WO2005116228A2 - Fermentative herstellung von feinchemikalien - Google Patents

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Stephan Freyer
Markus Lohscheidt
Oskar Zelder
Matthias Boy
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Definitions

  • the present invention relates to the fermentative production of fine chemicals by grinding, liquefying and saccharifying starch sources and the use of the sugar solution thereby obtained as a fermentation medium.
  • Fermentative processes for the production of fine chemicals such as Amino acids, vitamins and carotenoids by microorganisms are generally known. Depending on the different process conditions, different carbon sources are used. These range from pure sucrose to beet and sugar cane molasses, so-called "high test molasses” (inverted sugar cane molasses) to glucose from starch hydrolysates. For the biotechnological production of L-lysine, acetic acid and ethanol are also mentioned as large-scale co-substrates ( Pfefferle et al., Biotechnological Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112).
  • starch An important source of carbon for the fermentative production of fine chemicals mediated by microorganisms is starch. This must first be liquefied and saccharified in upstream reaction steps before it can be used as a carbon source in a fermentation.
  • a natural starch source such as potatoes, cassava, cereals, e.g. Wheat, corn, barley, rye, triticale or rice are usually obtained in a pre-cleaned form and then liquefied and saccharified enzymatically, in order to be used in the actual fermentation for the production of fine chemicals.
  • non-pretreated starch sources for the production of carbon sources for the fermentative production of fine chemicals.
  • the starch sources are first crushed by grinding.
  • the regrind is then subjected to liquefaction and saccharification. Since this regrind naturally contains, in addition to starch, a number of non-starch-containing constituents which adversely affect the fermentation, these constituents are usually separated off before the fermentation.
  • the removal can be done either directly after grinding (WO 02/277252; JP 2001-072701; JP 56-169594; CN 1218111), after liquefaction (WO 02/277252; CN 1173541) or after saccharification (CN 1266102; Beukema et al .: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give eulture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229). In all variants, however, a largely pure starch hydrolyzate is used in the fermentation.
  • Newer techniques are concerned in particular with improved methods which require a purification e.g. of liquefied and saccharified starch solutions (JP 57159500) and fermentation media from renewable resources (EP 1205557).
  • Unprocessed starch sources are known to be widely used in the fermentative production of bioethanol.
  • the process of dry grinding, liquefaction and saccharification of starch sources known as “dry milling”, is technically established on a large scale.
  • Corresponding process descriptions can be found, for example, in “The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries ", Jaques et al. (Ed.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1 -8977676-735, and in McAloon et al., “Determining the cost of producing ethanol from com starch and lignocellulosic feedstocks", NREL / TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
  • whole grains are ground, preferably maize, wheat, barley, millet and rye.
  • wet milling no additional liquid is added.
  • the grinding into fine components serves to make the starch contained in the grains accessible to the action of water and enzymes in the subsequent liquefaction and saccharification.
  • the oxygen supply to the microorganisms used is a limiting factor. Little is known about the influence of high solid concentrations on the oxygen transition from the gas to the liquid phase and thus on the oxygen transfer rate. On the other hand, it is known that an increasing viscosity with increasing solids concentration leads to a reduced oxygen transfer rate. If surface-active substances are also introduced into the fermentation medium with the solids, they influence the tendency of the gas bubbles to coalesce. The resulting bubble size in turn has a significant influence on oxygen transfer (Mersmann, A. et al .: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).
  • JP 2001/275693 describes a process for the fermentative production of amino acids, in which peeled cassava tubers are used as the starch source and have been dry milled. To carry out the process, however, it is necessary to set a particle size of the ground material of ⁇ 150 ⁇ m. In the filtration used for this purpose, more than 10% by weight of the regrind used, including components not containing starch, are separated off prior to the liquefaction / saccharification of the starch contained and the subsequent fermentation. In addition, the problem of separating non-starchy components does not arise in that the fermentation products, e.g. Lysine, are intended as a feed additive and therefore the non-starchy components of the cassava can remain in the product of value.
  • the fermentation products e.g. Lysine
  • cassava should be relatively unproblematic compared to other starch sources for dry milling. While the starch content of the cassava root in the dry state is typically at least 80% by weight (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Vol.
  • the dry starch content is significantly lower in comparison with cereals, generally below 70% by weight, for example about 68% by weight for corn and about 65 for wheat % By weight (Jaques et al., The Alcohol Textbook, see above). Accordingly, the glucose solution obtained after liquefaction and saccharification contains fewer foreign components and, in particular, fewer solids when using dry-ground cassava than when using another dry-ground starch source.
  • the viscosity of the reaction mixture is increased by an increased amount of foreign constituents.
  • starch from cassava should be relatively easy to process. Compared to maize starch, it has a higher viscosity at the swelling temperature, but the viscosity decreases more quickly with cassava than with maize starch (Menezes, TJB de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, page 24, right column).
  • the swelling and gelatinization temperatures of starch from cassava are lower than that of starch from cereals such as maize, which is why it is more accessible to bacterial amylase than cereal starch (Menezes, T.J.B. de, op. Cit.).
  • cassava over other starch sources are its low cellulose content and its low phytate content.
  • Cellulose and hemicellulose can be converted into furfurals, especially under acidic saccharification conditions (Jaques et al., The Alcohol Textbook, see above; Menezes, T.J.B. de, see above), which in turn can have an inhibitory effect on the microorganisms used in the fermentation.
  • Phytate also inhibits the microorganisms used for fermentation.
  • cassava as a starch source in a process corresponding to dry milling
  • a process based on cassava is nevertheless complex, not optimized and therefore not widely used.
  • the invention thus relates to a process for producing at least one microbial metabolite with at least 3 C atoms or with at least 2 C atoms and at least 1 N atom by sugar-based microbial fermentation, comprising:
  • a microorganism strain producing the desired metabolic product (s) is cultivated with the sugar-containing liquid medium, which is obtained by:
  • dry corn fruits or seeds come into consideration as starch sources, which in the dried state have at least 40% by weight and preferably at least 50% by weight of starch.
  • starch sources which in the dried state have at least 40% by weight and preferably at least 50% by weight of starch.
  • the starch source is preferably selected from cereal grains, particularly preferably from maize, rye, triticale and wheat grains.
  • the method according to the invention can also be carried out with other starch sources, such as, for example, potatoes, cassava / tapioca or a mixture of different starch-containing fruits or seeds.
  • the sugars contained in the sugar-containing liquid medium are preferably monosaccharides such as hexoses and pentoses, for example glucose, fructose, mannose, galactose, sorbose, xylose, arabinose and ribose, in particular glucose.
  • monosaccharides such as hexoses and pentoses
  • glucose fructose, mannose, galactose, sorbose, xylose, arabinose and ribose
  • the proportion of monosaccharides other than glucose can depend on the starch source used and the non-starchy content contained therein. Components vary and are influenced by the process control, for example by disintegrating cellulose components by adding cellulases.
  • the monosaccharides of the sugar-containing liquid medium advantageously comprise a proportion of glucose of at least 60% by weight, preferably at least 70% by weight and particularly preferably at least 80% by weight, based on the total amount of sugar contained in the sugar-containing liquid medium.
  • the amount of glucose is usually in the range from 75 to 99% by weight, in particular from 80 to 97% by weight and especially from 85 to 95% by weight, based on the total amount of sugar contained in the sugar-containing liquid medium.
  • the sugar-containing liquid medium with which the microorganism strain producing the desired metabolic products is cultivated contains at least part, preferably at least 20% by weight, in particular at least 50% by weight, especially at least 90% by weight and very particularly at least 99% by weight .-% of the non-starchy solid components contained in the ground cereal grains, according to the degree of grinding.
  • the proportion of the non-starch-containing solid constituents in the sugar-containing liquid medium is preferably at least 10% by weight and in particular at least 25% by weight, e.g. between 25 and 75% by weight and especially between 30 and 60% by weight.
  • the respective starch source with or without the addition of liquid, e.g. Water, milled, preferably without adding liquid.
  • Dry grinding can also be combined with a subsequent wet grinding.
  • hammer mills, rotor mills or roller-grist mills are typically used; Mixers, agitator ball mills, circulation mills, disk mills, ring chamber mills, vibratory mills or planetary mills are suitable for wet grinding. Basically, other mills can also be used.
  • the person skilled in the art can determine the amount of liquid required for wet grinding in routine experiments. It is usually set so that the dry matter content is in the range from 10 to 20% by weight.
  • a suitable grain size for the subsequent process steps is set by the grinding. It has proven to be advantageous here if the ground material obtained in grinding, in particular in the case of dry grinding, in step a1) has flour particles, ie particulate constituents, with a grain size in the range from 100 to 630 ⁇ m in a proportion of 30 to 100% by weight. %, preferably 40 to 95% by weight and particularly preferably 50 to 90% by weight.
  • the ground material obtained preferably contains 50% by weight of flour particles with a grain size of more than 100 ⁇ m. As a rule, at least 95% by weight of the ground flour particles have a grain size of less than 2 mm.
  • the grain size is measured by sieve analysis using a vibration analysis machine.
  • a minor one Grain size is generally advantageous for achieving a high product yield.
  • a too small particle size can, however, lead to problems, in particular due to lump formation / agglomeration, when mashing the ground material during liquefaction or when working up, for example when drying the solids after the fermentation step.
  • Flours are usually characterized by the degree of grinding or by the type of flour, and these correlate with one another in such a way that the number of types of flour increases with the degree of grinding.
  • the degree of grinding corresponds to the amount by weight of the flour obtained, based on 100 parts by weight of the ground material used. While at first pure, finest flour, e.g. accumulates from the inside of the grain, increases the proportion of crude fiber and husk content in the flour during further grinding, i.e. with increasing degree of grinding, the starch content is reduced.
  • the degree of grinding is therefore also reflected in the so-called flour type, which is used as a figure to classify flours, in particular cereal flours, and which is based on the ash content of the flour (so-called ash scale).
  • the flour type or number of types indicates the amount of ash (minerals) in mg that remains after burning 100 g of flour dry substance.
  • a higher type number means a higher degree of grinding, since the core of the cereal grain contains about 0.4% by weight, while the shell contains about 5% by weight of ash.
  • the cereal flours mainly consist of the crushed flour body, i.e. the starch component of the cereal grains; with a higher degree of grinding, the cereal flours also contain the chopped, protein-containing aleurone layer of the cereal grains, with grist also the components of the protein and fat-containing seedling as well as the crude fiber and ash-containing seed shells.
  • Flours with a high degree of grinding or a high number of types are generally preferred for the purposes of the invention. If grain is used as a starch source, the whole unpeeled grains are preferably ground and processed further.
  • the starch source will be comminuted to a size suitable for milling before milling, for example when using larger fruits such as potatoes or cassava. In the case of grain, this crushing step can be omitted and the whole grain is used and ground.
  • At least a portion of the regrind is preferably given in step a2), preferably at least 40% by weight, in particular at least 50% by weight and very particularly preferably at least 55% by weight in the course of the liquefaction the saccharification in the reactor. Frequently, the amount added will not exceed 90% by weight, in particular 85% by weight and particularly preferably 80% by weight.
  • the partial amount of regrind added in the course of the process is preferably fed to the reactor under conditions such as are present during the liquefaction.
  • the addition can be discontinuous, ie in portions in several portions, preferably not more than 20% by weight, particularly preferably not make up more than 10% by weight, for example 1 to 20% by weight, in particular 2 to 10% by weight, of the total amount of the ground material to be liquefied, or take place continuously. It is essential to the invention that at the beginning of the liquefaction, only a part of the millbase, preferably not more than 60% by weight, in particular not more than 50% by weight and particularly preferably not more than 45% by weight of the millbase, is present in the reactor is located and the remaining amount of the ground material is added during the liquefaction.
  • the liquefaction can also be carried out continuously, for example in a multi-stage reaction cascade.
  • the liquefaction in step a2) takes place in the presence of at least one starch liquefying enzyme, which is preferably selected from ⁇ -amylases.
  • starch liquefying enzyme which is preferably selected from ⁇ -amylases.
  • Other enzymes which liquefy and stabilize starch under the reaction conditions can also be used.
  • the ⁇ -amylase (or the starch liquefying enzyme used) can be placed in the reaction vessel or added in the course of step a2).
  • a partial amount of the ⁇ -amylase required in step a2) is preferably added at the beginning of step a2) or this partial amount is placed in the reactor.
  • the total amount of ⁇ -amylase is usually in the range from 0.002 to 3.0% by weight, preferably from 0.01 to 1.5% by weight and particularly preferably from 0.02 to 0.5% by weight, based on the total amount of starch source used.
  • the liquefaction can be carried out above or below the gelation temperature.
  • the liquefaction in step a2) is preferably carried out at least temporarily above the gelation temperature of the starch used (so-called cooking process).
  • a temperature in the range between 70 and 165 ° C., preferably between 80 and 125 ° C. and particularly preferably between 85 and 115 ° C. is chosen, the temperature preferably being at least 5 ° C. and particularly preferably at least 10 ° C. above the gelation temperature.
  • step a2) is preferably carried out at least at times at a pH in the weakly acidic range, preferably between 4.0 and 7.0, particularly preferably between 5.0 and 6.5, usually before or at the beginning of step a2) the pH is adjusted; this pH value is preferably checked during the liquefaction and adjusted if necessary.
  • the pH is preferably adjusted with dilute mineral acids such as H 2 SO 4 or H 3 PO 4 or with dilute alkali solutions such as NaOH or KOH.
  • step a2) of the process according to the invention is carried out in such a way that initially a partial amount of at most 60% by weight, preferably at most 50% by weight and particularly preferably at most 45% by weight, for example 10 to 60% by weight. %, in particular 15 to 50% by weight and particularly preferably 20 to 45% by weight, based on the total amount of the ground material, in an aqueous liquid, for example fresh water, recycled process water, for example from fermentation or processing, or suspended in a mixture of these liquids and then the liquefaction is carried out.
  • an aqueous liquid for example fresh water, recycled process water, for example from fermentation or processing, or suspended in a mixture of these liquids and then the liquefaction is carried out.
  • the liquid used to produce the suspension it is possible to bring the liquid used to produce the suspension to a slightly elevated temperature, e.g. in the range of 40 to 60 ° C, to pre-temper. However, it is preferred to use the liquids at room temperature.
  • the at least one starch-liquefying enzyme preferably an ⁇ -amylase
  • ⁇ -amylase it is advantageous to add only a subset of the ⁇ -amylase, e.g. 10 to 70% by weight and in particular 20 to 65% by weight, based on the total of ⁇ -amylase used in step a2).
  • the amount of ⁇ -amylase added at this time depends on the activity of the respective ⁇ -amylase in relation to the starch source used under the reaction conditions and is usually in the range from 0.0004 to 2.0% by weight, preferably from 0.001 up to 1.0% by weight and particularly preferably from 0.02 to 0.3% by weight, based on the total amount of the starch source used.
  • the portion of the ⁇ -amylase can be mixed with the liquid used before preparing the suspension.
  • the partial amount of ⁇ -amylase is preferably heated to the temperature used for liquefaction, especially at room temperature or only a slightly elevated temperature, e.g. in the range of 20 to 30 ° C, added to the suspension.
  • the amounts of ⁇ -amylase and regrind are advantageously selected so that the viscosity is sufficiently reduced during the gelling process to enable effective mixing of the suspension, for example by means of stirring.
  • the viscosity of the reaction mixture during gelling is preferably at most 20 Pas, particularly preferably at most 10 Pas and very particularly preferably at most 5 Pas. Viscosity is usually measured using a Haake Roto Visko RV20 viscometer with M5 measuring system and MVDIN measuring device at a temperature of 50 ° C and a shear rate of 200 s "1 .
  • the suspension thus prepared is then preferably heated to a temperature above the gelation temperature of the starch used.
  • a temperature in the range between 70 and "165 ° C, preferably between 80 and 125 ° C, and more preferably selected from 85 to 115 ° C, with the temperature pre preferably at least 5 ° C, and most preferably at least 10 ° C.
  • further portions of the starch source for example 2 to 20% by weight and in particular 5 to 10% by weight, based on the total amount of starch used, are gradually added to the starch-containing suspension. It is preferred to add those in the course of liquefaction.
  • the portion of the grinding stock not used when preparing the suspension can be added continuously during the liquefaction.
  • the temperature should advantageously be kept above the gelation temperature of the starch during the addition.
  • the reaction mixture is usually left for a while, e.g. 30 to 60 minutes or longer, if necessary, kept at the temperature set above the gelation temperature of the starch, i.e. overcooked.
  • the reaction mixture is then typically brought to a slightly lower temperature above the gelation temperature, e.g. 75 to 90 ° C, cooled, before another portion of ⁇ -amylase, preferably the majority, is added.
  • the amount of ⁇ -amylase added at this time is preferably 0.002 to 2.0% by weight, particularly preferably from 0.01 to 1.0% by weight and very particularly preferably from 0.02 to 0.4% by weight, based on the total amount of the starch source used.
  • the reaction mixture is kept at the set temperature or, if appropriate, heated further until the starch detection with iodine or possibly another test for the detection of starch is negative or at least substantially negative. If necessary, one or more further subsets of ⁇ -amylase, e.g. in the range of 0.001 to 0.5% by weight and preferably 0.002 to 0.2% by weight, based on the total amount of the starch source used, are added to the reaction mixture.
  • saccharification of the dextrins contained in the liquid medium is carried out continuously or discontinuously, preferably continuously.
  • the liquefied medium can be completely saccharified in a special saccharification tank before it is fed to the fermentation step b).
  • it has proven advantageous to carry out only partial saccharification before fermentation For example, one can proceed in such a way that a subset of the dextrins contained in the liquid medium, for example in the range from 10 to 90% by weight and in particular in the range from 20 to 80% by weight, based on the total weight of the dextrins ( or the original starch), saccharified and the resulting sugar-containing liquid medium is used in the fermentation.
  • saccharification can then take place in situ in the fermentation medium.
  • the saccharification can also be carried out directly in the fermenter (in situ) without the need for a separate saccharification tank.
  • the advantages of in-situ saccharification, ie saccharification partially or completely in the fermenter, are on the one hand reduced investment costs, and on the other hand a delayed release of the glucose can possibly result in a higher glucose concentration in the batch (batch) without any inhibition or Metabolism change of the microorganisms used occurs.
  • too high a concentration of glucose for example, leads to the formation of organic acids (acetate), while Saccharomyces cerevisae in this case switches to fermentation, for example, although there is sufficient oxygen in aerated fermenters (crabtree effect).
  • a delayed release of glucose can be adjusted by regulating the glucoamylase concentration. As a result, the aforementioned effects can be suppressed and more substrate can be placed in front, so that the dilution resulting from the feed stream supplied can be reduced
  • the liquefied starch solution is usually brought up to or slightly below the temperature optimum of the saccharifying enzyme, e.g. cooled to 50 to 70 ° C, preferably 60 to 65 ° C or tempered and then mixed with glucoamylase.
  • the liquefied starch solution is usually brought up to the fermentation temperature, ie. H. 32 to 37 ° C, cool before feeding them to the fermenter.
  • the glucoamylase (or the at least one saccharifying enzyme) for saccharification is added directly to the fermentation broth.
  • the saccharification of the liquefied starch according to step a2) takes place parallel to the metabolism of the sugar by the microorganisms according to step b).
  • the pH of the liquid medium is advantageously set to a value in the optimal range of action of the glucoamylase used, preferably in the range between 3.5 and 6.0; particularly preferably between 4.0 and 5.5 and very particularly preferably between 4.0 and 5.0.
  • panthothenate and vitamin B 2 for example, this can be advantageous overall despite the restricted activity of standard glucoamylases in this pH range or be necessary due to the fermentation conditions to be set.
  • saccharification takes place in a special saccharification tank.
  • the liquefied starch solution is heated to a temperature which is optimal for the enzyme or slightly below it, and the pH is adjusted to a value which is optimal for the enzyme in the manner described above.
  • the glucoamylase is usually added to the liquid medium containing dextrin in an amount of from 0.001 to 5.0% by weight, preferably from 0.005 to 3.0% by weight and particularly preferably from 0.01 to 1.0% by weight, based on the total amount of starch source used.
  • the dextrin-containing suspension is preferably kept at the set temperature for a period of, for example, 2 to 72 hours or longer, if necessary in particular from 5 to 48 hours, the dextrins being saccharified to monosaccharides.
  • the progress of saccharification can be followed using methods known to those skilled in the art, for example HPLC, enzyme tests or glucose test sticks. The saccharification is complete when the concentration of the monosaccharides no longer rises or falls significantly.
  • the discontinuous or continuous, preferably the discontinuous and in particular portionwise addition of the millbase takes place in the presence of the at least one ⁇ -amylase and the at least one glucoamylase in step a2) in such a way that the viscosity of the liquid medium is at most 20 Pas, preferably is a maximum of 10 Pas and particularly preferably a maximum of 5 Pas.
  • the viscosity control it has proven to be advantageous if at least 25% by weight, preferably at least 35% by weight and particularly preferably at least 50% by weight of the total amount of the millbase added at a temperature above the gelatinization temperature of the millbase Starch can be added.
  • the control of the viscosity can further be influenced by adding the at least one starch liquefying enzyme, preferably an ⁇ -amylase, and / or the at least one saccharifying enzyme, preferably a glucoamylase, itself in portions.
