzierende Fähigkeit besitzt, nicht nur von einem L-Isoleucin produzierenden Stamm induziert werden kann, sondern auch von einem nicht-Aminosäure produzierenden Stamm, der keine mutagenisierende Behandlung erhalten hat, um seine Aminosäure-Produktivität zu verbessern.

Tabelle 2

Stamm L-Isoleucin (g/Liter)

ATCC 11105 0
H-9146 0,5
H-8683 13,4
H-9156 15,1

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, umfassend:

Auswählen eines Mikroorganismus aus der Art Escherichia coli auf einem Agarmedium, bestehend aus 0,5% Glucose, 0,02% L-Homoserin, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/Liter Calciumchlorid und 2% Agar mit einem pH- Wert von 7, 2, mit der Maßgabe, daß, wenn der Mikroorganismus auxotroph ist, die erforderliche auxotrophe Verbindung dem Agarmedium zugesetzt wird, welcher Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 0,6 mm bildet, wenn er 3 bis 7 Tage bei 30 bis 35ºC gezüchtet wird;

Seine Züchtung in einem Nährmedium;

Produzieren und Anreichern von L-Isoleucin in dem Nährmedium unter Verwendung des Mikroorganismus; und

Gewinnen des L-Isoleucin daraus.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli H-9146 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5055 oder Escherichia coli H-9156 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5056 ist.

3. Mikroorganismus, der zur Art Escherichia coli gehört, welcher fähig ist, auf einem Agarmedium zu wachsen, bestehend aus 0,5% Glucose, 0,02% L- Homoserin, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/Liter Calciumchlorid und 2% Agar mit einem pH-Wert von 7, 2, mit der Maßgabe, daß, wenn der Mikroorganismus auxotroph ist, die erforderliche auxotrophe Verbindung dem Agarmedium zugesetzt wird, wobei Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 0,6 mm gebildet werden, wenn dieser 3 bis 7 Tage bei 30 bis 35ºC gezüchtet wird, und die Fähigkeit zur Produktion von L- Isoleucin in einem Nährmedium besitzt.

4. Mikroorganismus nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli H-9146 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5055 oder Escherichia coli H-9156 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP- 5056 ist.