Basische
Aminosäuren
wie L-Lysin, L-Histidin, L-Arginin und L-Ornithin werden überwiegend durch
mikrobielle Fermentationsverfahren hergestellt (s. z.B. Axel Kleemann
et al., „Amino
acids", in „Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry",
5th Edition on CD-ROM, 1997 Wiley-VCH und
dort zitierte Literatur; Th. Hermann, J. Biotechnol. 104 (2003),
S. 155–172
und dort zitierte Literatur; Pfefferle et al., Adv. Biochem. Eng./Biotechnology,
Vol. 79 (2003), 59–112
und dort zitierte Literatur; sowie Atkinson et al., in Biochemical
Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd ed.,
Stockton Press, 1991, Kapitel 20 und dort zitierte Literatur).
Bei
derartigen Fermentationsverfahren erhält man primär eine wässrige Fermentationsbrühe, welche
neben der gewünschten
basischen Aminosäure
und der aus den eingesetzten Mikroorganismen resultierenden Biomasse
eine Vielzahl an Nebenprodukten und Verunreinigungen, z.B. andere Aminosäuren, Substratreste,
Salze, Produkte der Zelllyse, und sonstige Nebenprodukte enthält.
Die
Gewinnung basischer Aminosäuren
aus der Fermentationsbrühe
und ihre Aufreinigung erfolgt häufig
unter Anwendung von stark sauren Kationentauschern (s. z.B. Th.
Hermann, loc.cit; Atkinson et al., loc. cit.). Zu diesem Zweck wird
die wässrige
Fermentationsbrühe,
vor oder nach Abtrennung der Mikroorganismen und sonstiger unlöslicher
Bestandteile (Biomasse), mit einer starken Säure wie beispielsweise Schwefelsäure auf
einen pH-Wert unterhalb 2 angesäuert,
so dass die basische Aminosäure
als Dikation vorliegt. Die angesäuerte
wässrige
Brühe wird dann über einen
stark sauren Kationentauscher, dessen Säuregruppen in der Salzform
vorliegen, z.B. als Natrium- oder Ammoniumsalze, geleitet, wodurch das
Dikation der basischen Aminosäure
auf dem Ionenaustauscherharz adsorbiert wird. Der so mit der basischen
Aminosäure
beladene Kationenaustauscher wird üblicherweise danach zur Entfernung
von Verunreinigungen mit Wasser gewaschen. Anschließend wird
die basische Aminosäure
durch Behandlung mit einer verdünnten
wässrigen
Base, beispielsweise Natronlauge, Ammoniakwasser oder ein wässrigen
Ammoniumpuffer, eluiert, wobei gleichzeitig die Salzform des Kationenaustauschers
regeneriert wird. Aus dem so gewonnenen Eluat kann die basische Aminosäure, gegebenenfalls
nach Ansäuern
des Eluats, in üblicher
Weise isoliert werden, z.B. durch Kristallisation.
Naturgemäß weist
die beim Beladen des Kationenaustauschers mit dem Dikation der basischen
Aminosäure
ablaufende Flüssigkeit
(Ablauf bzw. Effluent) eine hohe Salzkonzentration auf und wird
daher häufig
auch als "High Density
Waste Water" (HDWW)
bezeichnet. Auch bei dem sich gegebenenfalls anschließenden Waschschritt
fallen große Abwassermengen
mit Salzfracht an ("Low
Density Waste Water" (LDWW)).
Diese Abwässer
müssen zur
Verringerung der Salzfracht einer aufwändigen Abwasserbehandlung unterzogen
werden. Alternativ kann man die salzhaltigen Abwässer entwässern und das dabei anfallende
Konzentrat entsorgen oder einer anderen Verwendung zuführen. Beide
Maßnahmen
sind jedoch mit einem zusätzlichen
apparativen Aufwand und einem hohen Energieaufwand verbunden und
tragen daher zu einem nicht unbeträchtlichen Anteil zu den Kosten
der fermentativen Aminosäureherstellung
bei. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, die Salzfracht und
die Abwassermenge, welche bei einer Aufarbeitung von basische Aminosäure enthaltenden
Fermentationsbrühen
mittels Kationenaustauscher anfallen, zu reduzieren.