  • the sugar-containing liquid With a monosaccharide content of preferably more than 30% by weight, particularly preferably more than 35% by weight and very particularly preferably more than 40% by weight ,
  • all ⁇ -amylases can be used to liquefy the starch content in the regrind, in particular ⁇ -amylases obtained from Bacillus lichenformis or Bacillus staerothermophilus and especially those that liquefy by dry milling processes obtained materials can be used in the production of bioethanol.
  • the ⁇ -amylases suitable for liquefaction are also commercially available, for example from Novozymes under the name Termamyl 120 L, type L; or from Genencor under the name Spezyme.
  • a combination of different ⁇ -amylases can also be used for liquefaction.
  • all glucoamylases can be used to saccharify the dextrins (ie oligosaccharides) in the liquefied starch solution.
  • the, in particular glucoamylases which were obtained from Aspergilus and especially those which are used for saccharification of materials obtained by dry-milling processes in the context of the production of bioethanol.
  • the glucoamylases suitable for saccharification are also commercially available, for example from Novozymes under the name Dextrozyme GA; or from Genencor under the name Optidex.
  • a combination of different glucoamylases can also be used.
  • the concentration of Ca 2+ ions can be adjusted to an enzyme-specific optimal value, for example with CaCl 2 . Suitable concentration values can be determined by the person skilled in the art in routine experiments. If, for example, termamyl is used as the ⁇ -amylase, it is advantageous to set a Ca 2+ concentration in the liquid medium of, for example, 50 to 100 ppm, preferably 60 to 80 ppm and particularly preferably about 70 ppm.
  • the whole starch source e.g. in the case of grain the whole grain is ground, this also includes the non-starchy solid components of the starch source. This often requires the entry of a not negligible proportion of phytate from the corn crop.
  • at least one phytase is advantageously added to the liquid medium in step a2) before the sugar-containing liquid medium is fed to the fermentation step b).
  • the phytase can be added before, during or after the liquefaction or the sugarification, provided that it has the required heat stability.
  • Phytases can be used, provided their activity is at most insignificantly restricted under the reaction conditions.
  • the amount of phytase is usually 1 to 10,000 units / kg of starch source and in particular 10 to 2000 units / kg of starch source.
  • enzymes for example pullulanases, cellulases, hemicellulases, glucanases, xylanases, glucosidases or proteases, can also be added to the reaction mixture during the production of the sugar-containing liquid medium.
  • the addition of these enzymes can have a positive influence on the viscosity, ie reduce it (for example by cleavage of longer-chain glucans and / or (arabino-) xylans), the release of metabolizable glucosides and the release of (residual) starch.
  • the use of proteases has analogous positive effects, whereby additional amino acids can be released as growth factors for the fermentation.
  • the sugar-containing liquid medium can advantageously be used for the fermentative production of a microbial metabolite with at least 3 C atoms or with at least 2 C atoms and at least 1 N atom.
  • the sugar-containing liquid medium produced in step a) is fed to a fermentation according to b).
  • fine chemicals, ie compounds with at least 3 carbon atoms and / or at least one nitrogen atom and at least 2 carbon atoms are produced by the microorganisms.
  • the fermentation process can generally be carried out in the customary manner known to the person skilled in the art.
  • the volume ratio of the supplied sugar-containing liquid medium to the liquid medium which is present and which contains the microorganisms is generally in the range from about 1:10 to 10: 1, for example about 1: 2 or about 2: 1 and in particular about 1: 1.
  • the sugar content in the fermentation broth can be regulated via the feed rate of the sugar-containing liquid medium.
  • the feed rate will be adjusted so that the monosaccharide content in the fermentation broth is in the range from 0 0% by weight to about 5% by weight; however, the fermentation can also be carried out at significantly higher monosaccharide contents in the fermentation broth, for example about 10 to 20% by weight.
  • the sugar-containing liquid medium obtained in step a) can optionally be sterilized before the fermentation, the microorganisms being killed by thermal, chemical or mechanical methods.
  • the broth is usually heated to temperatures above 80 ° C.
  • the cells can be killed or lysed immediately before the fermentation.
  • the entire sugar-containing liquid medium is fed to the lysis or killing. This can be done thermally, mechanically or chemically.
  • a preferred embodiment of the invention relates to a method in which the liquid medium obtained in step a) is immediate, i.e. without prior sterilization, the fermentation is carried out or an at least partial in-situ saccharification is carried out.
  • the fermentation results in a liquid medium which, in addition to the desired non-volatile microbial metabolite, essentially the biomass produced during the fermentation, the non-metabolized components of the saccharified starch solution and in particular the non-starch-containing solid components of the starch source, such as fibers and unused sugar , and contains unused buffer and nutrient salts.
  • This liquid medium is also referred to in the present application as a fermentation broth, the expression fermentation broth also encompassing the (sugar-containing) liquid medium in which there is only a partial or incomplete fermentative conversion of the sugars contained therein, ie a partial or incomplete microbial metabolism of the monosaccharides ,
  • fine chemical in the following includes in particular organic, optionally 1 or more, e.g.
  • B 1, 2, 3 or 4 hydroxyl-bearing mono-, di- and tricarboxylic acids with preferably 3 to 10 carbon atoms, for example tartaric acid, itaconic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, 2,5-furanedicarboxylic acid, 3-hydroxypropionic acid, glutaric acid, Levulinic acid, lactic acid, propionic acid, gluconic acid, aconitic acid and diaminopimelic acid, citric acid; proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, for example lysine, glutamate, methionine, phenylalanine, aspartic acid and threonine; Purine and pyrimidine bases; Nucleosides and nucleotides, for example nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and adenosine 5'-monophosphate (AMP); lipids; saturated and unsaturated fatty acids with preferably 10 to 22 carbon atom
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for normal enzyme activity to occur. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic. Examples of such molecules are NAD and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP); the precursor of these cofactors is niacin.
  • the term "nutraceutical” encompasses food additives which are beneficial to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and certain lipids, e.g. Polyunsaturated fatty acids.
  • the metabolic products produced include 3 to 10 enzymes, amino acids, vitamins, disaccharides, aliphatic mono- and dicarboxylic acids C atoms, aliphatic hydroxycarboxylic acids with 3 to 10 C atoms, ketones with 3 to 10 C atoms, alkanols with 4 to 10 C atoms, alkane diols with 3 to 8 C atoms and polyhydroxyalkanoates.
  • non-volatile metabolic products are understood to mean compounds which, in general, cannot be removed from the fermentation broth without being decomposed by distillation. These compounds generally have a boiling point above the boiling point of water, often above 150 ° C and in particular above 200 ° C at normal pressure. As a rule, these are compounds which are present in a solid state under normal conditions (298 K, 101, 3 kPa).
  • non-volatile microbial metabolites which have a melting point below the boiling point of water or / and an oily consistency at normal pressure.
  • the maximum temperature will generally be checked during processing, especially during drying.
  • These compounds can also advantageously be produced by formulating them in quasi-solid form (pseudo-solid form) on adsorbents. As a rule, the solid constituents of the fermentation broth are separated off in this case before the depletion or isolation of the valuable product in step c).
  • Suitable adsorbents for the aforementioned purpose are, for example, activated carbons, aluminum oxides, silica gels, silica, clay, carbon blacks, zeolites, inorganic alkali and alkaline earth metal salts such as sodium, potassium, magnesium and calcium hydroxides, carbonates, silicates, sulfates and phosphates , in particular magnesium and calcium salts, for example Mg (OH) 2 , MgCO 3 , MgSiO, CaSO 4 , CaCO 3) alkaline earth metal oxides, for example MgO and CaO, other inorganic phosphates and sulfates, for example ZnSO, salts of organic acids, in particular their alkali and Alkaline earth metal salts and especially their sodium and potassium salts, for example sodium and potassium acetate, formate, hydrogen formate and citrate, as well as higher molecular weight organic carriers such as carbohydrates, for example sugar, optionally modified starches, cellulose, lignin, and generally
  • the carrier materials mentioned will have no or only small proportions, in particular only traces of halogens such as chloride ions and of nitrates.
  • examples of compounds which have a melting point below the boiling point of water or / and an oily consistency at normal pressure and which can advantageously be prepared in this way by the process according to the invention are ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and Docosahexaenoic acid, also propionic acid, lactic acid, propanediol, butanol and acetone.
  • these compounds in pseudo-solid formulation are also understood to be non-volatile microbial metabolites in solid form.
  • microorganisms used in the fermentation depend in a manner known per se on the respective fine chemicals, as explained in detail below. They can be of natural origin or genetically modified. Examples of suitable microorganisms and fermentation processes are given in Table A below:
  • Preferred embodiments of the method according to the invention relate to the production of enzymes such as phytases, xylanases, glucanases; Amino acids such as lysine, methionine, threonine; Vitamins such as pantothenic acid and riboflavin; Precursors and follow-up products thereof; and the preparation of the abovementioned mono-, di- and tricarboxylic acids, in particular aliphatic mono- and dicarboxylic acids with 3 to 10 carbon atoms such as propionic acid and succinic acid, aliphatic hydroxycarboxylic acids with 3 to 10 carbon atoms such as lactic acid; of the aforementioned longer-chain alkanols, in particular alkanols having 4 to 10 carbon atoms, such as butanol; of the aforementioned diols, in particular alkane diols with 3 to 8 carbon atoms, such as propanediol; of the aforementioned ketones, in
  • the microorganisms used in the fermentation are therefore selected from natural or recombinant microorganisms which produce at least one of the following metabolic products: enzymes such as phytase, xylanase, glucanase; Amino acids such as lysine, threonine and methionine; Vitamins such as pantothenic acid and riboflavin; Precursors and / or derived products thereof; Disaccharides such as trehalose; aliphatic mono- and dicarboxylic acids with 3 to 10 carbon atoms such as propionic acid and succinic acid; aliphatic hydroxycarboxylic acids with 3 to 10 carbon atoms such as lactic acid; Ketones with 3 to 10 carbon atoms such as acetone; Alkanols with 4 to 10 carbon atoms, such as butanol; Alkanediols with 3 to 8 carbon atoms, such as propanediol; and polyhydroxy
  • the microorganisms are selected from the genera Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium and Clostridium, in particular re among strains of Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger, or Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbschreibii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum and Clostridium acetobutlicum ,
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is lysine.
  • Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used to carry out the fermentation, e.g. in Pfefferle et al., loc. cit. and US 3,708,395.
  • both a continuous and a discontinuous (batch or fed-batch) mode of operation come into consideration; the fed-batch mode of operation is preferred.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is methionine.
  • Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used to carry out the fermentation, e.g. in WO 03/087386 and WO 03/100072.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is pantothenic acid.
  • Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used to carry out the fermentation, e.g. in WO 01/021772.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is polyhydroxyalkanoates such as poly-3-hydroxybutyrate and copolyesters with other organic hydroxycarboxylic acids such as 3-hydroxyvaleric acid, 4-hydroxybutyric acid and others which are used in Steinbüchel (loc. Cit.) Are described, e.g. also longer-chain hydroxycarboxylic acids such as 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxydecanoic acid and 3-hydroxytetradecanoic acid, and mixtures thereof. Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used to carry out the fermentation, e.g. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Vol. 14, (1996), pp. 431-438.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is riboflavin.
  • Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used to carry out the fermentation, for example in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 and Fujioka, K .: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this ri- boflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is a phytase.
  • Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used to carry out the fermentation, e.g. in WO 98/55599.
  • a sterilization step is optionally carried out in the manner described above.
  • the isolation or depletion of the metabolic product from the fermentation broth according to step c) is generally carried out in such a way that at least one metabolic product is depleted or isolated from the fermentation broth in such a way that the content of this metabolic product in the remaining fermentation broth is at most 20% by weight, in particular at most 10% by weight, especially at most 5% by weight and very particularly at most 2.5% by weight, in each case based on the total weight of the remaining fermentation broth.
  • the isolation or depletion of fine chemicals (i.e. the microbial metabolite) from the fermentation broth according to step c) can be carried out in one or more steps.
  • An important step in this is the separation of the solid components from the fermentation broth. This can be done either before or after the isolation of the valuable product.
  • Solid-liquid phase separation conventional methods are known in the art, which also include steps for the coarse and fine cleaning of the valuable materials as well as for packaging (e.g. described in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988 ), and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th edition on CD-ROM, Willey-VCH).
  • the product of value can advantageously proceed by first removing the solid constituents from the fermentation broth, for example by means of centrifugation or filtration, and then isolating the product of value from the liquid phase, for example by crystallization, precipitation, adsorption or distillation.
  • the product of value can also be isolated directly from the fermentation broth, for example by using chromatographic processes or extraction processes. Ionic exchange chromatography, in which the product of value can be selectively isolated on the chromatography column, should be mentioned in particular as a chromatographic method.
  • the solids are advantageously separated off from the remaining fermentation broth, for example by decanting, evaporating or drying.
  • Usual filtration methods are e.g. cake and depth filtration (e.g.
  • centrifugation methods are e.g. in G. Hultsch, H. Wilkesmann, "Filtering Centrifuges,” in D.B. Purchas, Solid - Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp. 493-559; and H. Trawinski, The Equivalent Clarification Area of Centrifuges, Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612.
  • Various designs, such as tube and basket centrifuges, as well as special push and inverted filter centrifuges and plate separators can be used.
  • Usual extraction methods include batch-wise or step-wise and differential continuous methods in cocurrent or countercurrent. You can work with two or one moving phases.
  • the solubility of the valuable substances and the secondary components to be separated in both phases can be influenced, among other things, by the choice of solvent, by variation of the counterions and by variation of the pH (Treybal, RE, Mass Transfer Operations, 3rd edition, New York, Mc Graw-Hill, 1979; Kula, M., Kroner, KH, Hustedt, H. and Schutee, H., Technical aspects of extractive enzyme purification, Ann. NY Acad. Sei., 341 (1981); Robinson, RG, and Cha, DY, Controlled pH extraction in the Separation of weak acids and bases, Biotech. Progress, 1 (1), 18 (1985)).
  • activated carbons In addition to many other adsorbents, activated carbons, ion exchange resins, natural or synthetic zeolites and activated aluminum oxides can be used. In addition, methods for affinity adsorption can also be used (e.g. described in Arnold, F.H., Blanch, H.W., and Wilke, C.R., Analysis of Affinity separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985)).
  • Chromatography precipitation, ultra-, micro- and nanofiltration, reverse osmosis, electrophoresis, electrodialysis and isoelectric focusing, for example, can be used in particular for cleaning the fine chemicals.
  • Chromatographic processes can be carried out batchwise or continuously.
  • Continuous chromatography includes, for example, a Continuous Rotating Annular Chromatograph (CRAC) (e.g. described in AJP Martin, Discuss. Farra day Soc. 7 (1949)), a True Moving Bed Chromatograph (TMBC) (e.g. described in K. Takeuchi, T Miyauchi, Y. Uraguchi, J. Chem. Eng.
  • CRAC Continuous Rotating Annular Chromatograph
  • TMBC True Moving Bed Chromatograph
  • the valuable substances or the secondary components can be precipitated (J. W. Mullin: Crystallization, 3rd ed., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993).
  • the precipitation can e.g. can be initiated by adding another solvent, adding salts and varying the temperature.
  • the resulting precipitate can be separated from the broth by the usual methods for separating solids described above.
  • microporous AS Michaels: “Ultrafiltration,” in ES Perry (ed.): Progress in Separation and Purification, vol. 1, Interscience Publ., New York 1968 .
  • homogeneous J. Crank, GS Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968; SA Stern: “The Separation of Gases by Selective Permeation,” in P.
  • Typical materials are cellulose esters, nylon, polyvinyl chloride, acrylonitrile, polypropylene, polycarbonate and ceramics. These membranes are used as a plate module (RF Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems, Elsevier, Amsterdam 1977), spiral module (US 3 417 870, 1968 (DT Bray)), tube bundle or hollow fiber module (H Strathmann: “Synthetic Membranes and their Preparation,” in MC Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp. 1-60). In addition, the use of liquid membranes is possible (NN Li: “Permeation Through Liquid Surfactant Membranes," AlChE J.
  • the desired material can be enriched on the feed side and via the retentate stream discharged and depleted on the feed side and discharged via the filtrate / permeate stream.
  • Electrophoretic processes are e.g. in Rudge, SR, Ladisch, MR, Process Consolidations for scale-up of liquid chromatography and electrophoresis, in Separation Coverage and Purification in Biotechnology, J. Asenjo and J. Hong, ed., ACS Symposium Series, 314, 122 (1986).
  • Numerous variants such as Isoelectric focusing in granulated gel layers, continuous isoelectric focusing with recycling, the "Rotofor" cell, free-flow focusing with recycling and multi-compartmentalized electrolysis with isoelectric membranes are used.
  • the matrix materials include Cellulose acetate, agarose gels and polyacrylamide gels are used.
  • Crystallization can be initiated, for example, by cooling, evaporation, vacuum crystallization (adiabatic cooling), reaction crystallization or salting out. Crystallization can be carried out, for example, in stirred and unstirred vessels, in the direct-contact process, in evaporation crystallizers (RK Multer, Chem Eng.
  • drying processes include processes for convection drying, for example in a drying oven, tunnel dryer, belt dryer, disc dryer, jet dryer, fluidized-bed dryer, ventilated and rotating drum dryer, spray dryer, current dryer, cyclone dryer, mixer dryer, paste grinding dryer, grinding dryer, ring dryer, shaft dryer, rotary tube dryer Carousel dryer.
  • Other processes use contact drying, eg paddle dryer; Vacuum or freeze drying, cone dryer, suction filter dryer, disc dryer, thin-film contact dryer, drum dryer, tough phase dryer, plate dryer, spiral conveyor dryer, double-cone dryer; or heat radiation (infrared, eg infrared rotary tube dryer) or dielectric energy (microwaves) for drying.
  • the drying apparatus used for thermal drying processes are mostly heated by steam, oil, gas or electric current and, depending on the design, can be operated in part under vacuum.
  • formulation processes can also be used, as described below for the production of the protein composition. These also include the addition of formulation adjuvants as indicated below.
  • the fine chemicals are isolated from the fermentation broth in accordance with c) by means of ion-exchange chromatography.
  • the general conditions and procedures are known to the person skilled in the art and e.g. in Römpp Lexikon der Chemie, 10th edition, 1997, Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Weis, Handbuch der lonenchromatographie, 1991, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim.
  • the procedure will be such that the compound produced by the microorganisms is selectively bound on the ion exchanger and the ion exchanger is washed before the elution of the compound produced by the microorganisms, e.g. with water.
  • the solids can optionally be removed using customary methods known to those skilled in the art, e.g. Filtration and centrifugation are separated.
  • the solids are not separated off before the solids-laden fermentation broth is placed on the ion-exchange chromatography column.
  • the ion exchanger is advantageously flowed against by gravity with the solids-laden fermentation broth, so that the solids contained do not lead to blocking (i.e. blockage) of the ion exchange column.
  • the metabolic product produced by the microorganisms is a basic amino acid
  • this can advantageously be separated from the fermentation broth by ion exchange chromatography, using an acidic cation exchange column.
  • the basic amino acid e.g. Lysine
  • the basic amino acid can be cleaned by washing, especially with water.
  • the basic amino acid is then eluted with a suitable eluent, for example ammonia water, preferably with 5% by volume ammonia water.
  • ion exchange chromatography for the separation or purification of basic amino acids such as lysine is e.g. in WO 01/072689 and Lee et al., The use of ion exclusion chromatography as approved to the normal ion exchange chromatography to achieve a more efficient lysine recovery from fermentation broth, Enzyme and Microbial Technology 30 (2002), 798-303 ,
  • the remaining fermentation residue can be worked up in an analogous manner as described below, i.e. are treated or processed, whereby a protein-containing by-product is obtained.
  • the isolation of the valuable product is advantageously carried out by centrifugation or filtration.
  • Analogous conditions and procedures can be used, such as those used for other carbon sources e.g. were described in the earlier application DE 10359668.2.
  • the fermentation broth produced is heated in order to dissolve all of the methionine.
  • the solids are then separated off by centrifugation or filtration.
  • the clear running of the solid separation is preferably concentrated by partial or complete evaporation, the methionine crystallizing out. Finally, the methionine is dried, if necessary after a previous further filtration step.
  • the solids separated by centrifugation or filtration essentially contain the biomass produced during the fermentation and the non-metabolized components of the saccharified starch solution, e.g. Fibers. This remaining fermentation residue can be treated or processed in an analogous manner as described below, so that a protein-containing by-product is obtained.
  • the isolation of the valuable product is advantageously also carried out by centrifugation or filtration.
  • Analogous conditions and procedures can be used, as described for other carbon sources, for example in EP 1050219 and WO 01/83799. Otherwise, the work-up can be carried out in a corresponding manner, as previously described for methionine.
  • the entire fermentation broth is preferably additionally pasteurized before the solids are separated off.
  • the clear running of the solids separation is preferably partially evaporated, optionally mixed with calcium chloride and dried, preferably spray-dried.
  • pantothenic acid one can also proceed in such a way that after step c) the cells and the undissolved or solid non-starchy constituents are separated off using decanters, centrifuges, filter technology or membrane technology (microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration) and / or one Combination of these procedures is carried out.
