DE2358496C2

DE2358496C2 - Herstellung von L-Serin

Info

Publication number: DE2358496C2
Application number: DE2358496A
Authority: DE
Inventors: Katsusuke Yokohama Kageyama; Shinpachi Chigasaki Kanagawa Konishi; Koji Kawasaki Kubota; Isamu Maeyashiki; Shinji Tokyo Okumura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-11-24
Filing date: 1973-11-23
Publication date: 1983-04-21
Also published as: US3880741A; DE2358496A1; IT1006116B; GB1422820A; JPS516236B2; FR2207987B1; FR2207987A1; JPS4975783A

Description

a) ein einer Fermentationsmethode den Mikroorganismus bei pH 5 bis 9 in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle, anorganische Salze, für das Wachstum erforderliche organische Spurennährstoffe und Glycin in einer Menge von 0,5 bis 4 Gew.-% des Kulturmediums enthält, so lange züchtet, bis L-Serin in dem 2« Medium angereichert ist, oder

b) in einer enzymatischen Methode Mikrobenzellen, die durch Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stick- :s stoffquelle, anorganische Salze und für das Wachstum erforderliche organische Spurennährstoffe enthält, hergestellt wurden, mit einer Reaktionslösung vermischt, die Glycin in einer Menge von 0,5 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das «1 Gewicht der Lösung enthält und einen pH-Wert von 5 bis 9 aufweist,

und das gebildete L-Serin gewinnt.

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch genannte Verfahren. w

L-Serin wird als Aminosäure, die für Ratten nicht essentiell ist, eingestuft; es hat jedoch Verwendung als Nahrungsmittelzusatz, als Ausgangsmaterial für Kosmetika und in der Medizin gefunden. Als Methoden zur Herstellung von L-Serin mit Hilfe von Mikroorganis- 4ϊ men wurden Verfahren bekannt, nach denen L-Serin aus Glycerinsäure mit Hilfe eines aus Mikroorganismen erhaltenen Enzyms hergestellt werden kann (veröffentlichte japanische Patentanmeldung 17 728/67) und ein Verfahren, nach dem L-Serin aus Glycin mit Hilfe eines fermentativen Verfahrens hergestellt werden kann (US-PS 36 23 952).

Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, L-Serin in einfacherer und wirtschaftlicherer Weise herzustellen, als es bisher möglich war.

Es konnte festgestellt werden, daß Mutanten des Genus Corynebacterium, die einen Nährstoffbedarf aufweisen, befähigt sind, größere Mengen an L-Serin aus Glycin zu bilden als die Elternstämme, denen ein Nährstoffbedarf fehlt, wie sie in der US-PS 36 23 952 bo beschrieben werden. Es war bisher nicht bekannt, daß L-Serin durch einen Mikroorganismus mit einem gewissen Nährstoffbedarf gebildet werden kann und daß die Fähigkeit eines bekannten L-Serin-Bildners verbessert wird, wenn ihm gegenüber den Elternstäm- b5 men ein gewisser Nährstoffbedarf verliehen wird.

Die vorstehend angegebene Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst.

Die Mikroorganismenstämme, die bei dem erfindung-sgemäßen Verfahren verwendet werden, sind Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1685 (Mutante mit Leucinbedarf), Corynebacterium glycinophilum FERM-P1686 (Mutante mit Tryptophanbedarf). Corynebacterium glycinophilum FERM P 1687 (Mutante mit Leucin- und Methioninbedarf), Corynebacterium g!ycinophilum FERM-P 1688 (Mutante mit Leucin- und Isoleucinbedarf) und Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1689 (Mutante mit Leucin- und Serinbedarf oder Leucin- und Glycinbedarf), die sich alle von Corynebacterium glyciophilum ATCC 21 341 ableiten.

Die vorstehend angegebenen 5 Stämme, die FERM-P-Hinterlegungsnummern haben, wurden bei dem Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science of Technology, the Ministry of the Industrial Trade and Industry, Japan, hinterlegt und sind bei der Hinterlegungsstelle frei erhältlich.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Mutantenstämme können mit Hilfe bekannter Selektionsmethoden, wie der Stempel-Methode und anschließende Prüfung ihrer L-Serin-Bildungsfähigkeit, aus künstlich induzierten Mutanten, die beispielsweise durch Behandeln der Zellen des Elternstammes mit 0,1 m Diäthylsulfat bei 30⁰C während 20 Stunden unter Schütteln erhalten wurden, hergestellt werden.

Corynebacterium glycinophilum ATCC 21 341 zeigt folgende taxonomische Eigenschaften:

1. Vegetative Zellen:

Kurze, gewöhnlich einfache oder doppelte Stäbchen, variierende Form, Größe 0,6 bis 0,8 χ 1,0 bis 3,0 Mikron aus Agar-Nährboden bei 30°C während 24 Stunden, nicht beweglich, keine Sporenbildung, Gram-positiv, nicht säurefest.