Ein
weiterer Nachteil ist die beim Ansäuern auftretende Niederschlagsbildung,
die zu einem Verstopfen der Kationenaustauscheranordnung führen kann.
Zudem sind zusätzliche
Waschschritte erforderlich, um die Verunreinigungen von den Kationenaustauschermaterialien
zu entfernen.
Die
US 4,714,767 beschreibt
ein mehrstufiges Verfahren zur Abtrennung basischer Aminosäuren aus
einer wässrigen
Brühe mittels
einer Anordnung von mehreren, in Serie geschalteten Kationenaustauschersäulen, bei
dem man den letzten Teil des beim Beladen der ersten Säule anfallenden
Effluenten in den Beladungsvorgang einer späteren Abtrennung zurückführt. Auch
wird vorgeschlagen, den letzten Teil des Eluats der ersten Säule in den
Elutionsvorgang einer späteren
Abtrennung zurückzuführen. Auf
diese Weise wird die Wassermenge reduziert, nicht jedoch die Salzfracht.
Hsiao
et al., Biotechnology and Bioengineering Vol. 49 (1996) S. 341–347, schlagen
zur Verringerung der Abwassermenge die Rückführung der am Kationenaustauscher
anfallenden salzhaltigen Effluente in das Fermentationsmedium vor.
Neben der Gefahr, dass hierdurch Fermentationsinhibitoren, welche
im Metabolismus der Mikroorganismen üblicherweise als Nebenprodukte
gebildet werden, im Fermentationsmedium akkumulieren, hat sich gezeigt,
dass hierbei die Bindungskapazität
des Kationenaustauschers herbgesetzt wird, sodass die durch die
verringerte Abwassermenge erreichte Kostenersparnis durch die Kosten
für eine
größere Kationenaustauscheranordnung
aufgezehrt werden.
I.
Lee et al., Enzyme and Microbiol. Technol. 30 (2002) S. 798 803,
schlagen zur Verringerung der Salzfracht bei der Aufarbeitung Lysin-haltiger
Fermentationsbrühen
den Ein satz der Ionenausschlusschromatographie anstelle des üblicherweise
eingesetzten Kationenaustauschers vor. Hierzu wird zunächst der
Feststoffanteil der Fermentationsbrühe mittels Mikrofiltration
entfernt. Die so erhaltene wässrige,
Lysin-haltige Brühe
wird auf den isoelektrischen Punkt (pH 9,74) eingestellt und dann
durch einen Kationentauscher geleitet. Da die ionischen Bestandteile
der Brühe
nicht absorbiert werden, finden sich diese im Effluenten wieder.
Die Aminosäure
wird anschließend
mit Wasser eluiert. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine hohe Wiedergewinnungsrate
an L-Lysin von mehr als 90% nur dann erreicht wird, wenn sowohl
die Menge an Lysin-haltigem Feed als auch die Durchflussrate gering
sind. Trotz der geringeren Salzfracht ist daher diese Aufarbeitungsform nicht
wirtschaftlich.
Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Gewinnung basischer Aminosäuren
aus der Fermentationsbrühe
eines die basische Aminosäure
produzierenden Mikroorganismenstamms bereitzustellen, das die hier
geschilderten Nachteile des Standes der Technik überwindet und das insbesondere
die Verringerung der anfallenden Waschwasser und Salzmenge ermöglicht und
gleichzeitig mit hoher Effizienz durchgeführt werden kann, d.h. eine
hohe Wiedergewinnungsrate an basischer Aminosäure auch bei hohen Beladungs-
und Fließraten
erlaubt.