  • the low-solids or low-solids stream contains pantothenic acid. This stream can, for example, be further concentrated and / or be dried or formulated.
  • the solids-containing stream can be worked up, analogously as described below, to a protein-containing by-product.
  • the cells are lysed or killed. This can be done immediately after fermentation. For this purpose, the entire fermentation broth is fed to lysis or killing. This can be done thermally, mechanically or chemically.
  • the cells can also be lysed after the solids have been separated off. In this case, only the solids-rich stream is fed to the aforementioned lysis.
  • the processing of pantothenic acid is carried out by thermally killing the cells after the fermentation and separating the cells and the non-starchy solid components by means of decanters, centrifuges, filter technology or membrane technology and / or a combination thereof ,
  • the stream which is low in solids or free of solids, contains pantothenic acid.
  • This current can e.g. be further concentrated.
  • auxiliaries such as those mentioned below are advantageously added to the low-solids broth. In this way, potential foaming and / or deposit formation can be reduced.
  • the concentrated stream is then fed directly to the drying or formulation.
  • the auxiliaries mentioned below can be added before, during or after drying or formulation. This can reduce the hygroscopicity of the product, improve the flow behavior of the product and / or increase the storage stability.
  • the solids-containing stream is preferably processed into a protein-containing by-product, analogously to that described below.
  • pantothenic acid Another preferred embodiment for working up the pantothenic acid provides that auxiliaries with special cations can also be added during the fermentation. This is e.g. described in WO 02/072857.
  • pantothenic acid from the fermentation broth by means of electrodialysis or ion exchange.
  • electrodialysis or ion exchange it is also possible to remove pantothenic acid from the fermentation broth by means of electrodialysis or ion exchange.
  • these methods are not preferred, since problems may be expected.
  • the fermentation residue remaining after isolation or depletion of the pantothenic acid, ie in particular the separated solids, can generally be treated or processed in a manner analogous to that described below, so that a protein-containing by-product is obtained.
  • the isolation of the valuable product is advantageously carried out by extraction with a solvent, such as. B described in US 4310684 or EP 355307.
  • the remaining solids can in the usual manner, for. B. by filtration or centrifugation. Otherwise, the solids can be worked up in a corresponding manner, as previously described for methionine.
  • the entire fermentation broth is preferably additionally pasteurized before the solids are separated off.
  • the clear running of the solids separation is preferably partially evaporated, calcium chloride optionally added and dried, preferably spray-dried.
  • the further purification of the polyhydroxyalkanoates is carried out in a manner known per se, e.g. in US 4310684 or EP 355307.
  • the remaining fermentation residue i.e. in particular the separated solids can be treated or processed in an analogous manner as described below, so that a protein-containing by-product is obtained.
  • the remaining fermentation broth essentially contains the biomass produced during fermentation, the non-metabolized components of the saccharified starch solution, e.g. Fibers and unused sugar, as well as unused buffer and nutrient salts.
  • these solids can be obtained from the remaining fermentation broth in a manner similar to the by-product from the production of bioethanol (which is called “Distiller's Dried Grains with Solubles (DDGS)" and is marketed as such).
  • the protein-containing by-product obtained in this way can be used as feed or feed additive for feeding animals, preferably of agricultural animals, both before and after further processing or processing steps. particularly preferably from cattle, pigs and poultry, very particularly preferably from cattle.
  • the fermentation broth can be worked up or processed into a protein composition by methods known to the person skilled in the art, in particular by changing the dry substance content (for example by drying or evaporation), grinding and formulating (for example adding additives, shaping processes such as pelleting and extruding). respectively. Furthermore, the processing and processing of the by-product also includes mixing with other feed or feed additives, for example in order to standardize the levels of nutrients.
  • the protein composition is generally produced by at least partially removing the volatile constituents of the fermentation broth following the depletion or isolation of at least one metabolic product in step c). This gives a protein composition in solid or semi-solid form.
  • the content of the depleted or isolated metabolic product in the remaining fermentation broth is generally at most 20% by weight, in particular at most 15% by weight, especially at most 10% by weight and very particularly at most 5% by weight, in each case based on the total weight of the remaining fermentation broth.
  • the entire remaining broth is usually either partially evaporated in a generally multi-stage evaporation and the solids present are then e.g. separated with a decanter or the solids are separated directly from the entire fermentation broth. Centrifugation, filtration, microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration, reverse osmosis or a combination of these methods, e.g. in a multi-stage system.
  • the solids separated off generally have a dry matter content in the range from 10 to 80% by weight, preferably 15 to 60% by weight and particularly preferably 20 to 50% by weight.
  • the finished protein composition obtained by further processing or processing advantageously has a content of about 90% by weight dry matter, so that the risk of spoilage during storage is reduced.
  • the protein composition can also be obtained by concentrating the solid constituents of the fermentation broth remaining after step c) by means of thermal processes (for example evaporation), mechanical processes (for example using filters, decanters, centrifuges) and the combinations of the individual processes mentioned which are customary for the person skilled in the art be won.
  • thermal processes for example evaporation
  • mechanical processes for example using filters, decanters, centrifuges
  • combinations of the individual processes mentioned which are customary for the person skilled in the art be won.
  • pasty residue which still contains the metabolic product according to the invention in small amounts, usually in the range from 0 to 10% by weight and in particular in the range from 0 to 5% by weight, based on the total weight of the residue, and the non-volatile , as a rule solid non-starch components of the starch source or at least large parts thereof, often at least 90% by weight or the total amount of solid non-starch components of the starch source and the biomass from the fermentation.
  • This semi-solid or solid residue can be fed directly to drying or formulation in the same way as the fermentation broth which is not concentrated and which remains after step c).
  • the liquid phase separated when the by-product is obtained can be partially recycled as process water.
  • This recirculated part of the liquid phase can advantageously be used, for example, in whole or in part in the production of the sugar-containing liquid after step a) or for the preparation of buffer or nutrient Salt solutions for use in fermentation can be used.
  • buffer or nutrient Salt solutions for use in fermentation can be used.
  • the proportion of recycled process water when preparing the suspension for starch liquefaction is therefore preferably at most 75% by weight, preferably at most 60% by weight and particularly preferably at most 50% by weight, in each case based on the total amount used to prepare the suspension Water, limited.
  • the proportion of process water when preparing the suspension in the preferred embodiment of step a2) is in the range from 5 to 60% by weight and preferably from 10 to 50% by weight, in each case based on the total for preparing the suspension water used.
  • the portion of the liquid phase not returned to the process can be concentrated to a syrup in a multi-stage evaporation.
  • the syrup thus obtained generally has a dry matter content in the range from 20 to 90% by weight, preferably 30 to 80% by weight and particularly preferably 40 to 70% by weight.
  • This syrup can be mixed with the solids separated during decanting (or in some other way) and then dried. Drying can e.g. by means of a drum dryer, spray dryer or paddle dryer, preferably a drum dryer is used.
  • the drying is preferably carried out in such a way that the solid obtained has a residual moisture content of at most 30% by weight, preferably at most 20% by weight and particularly preferably at most 10% by weight.
  • the properties of the dried by-product i.e. the protein composition
  • the properties of the dried by-product i.e. the protein composition
  • the properties of the dried by-product can be targeted with regard to various parameters such as grain size, particle shape, tendency to dust, hygroscopicity, stability , in particular storage stability, color, smell, flow behavior, tendency to agglomeration, electrostatic charging, sensitivity to light and temperature, mechanical stability and redispersibility can be assembled in a manner known per se.
  • formulation aids include e.g. Binders, carrier materials, powdering / flow aids, also color pigments, biocides, dispersants, anti-foaming agents, viscosity regulators, acids, alkalis, antioxidants, enzyme stabilizers, enzyme inhibitors, adsorbates, fats, fatty acids, oils or mixtures thereof.
  • Formulation aids of this type are advantageously used as drying aids, in particular when using formulation and drying processes such as spray, fluidized bed and freeze drying.
  • binders are carbohydrates, in particular sugars such as mono-, di-, oligo- and polysaccharides, for example dextrins, trehalose, glucose, glucose syrup, maltose, sucrose, fructose and lactose; colloidal substances such as animal proteins, e.g.
  • casein in particular sodium caseinate
  • vegetable proteins for example soy protein, pea protein, bean protein, lupine, zein, wheat protein, maize protein and rice protein
  • synthetic polymers for example polyethylene glycol, polyvinyl alcohol and in particular the Kollidon brands from BASF
  • optionally modified biopolymers for example Ligin, chitin, chitosan, polylactide and modified starches, for example octenyl succinate anhydride (OSA); Gums, eg gum acacia
  • Cellulose derivatives for example methyl cellulose, ethyl cellulose, (hydroxyethyl) methyl cellulose (HEMC), (hydroxypropyl) methyl cellulose (HPMC), carboxymethyl cellulose (CMC); Flours such as corn flour, wheat flour, rye flour, barley flour and rice flour.
  • carrier materials are carbohydrates, in particular the sugars mentioned above as binders, and starches, for example from corn, rice, potatoes, wheat and cassava; modified starches, for example octenyl succinate anhydride; Cellulose and microcrystalline cellulose; inorganic minerals or clay, for example clay, coal, diatomaceous earth, silica, tallow and kaolin; Semolina, for example wheat semolina, bran, for example wheat bran, the flours mentioned above as binders; Salts such as metal salts, in particular alkali and alkaline earth metal salts of organic acids, for example Mg, Ca, Zn, Na, K citrate, acetate, formate and hydrogen formates, inorganic salts, for example Mg, Ca, Zn , Na, K sulfates, carbonates, silicates or phosphates; Alkaline earth metal oxides such as CaO and MgO; inorganic buffering agents such as alkali metal hydrogen phosphates, in particular sodium
  • powdering agents or flow aids are diatomaceous earth, silica, e.g. the Sipernat brands from Degussa; Clay, coal, tallow and kaolin; the starches, modified starches, inorganic salts, salts of organic acids and buffering agents mentioned above as carrier materials; Cellulose and microcrystalline cellulose.
  • color pigments such as TiO 2 ; Bi-ozide; dispersant; Anti-foaming agent; Viscosity regulators; inorganic acids such as phosphoric acids, nitric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid; organic acids such as saturated and unsaturated mono- and dicarboxylic acids, for example formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, palmitic acid, stearic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, maleic acid and fumaric acid; Alkalis such as alkali metal hydroxides, for example NaOH and KOH; antioxidants; Enzyme stabilizers; Enzyme inhibitors; adsorbates; fats; Fatty acids and oils.
  • inorganic acids such as phosphoric acids, nitric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid
  • organic acids such as saturated and unsaturated mono- and di
  • the proportion of the abovementioned additives and, if appropriate, further additives, such as coating materials can vary widely depending on the special requirements of the particular metabolic product and depending on the properties of the additives used, for example in the range from 0.1 to 80% by weight, in particular in the range from 5 to 70% by weight and especially in the range from 10 to 60% by weight, in each case based on the total weight of the finished formulated product or in each case based on the total weight of the fully formulated product or mixture of substances.
  • Formulation auxiliaries can be added before, during or after the processing of the fermentation broth (also referred to as product formulation or solid design) and in particular during drying. Adding formulation aids before concentrating the fermentation broth remaining after step c) can be particularly advantageous in order to improve the processability of the substances or products to be processed.
  • the formulation auxiliaries can be added both to the by-product obtained in solid form and to a solution or suspension containing it, e.g. after step c) directly to the fermentation broth or to a solution or suspension obtained in the course of the work-up before the final drying step.
  • the auxiliary substances can e.g. are mixed into a suspension obtained by concentrating the fermentation broth remaining after step c); such a suspension can also be applied to a carrier material, e.g. by mixing in.
  • formulation aids are added e.g. when applying coatings or coatings / coating layers to dried particles. Additional aids can be added to the product both after drying and after a possible coating step.
  • the particles obtained by formulation processes can be dried to the desired residual moisture content by the drying processes described above.
  • All by-products obtained in solid form e.g. Particles, granules and extrudates can be coated with a coating, i.e. be covered with at least one further layer of material.
  • Coating takes place e.g. in mixers or fluidized beds in which the particles to be coated are whirled up or “fluidized” and then sprayed with the coating or coating material.
  • the coating material can be dry, for example as a powder, or in the form of a solution, dispersion, emulsion or suspension in a solvent, for example water, organic solvents and mixtures thereof, in particular in water. If present, the solvent is removed by evaporation during or after spraying onto the particles.
  • coating materials such as fats can also be applied as melts.
  • Coating materials that can be sprayed on as an aqueous dispersion or suspension are described, for example, in WO 03/059087.
  • These include in particular polyolefins such as polyethylene, polypropylene, polyethylene waxes, waxes, inorganic and organic salts, acronals, for example butyl acrylate-methyl acrylate copolymer, the styrofoam brands from BASF, for example based on styrene and butadiene, and hydrophobic substances such as described in WO 03/059086.
  • the solids content of the coating material is typically in the range from 0.1 to 20% by weight, in particular in the range from 0.2 to 10% by weight and especially in the ranging from 0.4 to 5 wt .-%, each based on the total weight of the formulated end product.
  • Coating materials that can be sprayed on as solutions are e.g. Polyethylene glycols, cellulose derivatives such as methyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose and ethyl cellulose, polyvinyl alcohol, proteins such as gelatin, inorganic and organic salts, carbohydrates such as sugar, e.g. Glucose, lactose, fructose, sucrose and trehalose; Strengths and modified strengths.
  • the solids content of the coating material is typically in the range from 0.1 to 20% by weight, in particular in the range from 0.2 to 10% by weight and especially in the range from 0.4 to 5% by weight. %, each based on the total weight of the formulated end product.
  • Coating materials that can be sprayed on as a melt are described, for example, in DE 199 29 257 and WO 92/12645. These include in particular polyethylene glycols, synthetic fats and waxes, for example Polygenous WE ® from. BASF, natural fats such as animal fats, for example beeswax, and vegetable fats such as Candelila- wax, fatty acids, for example animal waxes, tallow fatty acid, palmitic acid, stearic acid , triglycerides, Edenor products, Vegeole products, Montanesterwachse such Luwax e ® from. BASF.
  • polyethylene glycols synthetic fats and waxes
  • synthetic fats and waxes for example Polygenous WE ® from. BASF
  • natural fats such as animal fats, for example beeswax
  • vegetable fats such as Candelila- wax
  • fatty acids for example animal waxes, tallow fatty acid, palmitic acid
  • the solids content of the coating material is typically in the range from 1 to 25% by weight, in particular in the range from 2 to 25% by weight and especially in the range from 3 to 20% by weight, in each case based on the total weight of the formulated end product.
  • whole or ground cereal grains preferably maize, wheat, barley, millet and / or rye, can be added to the by-product or the protein composition.
  • Another object of the invention is thus a protein composition from a sugar-based microbial fermentation carried out according to the invention for the production of a metabolite with at least 3 C atoms or with at least 2 C atoms and at least 1 N atom, which is obtainable as described above.
  • This protein composition usually contains protein material, i.e. Biomass from the fermentation, non-starchy components of the starch source, in particular fibers, and fermentation product (metabolite).
  • the protein composition essentially contains the following dry matter components:
  • e 0 to 40% by weight, in particular 0.5 to 30% by weight and especially 1 to 20% by weight of non-metabolized further constituents of the fermentation broth, in particular residues of sugar, starch, nutrient salts and / or buffer salts;
  • components a) to e) add up to 100% by weight of dry matter.
  • the expression “essentially” here means that the proportion of further constituents different from a) to e) is small, as a rule this proportion becomes 10% by weight and in particular 5% by weight, in each case based on the total dry mass of the protein composition, especially this proportion is less than 1% by weight, in particular about 0% by weight.
  • Biomass (component a)) includes in particular the proportion of crude protein in the protein composition. This proportion is usually at least 40% by weight and is in particular in the range from 40 to 90% by weight, especially in the range from 45 to 85% by weight and especially in the range from 50 to 80% by weight based on the total dry mass of the protein composition.
  • the protein compositions according to the invention usually contain one or more essential amino acids, in particular at least one amino acid selected from lysine, methionine, threonine and tryptophan.
  • the essential amino acids in particular those mentioned, are generally present in an amount which is increased by a factor of at least 1.5 compared to a conventional DDGS by-product which is obtained in fermentative bioethanol production. If the respective amino acid is contained in the protein composition, it generally has a lysine content of at least 1% by weight, in particular in the range from 1 to 5% by weight, and a methionine content of at least 0.8% by weight.
  • % in particular in the range from 0.8 to 5% by weight, a threonine content of at least 1.5% by weight, in particular in the range from 1.5 to 5% by weight and / or a Tryptophan content of at least 0.4% by weight, in particular in the range from 0.4 to 5% by weight, in each case based on the total dry mass of the protein composition.
  • the protein compositions according to the invention usually still contain a small proportion of water, frequently in the range from 0 to 25% by weight, in particular in the range from 0.5 to 15% by weight, especially in the range from 1 to 10% by weight and entirely especially in the range of 1 to 5 wt .-% water, each based on the total weight of the protein composition.
  • Another object of the invention is a method as described above, characterized in that
  • step a a partial amount of not more than 50% by weight is taken from the sugar-containing liquid medium obtained in step a), which contains the non-starchy solid constituents of the starch source, and with the remaining amount a fermentation according to b) to produce a first metabolic product (A) performs;
  • the non-starch-containing solid constituents of the starch source are completely or partially separated from this partial amount and this is used to carry out a fermentation according to b) to produce a second metabolic product (B) which is identical to or different from the metabolic product (A).
  • the non-starchy solid constituents are separated off in accordance with (ii) such that the solids content of the remaining portion of the sugar-containing liquid medium is at most 50% by weight, preferably at most 30% by weight, particularly preferably at most 10% % and very particularly preferably a maximum of 5% by weight.
  • microorganisms in the separate fermentation according to (iii) for which certain minimum requirements have to be met, e.g. regarding the oxygen transfer rate.
  • microorganisms used in the separate fermentation according to (iii) e.g. Bacillus species, preferably Bacillus subtilis.
  • the compounds produced by such microorganisms in the separate fermentation are in particular vitamins, cofactors and nutraceuticals, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides, lipids, saturated and unsaturated fatty acids, aromatic compounds, proteins, carotenoids, especially vitamins, cofactors and Nutraceuticals, proteins and carotenoids and especially selected from riboflavin and calcium pantothenate.
  • this procedure enables the process according to the invention to be used advantageously even if the fine chemical produced is obtained as a solid during fermentation.
  • a preferred embodiment of this procedure relates to the parallel production of the same metabolic products (A) and (B) in two separate fermentations. This is particularly advantageous when there are different purity requirements for different applications of the same metabolic product.
  • the first metabolic product (A) e.g. an amino acid to be used as a feed additive, e.g. lysine
  • the same second metabolic product (B) e.g. the same amino acid to be used as a food additive, here e.g. lysine, using the prepared according to (ii) solids-depleted fermentation broth. Due to the complete The partial or partial removal of the non-starchy solid constituents can reduce the cleaning effort when working up the metabolic product, the area of application of which requires higher purity, for example as a food additive.
  • the metabolic product B produced by the microorganisms in the fermentation is riboflavin.
  • Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used here to carry out the fermentation, e.g. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 and Fujioka, K .: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
  • a preferably large-volume fermentation for the production of metabolic products A e.g. of fine chemicals such as lysine, in accordance with process steps a) to c) according to the invention.
  • a part of the sugar-containing liquid medium obtained after step a) is removed and according to (ii) by conventional methods, e.g. Centrifugation or filtration, completely or partially freed from the solids.
  • the sugar-containing liquid medium obtained therefrom, essentially completely or partially freed from the solids is subjected to (ii) fermentation to produce a metabolic product B, e.g. Riboflavin supplied.
  • the solid stream separated according to (ii) is advantageously returned to the stream of the sugar-containing liquid medium of the large-volume fermentation.
  • the riboflavin-containing fermentation broth produced in this way according to (ii) can be worked up according to the analogous conditions and procedures described for other carbon sources, e.g. in DE 4037441, EP 464582, EP 438767 and DE 3819745. After lysing the cell mass, the crystalline riboflavin is preferably separated off by decanting. Other types of solids separation, e.g. Filtration are also possible. The riboflavin is then dried, preferably by means of spray and fluid bed dryers. Alternatively, the fermentation mixture containing riboflavin produced according to (ii) can be worked up according to analogous conditions and procedures, e.g. described in EP 1048668 and EP 730034. After pasteurization, the fermentation broth is centrifuged here and the remaining solid-containing fraction is treated with a mineral acid. The riboflavin formed is filtered from the aqueous acidic medium, washed if necessary and then dried.
  • the separated solids can be processed into a by-product in the course of the large-volume fermentation process operated in parallel, as already described above.
  • the metabolic product B produced by the microorganisms in the fermentation is pantothenic acid.
  • Conditions and procedures analogous to those described for other carbon sources can be used here to carry out the fermentation, for example in WO 01/021772.
  • the sugar-containing liquid medium pre-cleaned according to (ii), preferably essentially freed from the solids, is fed to a fermentation according to (ii) for the production of pantothenic acid.
  • the reduced viscosity compared to the liquid medium containing solids is particularly advantageous.
  • the separated solid stream is preferably returned to the stream of the sugar-containing liquid medium of the large-volume fermentation.
  • pantothenic acid-containing fermentation broth produced according to (ii) can be worked up according to analogous conditions and procedures as described for other carbon sources, e.g. in EP 1050219 and WO 01/83799. After pasteurizing the entire fermentation broth, the remaining solids are e.g. separated by centrifugation or filtration. The clarity of the solids separation is partially evaporated, calcium chloride optionally added and dried, in particular spray-dried.
  • the separated solids can be processed into a by-product in the course of the large-volume fermentation process operated in parallel, as already described above.
  • the metabolic product B produced by the microorganisms in the fermentation is polyhydroxyalkanoates.
  • Analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used to carry out the fermentation, e.g. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Vol. 14, (1996), pp. 431-438.
  • the sugar-containing liquid medium pre-cleaned according to (ii), preferably substantially freed from the solids, is fed to a fermentation according to (ii) for the production of polyhydroxyalkanoates.
  • the separated solid stream is preferably returned to the stream of the sugar-containing liquid medium of the large-volume fermentation.
  • the fermentation broth produced according to (ii) and containing polyhydroxyalkanoate can be worked up according to the conditions and procedures analogous to those described for other carbon sources, for example in US 4310684 and EP 355307 Pasteurizing the entire fermentation broth, the remaining solids are separated, for example by centrifugation or filtration. The clarity of the solids removal is partially evaporated, calcium chloride optionally added and dried, in particular spray-dried. The further purification of the polyhydroxyalkanoates is carried out in a manner known per se, as described, for example, in US 4310684 or EP 355307.
  • the separated solids can be processed into a by-product in the course of the large-volume fermentation process operated in parallel, as already described above.
  • the regrind used below was produced as follows. Whole corn kernels were completely milled using a rotor mill. Three different subtleties were achieved using different racket mills, grinding tracks and sieve inserts. A sieve analysis of the ground material using a laboratory vibrating sieve (vibration analysis machine: Retsch Vibrotronic type VE1; sieving time 5 min; amplitude: 1.5 mm) gave the results listed in Table 1.
  • a further 400 g of the dry-ground corn meal (T71 / 03) were added over the course of 30 minutes, the temperature being raised to 91 ° C.
  • the reaction mixture was kept at this temperature for about 100 min.
  • a further 2.4 g of Termamyl 120L were added and the temperature was held for about 100 minutes.
  • the progress of the liquefaction was monitored during the period with the iodine-starch reaction.
  • the temperature was then raised to 100 ° C. and the reaction mixture was boiled for a further 20 min. At this point there was no longer any evidence of strength.
  • the reactor was cooled to 35 ° C.
  • the reaction mixture obtained from 11.1 a) was heated to 61 ° C. with constant stirring. Stirring was continued throughout the experiment. After adjusting the pH to 4.3 with H 2 SO 4 , 10.8 g (9.15 ml) of Dextrozyme GA (Novozymes A / S) were added. The temperature was maintained for about 3 hours, the progress of the reaction being monitored using glucose test sticks (S-Glucotest from Boehringer). The results are shown in Table 2 below.
  • the reaction mixture was then heated to 80 ° C. and then cooled. About 1180 g of liquid product with a density of about 1.2 kg / l and a dry matter content of about 53.7% by weight determined by means of an infrared dryer were obtained. The dry matter content (without water-soluble ingredients) was about 14% by weight after washing with water.
  • the proportion of glucose in the reaction mixture determined by HPLC was 380 g / l (cf. Table 2, sample No. 7).
  • a dry ground maize meal sample is liquefied in accordance with 11.1 a).
  • the reaction mixture obtained from II.2a) is heated to 61 ° C. with constant stirring. Stirring is continued throughout the experiment. After adjusting the pH to 4.3 with H 2 SO 4 , 10.8 g (9.15 ml) of Dextrozyme GA (Novozymes A / S) and 70 ⁇ l of phytase (700 units of phytase, Natuphyt Liquid 10000L from BASF Aktiengesellschaft) ) added. The temperature is held for about 3 hours, the progress of the reaction being monitored using glucose test sticks (S-Glucotest from Boehringer). The reaction mixture is then heated to 80 ° C. and then cooled. The product obtained is dried by means of an infrared dryer and washed with water. The proportion of glucose in the reaction mixture is determined by HPLC.
  • the addition of additional flour begins, initially 50 g of flour.
  • 0.13 ml of CaCl 2 stock solution is added to the mash in order to keep the Ca 2+ concentration at 70 ppm.
  • the temperature is kept constant at 85 ° C. Wait at least 10 minutes to ensure a complete reaction before adding another portion (50 g flour and 0.13 ml CaCl 2 stock solution).
  • 1.67 ml of Termamyl are added; then two further portions (50 g flour and 0.13 ml CaCl 2 stock solution each) are added. A dry matter content of 55% by weight is achieved.
  • the temperature is raised to 100 ° C. and the mash is boiled for 10 minutes.
  • a sample is taken and cooled to room temperature. After dilution of the sample with deionized water (about 1:10), a drop of concentrated Lugol's solution (mixture of 5 g I and 10 g Kl per liter) is added. A deep blue color indicates a content of remaining starch; browning occurs when the starch has been fully hydrolyzed. When the test shows a portion of starch remaining, the temperature is again lowered to 85 ° C and held constant. Another 1.67 ml of Termamyl are added until the iodine-starch reaction is negative.
  • the mixture tested negative for starch is then brought to 61 ° C. for the subsequent saccharification reaction.
  • the pH is adjusted to 4.3 by adding 50% sulfuric acid.
  • the pH is kept at this value in the course of the reaction.
  • the temperature is kept at 61 ° C.
  • 5.74 ml ( 1.5% by weight enzyme / dry matter)
  • Dextrozym GA Novozymes A / S
  • the reaction is allowed to proceed for an hour.
  • the mixture is heated to 85 ° C. to inactivate the enzyme.
  • the hot mixture is filled into sterile containers and stored after cooling at 4 ° C.
  • the addition of additional flour begins, initially 60 g of flour.
  • 0.13 ml of CaCl 2 stock solution is added to the mash in order to keep the Ca 2+ concentration at 70 ppm.
  • the temperature is kept constant at 85 ° C. Wait at least 10 minutes to ensure that the reaction is complete before adding a further portion (40 g of flour and 0.1 ml of CaCl 2 stock solution).
  • a further portion 40 g of flour and 0.1 ml of CaCl 2 stock solution
  • a dry matter content of 55% by weight is achieved.
  • the temperature is raised to 100 ° C.
  • the mixture tested negative for starch is then brought to 61 ° C. for the subsequent saccharification reaction.
  • the pH is adjusted to 4.3 by adding 50% sulfuric acid.
  • the pH is kept at this value in the course of the reaction.
  • the temperature is kept at 61 ° C.
  • 5.74 ml ( 1.5% by weight enzyme / dry matter)
  • Dextrozyme GA Novozymes A / S
  • the reaction is allowed to proceed for an hour.
  • the mixture is heated to 85 ° C. to inactivate the enzyme.
  • the hot mixture is filled into sterile containers and stored after cooling at 4 ° C.
  • an allelic exchange of the wild-type gene (lysC) coding for the enzyme aspartate kinase was carried out in C. glutamicum ATCC13032.
  • a nucleotide exchange was carried out in the lysC gene, so that the amino acid Thr at position 311 in the resulting protein was replaced by an III.
  • the oligonucleotide primers were used 5'-GAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC -3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3' (SEQ ID NO: 2) lysC using the Pfu-Turbo PCR system (Stratagene, USA) according to the manufacturer's PCR.
  • Chromosomal DNA from C. glutamicum ATCC 13032 was developed according to Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179 or Eikmanns et al.
  • the amplified fragment is flanked at its 5 'end by a Sall restriction site and at its 3' end by a Mlul restriction site. Before cloning, the amplified fragment was digested by these two restriction enzymes and purified using GFX TM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg).
  • the polynucleotide obtained was cloned via the Sall and Mlul restriction sections into pCLIK ⁇ MCS integratively SacB, hereinafter referred to as pCIS, (SEQ ID NO: 3) and transformed into E.coli XL-1 blue.
  • Selection for plasmid-bearing cells was achieved by plating on LB agar containing kanamycin (20 ⁇ g / ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190). The plasmid was isolated and the expected nucleotide sequence was confirmed by sequencing.
  • the plasmid DNA was prepared using methods and materials from Quiagen. Sequencing reactions were carried out according to Sanger et al.
  • the sequencing reactions were separated and evaluated using ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Rothstadt).
  • the plasmid obtained was named pCIS lysC (SEQ ID NO: 4). It comprises the following main areas:
  • the directed mutagenesis of the lysC gene from C. glutamicum was carried out using the Quick Change Kit (Stratagene, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the muta- genesis was carried out in the plasmid pCIS lysC (SEQ ID NO: 4).
  • the following oligonucleotide primers were synthesized for the exchange of thr 311 to 311 ile using the Quickchange method (Stratagene): 5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG -3 '(SEQ ID NO: 5)
  • the use of these oligonucleotide primers in the Quickchange reaction leads to an exchange of the nucleotide in position 932 (from C to T) in the lysC gene (SEQ ID NO: 7).
  • the resulting amino acid exchange Thr3111le in the lysC gene was confirmed by a sequencing reaction after transformation into E.coli XL1-blue and plasmid preparation.
  • the plasmid was named pCIS lysC thr311 ile (SEQ ID NO: 8). It comprises the following main areas:
  • the plasmid pCIS lysC thr311 ile was transformed into C. glutamicum ATCC13032 by means of electroporation, as described in Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 53: 299-303 (1989). Modifications to the protocol are described in DE 10046870.
  • the chromosomal arrangement of the lysC locus of individual transformants was determined using standard methods by Southern blot and hybridization, as in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989). This ensured that the transformants are those which have integrated the transformed plasmid by homologous recombination at the lysC locus. After growth of such colonies overnight in media containing no antibiotic, the cells are plated on a sucrose CM agar medium (10% sucrose) and incubated for 24 hours at 30 ° C.
  • the sacB gene containing sacB in the vector pCIS lysC thr311 ile converts sucrose into a toxic product, only those colonies can grow that the sacB gene through a second homologous recombination step between the wild-type gene lysC and have deleted the mutated gene lysC thr311ile. During homologous recombination, either the wild-type gene or the mutated gene can be deleted together with the sacB gene. If the sacB gene is removed together with the wild-type gene, a mutant transformant results.
  • Example 1 Enzymatic starch liquefaction and saccharification
  • Example 11.1 Two maize meal hydrolyzates obtained according to Example 11.1 were used in shake flask experiments using Corynebacterlum glutamicum (flasks 4-9). In addition, a wheat flour hydrolyzate (flask 1 -3) prepared in analogy to Example 11.1 was used in parallel.
  • CM agar composition: see Table 4; 20 min at 121 ° C.
  • the cells are incubated at 30 ° C. for 48 h.
  • the cells are then scraped off the plates and resuspended in saline.
  • 25 ml of the medium see Table 5
  • the samples are then incubated at 200 rpm and 30 ° C. in a humidified shaking cabinet (85% relative atmospheric humidity) for 48 hours.
  • the concentration of the lysine in the media is determined by means of HPLC. In all cases, approximately equal amounts of lysine were produced.
  • a maize meal hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask tests using Corynebacterlum glutamicum (ATCC13032 lysC fbr ) (flasks 1 + 2).
  • Corynebacterlum glutamicum ATCC13032 lysC fbr
  • a wheat flour hydrolyzate flask 3 + 4
  • rye flour hydrolyzate flask 5 + 6
  • compositions of the piston media 1 to 6 are listed in Table 8. An appropriate amount of glucose solution was used in the control medium instead of flour hydrolyzate.
  • lysine was produced in comparable amounts on the order of approximately 10 to 12 g / l, corresponding to the yield achieved in a standard fermentation with glucose nutrient solution. ⁇
  • the solids are usually separated from the fermentation broth by centrifugation in a first step.
  • centrifugation filtration processes such as membrane filtration can also be used.
  • the solids-free fermentation broth is then acidified (for example with sulfuric acid), as a result of which lysine is present in one or two protonated forms.
  • This acidified broth is then passed through a cation exchanger so that the lysine binds to the ion exchanger. After rinsing with water, ammonia water is then passed over the ion exchanger to elute the lysine.
  • a maize meal hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask tests (flasks 1-3). Bacillus PA824 was used as the panthothenate-producing strain (detailed description in WO 02/061108). In addition, a wheat flour hydrolyzate (flask 4-6) and rye flour hydrolyzate (flask 7-9) prepared in analogy to Example II.3 were used in parallel. 4.1) Preparation of the inoculum
  • pantothenic acid was produced in comparable amounts in the order of about 1.5 to 2 g / l, corresponding to the yield achieved in a standard fermentation with glucose nutrient solution.
  • Refurbishing the product can e.g. as described in WO 02/24001, WO 02/072857 and WO 05/028659.
  • a maize meal hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask tests using Aspergillus niger (flasks 1-3).
  • a wheat flour hydrolyzate (flask 4-6) and rye flour hydrolyzate (flask 7-9) prepared in analogy to Example II.3 were used in parallel.
  • An Aspergillus niger phytase production strain with 6 copies of the Aspergillus ficuum phyA gene under the control of the glaA promoter was generated analogously to the production of NP505-7 described in detail in WO98 / 46772.
  • a strain with 3 modified glaA ampicons (analog ISO505) was used, but without integrated phyA expression cassettes.
  • compositions of the piston media 1 to 9 are listed in Table 14. An appropriate amount of glucose solution was used in the control medium instead of flour hydrolyzate. Table 14: Piston media
  • the flasks were incubated for 6 days at 34 ° C and with agitation (170 rpm) in a humidified shaker. After the fermentation was stopped, the phytase activity was determined using an assay. After termination of the fermentation, the phytase activity with phytic acid as substrate and at a suitable phytase activity level (standard: 0.6 U / ml) in 250 mM acetic acid / sodium acetate / Tween 20 (0.1% by weight), pH 5.5 Buffer determined. The assay has been standardized for use in microtiter plates (MTP).
  • MTP microtiter plates
  • the product can be worked up as described in WO 98/55599.
  • a maize meal hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask tests using Ashbya gossypii (flasks 1-4).
  • a wheat flour hydrolyzate (flask 5-8) and rye flour hydrolyzate (flask 9-12) prepared in analogy to Example II.3 were used in parallel. 6.1) strain
  • the riboflavin-producing strain used is Ashbya gossypii ATCC 10895 (see also Schmidt G, et al. Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbya gossypii. Microbiology 142: 411 -417, 1996 ).
  • the product can be worked up as described in EP 00345717.
  • a maize meal hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask tests using Corynebacterlum glutamicum (flasks 1-3).
  • a wheat flour hydrolyzate (flask 4-6) and rye flour hydrolyzate (flask 7-9) prepared in analogy to Example II.3 were used in parallel.
  • a maize meal hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask experiments using Bacterium 130Z. 8.1) strain
  • Bacterium 130Z (ATCC No. 55618) was used as the succinate-producing strain. 8.2) Preparation of the fermentation broth
  • the composition of the medium is listed in Table 23 (cf. US 5,504,004). A corresponding amount of glucose solution was used in the control medium instead of flour hydrolyzate (final concentration glucose: 100 g / l). Table 23: Medium *
  • a maize flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a is used in shake flask experiments using Escherichia coli (flask 1-3). Similarly, a wheat flour hydrolyzate (flask 4-6) and rye flour hydrolyzate (flask 7-9) produced in the same way as in Example II.3 are used in parallel.
  • Escherichia co / strains which produce L-threonine are known to the person skilled in the art.
  • the production of such strains is e.g. in EP 1013765 A1, EP 1016710 A2, US 5,538,873.
  • compositions of the piston media 1 to 9 are listed in Table 25.
  • a corresponding amount of glucose solution is used in the control medium instead of flour hydrolyzate.
  • the flasks are incubated at 30 ° C and with agitation (200 rpm) in a humidified shaker until the glucose is used up.
  • the L-threonine content can be determined by reversed-phase HPLC as described by Lindroth et al., Analytical Chemistry 51: 1167-1174, 1979.
  • the fermentation broth can then be harvested and the L-threonine contained in the fermentation broth can be isolated, purified or otherwise processed, e.g. in US 5,538,873 and by Okamoto et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61 (11), 1877-1882, 1997.
  • a cassava flour hydrolyzate obtained analogously to Example II.3 was used in shake flask experiments using the lysine-producing strain of Corynebacterlum glutamicum described under 11.2) (flask 1 -4).
  • the flour used had the following size distribution: 45% ⁇ 100 ⁇ m, 56% ⁇ 200 ⁇ m, 79% ⁇ 630 ⁇ m.
  • the viscosity of the suspension was already relatively high at the beginning of the liquefaction step, so that initially cassava flour was used in an amount corresponding to a dry matter content of 35% by weight. There was a correspondingly increased addition of flour in order to ultimately achieve a dry matter content of 55% by weight.
  • the viscosity of the suspension remained relatively high throughout the liquefaction and saccharification.
  • the cassava flour tended to clump; the lumps only partially dissolved again in the further course. Existing lumps turned deep blue in the iodine starch test after a few minutes; this indicates that the clumped starch could not be fully implemented despite multiple boilings and longer waiting times. 11.1) strain
  • CM + CaAc agar composition: see Table 26; 20 min at 121 ° C.
  • the cells were incubated at 30 ° C. for 24 h.
  • the cells were then scraped off the plates and resuspended in saline.
  • the composition of the piston medium is shown in Table 27. An appropriate amount of glucose solution was used in the control medium instead of flour hydrolyzate.
  • lysine was produced in comparable amounts in the order of approximately 10 to 14 g / l, corresponding to the yield achieved in a standard fermentation with glucose nutrient solution.
  • a partially saccharified corn flour hydrolyzate was used in shake flask experiments using Aspergillus niger.
  • Dextrozyme GA Novozymes A / S
  • Example 5.1 The strain used in Example 5.1 was used.
  • the inoculum was prepared as described in Example 5.2).
  • the compositions of the piston medium listed in Table 29 were used to prepare the fermentation broth. Two flasks were made from each sample.
  • a partially saccharified corn flour hydrolyzate was used in shake flask experiments using Corynebacterlum glutamicum.
  • Dextrozyme GA Novozymes A / S
  • Example 3 The strain used in Example 3 was used.
  • the inoculum was produced as described in Example 3.1).
  • compositions of the flask medium listed in Table 31 were used to prepare the fermentation broth. Three flasks were made from each sample.
  • Example 14 In a fermentation for the production of lysine carried out analogously to example 3, after depletion of the lysine from the fermentation broth in step c), a protein composition was obtained as the dried fermentation residue.
  • Table 33 shows essential components of the composition with their weight fractions and compared with a conventional DDGS composition.
  • Table 33 Analysis results based on dry matter in% by weight **

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend: a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle umfasst; b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe, wobei man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit dem zuckerhaltigen Flüssigmedium kultiviert, welches man erhält durch: a1) Vermahlen der Stärkequelle; und a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt.

Description

Fermentative Hersteilung von Feinchemikalien
Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von Feinchemikalien durch Vermählen, Verflüssigen und Verzuckern von Stärkequellen und den Einsatz der dadurch gewonnenen Zuckerlösung als Fermentationsmedium.
Fermentative Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien wie z.B. Aminosäuren, Vitaminen und Carotenoiden durch Mikroorganismen sind allgemein bekannt. In Abhängigkeit von den verschiedenen Verfahrensbedingungen werden dabei unterschied- liehe Kohlenstoffquellen genutzt. Diese reichen von reiner Saccharose über Rüben- und Zuckerrohrmelasse, sogenannten „high test molasses" (invertierte Zuckerrohrmelasse) bis hin zu Glucose aus Stärkehydrolysaten. Für die biotechnologische Herstellung von L-Lysin werden darüber hinaus Essigsäure und Ethanol als großtechnisch einsetzbare Co-Substrate genannt (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysi- ne, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112).
Auf Basis der genannten Kohlenstoffquellen sind verschiedene Methoden und Vorgehensweisen zur zuckerbasierten, fermentativen Herstellung von Feinchemikalien etabliert. Am Beispiel des L-Lysins werden diese beispielsweise von Pfefferle et al. (a.a.O.) im Hinblick auf Stammentwicklung, Prozessentwicklung und großtechnische Produktion beschrieben.
Eine wichtige Kohlenstoffquelle für die durch Mikroorganismen vermittelte fermentative Herstellung von Feinchemikalien ist Stärke. Diese muss in vorgelagerten Reaktions- schritten zunächst verflüssigt und verzuckert werden, bevor sie als Kohlenstoffquelle in einer Fermentation genutzt werden kann. Hierzu wird die Stärke aus einer natürlichen Stärkequelle wie Kartoffeln, Cassava, Getreide, z.B. Weizen, Mais, Gerste, Roggen, Triticale oder Reis üblicherweise in vorgereinigter Form gewonnen und anschließend enzymatisch verflüssigt und verzuckert, um dann in der eigentlichen Fermentation zur Produktion der Feinchemikalien eingesetzt zu werden.
Neben dem Einsatz derartig vorgereinigter Stärkequellen ist auch die Verwendung nicht-vorbehandelter Stärkequellen zur Herstellung von Kohlenstoffquellen für die fermentative Produktion von Feinchemikalien beschrieben worden. Typischerweise wer- den die Stärkequellen dabei zunächst durch Mahlen zerkleinert. Das Mahlgut wird dann einer Verflüssigung und Verzuckerung unterworfen. Da dieses Mahlgut naturgemäß neben Stärke noch eine Reihe von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen enthält, die die Fermentation nachteilig beeinflussen, werden diese Bestandteile üblicherweise vor der Fermentation abgetrennt. Die Entfernung kann entweder direkt nach dem Mahlen (WO 02/277252; JP 2001 -072701 ; JP 56-169594; CN 1218111 ), nach der Verflüssigung (WO 02/277252; CN 1173541 ) oder im Anschluss an die Verzuckerung (CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give eulture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) erfolgen. In allen Varianten wird jedoch ein weitgehend reines Stärkehydrolysat in der Fermentation eingesetzt.
Neuere Techniken befassen sich insbesondere mit verbesserten Methoden, die vor der Fermentation eine Aufreinigung z.B. von verflüssigten und verzuckerten Stärkelösungen (JP 57159500) und von Fermentationsmedien aus erneuerbaren Ressourcen (EP 1205557) ermöglichen sollen.
Unaufbereitete Stärkequellen finden hingegen bekanntermaßen in großem Umfang Einsatz bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol. Dabei ist das als „Dry- milling" bekannte Verfahren des trockenen Vermahlens, Verflüssigens und Verzu- ckerns von Stärkequellen technisch in großem Maßstab etabliert. Entsprechende Prozessbeschreibungen finden sich z.B. in „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1 -8977676-735, und in McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from com starch and lignocellulosic feedstocks" ,NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
Bei den Dry-milling-Verfahren werden im ersten Schritt ganze Getreidekörner fein ver- mahlen, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse und Roggen. Im Gegensatz zum sogenannten „Wet-Milling"-Verfahren wird dabei keine zusätzliche Flüssigkeit zugesetzt. Das Zermahlen in feine Bestandteile dient dazu, die in den Körnern enthaltene Stärke in der nachfolgenden Verflüssigung und Verzuckerung der Einwirkung von Wasser und Enzymen zugänglich zu machen.
Da bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol das Wertprodukt durch Destillation gewonnen wird, stellt der Einsatz von Stärkequellen aus dem Dry-Milling-Prozess in nicht vorgereinigter Form kein spezielles Problem dar. Bei der Anwendung eines Dry- Milling-Verfahrens zur Produktion von Feinchemikalien ist jedoch der über die Zucker- lösung in die Fermentation eingetragene Feststoffstrom problematisch, da dieser sich sowohl negativ auf die Fermentation auswirken kann als auch die anschließende Aufarbeitung nicht unerheblich erschwert.
So ist für viele Fermentationen die Sauerstoffversorgung der eingesetzten Mikroorga- nismen, insbesondere wenn diese einen hohen Sauerstoffbedarf haben, ein limitierender Faktor. Über den Einfluss hoher Feststoffkonzentrationen auf den Sauerstoffübergang von der Gas- in die Flüssigphase und somit auf die Sauerstofftransferrate ist allgemein wenig bekannt. Es ist andererseits bekannt, dass eine mit zunehmender Feststoffkonzentration ansteigende Viskosität zu einer verminderten Sauerstofftransferrate führt. Werden darüber hinaus oberflächenaktive Substanzen mit den Feststoffen in das Fermentationsmedium eingetragen, so beeinflussen diese die Koalugationsneigung der Gasblasen. Die dadurch resultierende Blasengröße beeinflusst ihrerseits maßgeblich den Sauerstofftransfer (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreac- tors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370). Durch den Feststoffeintrag kann in Bezug auf die Viskosität der verwendeten Medien bereits bei der Herstellung der stärkehaltigen Suspension ein kritischer Wert erreicht werden, weil z.B. eine Suspension mit mehr als 30 Gew.-% Maismehl in Wasser nicht mehr homogen mischbar ist (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Dadurch ist bei herkömmlichem Vorgehen die Glucosekonzentration begrenzt. Aus verfahrensökonomischen Gründen ist es in der Regel nachteilig, mit Lösungen geringerer Konzentration zu arbeiten, weil dies zu einer überproportionalen Verdünnung der Fermentationsbrühe führt. Dadurch sinkt die erreichbare Endkonzentration der Zielprodukte, was zusätzliche Kosten bei deren Isolierung verursacht, und die Raum-Zeit-Ausbeute nimmt ab, was bei gleicher Produktionsmenge zu einem größeren Volumenbedarf, d.h. zu höheren Investitionskosten, führt.
Bei der Aufarbeitung können sich aus der erhöhten Feststoffkonzentration besondere Schwierigkeiten für den Einsatz spezieller Methoden ergeben. So ist z.B. bei der Aufreinigung der Fermentationsbrühe mittels lonenaustauschchromatographie die Neigung der eingesetzten Chromatographie-Säule zur Verblockung (d.h. Verstopfung) zu berücksichtigen.
Aufgrund dieser Schwierigkeiten eignen sich bisher bekannte Varianten des Dry- Milling-Verfahrens nicht zur Bereitstellung von Stärkequellen für die fermentative Herstellung von Feinchemikalien und sind daher ohne wesentliche wirtschaftliche Bedeutung. Versuche zur Übertragung des Dry-Milling-Konzepts und der mit diesem Verfahren verbundenen prinzipiellen Vorteile auf die großtechnische Herstellung von Fein- Chemikalien sind bisher lediglich unter Verwendung von Cassava als Stärkequelle beschrieben worden.
So beschreibt die JP 2001/275693 zwar ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, bei dem man als Stärkequelle geschälte Cassavaknollen einsetzt, die trocken vermählen wurden. Zur Durchführung des Verfahrens ist es jedoch erforderlich, eine Teilchengröße des Mahlgutes von ≤ 150 μm einzustellen. Bei der dazu angewendeten Filtration werden mehr als 10 Gew.-% des eingesetzten Mahlguts, einschließlich nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Verflüssigung/Verzuckerung der enthaltenen Stärke und der anschließenden Fermentation abgetrennt. Darüber hinaus stellt sich hier die Problematik des Abtrennens von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen insofern nicht, als da die Fermentationsprodukte, z.B. Lysin, als Futtermittelzusatz bestimmt sind und daher die nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Cassava im Wertprodukt verbleiben können.
Ein ähnliches Verfahren wird in der JP 2001/309751 zur Herstellung eines aminosäu- rehaltigen Futterzusatzes beschrieben. Entsprechend ist hier eine Aufreinigung bzw. Feststoffabtrennung nicht erforderlich. Cassava sollte jedoch im Vergleich zu anderen Stärkequellen für das Dry-Milling relativ unproblematisch sein. Während der Stärkeanteil der Cassavawurzel in trockenem Zustand typischerweise wenigstens 80 Gew.-% beträgt (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Bd. 20 (4), 1978, John Wiley and Sons, Inc., Tabelle 1 , Seite 558), liegt der Trockengehalt an Stärke im Vergleich dazu bei Getreide deutlich niedriger, in der Regel unterhalb 70 Gew.-%, z.B. bei Mais bei etwa 68 Gew.-% und bei Weizen bei etwa 65 Gew.-% (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.). Dementsprechend enthält die nach Verflüssigung und Verzuckerung erhaltene Glucoselösung bei Einsatz von trocken ver- mahlener Cassava weniger Fremdbestandteile und insbesondere weniger Feststoffe als bei Einsatz einer anderen trocken vermahlenen Stärkequelle.
Durch eine erhöhte Menge an Fremdbestandteilen wird die Viskosität der Reaktionsmischung erhöht. Stärke aus Cassava sollte jedoch relativ leicht zu verarbeiten sein. Zwar weist sie im Vergleich zu Maisstärke eine höhere Viskosität bei der Quellungstemperatur auf, dafür nimmt die Viskosität jedoch bei ansteigender Temperatur bei Cassava schneller ab als bei Maisstärke (Menezes, T.J.B. de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, Seite 24, rechte Spalte). Darüber hinaus sind die Quellungs- und Gelatinierungstemperaturen von Stärke aus Cassava niedriger als die von Stärke aus Getreide wie Mais, weshalb sie leichter für bakterielle -Amylase zugänglich ist als Getreidestärke (Menezes, T.J.B. de, a.a.O.).
Weitere Vorteile von Cassava gegenüber anderen Stärkequellen sind ihr geringer Cel- lulosegehalt und ihr niedriger Phytatgehalt. Cellulose und Hemicellulose können insbe- sondere unter sauren Verzuckerungsbedingungen in Furfurale umgewandelt werden (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.; Menezes, T.J.B. de, s.o.), die ihrerseits auf die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen eine inhibierende Wirkung haben können. Phytat inhibiert ebenfalls die für die Fermentation eingesetzten Mikroorganismen.
Während es somit technisch möglich ist, Cassava als Stärkequelle in einem dem Dry- milling entsprechenden Verfahren zu verarbeiten, so ist ein solches Verfahren auf Basis von Cassava dennoch komplex, nicht optimiert und daher nicht weit verbreitet.
Es war somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Verfahren zur fermentativen Herstellung von Feinchemikalien bereitzustellen, das die Verwendung einer Vielzahl stärkehaltiger, weltweit lokal verfügbarer Pflanzen, z.B. Getreide oder Kartoffeln, als Stärkequelle erlaubt. Das Verfahren sollte sich durch eine leichte Handhabbarkeit der verwendeten Medien auszeichnen und insbesondere aufwändige Vor- oder Aufreinigungsschritte, wie etwa die Abtrennung fester nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Fermentation vermeiden. Außerdem sollte es eine leichte Aufarbeitung des Fermentationsgemisches ermöglichen. Im Rahmen der von der Anmelderin durchgeführten Arbeiten wurde überraschend gefunden, dass ein solches Verfahren trotz des inhärent erhöhten Feststoffeintrags effizient durchführbar ist. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend:
a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharid- gehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle um- f asst;
b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und
c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe,
dadurch gekennzeichnet, dass man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselpro- dukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit dem zuckerhaltigen Flüssigmedi- um kultiviert, welches man erhält durch:
a1 ) Vermählen der Stärkequelle; und
a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindes- tens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt.
Als Stärkequelle kommen vor allem trockene Kornfrüchte oder Samen in Betracht, die in getrocknetem Zustand mindestens 40 Gew.-% und bevorzugt mindestens 50 Gew.- % Stärkeanteil aufweisen. Diese finden sich in vielen der heutzutage in großem Maßstab kultivierten Getreidepflanzen wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, Roggen, Triticale, Reis und verschiedenen Hirsesorten, z.B. Sorghum und Milo. Bevorzugt ist die Stärke- quelle unter Getreidekörnern, besonders bevorzugt unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern ausgewählt. Grundsätzlich lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit anderen Stärkequellen durchführen, wie beispielsweise Kartoffeln, Cassa- va/Tapioka oder einer Mischung verschiedener stärkehaltiger Früchte oder Samen.
Bei den in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltenen Zuckern handelt es sich vorzugsweise um Monosaccharide wie Hexosen und Pentosen, z.B. Glucose, Fructo- se, Mannose, Galactose, Sorbose, Xylose, Arabinose und Ribose, insbesondere um Glucose. Der Anteil an von Glucose verschiedenen Monosacchariden kann abhängig von der verwendeten Stärkequelle und den darin enthaltenen nicht-stärkehaltigen Be- standteilen variieren und durch die Verfahrensführung, beispielsweise durch Auf- schluss von Cellulosebestandteilen durch Zusatz von Cellulasen, beeinflusst werden. Vorteilhafterweise umfassen die Monosaccharide des zuckerhaltigen Flüssigmediums einen Anteil an Glucose von mindestens 60 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 80 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge. Üblicherweise liegt der Gluco- seanteil im Bereich von 75 bis 99 Gew.-%, insbesondere von 80 bis 97 Gew.-% und speziell von 85 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge.
Erfindungsgemäß enthält das zuckerhaltige Flüssigmedium, mit welchem der die gewünschten Stoffwechselprodukte produzierende Mikroorganismenstamm kultiviert wird, zumindest einen Teil, vorzugsweise wenigstens 20 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-%, speziell wenigstens 90 Gew.-% und ganz speziell wenigstens 99 Gew.-% der in den vermahlenen Getreidekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts (und damit auf die Menge an Monosaccharid im zuckerhaltigen Flüssigmedium) beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 25 Gew.-%, z.B. zwischen 25 und 75 Gew.-% und speziell zwischen 30 und 60 Gew.-%.
Zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums wird im Schritt a1) die jeweilige Stärkequelle mit oder ohne Zusatz von Flüssigkeit, z.B. Wasser, vermählen, bevorzugt ohne Zusatz von Flüssigkeit. Es kann auch eine Trockenvermahlung mit einer anschließenden Nassvermahlung kombiniert werden. Zur trockenen Vermahlung werden typischerweise Hammermühlen, Rotormühlen oder Walzen-Schrotmühlen eingesetzt; zur Nassvermahlung eignen sich Rührmixer, Rührwerkskugelmühlen, Zirkulationsmühlen, Scheibenmühlen, Ringkammermühlen, Schwingmühlen oder Planetenmühlen. Grundsätzlich kommen auch andere Mühlen in Betracht. Die zur Nassvermahlung erforderliche Flüssigkeitsmenge kann der Fachmann in Routineexperimenten ermitteln. Üblicherweise wird sie so eingestellt, dass der Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 20 Gew.-% liegt.
Durch das Mahlen wird eine für die sich anschließenden Verfahrensschritte geeignete Korngröße eingestellt. Hierbei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das beim Vermählen, insbesondere bei trockener Vermahlung, im Schritt a1) erhaltene Mahlgut Mehlpartikel, d.h. teilchenförmige Bestandteile, mit einer Korngröße im Bereich von 100 bis 630 μm in einem Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% aufweist. Vorzugsweise enthält das erhaltene Mahlgut 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm. In der Regel weisen mindestens 95 Gew.-% der ermahlenen Mehlpartikel eine Korngröße von weniger als 2 mm auf. Die Messung der Korngröße erfolgt dabei mittels Siebanalyse unter Verwendung einer Vibrations-Analysenmaschine. Eine geringe Korngröße ist grundsätzlich zur Erzielung einer hohen Produktausbeute vorteilhaft. Eine zu geringe Teilchengröße kann jedoch zu Problemen, insbesondere durch Klumpenbildung/Agglomeration, beim Anmaischen des Mahlguts während der Verflüssigung bzw. bei der Aufarbeitung, z.B. bei der Trocknung der Feststoffe nach dem Fermentati- onsschritt, führen.
Üblicherweise werden Mehle durch den Ausmahlungsgrad bzw. durch die Mehltype charakterisiert, wobei diese so miteinander korrelieren, dass mit zunehmendem Ausmahlungsgrad auch die Kennzahl der Mehltype zunimmt. Der Ausmahlungsgrad ent- spricht der Gewichtsmenge des gewonnenen Mehls bezogen auf 100 Gewichtsteile des eingesetzten Mahlguts. Während beim Mahlen zunächst reines, feinstes Mehl, z.B. aus dem Inneren des Getreidekorns, anfällt, nimmt beim weiteren Vermählen, also mit steigendem Ausmahlungsgrad, der Anteil an Rohfaser- und Schalengehalt im Mehl zu, der Stärkeanteil wird dabei geringer. Der Ausmahlungsgrad spiegelt sich daher auch in der sogenannten Mehltype wider, die als Zahlenangabe zur Klassifizierung von Mehlen, insbesondere von Getreidemehlen, verwendet wird und die auf dem Aschegehalt des Mehles beruht (sogenannte Ascheskala). Die Mehltype bzw. die Typenzahl gibt hierbei die Menge Asche (Mineralstoffe) in mg an, die beim Verbrennen von 100 g Mehltrockensubstanz zurück bleibt. Für Getreidemehle bedeutet eine höhere Typzahl einen höheren Ausmahlungsgrad, da der Kern des Getreidekorns in etwa 0,4 Gew.-%, die Schale hingegen etwa 5 Gew.-% Asche enthält. Bei niederem Ausmahlungsgrad bestehen die Getreidemehle also überwiegend aus dem zerkleinerten Mehlkörper, d.h. dem Stärkebestandteil der Getreidekörner; bei höherem Ausmahlungsgrad enthalten die Getreidemehle auch die zerkleinerte, eiweißhaltige Aleuronschicht der Getreide- körner, bei Schrot auch die Bestandteile des eiweiß- und fetthaltigen Keimlings sowie der rohfaser- und aschehaltigen Samenschalen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind grundsätzlich Mehle mit einem hohen Ausmahlungsgrad bzw. einer hohen Typzahl bevorzugt. Wird Getreide als Stärkequelle eingesetzt, so werden vorzugsweise die ganzen ungeschälten Körner vermählen und weiter verarbeitet.
Gegebenenfalls wird man die Stärkequelle vor dem Vermählen auf eine für das Vermählen geeignete Größe zerkleinern, beispielsweise bei Einsatz größerer Früchte wie Kartoffeln oder Cassava. Im Falle von Getreide kann dieser Zerkleinerungsschritt entfallen, und das ganze Korn wird eingesetzt und vermählen.
Zum Verflüssigen des Stärkeanteils im Mahlgut gibt man im Schritt a2) wenigstens eine Teilmenge des Mahlgutes, vorzugsweise wenigstens 40 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 55 Gew.-% im Verlauf der Verflüssigung, jedoch vor der Verzuckerung in den Reaktor. Häufig wird die zuge- gebene Menge 90 Gew.-%, insbesondere 85 Gew.-% und besonders bevorzugt 80 Gew.-% nicht überschreiten. Vorzugsweise wird die im Verlauf zugegebene Teilmenge an Mahlgut dem Reaktor unter Bedingungen zugeführt, wie sie bei der Verflüssigung vorliegen. Die Zugabe kann diskontinuierlich, d.h. portionsweise in mehreren Teilportionen, die vorzugsweise jeweils nicht mehr als 20 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-%, z.B. 1 bis 20 Gew.-% insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, der Gesamtmenge des zu verflüssigenden Mahlgutes ausmachen, oder kontinuierlich erfolgen. Erfindungswesentlich ist, dass sich zu Beginn der Verflüssigung nur ein Teil des Mahlgutes, vorzugsweise nicht mehr als 60 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 50 Gew.-% und besonders bevorzugt nicht mehr als 45 Gew.-% des Mahlgutes, im Reaktor befindet und die Restmenge des Mahlgutes während des Verflüssigens zugegeben wird. Die Verflüssigung kann auch kontinuierlich, z.B. in einer mehrstufigen Reaktionskaskade, ausgeführt werden.
Erfindungsgemäß erfolgt das Verflüssigen in Schritt a2) in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms, das vorzugsweise unter α-Amylasen ausgewählt ist. Andere unter den Reaktionsbedingungen aktive und stabile Stärke verflüssigende Enzyme sind ebenfalls einsetzbar.
Die α-Amylase (bzw. das verwendete Stärke verflüssigende Enzym) kann im Reaktionsgefäß vorgelegt oder im Verlauf des Schrittes a2) zugegeben werden. Vorzugsweise gibt man eine Teilmenge der in Schritt a2) benötigten α-Amylase zu Beginn von Schritt a2) zu oder legt diese Teilmenge im Reaktor vor. Die Gesamtmenge an α- Amylase liegt üblicherweise im Bereich von 0,002 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1 ,5 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
Die Verflüssigung kann oberhalb oder unterhalb der Gelierungstemperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Verflüssigung in Schritt a2) zumindest zeitweise oberhalb der Gelierungstemperatur der eingesetzten Stärke (sogenannter Cooking Prozess). In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und 165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125 °C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 1 15 °C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt.
Für eine optimale Wirkung der α-Amylase wird Schritt a2) vorzugsweise zumindest zeitweise bei einem pH-Wert im schwach sauren Bereich, vorzugsweise zwischen 4,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,0 bis 6,5 durchgeführt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn von Schritt a2) die pH-Einstellung vorgenommen wird; dieser pH- Wert wird während der Verflüssigung vorzugsweise kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt vorzugsweise mit verdünnten Mineralsäuren wie H2SO4 oder H3PO4 bzw. mit verdünnten Alkalilaugen wie NaOH oder KOH.
In einer bevorzugten Ausführungsform führt man Schritt a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens so durch, dass zunächst eine Teilmenge von höchstens 60 Gew.-%, bevorzugt höchstens 50 Gew.-% und besonders bevorzugt höchstens 45 Gew.-%, z.B. 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 45 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Mahlguts, in einer wässrigen Flüssigkeit, z.B. Frischwasser, rückgeführtes Prozesswasser, z.B. aus der Fermentation oder der Aufarbeitung, oder in einer Mischung dieser Flüssigkeiten suspendiert wird und anschließend die Verflüssigung durchgeführt wird.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die zur Erzeugung der Suspension verwendete Flüssigkeit auf eine leicht erhöhte Temperatur, z.B. im Bereich von 40 bis 60°C, vorzutemperieren. Es ist jedoch bevorzugt, die Flüssigkeiten bei Raumtemperatur einzusetzen.
Zu dieser Suspension wird dann das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, gegeben. Wird eine α-Amylase verwendet, so gibt man vorteilhafterweise nur eine Teilmenge der α-Amylase zu, z.B. 10 bis 70 Gew.-% und insbesondere 20 bis 65 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt in Schritt a2) eingesetzte α-Amylase. Die zu diesem Zeitpunkt zugegebene Menge an α-Amylase richtet sich nach der Aktivität der jeweiligen α-Amylase in Bezug auf die verwendete Stärkequelle unter den Reaktionsbedingungen und liegt üblicherweise im Bereich von 0,0004 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 bis 1 ,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle. Alternativ kann die Teilmenge der α-Amylase vor dem Ansetzen der Suspension mit der verwen- deten Flüssigkeit vermengt werden.
Hierbei wird vorzugsweise die Teilmenge an α-Amylase vor dem Beginn des Aufheizens auf die zur Verflüssigung angewendete Temperatur, insbesondere bei Raumtemperatur oder nur leicht erhöhter Temperatur, z.B. im Bereich von 20 bis 30 °C, zu der Suspension gegeben.
Vorteilhafterweise werden die Mengen an α-Amylase und Mahlgut so ausgewählt sein, dass die Viskosität während des Gelierungsvorgangs ausreichend reduziert ist, um eine effektive Durchmischung der Suspension, z.B. mittels Rühren, zu ermöglichen. Bevorzugt beträgt die Viskosität der Reaktionsmischung während des Gelierens maximal 20 Pas, besonders bevorzugt maximal 10 Pas und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Pas. Die Messung der Viskosität erfolgt in der Regel mit einem Haake Viskosi- meter Type Roto Visko RV20 mit Messsystem M5 und Messeinrichtung MVDIN bei einer Temperatur von 50 °C und einer Schergeschwindigkeit von 200 s"1.
Die so angesetzte Suspension wird dann vorzugsweise auf eine Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der verwendeten Stärke erhitzt. In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und "165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125 °C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 115 °C gewählt, wobei die Temperatur vor- zugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt. Unter Kontrolle der Viskosität werden nach und nach weitere Teilmengen der Stärkequelle, z.B. jeweils 2 bis 20 Gew.-% und insbesondere 5 bis 10 Gew.-% bezogen auf die gesamte eingesetzte Stärkemenge, zu der stärkehaltigen Suspension zugegeben. Es ist bevorzugt, die im Verlauf der Verflüssigung zuzugeben- de Teilmenge des Mahlgutes in mindestens 2, bevorzugt mindestens 4 und besonders bevorzugt mindestens 6 Teilportionen der Reaktionsmischung zuzugeben. Alternativ kann die Zugabe der beim Ansetzen der Suspension nicht eingesetzten Teilmenge des Mahlgutes kontinuierlich während der Verflüssigung erfolgen. Die Temperatur sollte bei der Zugabe vorteilhafterweise oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke gehalten werden.
Nach vollständiger Zugabe des Mehls wird das Reaktionsgemisch üblicherweise noch eine Zeit, z.B. 30 bis 60 Minuten oder länger, sofern erforderlich, bei der oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke eingestellten Temperatur gehalten, d.h. verkocht. Die Reaktionsmischung wird dann in der Regel auf eine etwas geringere Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur, z.B. 75 bis 90°C, abgekühlt, bevor eine weitere Teilmenge an α-Amylase, vorzugsweise die Hauptmenge, zugesetzt wird. Je nach Aktivität der verwendeten α-Amylase unter den Reaktionsbedingungen beträgt die Menge an zu diesem Zeitpunkt zugegebener α-Amylase vorzugsweise 0,002 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,4 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
Bei diesen Temperaturen wird die granuläre Struktur der Stärke zerstört (Gelieren), wodurch deren enzymatischer Abbau ermöglicht wird. Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten oder gegebenenfalls weiter erhitzt, bis der Stärkenachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls können hierbei noch eine oder meh- rere weitere Teilmengen α-Amylase, z.B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.
Nach abgeschlossener Verflüssigung der Stärke wird eine Verzuckerung der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, d. h. deren Abbau zu Glucose, kontinuierlich o- der diskontinuierlich durchgeführt, bevorzugt kontinuierlich. Das verflüssigte Medium kann in einem speziellen Verzuckerungstank vollständig verzuckert werden, bevor es dem Fermentationsschritt b) zugeführt wird. Es hat sich andererseits als vorteilhaft erwiesen, vor der Fermentation nur eine teilweise Verzuckerung vorzunehmen. Bei- spielsweise kann man so vorgehen, dass man eine Teilmenge der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, z.B. im Bereich von 10 bis 90 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 20 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Dextrine (bzw. der ursprünglichen Stärke), verzuckert und das resultierende zuckerhaltige Flüssigmedium in der Fermentation einsetzt. Im Fermentationsmedium kann dann eine weitere Verzuckerung in situ erfolgen. Die Verzuckerung kann des Weiteren unter Wegfall eines separaten Verzuckerungstanks direkt im Fermenter (in situ) durchgeführt werden. Vorteile der in-situ-Verzuckerung, d.h. einer teilweise oder vollständig im Fermenter erfolgenden Verzuckerung, sind einerseits reduzierte Investitionskosten, andererseits kann durch eine retardierte Freisetzung der Glucose gegebenenfalls eine höhere Glu- cosekonzentration im Ansatz (Batch) vorgelegt werden, ohne dass eine Inhibierung oder Stoffwechseländerung der eingesetzten Mikroorganismen auftritt. Bei E.coli führt eine zu hohe Glucosekonzentration z.B. zur Bildung von organischen Säuren (Acetat), während Saccharomyces cerevisae in diesem Fall z.B. auf Vergärung umschaltet, obwohl in belüfteten Fermentern ausreichend Sauerstoff vorhanden ist (Crabtree-Effekt). Eine retardierte Freisetzung von Glucose ist durch die Regelung der Glucoamylase- konzentration einstellbar. Hierdurch können die vorgenannten Effekte unterdrückt werden und es kann mehr Substrat vorgelegt werden, so dass die aus dem zugeführten Feed-Strom resultierende Verdünnung reduziert werden kann.
Im Fall der Verzuckerung in einem Verzuckerungstank wird die verflüssigte Stärkelö- sung üblicherweise auf das Temperaturoptimum des verzuckernden Enzyms oder leicht darunter, z.B. auf 50 bis 70 °C, bevorzugt 60 bis 65 °C abgekühlt bzw. temperiert und anschließend mit Glucoamylase versetzt.
Sofern man die Verzuckerung im Fermenter durchführt, wird man die verflüssigte Stär- kelösung in der Regel auf Fermentationstemperatur, d. h. 32 bis 37°C, abkühlen, bevor man sie dem Fermenter zuführt. Die Glucoamylase (bzw. das mindestens eine verzuckernde Enzym) zur Verzuckerung wird in diesem Fall der Fermentationsbrühe direkt zugesetzt. Die Verzuckerung der verflüssigten Stärke gemäß Schritt a2) erfolgt hierbei parallel zur Verstoffwechselung des Zuckers durch die Mikroorganismen gemäß Schritt b).
Vorteilhafterweise wird vor Zugabe der Glucoamylase der pH-Wert des Flüssigmediums auf einen Wert im optimalen Wirkungsbereich der eingesetzten Glucoamylase, vorzugsweise im Bereich zwischen 3,5 und 6,0; besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,5 und ganz besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,0 eingestellt. Es ist jedoch auch möglich, insbesondere bei Durchführung der Verzuckerung direkt im Fermenter, den pH-Wert außerhalb der vorgenannten Bereiche einzustellen, z.B. im Bereich von 6,0 bis 8,0. Dies kann z.B. bei der Herstellung von Lysin, Panthothenat und Vitamin B2 trotz der eingeschränkten Aktivität von Standard-Glucoamylasen in diesem pH-Bereich insgesamt vorteilhaft oder aufgrund der einzustellenden Fermentationsbedingungen erforderlich sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verzuckerung in einem speziellen Verzuckerungstank. Dazu wird die verflüssigte Stärkelösung auf eine für das Enzym optimale Temperatur oder leicht darunter temperiert und der pH-Wert in der oben beschriebenen Weise auf einen für das Enzym optimalen Wert eingestellt. Die Glucoamylase wird dem dextrinhaltigen Flüssigmedium üblicherweise in einer Menge von 0,001 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,005 bis 3,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zugesetzt. Nach Zugabe der Glucoamylase wird die dextrinhaltige Suspension vorzugsweise für einen Zeitraum von z.B. 2 bis 72 Stunden oder länger, sofern erforderlich, insbesondere von 5 bis 48 Stunden bei der eingestellten Temperatur gehalten, wobei die Dextrine zu Monosacchariden verzuckert werden. Der Fortschritt der Verzuckerung kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, z.B. HPLC, Enzym- tests oder Glucose-Teststäbchen, verfolgt werden. Die Verzuckerung ist abgeschlossen, wenn die Konzentration der Monosaccharide nicht mehr wesentlich ansteigt oder wieder fällt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die diskontinuierliche oder kontinuierli- ehe, bevorzugt die diskontinuierliche und insbesondere portionsweise Zugabe des Mahlguts in Gegenwart der mindestens einen α-Amylase sowie der mindestens einen Glucoamylase im Schritt a2) derart, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas, bevorzugt maximal 10 Pas und besonders bevorzugt maximal 5 Pas beträgt. Zur Unterstützung der Viskositätskontrolle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn mindestens 25 Gew.-%, bevorzugt mindestens 35 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 50 Gew.-% der Gesamtmenge des zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelatinierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden. Die Kontrolle der Viskosität kann des Weiteren dadurch beeinflusst werden, dass das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, oder/und das mindestens eine verzuckernde Enzym, vorzugsweise eine Glucoamylase, selbst portionsweise zugegeben werden.
Durch Anwendung der Schritte a1) und a2) ist es möglich, die zuckerhaltige Flüssigkeit mit einem Monosaccharidgehalt von vorzugsweise mehr als 30 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 35 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt mehr als 40 Gew.-% herzustellen.
Zur Verflüssigung des Stärkeanteils im Mahlgut können grundsätzlich alle α-Amylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.1) eingesetzt werden, insbesondere α-Amylasen, die aus Bacillus lichenformis oder Bacillus staerothermophilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verflüssigen von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verflüssigen geeigneten α-Amylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozy- mes unter der Bezeichnung Termamyl 120 L, Typ L; oder von Genencor unter der Be- Zeichnung Spezyme. Es kann auch eine Kombination verschiedener α-Amylasen zur Verflüssigung eingesetzt werden.
Zur Verzuckerung der Dextrine (d.h. Oligosaccharide) in der verflüssigten Stärkelösung können grundsätzlich alle Glucoamylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.3) eingesetzt wer- den, insbesondere Glucoamylasen, die aus Aspergilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verzuckern von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verzuckern geeigneten Glucoamylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novo- zymes unter der Bezeichnung Dextrozyme GA; oder von Genencor unter der Bezeichnung Optidex. Es kann auch eine Kombination verschiedener Glucoamylasen verwendet werden.
Zur Stabilisierung der eingesetzten Enzyme kann gegebenenfalls die Konzentration an Ca2+-lonen, z.B. mit CaCI2, auf einen enzymspezifischen optimalen Wert eingestellt werden. Geeignete Konzentrationswerte können vom Fachmann in Routineexperimenten bestimmt werden. Wird z.B. Termamyl als α-Amylase eingesetzt, so ist es vorteilhaft, eine Ca2+-Konzentration von z.B. 50 bis 100 ppm, bevorzugt 60 bis 80 ppm und besonders bevorzugt etwa 70 ppm im Flüssigmedium einzustellen.
Da zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß a) die ganze Stärkequelle, z.B. im Falle von Getreide das ganze Korn, vermählen wird, umfasst diese auch die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Dies bedingt oftmals den Eintrag eines nicht zu vernachlässigenden Anteils an Phytat aus der Kornfrucht. Um die daraus resultierende inhibierende Wirkung zu vermeiden, wird vorteilhafterweise in Schritt a2) dem Flüssigmedium mindestens eine Phytase zugesetzt, bevor das zuckerhaltige Flüssigmedium dem Fermentationsschritt b) zugeführt wird.
Die Zugabe der Phytase kann vor, während oder nach der Verflüssigung oder der Ver- zuckerung erfolgen, sofern sie die jeweils erforderliche Hitzestabilität aufweist.
Es können beliebige Phytasen eingesetzt werden, soweit deren Aktivität unter den Reaktionsbedingungen jeweils höchstens unwesentlich eingeschränkt ist. Bevorzugt sind Phytasen mit einer Temperaturstabilität (T50) > 50 °C und besonders bevorzugt > 60 °C.
Die Menge an Phytase beträgt üblicherweise 1 bis 10000 Units/kg Stärkequelle und insbesondere 10 bis 2000 Units/kg Stärkequelle.
Zur Erhöhung der Gesamtzuckerausbeute bzw. zur Gewinnung freier Aminosäuren können dem Reaktionsgemisch während der Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums außerdem weitere Enzyme, zum Beispiel Pullulanasen, Cellulasen, Hemicel- lulasen, Glucanasen, Xylanasen, Glucosidasen oder Proteasen, zugesetzt werden. Der Zusatz dieser Enzyme kann die Viskosität positiv beeinflussen, d.h. herabsetzen (z.B. durch Spaltung längerkettiger Glucane und/oder von (Arabino-)Xylanen), die Freisetzung metabolisierbarer Glucoside und die Freisetzung von (Rest-)Stärke bewirken. Der Einsatz von Proteasen hat analoge positive Effekte, wobei zusätzlich Aminosäuren als Wachstumsfaktoren für die Fermentation freigesetzt werden können. Das zuckerhaltige Flüssigmedium kann vorteilhaft zur fermentativen Herstellung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom verwendet werden. Dazu wird das in Schritt a) hergestellte zuckerhaltige Flüssigmedium einer Fermentation gemäß b) zugeführt. In der Fermentation werden Feinchemikalien, d. h. Verbindungen mit mindestens 3 C- Atomen und/oder mindestens einem N-Atom und mindestens 2 C-Atomen, von den Mikroorganismen produziert. Die Durchführung des Fermentationsverfahrens kann in der Regel in der dem Fachmann bekannten üblichen Art und Weise erfolgen. Dabei liegt das Volumenverhältnis von zugeführtem zuckerhaltigen Flüssigmedium zu dem vorgelegten und die Mikroorganismen enthaltenden Flüssigmedium im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 :10 bis 10:1 , z.B. bei etwa 1 :2 oder etwa 2:1 und insbesondere bei etwa 1 :1. Insbesondere über die Zufuhrgeschwindigkeit des zuckerhaltigen Flüssigmediums kann der Zuckergehalt in der Fermentationsbrühe reguliert werden. In der Regel wird man die Zufuhrgeschwindigkeit so einstellen, dass der Monosaccharidgehalt in der Fermentationsbrühe im Bereich von ≥ 0 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% liegt; die Fermentation kann jedoch auch bei deutlich höheren Monosaccharidgehalten in der Fermentationsbrühe, z.B. etwa 10 bis 20 Gew.-%, durchgeführt werden.
Sofern die Verzuckerung und die Fermentation separat durchgeführt wird, kann das in Schritt a) erhaltene, zuckerhaltige Flüssigmedium vor der Fermentation gegebenenfalls sterilisiert werden, wober man die Mikroorganismen durch thermische, chemische oder mechanische Verfahren abtötet. Hierbei heizt man die Brühe üblicherweise auf Temperaturen oberhalb 80°C auf. Die Abtötung bzw. Lyse der Zellen kann unmittelbar vor der Fermentation erfolgen. Hierzu wird die gesamte zuckerhaltige Flüssigmedium der Lyse bzw. Abtötung zugeführt. Diese kann thermisch, mechanisch oder chemisch erfolgen. Es hat sich jedoch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als nicht notwendig erwiesen, vor der Fermentation einen Sterilisierungsschritt wie hier beschrieben durchzuführen, sondern es hat sich vielmehr als vorteilhaft erwiesen, keinen solchen Sterilisierungsschritt durchzuführen. Dementsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungs- form der Erfindung ein Verfahren, bei dem das in Schritt a) erhaltene Flüssigmedium unmittelbar, d.h. ohne vorherige Sterilisation, der Fermentation zugeführt oder eine zumindest teilweise in-situ-Verzuckerung durchgeführt wird.
Bei der Fermentation resultiert ein Flüssigmedium, das neben dem gewünschten nicht- flüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukt im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung und insbesondere die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, wie z.B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Pufferund Nährsalze enthält. Dieses Flüssigmedium wird in der vorliegenden Anmeldung auch als Fermentationsbrühe bezeichnet, wobei der Ausdruck Fermentationsbrühe auch das (zuckerhaltige) Flüssigmedium umfasst, bei dem eine erst teilweise oder unvollständige fermentative Umsetzung der darin enthaltenen Zucker, d.h. eine teilweise oder unvollständige mikrobielle Verstoffwechselung der Monosaccharide, erfolgt ist. Der Begriff Feinchemikalie umfasst im Folgenden insbesondere organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z. B. 1 , 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tragende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen, z.B. Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, 3- Hydroxypropionsäure, Glutarsäure, Lävulinsäure, Milchsäure, Propionsäure, Glucon- säure, Aconitsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäure; proteinogene und nicht- proteinogene Aminosäuren, z.B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparagin- säure und Threonin; Purin- und Pyrimidinbasen; Nukleoside und Nukleotide, z.B. Niko- tinamidadenindinukleotid (NAD) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP); Lipide; gesät- tigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z.B. y- Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Do- cosahexaensäure; Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z.B. Propandiol und Bu- tandiol; höherwertige Alkohole mit 3 oder mehr, z.B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z.B. Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol und Arabinitol; längerkettige Alkohole mit wenigstens 4 C-Atomen, z.B. mit 4 bis 22 C-Atomen, z.B. Butanol; Kohlenhydrate, z.B. Hyaluron- säure und Trehalose; aromatische Verbindungen, z.B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo; Vitamine und Provitamine, z.B. Ascorbinsäure, Vitamin B6, Vitamin B12 und Ri- boflavin, Cofaktoren und sogenannte Nutrazeutika; Proteine wie Enzyme, z. B. Phytasen, Xylanasen und Glucanasen; Carotenoide, z.B. Lycopin, ß-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin; Ketone mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z.B. Aceton und Acetoin; Lactone, z.B. γ-Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z.B. Polyhydroxyacetat, Polyester, Polysaccharide, Polyisoprenoide, Polyamide, Polyhydroxyalkanoate, z.B. Poly-3- hydroxybuttersäure und Copolyester mit anderen organischen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (Hg.), Biopolymers, 1. Aufl., 2003, Wiley-VCH, Weinheim und der dort zitierten Literatur beschrieben sind; sowie Vorstufen und Derivate der vorgenannten Verbindungen. Weitere als Feinchemikalien in Frage kommende Verbindungen sind von Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086 beschrie- ben.
Der Begriff "Cofaktor" umfasst nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise orga- nisch. Beispiele solcher Moleküle sind NAD und Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP); die Vorstufe dieser Cofaktoren ist Niacin.
Der Begriff "Nutrazeutikum" umfasst Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Mole- küle sind Vitamine, Antioxidantien und bestimmte Lipide, z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren.
Insbesondere sind die hergestellten Stoffwechselprodukte unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen, Alkandiolen mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoaten ausgewählt.
Es versteht sich für den Fachmann, dass die erfindungsgemäß auf fermentativem Weg hergestellten Verbindungen jeweils in der von den eingesetzten Mikroorganismen produzierten Enantiomerenform erhalten werden (sofern unterschiedliche Enantiomere existieren). So erhält man z.B. von den Aminosäuren in der Regel das jeweilige L- Enantiomer.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt zur Herstellung nicht-flüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte eingesetzt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter nicht-flüchtigen Stoffwechselprodukten Verbindungen verstanden, die sich im Allgemeinen auf destillativem Weg nicht unzersetzt aus der Fermentationsbrü- he entfernen lassen. Diese Verbindungen weisen in der Regel einen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser, häufig oberhalb 150 °C und insbesondere oberhalb 200 °C bei Normaldruck auf. In der Regel handelt es sich um Verbindungen, die bei Normalbedingungen (298 K, 101 ,3 kPa) in festem Zustand vorliegen.
Es ist jedoch auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte einzusetzen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen. In diesem Fall wird man in der Regel während der Aufarbeitung, insbesondere während der Trocknung die maximale Temperature kontrollieren. Vorteilhaft kön- nen diese Verbindungen auch dadurch hergestellt werden, dass man sie in quasi fester Form (pseudofester Form) auf Adsorbentien formuliert. In der Regel wird man in diesem Fall vor der Abreicherung oder Isolierung des Wertprodukts gemäß Schritt c) die festen Bestandteile der Fermentationsbrühe abtrennen.
Zu dem vorgenannten Zweck geeignete Adsorbentien sind z.B. Aktivkohlen, Aluminiumoxide, Kieselgele, Kieselsäure, Ton, Ruße, Zeolithe, anorganische Alkali- und Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calciumhydroxide, - carbonate, -Silikate, -sulfate, -phosphate, insbesondere Magnesium- und Calciumsalze, z.B. Mg(OH)2, MgCO3, MgSiO , CaSO4, CaCO3) Erdalkalimetalloxide, z.B. MgO und CaO, andere anorganische Phosphate und Sulfate, z.B. ZnSO , Salze organischer Säuren, insbesondere deren Alkali- und Erdalkalimetallsalze und speziell deren Natrium- und Kaliumsalze, z.B. Natrium- und Kaliumacetat, -formiat, -hydrogenformiate und -citrat, sowie höhermolekulare organische Träger wie Kohlenhydrate, z.B. Zucker, gegebenenfalls modifizierte Stärken, Cellulose, Lignin, sowie allgemein die weiter unten im Zusammenhang mit der Produktformulierung genannten Trägermaterialien. In der Regel werden die genannten Trägermaterialien keine oder nur geringe Anteile, insbesondere lediglich Spuren an Halogenen wie Chloridionen und an Nitraten aufweisen. Beispiele für Verbindungen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen und die vorteilhaft auf diese Weise durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden können, sind γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure, weiterhin Propionsäure, Milchsäure, Propandiol, Butanol und Aceton. Auch diese Verbindungen in pseudofester Formulierung werden im Sinne der vorliegenden Erfindung als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in fester Form verstanden.
Die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen richten sich in an sich bekannter Weise nach den jeweiligen Feinchemikalien, wie unten im einzelnen erläutert. Sie können natürlichen Ursprungs oder genetisch modifiziert sein. Beispiele für geeignete Mikroorganismen und Fermentationsverfahren sind die in der folgenden Tabelle A angegeben:
Tabelle A:
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Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen die Herstellung von Enzymen wie Phytasen, Xylanasen, Glucanasen; Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin; Vitaminen wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufern und Folgeprodukten davon; sowie die Herstellung von den vorgenannten Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure und Bernsteinsäure, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; von den vorgenannten längerkettigen Alkano- len, insbesondere Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; von den vorgenannten Diolen, insbesondere Alkandiolen mit 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol; von den vorgenannten Ketonen, insbesondere Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; von den vorgenannten Kohlehydraten, insbesondere Disacchariden wie Trehalose; und von Polyhydroxyalkanoaten .
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen daher ausgewählt unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme wie Phytase, Xylanase, Glucanase; Aminosäuren wie Lysin, Threonin und Methionin; Vitamine wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon; Disaccharide wie Trehalose; aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C- Atomen wie Propionsäure und Bernsteinsäure; aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol; und Polyhydroxyalkanoate.
Insbesondere sind die Mikroorganismen ausgewählt unter den Gattungen Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium und Clostridium, insbesonde- re unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propioni- bacterium freudenreichii, Clostridium propionicum und Clostridium acetobutlicum.
In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Lysin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehenswei- sen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in Pfefferle et al., a.a.O. und US 3,708,395. Prinzipiell kommen sowohl eine kontinuierliche als auch eine diskontinuierliche (Batch oder Fed-Batch) Betriebsweise in Betracht, bevorzugt ist die Fed-Batch Betriebsweise.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 03/087386 und WO 03/100072.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Po- lyhydroxyalkanoate wie Poly-3-hydroxybutyrat und Copolyester mit anderen organi- sehen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (a.a.O.) beschrieben sind, z.B. auch längerkettige Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3- Hydroxytetradecansäure, sowie Mischungen davon. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this ri- boflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine Phytase. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 98/55599.
Vor der weiteren Verarbeitung der Fermentationsbrühe (d.h. vor Schritt c) wird gege- benenfalls ein Sterilisierungsschritt in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.
Die Isolierung oder Abreicherung des Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) erfolgt in der Regel derart, dass man wenigstens ein Stoffwechselprodukt so aus der Fermentationsbrühe abreichert oder isoliert, dass der Gehalt dieses Stoffwechselprodukts in der verbleibenden Fermentationsbrühe höchstens 20 Gew.-%, insbesondere höchstens 10 Gew.-%, speziell höchstens 5 Gew.-% und ganz speziell höchstens 2,5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der verbleibenden Fermentationsbrühe, beträgt.
Die Isolierung oder Abreicherung von Feinchemikalien (d.h. des mikrobiellen Stoffwechselprodukts) aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) kann in einem oder mehreren Schritten erfolgen. Ein wesentlicher Schritt dabei ist die Abtrennung der festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe. Diese kann entweder vor oder nach der Isolierung des Wertprodukts durchgeführt werden. Sowohl zur Isolierung von Wertstof- fen als auch zur Abtrennung von Feststoffen, d.h. Fest-Flüssig-Phasenseparation, sind im Fachgebiet übliche Methoden bekannt, die auch Schritte zur Grob- und Feinreinigung der Wertstoffe sowie zur Konfektionierung umfassen (z.B. beschrieben in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wi- ley-VCH).
Zur Isolierung des Wertprodukts kann man vorteilhafterweise so vorgehen, dass man zunächst die festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe entfernt, z.B. mittels Zentrifugation oder Filtration, und anschließend das Wertprodukt aus der flüssigen Phase isoliert, z.B. durch Kristallisation, Fällung, Adsorption oder Destillation. Alternativ kann das Wertprodukt auch direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert werden, z.B. durch Einsatz chromatographischer Verfahren oder von Extraktions-Verfahren. Als chromatographisches Verfahren ist insbesondere die lonenaustauschchromatographie zu nennen, bei der das Wertprodukt selektiv auf der Chromatographiesäule isoliert werden kann. In diesem Fall erfolgt die Abtrennung der Feststoffe aus der verbleibenden Fermentationsbrühe vorteilhafterweise z.B. durch Dekantieren, Eindampfen o- der/und Trocknung. Übliche Filtrations-Verfahren sind z.B. die Kuchen- und Tiefenfiltration (z.B. beschrieben in A. Rushton, A. S. Ward, R. G. Holdich: Solid - Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp. 177ff., K. J. Ives, in A. Rushton (Hg.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series E Nr. 88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp. 90ff.) und Cross-flow- Filtrationen, insbesondere die Mikrofiltration zur Abtrennung von Feststoffen > 0,1 μm (z.B. beschrieben in J. Altmann, S. Ripperger, J. Membrane Sei. 124 (1997) 119 — 128.).
Übliche Zentrifugations-Verfahren sind z.B. in G. Hultsch, H. Wilkesmann, "Filtering Centrifuges," in D.B. Purchas, Solid - Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp. 493 - 559; und H. Trawinski, Die äquivalente Klärfläche von Zentrifugen, Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612 beschrieben. Verschiedene Bauformen wie Röhren- und Korbzentrifugen sowie im speziellen Schub-, Stülpfilterzentrifugen und Tellerseparatoren können eingesetzt werden.
Übliche Extraktions-Verfahren umfassen batch-weise bzw. stufenweise und differentiel- le kontinuierliche Verfahren im Gleich- oder Gegenstrom. Dabei kann mit zwei oder einer beweglichen Phasen gearbeitet werden. Die Löslichkeit der Wertstoffe und der abzutrennenden Nebenkomponenten in beiden Phasen kann unter Anderem durch die Wahl des Lösungsmittels, durch Variation der Gegenionen und durch Variation des pH- Wertes beeinflusst werden (Treybal, R.E., Mass Transfer Operations, 3. Aufl., New York, Mc Graw-Hill, 1979; Kula, M., Kroner, K.H., Hustedt, H. und Schutee, H., Technical aspects of extractive enzyme purification, Ann. N.Y. Acad. Sei., 341 (1981 ); Robin- son, R.G., and Cha, D.Y., Controlled pH extraction in the Separation of weak acids and bases, Biotech. Progress, 1 (1), 18 (1985)).
Übliche Adsorptions-Verfahren sind z.B. in D. M. Ruthven: Principles of Adsorption and Adsorption Processes, J. Wiley & Sons, New York 1984.; G. Wedler: Adsorption, Ver- lag Chemie, Weinheim 1970.) beschrieben. Festbett-, Moving-bed- und Fluidized-bed- Adsorber können zur Anwendung kommen. Die Adsorption kann batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden (K. Hauffe, S. R. Morrison: De Gruyter Studienbuch "Adsorption," De Gruyter, Berlin 1974.; W. Käst: Adsorptionstechnik, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988.). Neben vielen anderen Adsorbentien können aktivierte Kohlen, lonenaustauscherharze, natürliche oder synthetische Zeolithe und aktivierte Aluminiumoxide eingesetzt werden. Daneben können auch Verfahren zur Affinitätsadsorption zur Anwendung kommen (z.B. beschrieben in Arnold, F.H., Blanch, H.W., and Wilke, C.R., Analysis of Affinity separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985)).
Insbesondere zur Reinigung der Feinchemikalien können z.B. Chromatographie, Fällung, Ultra-, Mikro- und Nanofiltration, Reversosmose, Elektrophorese, Elektrodialyse und isoelektrische Fokussierung eingesetzt werden. Chromatographische Verfahren können batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Zur kontinuierlichen Chromatographie zählen z.B. ein Continuous Rotating Annular Chromatograph (CRAC) (z.B. beschrieben in A. J. P. Martin, Discuss. Farra- day Soc. 7 (1949)), ein True Moving Bed Chromatograph (TMBC) (z.B. beschrieben in K. Takeuchi, T. Miyauchi, Y. Uraguchi, J. Chem. Eng. Japan 11 (1978) 216-220.) und ein Simulated Moving Bed Chromatograph (SMB) (z.B. beschrieben in D. B. Brough- ton, Universal Oil Products Co., US 2,985,589, 1961). Als Festphase werden z.B. aktivierte Aluminiumoxide, Silikagele, glykolimprägnierte Diatomerenerden, Dextrane, Polymere sulfonierter Stryene, Polyacrylamide sowie polymergebundene Proteine einge- setzt (Arnold, F.H., Blanch, H.W., und Wilke, C.R., Analysis of Affinity separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985); Gibbs, S.J., und Lightfoot, E.N., Scaling up gradient elution chromatography, IEC Fund., 25, 490 (1986); King, C.J., Separation Processes, 2. Aufl., New York, McGraw-Hill (1979); Yau, W. W., Kirlland, J.J., und Bly, D.D., Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography, Wiley, New York (1979)).
Bei einer Fällung können entweder die Wertstoffe oder die Nebenkomponenten ausgefällt werden (J. W. Mullin: Crystallization, 3rd ed., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993). Die Fällung kann z.B. eingeleitet werden durch Zugabe eines weiteren Lösungsmittels, Zugabe von Salzen und die Variation der Temperatur. Der entstehende Niederschlag kann durch die oben beschriebenen üblichen Verfahren zur Abtrennung von Feststoffen von der Brühe separiert werden.
Bei der Mikro-, Ultra-, Nanofiltration und der Reversosmose können z.B. mikroporöse (A. S. Michaels: "Ultrafiltration," in E. S. Perry (ed.): Progress in Separation and Purifi- cation, vol. 1 , Interscience Publ., New York 1968.), homogene (J. Crank, G. S. Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968; S. A. Stern: "The Separation of Gases by Selective Permeation," in P. Meares (ed.): Membrane Separation Processes, Elsevier, Amsterdam 1976.), asymetrische (R. E. Kesting: Synthetic Poly- meric Membranes, A Structural Perspective, Wiley-Interscience, New York 1985.) und elektrisch geladene (F. Helfferich: Ion-Exchange, McGraw-Hill, London 1962.) Membranen eingesetzt werden, die nach verschiedenen Verfahren erzeugt werden (R. Zsig- mondy, US 1 421 341 , 1922; D. B. Pall, US 4 340 479, 1982; S. Loeb, S. Sourirajan, US 3 133 132, 1964.). Typische Werkstoffe sind Celluloseester, Nylon, Polyvinylchlorid, Acrylnitril, Polypropylen, Polycarbonat und Keramik. Der Einsatz dieser Membra- nen erfolgt als Plattenmodul (R. F. Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate- and-Frame Systems, Elsevier, Amsterdam 1977), Spiralmodul (US 3 417 870, 1968 (D. T. Bray)), Rohrbündel bzw. Hohlfasermodul (H. Strathmann: "Synthetic Membranes and their Preparation," in M. C. Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp. 1 - 60). Daneben ist die Ver- wendung flüssiger Membranen möglich (N. N. Li: "Permeation Through Liquid Surfac- tant Membranes," AlChE J. 17 (1971) 459; S. G. Kimura, S. L. Matson, W. J. Ward III: "Industrial Applications of Facilitated Transport," in N. N. Li (ed.): Recent Developments in Separation Science, Bd. V, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1979, pp. 11-25). Der gewünschte Wertstoff kann sowohl feedseitig angereichert und über den Retentatstrom abgeführt als auch feedseitig abgereichert und über den Filtrat-/Permeatstrom abgeführt werden.
Elektrophoretische Verfahren sind z.B. in Rudge, S.R., Ladisch, M.R., Process consid- erations for scale-up of liquid chromatography and electrophoresis, in Separation Re- covery and Purification in Biotechnology, J. Asenjo und J. Hong, Hg., ACS Symposium Series, 314, 122 (1986) beschrieben. Zahlreiche Varianten wie z.B. isoelektrische Fo- kussierung in granulierten Gelschichten, kontinuierliche isoelektrische Fokussierung mit Recycling, die „Rotofor-„Zelle, die Freifluss-Fokussierung mit Recycling und die multi-kompartimentierte Elektrolyse mit isoelektrischen Membranen finden Anwendung. Als Matrixmaterialien kommen u.a. Celluloseacetat, Agarosegele und Polyacrylamid- gele zum Einsatz.
Übliche Kristallisations-Verfahren sind z.B. in Janeic, S.J., Grootscholten, P.A., Indus- trial Crystallization, New York, Academic, 1984; A. W. Bamforth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965; G. Matz: Kristallisation, 2. Aufl., Springer Verlag, Berlin 1969; J. Nyvlt: Industrial Crystallization —State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982; S. J. Janeic', P. A. M. Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984; O. Söhnel, J. Garside: Precipitation, Butterworth-Heinemann, Oxford, 1992; A. S. Myerson (Hg.): Handbook of Industrial Crystallization, Butterworth-Heineman, Boston 1993; J. W. Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993; A. Mersmann (Hg.): Crystallization Technology Handbook, Marcel Dekker, New York 1995 beschrieben. Eine Kristallisation kann z.B. durch Kühlung, Verdampfung, Vakuumkristallisation (adiabate Kühlung), Reaktionskristallisation oder Aussalzen initiiert werden. Die Kristallisation kann z.B. in gerührten und ungerührten Kesseln, im Direkt- Kontakt-Verfahren, in Verdampfungskristallisatoren (R. K. Multer, Chem Eng. (N.Y.) 89 (1982) March, 87-89), in Vakuumkristallisatoren absatzweise oder kontinuierlich, z.B. in Zwangsumlauf-Kristallisatoren (Swenson forced-circulation crystaller) oder Wirbelschicht-Kristallisatoren (Oslo-type) (A. D. Randolph, M. A. Larson: Theory of Particulate Processes, 2. Aufl. Academic Press, New York 1988; J. Robinson, J. E. Roberts, Can. J. Chem. Eng. 35 (1957) 105-112; J. Nyvlt: Design of Crystallizers, CRC Press, Boca Raton, 1992) durchgeführt werden. Auch fraktionierte Kristallisation ist möglich (L. Gordon, M. L. Salutsky, H. H. Willard: Precipitation from Homogeneous Solution, Wiley-Interscience, New York 1959). Ebenso können Enantiomere und Racemate getrennt werden (J. Jacques, A. Collet, S. H. Willen: Enantiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York 1981 ; R. A. Sheldon: Chirotechnology, Marcel Dekker, New York 1993; A. N. Collins, G. N. Sheldrake, J. Crosby (Hg.): Chirality in Industry, Wiley, New York 1985).
Übliche Verfahren zur Trocknung sind z.B. in O. Krischer, W. Käst: Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik, 3. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; R. B. Keey: Drying: Principles and Practice, Pergamon Press, Oxford 1972; K. Kröll: Trockner und Trocknungsverfahren, 2. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; Williams-Gardener, A.: Industrial Drying, Houston, Gulf, 1977; K. Kröll, W. Käst: Trocknen und Trockner in der Produktion, Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1989 beschrieben. Zu den Beispielen für Trocknungsverfahren zählen Verfahren zur Konvektionstrocknung, z.B. in einem Trockenofen, Tunneltrockner, Bandtrockner, Scheibentrockner, Jettrockner, Wirbelschichttrockner, belüftete sowie rotierende Trommeltrockner, Sprühtrockner, Stromtrockner, Zyklontrockner, Mischertrockner, Pasten-Mahltrockner, Mahltrockner, Ringtrockner, Schachttrockner, Drehrohrtrockner, Ka- russeltrockner. Weitere Verfahren nutzen die Kontakttrocknung, z.B. Schaufeltrockner; Vakuum- bzw. Gefriertrocknung, Konustrockner, Nutschtrockner, Scheibentrockner, Dünnschicht-Kontakttrockner, Walzentrockner, Zähphasen-Trockner, tellertrockner, Wendelfördertrockner, Doppelkonustrockner; oder Wärmestrahlung (Infrarot, z.B. Infrarot-Drehrohrtrockner) oder dielektrische Energie (Mikrowellen) zur Trocknung. Die für thermische Trocknungsverfahren verwendeten Trocknungsapparate werden meist durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom beheizt und können, je nach Auslegung, zum Teil unter Vakuum betrieben werden.
Neben der Trocknung können auch Formulierungsverfahren zum Einsatz kommen, wie sie weiter unten für die Herstellung der Proteinzusammensetzung beschrieben sind. Diese umfassen auch die Zugabe von Formulierungshilfsstoffen, wie unten angegeben.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Isolierung der Feinchemikalien aus der Fermentationsbrühe gemäß c) mittels lonenaustausch-Chromatographie. Die allgemeinen Bedingungen und Vorgehensweisen dabei sind dem Fachmann bekannt und z.B. in Römpp Lexikon der Chemie, 10. Auflage,1997, Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Weis, Handbuch der lonenchromatographie, 1991 , VCH Verlagsgesellschaft, Wein- heim, beschrieben. Im Allgemeinen wird man so vorgehen, dass die durch die Mikroorganismen produzierte Verbindung selektiv auf dem Ionenaustauscher gebunden wird und der Ionenaustauscher vor der Elution der durch die Mikroorganismen produzierten Verbindung gewaschen wird, z.B. mit Wasser.
Vor Aufgabe der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe auf die lonenaustauschchro- matographiesäule können die Feststoffe gegebenenfalls mittels dem Fachmann bekannter üblicher Verfahren, z.B. Filtration und Zentrifugation, abgetrennt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt keine Abtrennung der Fest- Stoffe vor der Aufgabe der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe auf die lone- naustauchchromatographiesäule. In diesem Fall wird der Ionenaustauscher vorteilhafterweise entgegen der Schwerkraft mit der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe angeströmt, so dass die enthaltenen Feststoffe nicht zu einer Verblockung (d.h. Verstopfung) der lonenaustauschersäule führen.
Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine basische Aminosäure, so kann diese vorteilhaft durch lonenaustauschchroma- tographie aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, indem eine saure Kationenaustauschersäule eingesetzt wird. In diesem Fall wird die basische Aminosäure, z.B. Lysin, auf der lonenaustauschersäule selektiv gebunden. Vor der Elution ist eine Aufreinigung durch Waschen, insbesondere mit Wasser, möglich. Die Elution der basischen Aminosäure erfolgt dann mit einem geeigneten Elutionsmittel, z.B. Ammoniakwasser, bevorzugt mit 5 Vol.-%igem Ammoniakwasser.
Die Anwendung der lonenaustauschchromatographie zur Abtrennung oder Aufreinigung basischer Aminosäuren wie Lysin ist z.B. in der WO 01/072689 und Lee et al., The use of ion exclusion chromatography as approved to the normal ion exchange chromatography to achieve a more efficient lysine recovery from fermentation broth, Enzyme and Microbial Technology 30 (2002), 798-303 beschrieben.
Der verbleibende Fermentationsrückstand kann in analoger Weise wie im Folgenden beschrieben aufgearbeitet, d.h. behandelt bzw. verarbeitet werden, wobei man ein pro- teinhaltiges Nebenprodukt erhält.
Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin, so erfolgt die Isolierung des Wertprodukts vorteilhafterweise durch Zentrifugation oder Filtration. Dabei können analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen z.B. in der früheren Anmeldung DE 10359668.2 beschrieben wurden. Nach Ende der Fermentation wird die erzeugte Fermentationsbrühe aufgeheizt, um das gesamte Methionin in Lösung zu bringen. Anschließend werden die Feststoffe durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise durch teilweises oder vollständiges Eindampfen aufkonzentriert, wobei das Methionin auskristallisiert. Ab- schließend erfolgt eine Trocknung des Methionins, gegebenenfalls nach einem vorherigen weiteren Filtrationsschritt.
Die durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennten Feststoffe enthalten im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse und die nicht verstoffwechsel- ten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung, z.B. Fasern. Dieser verbleibende Fermentationsrückstand kann in analoger Weise, wie unten beschrieben, behandelt bzw. verarbeitet werden, so dass ein proteinhaltiges Nebenprodukt erhalten wird.
Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pantothensäure, so erfolgt die Isolierung des Wertprodukts vorteilhafterweise gleichfalls durch Zentrifugation oder Filtration. Dabei können analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Im Übrigen kann die Aufarbeitung in entsprechender Weise, wie zuvor für Methionin beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise führt man im Falle der Pantothensäure zusätzlich eine Pasteurisierung der gesamten Fermentationsbrühe vor der Abtrennung der Feststoffe durch. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, bevorzugt sprühgetrocknet. Zur Gewinnung der Pantothensäure kann man auch so vorgehen, dass nach Schritt c) eine Abtrennung der Zellen und der ungelösten bzw. festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile mittels Dekanter, Zentrifugen, Filtertechnik oder Membrantechnik (Mikrofiltra- tion, Ultrafiltration, Nanofiltration) und/oder einer Kombination dieser Verfahren vorge- nommen wird. Der feststoffarme bzw. -freie Strom enthält die Pantothensäure. Dieser Strom kann z.B. weiter auf konzentriert werden und/oder einer Trocknung bzw. Formulierung zugeführt werden. Der feststoffhaltige Strom kann, analog wie unten beschrieben, zu einem proteinhaltigen Nebenprodukt aufgearbeitet werden.
Gegebenenfalls führt man eine Lyse bzw. Abtötung der Zellen durch. Diese kann unmittelbar nach der Fermentation erfolgen. Hierzu wird die gesamte Fermentationsbrühe der Lyse bzw. Abtötung zugeführt. Diese kann thermisch, mechanisch oder chemisch erfolgen. Eine Lyse der Zellen kann auch nach der Abtrennung der Feststoffe erfolgen. Hierbei wird nur der feststoffreiche Strom der vorgenannten Lyse zugeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform geht man bei der Aufarbeitung der Pantothensäure so vor, dass man nach der Fermentation eine thermische Abtötung der Zellen vornimmt und die Zellen und die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile mittels Dekanter, Zentrifugen, Filtertechnik oder Membrantechnik und/oder einer Kombination davon abtrennt. Der feststoffarme bzw. -freie Strom enthält die Pantothensäure. Dieser Strom kann z.B. weiter aufkonzentriert werden. Vor, während oder nach der Aufkonzentrierung werden vorteilhafterweise Hilfsstoffe wie die weiter unten genannten zu der feststoffarmen Brühe gegeben. Hierdurch kann eine potentielle Schaumbildung und/oder Belagbildung reduziert werden. Der aufkonzentrierte Strom wird dann direkt der Trock- nung bzw. Formulierung zugeführt. Auch hierbei können vor, während oder nach der Trocknung bzw. Formulierung die unten genannten Hilfsstoffe zugegeben werden. Hierdurch kann die Hygroskopizität des Produkts reduziert, das Fließverhalten des Produktes verbessert und/oder die Lagerstabilität erhöht werden. Der feststoffhaltige Strom wird in diesem Fall vorzugsweise, analog wie unten beschrieben, zu einem pro- teinhaltigen Nebenprodukt verarbeitet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform zur Aufarbeitung der Pantothensäure sieht vor, dass Hilfsstoffe mit speziellen Kationen auch bereits während der Fermentation zugegeben werden können. Dies ist z.B. in der WO 02/072857 beschrieben.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform zur Aufarbeitung der Pantothensäure mittels Zentrifugation, Dekantierung, Ultrafiltration und/oder Diafiltration ist in der WO 05/028659 beschrieben.
Eine Abtrennung der Pantothensäure aus der Fermentationsbrühe mittels Elektrodialy- se oder lonenaustausch ist ebenfalls möglich. Diese Verfahren sind jedoch nicht bevorzugt, da hierbei gegebenenfalls Probleme zu erwarten sind. Der nach Isolierung oder Abreicherung der Pantothensäure verbleibende Fermentationsrückstand, d.h. insbesondere die abgetrennten Feststoffe, kann allgemein in analoger Weise, wie unten beschrieben, behandelt oder verarbeitet werden, so dass ein proteinhaltiges Nebenprodukt erhalten wird.
Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Polyhydroxyalkanoate, so erfolgt die Isolierung des Wertproduktes vorteilhafterweise durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie z. B in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben. Die übrigen Feststoffe können in üblicher Weise, z. B. durch Filt- ration oder Zentrifugation, abgetrennt werden. Im Übrigen kann die Aufarbeitung der Feststoffe in entsprechender Weise, wie zuvor für Methionin beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise führt man im Falle der Polyhydroxyalkanoate zusätzlich eine Pasteurisierung der gesamten Fermentationsbrühe vor der Abtrennung der Feststoffe durch. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise teilweise eingedampft, gege- benenfalls mit Caiciumchlorid versetzt und getrocknet, bevorzugt sprühgetrocknet. Die weitere Auf reinigung der Polyhydroxyalkanoate erfolgt in an sich bekannter Weise, wie z.B. in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben.
Der verbleibende Fermentationsrückstand, d.h. insbesondere die abgetrennten Fest- Stoffe, kann in analoger Weise, wie unten beschrieben, behandelt oder verarbeitet werden, so dass ein proteinhaltiges Nebenprodukt erhalten wird.
Die nach Abtrennung des Wertprodukts, z.B. einer basischen Aminosäure wie Lysin, verbleibende Fermentationsbrühe enthält im Wesentlichen die während der Fermenta- tion erzeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung, wie z.B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Puffer- und Nährsalze. Diese Feststoffe können aus der verbleibenden Fermentationsbrühe ähnlich wie das bei der Herstellung von Bioethanol anfallende Nebenprodukt (das dort „Distiller's Dried Grains with Solubles (DDGS)" genannt und als solches vermarktet wird) gewonnen werden. Hierbei kann eine im Wesentlichen vollständige oder nur teilweise Abtrennung der Fermentationsbrühe von den Feststoffen erfolgen. Das auf diese Weise erhaltene proteinhaltige Nebenprodukt, im Folgenden auch als Proteinzusammensetzung bezeichnet, kann sowohl vor als auch nach weiteren Be- bzw. Verarbeitungsschritten als Futtermittel oder Futtermitteladditiv zur Fütterung von Tieren, be- vorzugt von landwirtschaftlichen Nutztieren, besonders bevorzugt von Rindern, Schweinen und Geflügel, ganz besonders bevorzugt von Rindern verwendet werden.
Die Aufarbeitung, bzw. Ver- und Bearbeitung der Fermentationsbrühe zu einer Proteinzusammensetzung kann nach dem Fachmann bekannten Methoden, insbesondere durch Veränderung des Trockensubstanzgehaltes (z.B. durch Trocknen oder Eindampfen), Mahlen und Formulieren (z.B. Zugabe von Additiven, formgebende Verfahren wie Pelletieren und Extrudieren) erfolgen. Ferner umfasst die Ver- und Bearbeitung des Nebenproduktes auch die Vermischung mit anderen Futtermitteln bzw. Futterzusatzstoffen, z.B. um die Gehalte an Nährstoffen zu standardisieren. Die Proteinzusammensetzung wird in der Regel hergestellt, indem man im Anschluss an die Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts gemäß Schritt c) die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe wenigstens teilweise ent- fernt. Hierbei erhält man eine Proteinzusammensetzung in fester oder halbfester Form. Der Gehalt des abgereicherten oder isolierten Stoffwechselprodukts in der verbleibenden Fermentationsbrühe beträgt in der Regel höchstens 20 Gew.-%, insbesondere höchstens 15 Gew.-%, speziell höchstens 10 Gew.-% und ganz speziell höchstens 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der verbleibenden Fermentations- brühe.
Zur Gewinnung der Proteinzusammensetzung nach Abtrennung des Wertprodukts wird üblicherweise die gesamte verbleibende Brühe entweder in einer in der Regel mehrstufigen Verdampfung teilweise eingedampft und die enthaltenen Feststoffe anschließend z.B. mit einem Dekanter abgetrennt oder die Feststoffabtrennung erfolgt direkt aus der gesamten Fermentationsbrühe. Zur Abtrennung der Feststoffe können Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Umkehrosmose oder eine Kombination dieser Verfahren, z.B. in einer mehrstufigen Anlage, eingesetzt werden. Die hierbei abgetrennten Feststoffe weisen in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 80 Gew.-%, bevorzugt 15 bis 60 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 50 Gew.-% auf. Die durch weitere Be- bzw. Verarbeitung erhaltene fertige Proteinzusammensetzung weist vorteilhafterweise einen Gehalt von etwa 90 Gew.-% Trockensubstanz auf, so dass die Gefahr von Verderb bei einer Lagerung reduziert ist.
Die Proteinzusammensetzung kann auch durch Aufkonzentrierung der festen Bestandteile der nach Schritt c) verbleibenden Fermentationsbrühe mittels thermischer Verfahren (z.B. Eindampfung), mechanischer Verfahren (z.B. unter Einsatz von Filtern, De- kantern, Zentrifugen) und der für den Fachmann üblichen Kombinationen der genannten einzelnen Verfahren gewonnen werden. Durch die Aufkonzentrierung der Brühe erhält man einen festen oder halbfesten, z.B. pastösen, Rückstand, welcher das erfindungsgemäß hergestellte Stoffwechselprodukt noch in geringen Mengen, in der Regel im Bereich von 0 bis 10 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 0 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Rückstands, und die nichtflüchtigen, in der Regel festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle oder zumindest große Teile davon, häufig wenigstens 90 Gew.-% oder die Gesamtmenge der festen nichtstärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle sowie die Biomasse aus der Fermentation enthält. Dieser halbfeste oder feste Rückstand kann in gleicher Weise wie die nicht aufkonzentrierte, nach Schritt c) verbleibende Fermentationsbrühe direkt einer Trocknung oder Formulierung zugeführt werden.
Die bei der Gewinnung des Nebenprodukts abgetrennte flüssige Phase kann teilweise als Prozesswasser zurückgeführt werden. Dieser rückgeführte Teil der flüssigen Phase kann vorteilhaft z.B. ganz oder teilweise bei der Herstellung der zuckerhaltigen Flüssigkeit nach Schritt a) eingesetzt werden oder zum Ansetzen von Puffer- bzw. Nähr- Salzlösungen für den Einsatz in der Fermentation verwendet werden. Bei der Zumi- schung von rückgeführtem Prozesswasser in Schritt a) ist zu berücksichtigen, dass ein zu hoher Anteil die Fermentation durch ein Überangebot an bestimmten Mineralstoffen und Ionen, z.B. Natrium- und Lactationen, negativ beeinflussen kann. Vorzugsweise ist der Anteil an rückgeführtem Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension zur Stärkeverflüssigung erfindungsgemäß daher auf maximal 75 Gew.-%, bevorzugt maximal 60 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 50 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte zum Ansetzen der Suspension eingesetzte Wasser, beschränkt. Vorteilhafterweise liegt der Anteil an Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension in der be- vorzugten Ausgestaltung von Schritt a2) im Bereich von 5 bis 60 Gew.-% und bevorzugt von 10 bis 50 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte zum Ansetzen der Suspension eingesetzte Wasser.
Der Anteil der nicht in den Prozess zurückgeführten flüssigen Phase kann in einer mehrstufigen Eindampfung zu einem Sirup auf konzentriert werden. Der so erhaltene Sirup weist in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 20 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 80 Gew.-% und besonders bevorzugt 40 bis 70 Gew.-% auf. Dieser Sirup kann mit den beim Dekantieren (oder auf andere Weise) abgetrennten Feststoffen vermischt und anschließend getrocknet werden. Die Trocknung kann z.B. mittels Trommeltrockner, Sprühtrockner oder Schaufeltrockner erfolgen, bevorzugt wird ein Trommeltrockner eingesetzt. Die Trocknung wird bevorzugt so durchgeführt, dass der erhaltene Feststoff einen Gehalt an Restfeuchte von maximal 30 Gew.-%, bevorzugt maximal 20 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% aufweist.
Durch Zugabe von Formulierungshilfsmitteln wie Träger- und Coatingmaterialien, Bindemitteln sowie anderer Additive können die Eigenschaften des getrockneten und zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentation vorliegenden Nebenproduktes (d.h. der Proteinzusammensetzung) gezielt hinsichtlich verschiedener Parameter wie Korngröße, Partikelform, Neigung zum Stauben, Hygroskopizität, Stabilität, insbeson- dere Lagerstabilität, Farbe, Geruch, Fließverhalten, Agglomerationsneigung, elektrostatischer Aufladung, Licht- und Temperaturempfindlichkeit, mechanischer Stabilität und Redispergierbarkeit in an sich bekannter Weise konfektioniert werden.
Zu den üblicherweise verwendeten Formulierungshilfsmitteln gehören z.B. Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, Viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxidantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle o- der Mischungen hieraus. Derartige Formulierungshilfsmittel werden vorteilhaft insbesondere bei Anwendung von Formulierungs- und Trocknungsverfahren wie Sprüh-, Wirbelschicht- und Gefriertrocknung als Trocknungshilfsmittel eingesetzt.
Beispiele für Bindemittel sind Kohlenhydrate, insbesondere Zucker wie Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, z.B. Dextrine, Trehalose, Glucose, Glucosesirup, Maltose, Saccharose, Fructose und Lactose; kolloidale Substanzen wie tierische Proteine, z.B. Gelatine, Casein, insbesondere Natriumcaseinat, pflanzliche Proteine, z.B. Sojaprotein, Erbsenprotein, Bohnenprotein, Lupin, Zein, Weizenprotein, Maisprotein und Reisprotein, synthetische Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und insbesondere die Kollidon-Marken der Fa. BASF, gegebenenfalls modifizierte Biopolymere, z.B. Lig- nin, Chitin, Chitosan, Polylactid und modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid (OSA); Gummen, z.B. Gummi acacia; Cellulosederivate, z.B. Methylcellulose, Ethylcel- lulose, (Hydroxyethyl)methylcellulose (HEMC), (Hydroxypropyl)methylcellulose (HPMC), Carboxymethylcellulose (CMC); Mehle, z.B. Maismehl, Weizenmehl, Roggenmehl, Gerstenmehl und Reismehl.
Beispiele für Trägermaterialien sind Kohlenhydrate, insbesondere die als Bindemittel vorgenannten Zucker sowie Stärken, z.B. aus Mais, Reis, Kartoffel, Weizen und Cassava; modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid; Cellulose und mikrokristalline Cellulose; anorganische Mineralien oder Lehm, z.B. Ton, Kohle, Kieselgur, Kieselsäu- re, Talg und Kaolin; Gries, z.B. Weizengries, Kleie, z.B. Weizenkleie, die als Bindemittel vorgenannten Mehle; Salze wie Metallsalze, insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallsalze organischer Säuren, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-citrat, -acetat, -formiat und -hydrogenformiate, anorganische Salze, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-sulfate, -carbonate, -Silikate oder -phosphate; Erdalkalimetalloxide wie CaO und MgO; anorganische Puffe- rungsmittel wie Alkalimetallhydrogenphosphate, insbesondere Natrium- und Kalium- hydrogenphosphate, z.B. K2HPO , KH2PO4 und Na2HPO4; sowie allgemein die im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Herstellung von Stoffwechselprodukten mit niedrigem Schmelzpunkt bzw. öliger Konsistenz genannten Adsorbentien.
Beispiele für Puderungsmittel bzw. Fließhilfsmittel sind Kieselgur, Kieselsäure, z.B. die Sipernat-Marken der Fa. Degussa; Ton, Kohle, Talg und Kaolin; die als Trägermaterialien vorgenannten Stärken, modifizierten Stärken, anorganischen Salze, Salze organischer Säuren und Pufferungsmittel; Cellulose und mikrokristalline Cellulose.
Hinsichtlich sonstiger Additive seien als Beispiele genannt Farbpigmente wie TiO2; Bi- ozide; Dispergiermittel; Antischaummittel; Viskositätsregulierende Mittel; anorganische Säuren wie Phosphorsäuren, Salpetersäure, Salzsäure, Schwefelsäure; organische Säuren wie gesättigte und ungesättigte Mono- und Dicarbonsäuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure und Fumarsäure; Laugen wie Alkalimetallhydroxide, z.B. NaOH und KOH; Antioxidantien; Enzymstabilisatoren; Enzyminhibitoren; Adsorbate; Fette; Fettsäuren und Öle.
Der Anteil an den vorgenannten Zusatzstoffen und gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen wie Coatingmaterialien kann je nach den speziellen Erfordernissen des jeweiligen Stoffwechselprodukts sowie in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingesetzten Zusatzstoffe stark variieren und z.B. im Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 5 bis 70 Gew.-% und speziell im Bereich von 10 bis 60 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. Stoffge- mischs, liegen.
Die Zugabe von Formulierungshilfsmitteln kann vor, während oder nach der Aufarbei- tung der Fermentationsbrühe (auch als Produktformulierung oder Feststoffdesign bezeichnet) und insbesondere während der Trocknung erfolgen. Eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln vor Aufkonzentrierung der nach Schritt c) verbleibenden Fermentationsbrühe kann insbesondere vorteilhaft sein, um die Prozessierbarkeit der aufzuarbeitenden Stoffe bzw. Produkte zu verbessern. Die Formulierungshilfsmittel können sowohl dem in fester Form erhaltenen Nebenprodukt als auch einer dieses enthaltenden Lösung oder Suspension zugegeben werden, z.B. nach Schritt c) direkt zu der Fermentationsbrühe oder zu einer im Verlauf der Aufarbeitung erhaltenen Lösung oder Suspension vor dem abschließenden Trocknungsschritt.
So können die Hilfsstoffe z.B. in eine durch Aufkonzentrierung der nach Schritt c) verbliebenen Fermentationsbrühe erhaltene Suspension eingemischt werden; eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z.B. durch Untermischen. Insbesondere nach der Trocknung erfolgt eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln z.B. beim Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf ge- trocknete Partikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach einem eventuellen Coa- tingschritt können dem Produkt weitere Hilfsmittel zugegeben werden. Die durch Formulierungsverfahren gewonnen Partikel können durch die oben beschriebenen Trocknungsverfahren bis auf den gewünschten Restfeuchtigkeitsgehalt getrocknet werden.
Alle in fester Form erhaltenen Nebenprodukte, z.B. Partikel, Granulate und Extrudate, können mit einem Überzug bzw. einem Coating beschichtet werden, d.h. mit mindestens einer weiteren Stoffschicht überzogen werden. Das Coaten erfolgt z.B. in Mischern oder Wirbelschichten, in denen die zu beschichtenden Teilchen aufgewirbelt bzw. „fluidisiert" werden und dann mit dem Überzugs- bzw. Coatingmaterial besprüht werden. Das Coatingmaterial kann trocken, z.B. als Pulver, oder in Form einer Lösung, Dispersion, Emulsion oder Suspension in einem Lösungsmittel, z.B. Wasser, organische Lösungsmittel und Mischungen davon, insbesondere in Wasser, vorliegen. Sofern vorhanden, wird das Lösungsmittel während oder nach dem Aufsprühen auf die Teilchen durch Verdampfen entfernt. Des Weiteren können Coatingmaterialien wie Fette auch als Schmelzen aufgebracht werden.
Coatingmaterialien, die als wässrige Dispersion oder Suspension aufgesprüht werden können sind z.B. in der WO 03/059087 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyolefine wie Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenwachse, Wachse, anorganische und organische Salze, Acronale, z.B. Butylacrolat-Methylacrolat-Copolymer, die Styro- fan-Marken der Fa. BASF, z.B. auf Basis von Styrol und Butadien, und hydrophobe Substanzen wie in der WO 03/059086 beschrieben. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoff gehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 20 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 10 Gew.-% und speziell im Be- reich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.
Coatingmaterialien, die als Lösungen aufgesprüht werden können sind z.B. Polyethy- lenglykole, Cellulosederivate wie Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Ethylcellulose, Polyvinylalkohol, Proteine wie Gelatine, anorganische und organische Salze, Kohlenhydrate wie Zucker, z.B. Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose und Trehalose; Stärken und modifizierte Stärken. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoff gehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 20 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.
Coatingmaterialien, die als Schmelze aufgesprüht werden können sind z.B. in der DE 199 29 257 und WO 92/12645 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyethy- lenglykole, synthetische Fette und Wachse, z.B. Polygen WE® der Fa. BASF, natürliche Fette wie tierische Fette, z.B. Bienenwachs, und pflanzliche Fette, z.B. Candelila- wachs, Fettsäuren, z.B. tierische Wachse, Taigfettsäuren, Palmitinsäure, Stearinsäure, Triglyceride, Edenor-Produkte, Vegeole-Produkte, Montanesterwachse, z.B. Luwax E® der Fa. BASF. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 1 bis 25 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 2 bis 25 Gew.-% und speziell im Bereich von 3 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.
Nach der Trocknung und/oder Formulierung können dem Nebenprodukt bzw. der Proteinzusammensetzung ganze oder gemahlene Getreidekörner, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse und/oder Roggen zugegeben werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit eine Proteinzusammensetzung aus einer erfindungsgemäß durchgeführten zuckerbasierten mikrobiellen Fermentation zur Herstellung eines Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom, das wie zuvor beschrieben erhältlich ist. Diese Proteinzusammensetzung enthält üblicherweise Proteinmaterial, d.h. Biomasse aus der Fermentation, nicht-stärkehaltige Bestandteile der Stärkequelle, insbesondere Fasern, und Fermentaionsprodukt (Metabolit). Insbesondere enthält die Proteinzusammensetzung im Wesentlichen die folgenden Trockenmasse-Bestandteile:
a) 1 bis 90 Gew.-%, insbesondere 5 bis 85 Gew.-% und speziell 10 bis 75 Gew.-% