DE2707105A1 - Verfahren zur herstellung von l-arginin auf mikrobiologischem wege - Google Patents
Verfahren zur herstellung von l-arginin auf mikrobiologischem wegeInfo
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Description
u.Z.: M 087
Case: 186-4
KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
Tokyo, Japan
Tokyo, Japan
"Verfahren zur Herstellung von L-Arginin auf mikrobiologischem
Wege"
Priorität: 18. Februar 1976, Japan, Nr. 15737/1976
L-Arginin gilt als essentielle Aminosäure im Hinblick auf seine
Wachstumswirkung bei Ratten. Unter anderem erweist sich diese Aminosäure auch als wertvolle Ausgangsverbindung zur Herstellung
von Arginin-glutamat, das als Hilfsstoff bei der Behandlung von
Ammoniumvergiftungen aufgrund von Leberversagen verwendet wird.
Bisher wurde L-Arginin nach verschiedenen Verfahren hergestellt.
Beispielsweise ist die L-Form durch Hydrolyse von Proteinen erhältlich.
Zur großtechnischen Argininherstellung dient die Fällung aus Gelatinehydrolysaten in Form von Flavianaten.
Mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch
Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus unter Ver-
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wendung von Stämmen, die gegen Arginin-Analoge resistent sind,
sind in Applied Microbiology, Bd. 32 (197O, S. 987 sowie in
der japanischen Patentveröffentlichung 25359/74 beschrieben.
Ferner ist in der JA-OS 61388/74- ein Verfahren zur Herstellung
von L-Arginin durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung
Brevibacterium mit einem Nährstoffbedarf für Guanin beschrieben.
Es besteht aber nach wie vor ein Bedürfnis nach mikrobiologischen Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, die sich großtechnisch
unter Erzielung hoher Ausbeuten durchführen lassen.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß sich die Ausbeute an L-Arginin verbessern läßt, wenn man bestimmte auxotrophe
Mutanten der Gattung Bacillus züchtet.
Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin mit erhöhten Ausbeuten zur Verfügung gestellt, bei
dem ein Mikroorganismenstamm der Gattung Bacillus, der zur Bildung von L-Arginin fähig ist und einen Nährstoffbedarf (einschließlich
des sogenannten "leaky"-Typs) für mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Methionin, Histidin, Threonin, Prolin,
Isoleucin, Lysin, Adenin, Guanin und Uracil oder dessen Vorläufer aufweist, in einem Nährmedium züchtet und das in der
Kulturflüssigkeit angereicherte L-Arginin gewinnt.
Der Ausdruck "Nährstoffbedarf" bedeutet, daß Mutanten mit
dieser Eigenschaft in einem Minimalmedium, in dem der Ausgangs-
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stamm ein gutes Wachstum zeigt, nicht so gut wie der Ausgangsstamm
wachsen, wobei jedoch nach Zugabe eines spezifischen Nährstoffs ein ebenso gutes Wachstum wie das des Ausgangsstamms
im Minimalmedium zu beobachten ist. Derartige Mutanten werden als auxotroph bezeichnet.
Wie vorstehend erwähnt, können im erfindungsgemäßen Verfahren auch Mutanten vom sogenannten "leaky"-Typ verwendet werden, bei
denen der Nährstoffbedarf nicht absolut ist.
Erfindungsgemäß wird L-Arginin gebildet und in der Kulturflüssigkeit
angereichert, indem man einen L-Arginin bildenden Stamm der nachstehend beschriebenen Art in einem normalen Nährmedium
züchtet. Das gebildete L-Arginin läßt sich aus der Kulturflüssigkeit
leicht isolieren und gewinnen.
Als L-Arginin bildende Stämme können im erfindungsgemäßen Verfahren
beliebige Mutanten verwendet werden, die erhältlich sind, wenn man einen Stamm der Gattung Bacillus mit der Fähigkeit zur
Bildung von L-Arginin mit einem Nährstoffbedarf (einschließlich
des sogenannten "leaky"-Typs) für mindestens eine der Verbindungen
Methionin, Histidin, Threonin, Prolin, Isoleucin, Lysin, Adenin, Guanin, Uracil oder Uracil-Vorläufer ausstattet.
Zur Mutation können alle Stämme der Gattung Bacillus, die zur Bildung von L-Arginin fähig sind, eingesetzt werden. Insbesondere
werden L-Arginin bildende Stämme der Gattung Bacillus verwendet,
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die gegen Arginin-Analoge, wie Canavanin, Homoarginin, D-Arginin
und Arginin-hydroxamat oder Histidin-Analoge, wie 2-Thiazolalanin,
resistent sind. Insbesondere werden Stämme der Spezies Bacillus subtilis bevorzugt.
Nachstehend sind Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Mutanten angegeben, die durch Mutation des Arginin bildenden
Ausgangsstamms Bacillus subtilis 11OM-59 (prototropher, gegen
Arginin-hydroxamat resistenter Stamm), ATCC 31193» abgeleitet
von Bacillus subtilis ATCC 15244 (Wildstamm), gemäß üblichen
Mutationsverfahren erhalten worden sind. Die nachstehend angegebenen Stämme sind bei der American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, V.St.A. unter den angegebenen Nummern
hinterlegt. Diese Stämme sind für die Öffentlichkeit frei zugänglich.
Stamm ATCC
Bacillus subtilis BA-22 31185
(Methioninbedarf)
Bacillus subtilis BA-26 31186
(Histidinbedarf)
Bacillus subtilis BA-10 31184
(Threoninbedarf)
Bacillus subtilis BA-9 31183
(Prolinbedarf)
Bacillus subtilis BA-32 31187
(Isoleucin- oder Lysinbedarf)
Bacillus subtilis BA-43 31188
(Adenin- oder Guaninbedarf)
Bacillus subtilis 59FL-1 31189
(Uracil- oder Orotsäurebedarf)
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Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme können auch andere als
die vorstehend angegebenen Nährstoffbedürfnisse aufweisen. Beispielsweise können Stämme verwendet werden, die neben den vorerwähnten
Bedürfnissen auch einen Tryptophanbedarf aufweisen.
Mutanten mit den erforderlichen Eigenschaften können nach üblichen
Mutations- und Auswahlverfahren erhalten werden. Nachstehend ist ein Beispiel zur Herstellung der vorerwähnten speziellen Mutanten
angegeben: Mikroorganismenzellen des Ausgangsstamms v/erden auf einem schräggestellten Bouillon-Medium mit einem Gehalt an 0,5 g/dl
Hefeextrakt, 1 g/dl Fleischextrakt, 1 g/dl Pepton, 0,5 g/dl NaGl und 2 g/dl Agar (pH-Wert 7,2) 2M- Stunden bei 3O0C gezüchtet.
10 Anschließend werden die Zellen in einer Konzentration von 10 Zellen pro ml in 0,05 m Tris-Maleat-Puffer vom pH-Wert 6,0 mit
einem Gehalt an 2 mg/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin suspendiert.
Die Suspension wird 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend 15 Minuten bei#3000 U/min zentrifugiert.
Anschließend werden die Zellen wieder in 0,05 m Tris-Maleat-Puffer
vom pH-Wert 6,0 in der vorstehend angegebenen Konzentration suspendiert. Sodann wird 1 ml der Suspension auf
10 ml eines Nährmediums mit einem Gehalt an 2 g/dl Glucose, 1 g/dl Pepton, 1 g/dl Hefeextrakt und 0,5 g/dl NaCl (pH-Wert 7,2)
überimpft. Sodann wird über Nacht bei 30°C inkubiert. Die Zellen werden gesammelt, mit 0,05 m Tris-Maleat-Puffer vom pH-Wert 6,0
gewaschen und im vorgenannten Puffer in einer Konzentration von etwa 10 ^ Zellen pro ml suspendiert. Anschließend werden 0,1 ml
der Suspension auf eine Agar-Platte mit einem kompletten Medium mit einem Gehalt an 1 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Hefeextrakt, 1 g/dl
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Pepton, 0,25 g/dl NaCl und 2 g/dl Agar (pH-Wert 7,2) gestrichen.
Die Zellen werden zur Bildung von Kolonien 24 Stunden bei 3O0C
inkubiert. Die erhaltenen Zellen werden auf eine Agar-Platte mit einem kompletten Medium der vorstehend angegebenen Zusammensetzung
gestrichen. Ferner werden sie auch auf eine Agar-Platte mit einem Minimalmedium mit einem Gehalt an 1 g/dl Glucose,
0,1 g/dl Ammoniummonophosphat, 0,02 g/dl Kaliumchlorid, 0,02 g/dl Magnesiumsulfat, 30 γ/Liter Biotin, 1 ml/Liter Spurenelemente,
10 mg/Liter Vitamin B^ und 2 g/dl Agar (pH-Wert 7»2) gestrichen.
Sodann wird 1^2 Tage bei 300C stehengelassen. Die im letztgenannten
Medium verwendeten Spurenelemente werden mittels einer Lösung zugeführt, die in einem Gesamtvolumen von 1 Liter 88 mg
Natriumborat-decahydrat, 37 mg Ammoniummolybdat-tetrahydrat, 8,8 mg
Zinksulfat-heptahydrat, 270 mg Kupfersulfat-pentahydrat, 7,2 mg
Manganchlorid-tetrahydrat und 970 mg Eisen(III)-chlorid-hexahydrat in destilliertem Wasser enthält.
Entsprechende auxotrophe Stämme werden aus den Stämmen ausgewählt,
die auf einer Agar-Platte mit dem Minimalmedium kein Wachstum zeigen, aber auf dem kompletten Medium wachsen. Der
Nährstoffbedarf der ausgewählten auxotrophen Mutante wird durch Auxanographie bestimmt. Die auxotrophen Stämme, die den gewünschten
Nährstoffbedarf aufweisen, werden dann auf ihre Fähigkeit
zur Bildung von L-Arginin in erhöhten Ausbeuten untersucht. Stämme mit den entsprechenden Fähigkeiten werden für das erfindungsgemäße
Verfahren verwendet.
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- ίο -
Zur Durchführung des erfindungsgeinäßen Verfahrens eignen sich
Nährmedien, die im allgemeinen zur Herstellung von Aminosäuren auf mikrobiologischem Wege verwendet werden. Es können synthetische
oder natürliche Medien verwendet werden, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Bestandteile und andere Nährstoffquellen
aufweisen, wie in den Beispielen angegeben ist. Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate, wie Glucose,
Saccharose, Fructose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysate und Rohrzuckermelassen (blackstrap molasses), Glycerin, mehrwertige
Alkohole, organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, Alkohole, wie Äthanol und Methanol,
Aminosäuren, wie Glutaminsäure und Asparaginsäure, n-Paraffine
und andere Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen können Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze,
wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat
und Ammoniumacetat, Harnstoff und andere stickstoffhaltige Verbindungen und natürliche Substanzen, wie Pepton, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysat, Fischmehl, digeriertes Fischmehl, entfetteter Sojabohnenkuchen, digerierter
entfetteter Sohabohnenkuchen und Chrysalishydrolysat, verwendet werden. Beispiele für anorganische Bestandteile sind Kalium- '
phosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat,
Mangansulfat und Calciumcarbonat.
Selbstverständlich muß das Nährmedium mit entsprechenden Mengen an Nährstoffen versetzt werden, die die entsprechenden Mikroorganismen
für ihr Wachstum benötigen. In manchen Fällen sind
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diese Nährstoffe Bestandteile von natürlichen Substanzen, die als Stickstoffquellen verwendet werden.
Erfindungsgemäß kann die Produktivität an L-Arginin der auxotrophen
Stämme weiter gesteigert werden, indem man das Nährmedium mit L-Glutaminsäure entweder zu Beginn der Züchtung oder
während der Wachstumsphase der Zellen zusetzt. In beiden Fällen wird L-Glutaminsäure vorzugsweise in einer Gesamtmenge von
0,1*^3 Prozent (Gewicht/Volumen) des Mediums zugesetzt.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise
durch Schütteln, bewegte Submerskultur oder dergl. Die bevorzugte Züchtungstemperatur beträgt im allgemeinen 20~40°C.
Jedoch kann die Züchtung auch bei Temperaturen außerhalb dieses Bereichs durchgeführt werden, solange die entsprechenden Mikroorganismen
ein Wachstum aufweisen. Um eine hohe Ausbeute zu erzielen, ist es wünschenswert, den pH-Wert des Mediums während
der Züchtung um den Neutralpunkt zu halten. Im allgemeinen wird die Züchtung 1 bis 5 Tage unter diesen Bedingungen durchgeführt,
wobei sich eine beträchtliche Menge an L-Arginin in der Kulturflüssigkeit
anreichert.
Nach Beendigung der Züchtung werden die Mikroorganismenzellen und ein eventuell gebildeter Niederschlag nach üblichen Verfahren
aus der Kulturflüssigkeit entfernt. Anschließend wird das L-Arginin aus der Kulturflüssigkeit nach bekannten Verfahren
gewonnen, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaus-
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tauscherharz, wie in Beispiel 1 ausgeführt ist. Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Jeweils 5 ml eines Nährmediums der nachstehenden Zusammensetzung
werden in große Reagenzgläser gegeben und sterilisiert.
Rohrzuckermelasse 10 g/dl (als Glucose)
Ammoniumsulfat 3 g/dl
Harnstoff 0,3 g/dl
Kaiiumdihydrogenphosphat 0,05 g/dl
Dikaliumhydrogenphosphat 0,05 g/dl
Magnesiumsulfat 0,025 g/dl
Maisquellflüssigkeit 0,5 g/dl (pH-Wert 7,2)
Die in Tabelle I angegebenen Stämme und der Arginin bildende Ausgangsstamm, d.h. Bacillus subtilis 11OM-59 (prototropher,
gegen Arginin-hydroxamat resistenter Stamm), werden auf ein Anzuchtmedium mit einem Gehalt an 2 g/dl Glucose, 1 g/dl Pepton,
1 g/dl Hefeextrakt und 0,5 g/dl Natriumchlorid (pH-V/ert 7,2) überimpft und 24 Stunden bei 300C gezüchtet. Die Anzuchtkulturen
werden anschließend in einem Verhältnis von 10 Prozent in ein Reagenzglas mit dem Nährmedium überimpft und 96 Stunden bei 300C
unter Schütteln gezüchtet. Danach hat sich in den Kulturflüssigkeiten L-Arginin in den in Tabelle I angegebenen Mengen angereichert.
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Nachstehend wird ein Beispiel für ein Isolationsverfahren angegeben:
Die Bakterienzellen und andere unlösliche Materialien werden aus der Kulturflüssigkeit von Bacillus subtilis BA-22
(ATCC 31185) entfernt. 1 Liter des erhaltenen Filtrats wird auf eine mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz (Amberlite IR-120B)(Natriumform)
gepackte Säule aufgesetzt, wobei das L-Arginin adsorbiert wird. Nach dem Waschen wird das L-Arginin nach üblichen
Verfahren eluiert, isoliert und gereinigt. Man erhält 3,8 g L-Arginin in kristalliner Form.
Stamm
Nährstoffbedarf
Menge an L-Arginin (mp;/ml)
Bacillus | subtilis | BA-22 | Methionin | 5,8 |
Bacillus | subtilis | BA-26 | Histidin | 4,5 |
Bacillus | subtilis | BA-10 | Threonin | 4,7 |
Bacillus | subtilis | BA-9 | Prolin | 4,1 |
Bacillus | subtilis | BA-32 | Isoleucin oder Lysin |
4,0 |
Bacillus | subtilis | BA-43 | Adenin oder Guanin |
4,0 |
Bacillus | subtilis | 59PL-1 | Uracil oder Orotsäure |
3,8 |
Bacillus subtilis (Ausgangsstamm) |
11OM-59 | keiner | 3,0 |
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird die Züchtung gemäß Beispiel 1 durchgeführt,
wobei aber die in Tabelle II angegebenen Stämme als
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Anzucht Stämme verwendet werden und das Nährmedium mit 1,5 g/dl Mononatriumglutamat versetzt wird. L-Arginin wird in der Gärflüssigkeit
in den in Tabelle II angegebenen Mengen angereichert.
Tabelle II | Nährstoffbedarf | Men | |
Stamm | Methionin | ||
Bacillus subtilis | BA-22 | Histidin | |
Bacillus subtilis | BA-26 | keiner | |
Bacillus subtilis (Ausgangsstamm) |
11OM-59 | ||
ge an L-Arginin (mp:/ml) |
|||
6,2 | |||
5,7 | |||
3,9 |
Es ergibt sich, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren eine
signifikante Ausbeutesteigerung erreicht werden kann.
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Claims (9)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung von L-Arginin auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man einen von einem L-Arginin bildenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus abgeleiteten Mutantenstamm mit einem Nährstoffbedarf an mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Methionin, Histidin, Threonin, Prolin, Isoleucin, Lysin, Adenin, Guanin, Uracil und Uracil-Vorläufer in einem Nähmedium züchtet, bis L-Arginin in der Kulturflüssigkeit gebildet worden ist, und anschließend das L-Arginin isoliert.709835/0777 ORIGINAL INSPECTED
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,1 bis 3 Prozent L-Glutaminsäure enthält.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung 1 bis 5 Tage bei 20 bis 400C durchführt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mutantenstamm der Spezies Bacillus subtilis verwendet.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutantenstamm Bacillus subtilis ATCC 31183, Bacillus subtilis ATCC 31184, Bacillus subtilis ATCC 31185, Bacillus subtilis ATCC 31186, Bacillus subtilis ATCC 31187, Bacillus subtilis ATCC 31188 oder Bacillus subtilis ATCC 31189 verwendet.
- 6. Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, dadurch gekennz eichnet, daß man einen Ausgangsmikroorganismus der Gattung Bacillus so mutiert, daß er einen Nährstoffbedarf für mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Methionin, Histidin, Threonin, Prolin, Isoleucin, Lysin, Adenin, Guanin, Uracil und Uracil-Vorläufer aufweist, die erhaltene Mutante in einem Nährmedium züchtet, bis L-Arginin in der Kulturflüssigkeit gebildet worden ist, und anschließend709835/0777das Ir-Arginin isoliert.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstamm einen Stamm verwendet, der gegen Arginin-Analoge resistent ist.
- 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,1 bis 3 Prozent L-Glutaminsäure enthält.
- 9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung 1 bis 5 Tage bei Temperaturen von 20 bis 400C durchführt.709335/0777
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