Es
wurde überraschenderweise
gefunden, dass diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst wird, bei
dem man
- a) die Fermentationsbrühe mit einer
Säure,
deren pKS-Wert in Wasser bei 25°C im Bereich
von 2 bis 5 liegt, ansäuert
und
- b) die basische Aminosäure
aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe durch sukzessives Beladen
einer einstufigen oder einer mehrstufigen, seriellen Anordnung eines
stark sauren Kationenaustauschers in seiner Salzform mit der in Schritt
a) erhaltenen Brühe
und Eluieren der basischen Aminsäure
mit einem basischen Eluens abtrennt.
Dementsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung das hier und in den Ansprüchen dargelegte Verfahren
zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines
die basische Aminosäure
produzierenden Mikroorganismenstamms.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist mit einer Reihe von Vorteilen verbunden: zum einen tritt aufgrund
der gewählten
pH-Werte der Brühe
tritt keine nennenswerte Ausfällung
von Verunreinigungen auf, welche den Kationenaustauscher blockieren können und
auf diese Weise den Bedarf an Waschwasser erhöhen. Zudem ist die beim erfindungsgemäßen Verfahren
anfallende Salzmenge und damit die Salzfracht des Abwassers geringer
als in den Verfahren des Standes der Technik, bei denen Kationenaustauscher
zur Abtrennung und Gewinnung der basischen Aminosäure aus
der Fermentationsbrühe
genutzt werden. Zudem erreicht man hohe Ausbeuten von in der Regel
größer 95%
an basischer Aminosäure
auch bei hohen Beladungs- und Durchflussraten am Kationenaustauscher.
Erfindungsgemäß säuert man
in einem ersten Schritt die Fermentationsbrühe mit einer Säure an,
deren pKS-Wert bei 25°C
im Bereich von 2 bis 5 und insbesondere im Bereich von 3 bis 4 liegt.
Beispiele
für geeignete
Säuren
umfassen Phosphorsäure,
organische Monocarbonsäuren
mit vorzugsweise 1 bis 6 C-Atomen wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Butyrsäure und
Pentansäure,
Dicarbonsäuren
mit vorzugsweise 2 bis 6 C-Atomen wie Oxalsäure, Malonsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure und
Sorbinsäure,
Hydroxycarbonsäuren
mit vorzugsweise 1 bis 3 Carboxylgruppen sowie mit wenigstens einer,
z.B. 1, 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen wie Zitronensäure, Glykolsäure und
Milchsäure
und Mischungen dieser Säuren.
Bevorzugt ist die Säure
aus der Gruppe der organischen Carbonsäuren und der Hydroxycarbonsäuren ausgewählt. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung handelt es sich bei der Säure um Ameisensäure.
Die
Menge an Säure
wird vorzugsweise so gewählt,
dass in der Brühe
ein pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und insbesondere im Bereich von pH 4,0
bis 5,5 resultiert. Vorzugsweise setzt man zum Ansäuern 0,05
bis 2 mol Säure,
insbesondere 0,1 bis 1 mol Säure
und speziell 0,15 bis 0,5 mol Säure
pro kg Fermentationsbrühe
ein.
Gegebenenfalls
kann man vor oder nach dem Ansäuern
einen Teil oder die Hauptmenge der in der Fermentationsbrühe enthaltenen
Mikroorganismen und gegebenenfalls sonstige, vorhandene Feststoffe
aus der Fermentationsbrühe
abtrennen. Eine Abtrennung dieser Bestandteile ist prinzipiell nicht
erforderlich. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung keine Abtrennung dieser Bestandteile vorgenommen und
die Kationenaustauscheranordnung wird direkt mit der angesäuerten wässrigen
Brühe beladen.
Das
Abtrennen der Mikroorganismen und sonstiger fester Bestandteile
kann, sofern gewünscht,
in für
die Abtrennung von Mikroorganismen üblicherweise durch Filtration
einschließlich
Kuchen- und Tiefenfiltration, Cross-Flow-Filtration, durch Membrantrennverfahren
wie Ultra- und Mikrofiltration, durch Zentrifugation und Dekantieren,
durch Einsatz von Hydrozyklonen oder in sonstiger Weise erfolgen.
Es hat sich bewährt,
vor der Abtrennung die Mikroorganismen in der Fermentationsbrühe zu inaktivieren
(Sterilisieren der Fermentationsbrühe), beispielsweise durch übliche Pasteurisierungsverfahren wie
durch Eintrag von Wärme
und/oder Heißdampf. Hierzu
können übliche Wärmetauscher,
beispielsweise Rohrbündelwärmetauscher
oder Plattenwärmetauscher
eingesetzt werden.
Aus
der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe wird
anschließend
in Schritt b) die basische Aminosäure mit Hilfe einer Kationenaustauscheranordnung
abgetrennt. Die Abtrennung in Schritt b) umfasst erfindungsgemäß wenigstens
einen Beladungsschritt, bei der die basische Aminosäure auf
dem stark sauren Ionenaustauscher adsorbiert wird, und wenigstens
einen Elutionschritt, durch den die basische Aminosäure vom
Ionenaustauscher desorbiert wird. Diese Schritte können in
der angegebenen Reihenfolge mehrfach wiederholt werden und es können zwischen
den Schritten Waschschritte mit Wasser durchgeführt werden.
Die
im erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzte Kationenaustauscheranordnung umfasst einen oder mehrere,
z.B. 2, 3 oder 4, in Serie geschaltete Stufen, üblicherweise in Form von Ionenaustauschersäulen, die
als stationäre
Phase einen oder mehrere stark saure Kationenaustauscher enthalten.
Als
stark saure Kationenaustauscher kommen grundsätzlich alle Ionenaustauscherharze
in Betracht, die stark saure Gruppen, in der Regel Sulfonatgruppen,
aufweisen. In der Regel handelt es sich um partikelförmige, mäßig oder
stark vernetzte organische Polymere, häufig auf der Basis von Polystyrol, die
an der Oberfläche
der Polymerpartikel eine Vielzahl stark saure Gruppen aufweisen.
Die durchschnittliche Anzahl der sauren Gruppen liegt üblicherweise
im Bereich von 1 bis 4 meq/ml Ionentauscherharz. Die mittlere Teilchengröße der Ionentauscherpartikel
liegt typischerweise im Bereich von 0,1 bis 1 mm, wobei größere als
auch kleinere Teilchengrößen je nach
Abmessung der Ionentauscheranordnung geeignet sein können. Die
Polymerteilchen können
z.B. gel-artig sein oder eine makroporöse Struktur aufweisen.
Derartige
Ionentauscher sind bekannt und werden z.T. kommerziell für die Aufreinigung
von Aminosäuren
angeboten, beispielsweise unter den Handelsbezeichnungen Lewatit® K
oder Lewatit® S der
Fa. Bayer Aktiengesellschaft, z.B. Lewatit® K 2629,
Lewatit® S110,
Lewatit® S110H,
Lewatit® S1467,
Lewatit® S1468,
Lewatit® S2568,
Lewatit® S2568H,
Amberjet®,
Amberlyst® oder
Amberlite® der Fa.
Rohm & Haas,
z.B. Amberjet® 1200,
Amberjet® 1500,
Amberlite® 200,
Amberlite® 250,
Amberlite® IRV120,
Amberlite® IR
120, Amberlite® IR
2000, Amberlite® CG
6000, Amberlyst® 119
Wet, Dowex® der Firma
Dow Chemicals, z.B. Dowex® 50X1-100, Dowex® 50X2-100,
Dowex® 50X2-200,
Dowex® 50X2-400,
Dowex® 50X4-100,
Dowex® 50X4-200, Dowex® 50X4-400, Dowex® 50X8-100,
Dowex® 50X8-200,
Dowex® 50X8-400,
Dowex® 40X1-100, Dowex® 40X1-100,
Dowex® 40X1-100,
Dowex® HCR-S,
Dowex® HCR-W2,
Dowex® MSC-1,
Dowex® 650C,
Dowex® G26,
Dowex® 88,
Dowex® Monosphere
88, Dowex® Monosphere
99K/320, Dowex® Monosphere
99K/350, Dowex® Monosphere
99Ca/320, Dowex® Marathon
C, Dowex® 032,
Dowex® 406,
Dowex® 437,
Dowex® C500ES,
Dowex® XUS
43518, Dowex® XUS
40406.00, Diaion® der Fa. Mitsubishi Corp.,
z.B.
Diaion® SK1B,
Diaion® SK1BS,
Diaion® SK104,
Diaion® SK112,
Diaion® SK116,
Diaion® 1-3561,
Diaion® 1-3565,
Diaion® 1-3570,
Diaion® 1-3573,
Diaion® 1-3577,
Diaion® 1-3581,
Duolite® D 5427,
Duolite® D
5552 (organisch basierte Kationenaustauscher), weiterhin Adsorbosphere® SCX,
Bakerbond® SCX,
Partisil® SCX,
Spherisorb® SCX,
Supelcosil® LC3-SCX,
Ultralsil® SCX
und Zorbax® 300 SCX
(Silica-basierter Kationenaustauscher).
Die
Kationenaustauscheranordnung kann absatzweise betrieben werden und
weist dann ein oder mehrere, z.B. 2, 3 oder 4 in Serie geschaltete, stationäre Ionentauscherfestbetten
auf. Sie kann auch kontinuierlich betrieben werden und weist dann in
der Regel 5 bis 50 und insbesondere 15 bis 40 Ionentauscherbetten
auf, die z.B. Bestandteil einer "True
Moving Bed"-Anordnung
(siehe K. Tekeuchi J. Chem. Eng. Japan 11 (1978 S. 216–220), einer "Continuos Circulating
Annular"-Anordnung
(siehe J.P. Martin, Discuss. Farraday Soc. 1949, S. 7) oder einer "Simulated Moving
Bed"-Anordnung,
wie beispielsweise in
US 2,985,589 und
WO 01/72689 sowie von G.J. Rossiter et al. Proceedings of AIChE
Conference, Los Angeles, CA, Nov. 1991 oder H.J. Van Walsem et al.
J. Biochtechnol. 59 (1997) S 127–123 beschrieben, sein können.
Vor
dem Beladen des Kationenaustauschers mit der abzutrennenden basischen
Aminosäure
liegt das in der Ionenaustauscheranordnung enthaltene Kationenaustauschermaterial
in seiner Salzform vor, d.h. die stark sauren Gruppen des Kationenaustauschers
liegen in deprotonierter Form vor und koordinieren zur Ladungsneutralität eine entsprechende Anzahl
an Kationen. In der Regel handelt es sich bei den Kationen um Alkalimetallkationen,
insbesondere um Natriumionen oder besonders bevorzugt um Ammoniumionen
(NH4 +).
Zum
Beladen des Kationenaustauscher mit der basische Aminosäure leitet
man die angesäuerte wässrige Brühe in üblicher
Weise durch die Kationenaustauscheranordnung. Die Beladung kann
sowohl absteigend als auch aufsteigend erfolgen, wobei ersteres
bevorzugt ist. Die Beladung erfolgt vorzugsweise mit einer spezifischen
Fließrate
im Bereich von 0,1 h–1 bis 2 h–1.
Die Beladung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich
von 20 bis 70°C
und insbesondere im Bereich von 30 bis 60°C. Die Menge an wässriger
Brühe wird üblicherweise
so gewählt,
dass wenigstens 35% und insbesondere wenigstens 42% der in der wässrigen
Brühe enthaltenen
basischen Aminosäure
adsorbiert werden. Die Menge an wässriger Brühe beträgt in der Regel die 0,8-fache
bis 2-fache Menge
des Bettvolumens. Je nach Adsorptionsgrad kann der am Ausgang der
Kationenaustauscheranordnung anfallende Effluent noch basische Aminosäure enthalten,
so dass der Effluent, ggf. nach Einstellung des pH-Werts, in einer
nachfolgenden Stufe auf einen Ionentauscher geleitet werden kann.
Dem
Beladungsvorgang kann sich ein Waschschritt anschließen. Hierzu
wird Wasser durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Menge
an Waschwasser beträgt
auf dieser Stufe üblicherweise
das 0,05- bis 0,3-fache des Bettvolumens. Die dabei anfallenden
Waschwässer
können geringe
Mengen der basischen Aminosäure
enthalten und können
dann mit dem beim Beladen anfallenden Effluenten vereinigt werden.
Anders als in den Verfahren des Standes der Technik ist ein solcher Waschschritt
nicht erforderlich, so dass eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
keinen Waschritt umfasst und die Elution unmittelbar im Anschluß an das
Beladen erfolgt.
Dem
Beladungs- bzw. dem gegebenenfalls durchgeführten Waschschritt schließt sich
die Elution der basischen Aminosäure
an. Hierzu leitet man eine wässrige
Lösung
einer Base (Eluent) durch die Kationenaustauscheranordnung. Hierdurch
wird die basische Aminosäure
desorbiert und eluiert und der Kationenaustauscher regeneriert,
d.h. die sauren Gruppen des Kationenaustauschers werden wieder in
die Salzform überführt. Die
Basenkonzentration in dem Eluenten liegt üblicherweise im Bereich von
1 bis 10 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 2 bis 8 Gew.-%.
Geeignete Basen sind beispielsweise Ammoniak, Alkalimetallhydroxide
und -carbonate, wobei Natronlauge und insbesondere Ammoniak bevorzugt werden.
Die Menge an wässriger
Base beträgt
in der Regel die 0,5- bis 3-fache Menge des Bettvolumens. Bezüglich der
Temperaturen und Fließrate
gilt das für das
Beladen gesagte. Die Elution kann sowohl aufsteigend als auch absteigend
durchgeführt
werden. Die Elution kann in der gleichen Richtung wie die Beladung
oder entgegengesetzt hierzu durchgeführt werden.
Der
Elution kann sich ein weiterer Waschschritt anschließen, um
gegebenenfalls vorhandene Verunreinigungen zu entfernen. Hierzu
wird Wasser durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die
Menge an Waschwasser beträgt
auf dieser Stufe üblicherweise
das 0,05- bis 0,3-fache des Bettvolumens. Der beim Waschritt anfallende
Effluent wird als Abwasser mit geringer Salzfracht einer üblichen
Abwasserbehandlung oder einer sonstigen Aufarbeitung zugeführt.
Das
bei der Elution anfallende Eluat wird zur Gewinnung der Aminosäure in üblicher
Weise aufgearbeitet. In der Regel wird man hierzu das Eluat aufkonzentrieren,
z.B. durch Entfernen des Wasser in einer üblichen Verdampferanordnung.
Auf
diese Weise erhält
man eine konzentrierte wässrige
Lösung
der basischen Aminosäure,
aus der diese durch Fällung
oder Kristallisation, z.B. nach Zusatz von Salzsäure als Hydrochlorid, isoliert
werden kann. Verfahren hierzu sind dem Fachmann bekannt und in der
Literatur umfassend beschrieben (z.B. Hermann T. Industrial Production
of amino acids by coryneform bacteria, J. of Biotechnology, 104(2003),
155–172).
Das
beim Aufkonzentrieren anfallende wässrige Kondensat kann verworfen
oder in den Prozess zurückgeführt werden.
Beispielsweise kann das Kondensat in den Elutionsschritt der basischen
Aminosäure
in einer nachfolgenden Aminosäureabtrennung
zurückgeführt werden.
Vorzugsweise wird man hierzu das Kondensat im Anschluss an die Elution
mit der wässrigen
Base durch die Kationenaustauscheranordnung leiten. Der dabei anfallende
Ablauf enthält häufig noch
geringen Mengen an basischer Aminosäure und wird üblicherweise
in die Elution einer nachfolgenden Aminosäureabtrennung zurückgeführt.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist grundsätzlich
für die
Isolierung aller basischen Aminsäuren,
insbesondere natürlicher
Aminosäuren
wie Lysin, Ornithin, Histidin oder Arginin anwendbar und wird insbesondere
zur Isolierung von fermentativ hergestelltem L-Lysin eingesetzt.
Die Art des Fermentationsprozessese sowie der zur Herstellung der
Aminosäure
eingesetzte Mikroorganismenstamm spielen für das erfindungsgemäße Verfahren
keine Rolle, so dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung der
basischen Aminosäure
aus beliebigen Fermentationsbrühen
geeignet ist, eingesetzt werden
In
der Regel handelt es sich um Verfahren, bei denen man einen Mikroorganismenstamm,
der die gewünschte
basische Aminosäure
produziert, in einem Fermentationsmedium kultiviert, das als Substrat
mindestens eine Kohlenstoffquelle, z.B. Melasse und/oder Rohzucker,
und eine Stickstoffquelle, z.B. Ammoniak oder Ammoniumsalze wie
Ammoniumsulfat, sowie gegebenenfalls Mineralstoffe und Spurenelemente
enthält.
Diese Substratbestandteile können
als solche oder in Form einer komplexen Mischung, z.B. als Corn-Streep-Liquor,
eingesetzt werden.
Die
Art des Mikroorganismenstamms richtet sich naturgemäß nach der
Art der zu produzierenden Aminosäure.
In der Regel handelt es sich um Stämme, welche die gewünschte basische
Aminosäure überproduzieren.
Im Falle des L-Lysins, des Ornithins und des Histidins handelt es
sich in der Regel um Stämme
der Gattung Corynebacterium oder Brevi bacterium, z.B der Spezies
Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium lactofermentum, im
Falle des Arginins um Stämme
der Spezies Bacillus subtilis oder Brevibacterium flavum, wobei
jedoch in jüngerer
Zeit auch Stämme
anderer Gattungen eingesetzt werden.
In
der Regel wird man die Fermentation so weit führen, dass der Gehalt an basischer
Aminosäure
in der Fermentationsbrühe
im Bereich von 50 bis 200 g/L und insbesondere im Bereich von 80
bis 150 g/L liegt. Der Anteil an Biomasse, d.h. Mikroorganismen
(als Biotrockenmasse) und sonstige unlösliche Bestandteile biologischen
Ursprungs (z.B. Zellulosefasern aus der Glukosequelle), liegt üblicherweise
im Bereich von 3 bis 7 Gew.%. Daneben enthält die Fermentationsbrühe in der
Regel noch Restmengen an Sub strat, z.B. nicht verbrauchter Zucker
(üblicherweise
weniger als 40 g/l) sowie Nebenprodukte der Fermentation, z.B. saure
oder neutrale Aminosäuren oder
sonstige basische Aminsäuren,
Peptide und dergleichen. Der pH-Wert liegt häufig im Bereich von > 6 bis 7,5 und insbesondere
im Bereich von 6,2 bis 7,2. Daneben enthält die Fermentationsbrühe in der Regel
noch Restmengen an Substrat, z.B. nicht verbrauchter Zucker (üblicherweise
weniger als 40 g/l) sowie Nebenprodukte der Fermentation, z.B. saure oder
neutrale Aminosäuren
oder sonstige basische Aminsäuren,
Peptide und dergleichen.
Die
Fermentationsverfahren können
kontinuierlich oder absatzweise als Batch- oder Fed-Batch-Verfahren
durchgeführt
werden. In der Regel handelt es sich um eine Fermentationsbrühe, die
nach einem Fed-Batch-Verfahren hergestellt wurde, d.h. die Hauptmenge
der Substrate wird der Mikroorganismen-haltigen Brühe im Verlauf
der Fermentation zugeführt.
Derartige
Verfahren und geeignete Mikroorganismenstämme sind dem Fachmann bekannt,
z.B. aus dem eingangs zitierten Stand der Technik (siehe insbesondere
Pfefferte et al. und Th. Herrmann, loc.cit) sowie aus WO 95/16042,
WO 96/06180, WO 96/16042, WO 96/41042, WO 01/09306, EP-A 175309,
EP-A 327945, EP-A 551614, EP-A 837134,
US 4346170 ,
US 5305576 ,
US 6025165 ,
US 6653454 ,
DE 253199 ,
GB 851396 ,
GB 849370 und
GB 1118719 (Herstellung von L-Lysin),
EP-A 393708,
GB 1098348 ,
US 3668072 ,
US 3574061 ,
US 3532600 ,
US 2988489 ,
JP 2283290 ,
JP 57016696 (L-Ornithin),
US 3902967 ,
US 4086137 ,
GB 2084566 (Arginin)
US 3875001 und
US 3902966 (Histidin) bekannt.
Die
Maßnahmen
zur technischen Durchführung
und Steuerung derartiger Fermenationen sind dem Fachmann geläufig und
kann der einschlägigigen
Literatur, beispielsweise Storhas (s.o.) und J.E. Bailey et al.
Biochemical Engineering Fundamentals, 2. ed. MacGraw-Hill 1986,
Kapitel 9, entnommen werden.
Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele
erläutert,
die bevorzugte Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
darstellen und nicht einschränkend
zu verstehen sind.
Verwendete Abkürzungen:
-
- HDWW:
- Abwasser mit hoher
Salzfracht
- LDWW:
- Abwasser mit geringer
Salzfracht
- ID:
- Innendurchmesser
- H:
- Höhe
- Lys-HCl:
- L-Lysin-Monohydrochlorid
- BV:
- Bettvolumen (Volumen
des Kationenaustauschers in der Anordnung)
- SV:
- spezifische Fließrate (Fließgeschwindigkeit
in 1 BV/H)
Einsatzmaterialien:
Alle
Versuche wurden mit einer L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühe durchgeführt, die
in an sich bekannter Weise durch Fermentation mit C. glutamicum
hergestellt wurde. Die Fermentationsbrühe wies einen Gehalt an Lys-HCl
von 110 bis 130 g/l und einen Gehalt an Biomasse (als Biotrockenmasse
gerechnet) von 2,5–3,5
Gew.-% auf. Der Salzgehalt lag zwischen 3 und 5 Gew.-%.
Kationenaustauscheranordnung
In
Vergleichsbeispiel 1 und den Beispielen 1 und 2 diente als Kationenaustauscheranordnung
jeweils eine zylindrische Säule
mit den Abmessungen 125 mm (ID) × 495 mm (H), die mit 3000
ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes beladen war. Als
Kationenaustauscher diente ein sulfoniertes, vernetztes Polystyrol
vom Geltyp mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 0,6 mm (DIAION
SK1B der Firma Samyang Co. Ltd. Korea) und einer Gesamtkapazität > 2 meq/ml. Die Kationenaustauscheranordnung
wurde vor ihrer Benutzung mit 6 gew.-%igem wässrigem Ammoniak äquilibriert.
In
Beispiel 3 diente als Kationenaustauscheranordnung eine SepTor pilot
Anlage (Model 30-6, Torus Liquid Separation, Holland), die mit 22,8 L
stark saurem Kationenaustauscherharz beladen war. Als Kationenaustauscher
diente ein sulfoniertes, vernetztes Polystyrol vom Geltyp mit einer
mittleren Teilchengröße von etwa
0.6 mm (DIAION SK1B der Firma Samyang Co. Ltd. Korea) und einer
Gesamtkapazität > 2 meq/ml.