2. Agar-Kolonien:

Kreisförmig, glatt, einheitlich, konvex erhöht, opak, gräulichweiß, Medium unverändert.

3. Gelatine-Kolonien:

Kreisförmig, konvex erhöht, einheitlich, keine Verflüssigung, glatt, opak.

4. Agar-Ausstrich:

Mäßiges Wachstum, fadenförmig, glänzend, gräulichweiß, butterähnlich, Medium unverändert.

5. Nährbrühe:

Kein Wachstum an der Oberfläche, trüb, flockiges Sediment, Menge des Sediments ist gering.

6. Temperatureinfluß:

Wachstum bei 20 bis 37°C, kein Wachstum bei 42⁰C.

7. Physiologische Eigenschaften:

1.) BCP-Milch: unverändert bis leicht alkalisch
2.) MR-Test: negativ
3.) Voges-Proscauer-Reaktion: negativ
4.) Indolbiidung: negativ
5.) Nitratreduktion: positiv
6.) Verflüssigung von Gelatine: negativ
7.) Hydrolyse von Stärke: negativ
8.) Citratverbrauch: verbraucht Citrat
9.) Keine Säurebildung und Gasbildung aus Arabinose, Xylose, Glucose, Mannose, Fructose, Galactose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Raffinose, Sorbit, Inosit, Glycerin, Salicin,«-Methylglycosid, Inulin, Dextrin, Stärke und Cellulose (Pepton — Medium).
10.) Bei aerober Züchtung tritt geringe Säurebildung aus Glucose, jedoch keine Gasbildung aus Glucose ein. Keine Säure- und Gasbildung

unter anaeroben Bedingungen nach der

Methode von Hugh und Leifson.
11.) Katalase: positiv
12.) Aerob
13.) Wachstum auf einem aus Nährbrühe bestehen-

den Medium, dem 6% Glycin zugesetzt ist.
8. Ausgangsmaterial:
Faule Früchte.

In Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, kann keine Mikroorganismenspezies festgestellt werden, die als gleiche Spezies wie der erfindungsgemäß aufgefundene Mikroorganismus identifiziert werden kann. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm ist daher als Mikroorganismus anzusehen, der einer neuen Spezies angehört und wurde als Corynebacterium glycinophilum bezeichnet

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bildung von L-Serin verwendete Kulturmedium kann ein völlig übliches Medium sein. Es muß eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle, wachstumsfördernde Substanzen, spezifische Nährstoffe, die für die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten erforderlich sind, und anorganische Substanzen enthalten.

Die zur Verwendung für die Zwecke der Erfindung geeigneten Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Maltose, Fructose, Stärkehydrolysate und Melassen. Auch organische Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure und Zitronensäure, Alkohole, wie Äthanol, und organisehe Verbindungen, wie Benzoesäure, werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Kohlenstoffquellen verwendet.

Eine Stickstoffquelle kann durch Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, oder durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder in Gasform eingeführt werden. Organische Verbindungen, wie Aminosäuren, Harnstoff oder Proteinhydrolysate, können ebenfalls verwendet werden. Als anorganische Substanz können Phosphate, Calciumsalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Mangansalze und weitere übliche Verbindungen zugesetzt werden. Zu wachstumsfördernden Mitteln und anderen Nährstoffen, welche die Ausbeute und die Bildungsrate von L-Serin verbessern, gehören Aminosäuren, verschiedene Vitamine, Sojabohnen-Pioteinhydrolysat, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Pepton und Kaseinhydrolysat. Die für die erfindungsgemäß verwendeten Stämme erforderlichen Nährstoffe werden natürlich dem Nährmedium zugesetzt, sofern nicht diese Nährstoffe bereits in den im Medium vorliegenden Bestandteilen enthalten sind. Im letzteren Fall ist es nicht erforderlich, diese Nährstoffe speziell dem Medium außerdem zuzusetzen.

Das dem Medium zuzugebende Glycin kann in Form eines Glycin enthaltenden Materials oder auch als reines Glycin, das durch synthetische Methoden hergestellt wurde, zugesetzt werden. Für das Fermentationsverfahren beträgt seine Konzentration in dem Kulturmedium zweckmäßig 0,5 bis 4,0 Gew.-%. Der Zeitpunkt der Zugabe des Glycins zu dem Medium kann so gewählt werden, daß die Gesamtmenge dem Medium vor dem Beimpfen mit dem Mikroorganismus oder zu Beginn der Fermentation zugesetzt wird. Es kann außerdem zum Teil dem Medium zu Beginn der Fermentation zugesetzt werden und der restliche Anteil kann während der Fermentation zugegeben werden. Bei der enzymatischen Methode beträgt die Glycinkonzentration in der Reaktionslösung auf 0,5 bis 5 Gew.-%.

Die Fermentation wird zweckmäßig unter aeroben Bedingungen durch Schütteln oder Belüftung oder unter Bewegen des Mediums durchgeführt, d. h, das Nährmedium kann durch Schütteln, Rühren oder Durchleiten von Luft durch das Medium mit Sauerstoff in Berührung gebracht werden. Zum Erzielen bester Ergebnisse sollte der pH-Wert des Kulturmediums auf 5,0 bis 9,0 eingestellt werden. Wenn daher der pH-Wer» des Mediums die Neigung zeigt, auf Werte oberhalb 9,0 anzusteigen, ist es erforderlich, ihn mit Hilfe eines Neutralisationsmittels, wie Chlorwasserstoff oder Schwefelsäure, auf einen Wert innerhalb des genannten Bereiches einzustellen. Wenn dagegen der pH-Wert des Mediums die Neigung zeigt, auf Werte unter 5,0 zu fallen, ist es erforderlich, ihn mit Hilfe von Neutralisationsmitteln, wie Calciumcarbonat, Ammoniak, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, auf den obengenannten Bereich einzustellen.

Die Züchtungstemperatur beträgt 24 bis 37°C. Gewöhnlich wird die Fermentation während 2 bis 5 Tagen durchgeführt

Das enzymatische Verfahren wird zweckmäßig durchgeführt, indem die Mikrobenzellen in einer Reaktionslösung während 5 Stunden bis 48 Stunden mit Glycin in Berührung gehalten werden. Die Reaktionstemperatur beträgt 25 bis 4O⁰C und der pH-Wert der Reaktionslösung wird im Bereich von 5,0 bis 9,0 eingestellt Die verwendeten Mikrobenzellen sind die Enzymquelie für die Reaktion zur Bildung von L-Serin aus Glycin und werden durch Gewinnen von Zellen aus einer Kulturbrühe erhalten, nachdem die Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Stämme unter nahezu den gleichen Bedingungen, wie sie für die fermentative Methode gezeigt wurden, durchgeführt wurde.

Die Gewinnung des in der Fermentationsbrühe angereicherten L-Serins ist sehr einfach, weil die Anreicherung anderer Aminosäuren in der Brühe ziemlich gering ist, und kann nach bekannten Methoden erfolgen. Die Bakterienzellen können durch Filtration oder Zentrifugieren aus der Kulturbrühe oder der Reaktionrlösung entfernt werden und L-Serin kann unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes in der Η-Form in Verbindung mit einem Eindampfvorgang unter vermindertem Druck und einem Fällungsvorgang, wie in den Beispielen gezeigt wird, gewonnen werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt wird mit Hilfe des Rf-Werts durch Papierchromatografie als L-Serin identifiziert und die biologische Bestimmung des in der Brühe angereicherten Produkts erfolgt durch mikrobiologische Analyse unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert. In diesen Beispielen bedeuten alle Prozentangaben Gewichtsprozent.

Beispiel 1

Ein wäßriges Kulturmedium, das 5% Glucose, 0,2% (NH-O₂SO₄, 0,3% NH₄NO₃, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,2 mg/1 Biotin, 1 mg/1 Thiamin · HCI, 1 mg/1 Nikotinamid, 1 mg/l Pyridoxal · HCl. 1 mg/1 Folsäure, 2 mg/1 Riboflavin, 1 mg/1 Calciumpanthotenat, 0,2 mg/1 Pyridoxin, 1 mg/1 Paraaminobenzosäure, 0,05% DL-Methionin, 0,05% L-Glutaminsäure, 0,05% L-Valin, 2% Glycin und den in Tabelle 1 gezeigten für jeden Stamm erforderlichen Nährstoff enthielt, wurde hergestellt und auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. 20-ml-Anteile der Lösung wurden in 500-ml-Schüttel-

kolben gegeben und 5 Minuten mit Hilfe von Dampf von UO⁰C sterilisiert

Die wäßrigen Medien wurden mit den 5 Stämmen von Corynebacterium glycinophilum und ihrem Elternstamm ATCC 21 341 angeimpft, die in Tabelle 1 gezeigt sind. Diese Stämme waren vorher auf Bouillon-Schrägagar 40 Stunden bei 30° C gezüchtet worden.

Nach 72stündiger Züchtung unter Schütteln bei 31°C waren in jeder Kulturbrühe die in Tabelle 1 gezeigten Mengen an L-Serin angereichert worden.

Tabelle 1

Verwendete Stämme

Zugesetzte Nährstoffe, Menge

Angereichertes L-Serin (g/l)

Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1685 Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1686 Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1687 Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1688

Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1689 Corynebacterium glycinophilum ATCC 21341

L-Leucin (0,03%)	!0,6
L-Tryptophan (0,02%)	9,7
L-Leucin (0,03%)	11,5
L-Leucin (0,03%)	10,2
L-Isoleucin (0,03%)
L-Leucin (0,03%)	8,9
keine	7,8

Die Mikrobenzellen wurden durch Filtration aus einem Liter der Kulturbrühe von Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1687 durch Filtration entfernt und die zellfreie Lösung wurde auf einen pH-Wert von 1,0 bis 2,0 eingestellt und über ein Ionenaustauscherharz (Dowex 50-X4) geleitet. Das Harz wurde mit 1 1 Wasser und 0,025 η Chlorwasserstoffsäure gewaschen und die L-Serin-Fraktion wurde mit Hilfe von 0,2 η Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und rohes kristallines L-Serin wurde durch Zugabe von kaltem Alkohol aus dem Konzentrat ausgefällt. 5,8 g reines L-Serin wurden durch Umkristallisieren gewonnen.

Beispiel 2

Ein wäßriges Kulturmedium, das 10% Glucose, 0,2% (NH₄J₂SO₄,0,3% NH₄NO₃,0,05% MgSO₄ · 7 H₂0,0,1% KH₂PO₄,0,2 mg/1 Biotin, 1 mg/1 Thiamin · HCI, 2,5 mg/1 Nikotinamid, 1 mg/1 Folsäure, 0,3% DL-Methionin, 0,06% L-Leucin, 1% Sojabohnenproteinhydrolysat (Gesamtstickstoffgehalt 2,4%) und 3% Glycin (gesondert sterilisiert) enthielt, wurde hergestellt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. 300-mI-Proben der Lösung wurden in 1-Liter-Fermentationsflaschen gegeben.

Die wäßrigen Medien wurden mit Corynebacterium glycinophilum FERM-P 1687 beimpft, das vorher auf Bouillon-Schrägagar 40 Stunden bei 30⁰C gezüchtet worden war. Die Züchtung wurde bei 34°C unter Belüften mit '/2 Volumteil Luft pro Minute durchgeführt

und der pH-Wert wurde mit wäßrigem Ammoniak bei 6,5 gehalten.

Nach 56stündiger Züchtung wurden 15,9 g/l L-Serin in der Brühe festgestellt. 4,4 g kristallines L-Serin wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 3

Mikrobenzellen jeder Kulturbrühe der 6 Stämme, die nach 48stündiger Züchtung in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Mikrobenzellen wurden mit einer Reaktionslösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung gewaschen und danach in je 20 ml der Reaktionslösung gegeben. In dem Gemisch hatte die Konzentration der Mikrobenzellen die in Tabelle 2 gezeigten Werte.

Die Reaktion wurde während 24 Stunden unter Schütteln bei 37° C durchgeführt. Die in jedem Reaktionsgemisch gebildete Menge an L-Serin ist in Tabelle 2 gezeigt.

Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Kohlenstoffquelle (gemäß Tabelle 2) 2%

Glycin 2%

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7 H₂O 0,04%

Nikotinamid 2,5 mg/1

Thiamin · HCl (pH 7,5) 1 mg/1

Tabelle 2

Verwendeter Stamm	Konzentration	Kohlenstoffquelle	Gebildetes
	d. Mikrobenzellen		L-Serin
	(OD 562)*)		(g/l)

Coryneb. glycinophilum FERM-P 1685 Coryneb. glycinophilum FERM-P 1686

	Glucose	3,0
0,64	Essigsäure	1,6
0,68	Glucose	3,6

Fortsetzung

Verwendeter Stamm

Konzentration d. Mikrobenzellcn

(OD 562)*)

KohlenstofTquelle

Gebildetes L-Scrin

(g/l)

Coryneb. glycinophilum FERM-P 1687 Coryneb. glycinophilum FERM-P 1688 Coryneb. glycinophilum FERM-P 1689 Coryneb. glycinophilum ATCC 21 341

0,67 0,65 0,67 0,66

Glucose	4,3
Essigsäure	2,1
Glucose	3,3
Essigsäure	1,5
Glucose	2,9
Essigsäure	1,4
Glucose	2,5
Essigsäure	1,0

*) OD 562: Diese Angabe bedeutet die optische Dichte bei 562 ηΐμ. Die Konzentration der Mikrobenzellen zu Beginn der Reaktion wurde durch Lichtabsorption bei 562 πΐμ jeder Kulturbrühe, verdünnt mit 25 Volumteilen Wasser, gemessen.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von L-Serin mit Hilfe eines Serin bildenden Mikroorganismus von Corynebacterium glycincyhilum, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium glycinophilum Ferm-P 1685, 1686, 1687, 1688 oder 1689, die einen Nährstoffbedarf von mindestens einem der Nährstoffe Leucin, Isoleucin, Methionin, Trypto- m phan. Serin und Glycin aufweisen, einsetzt und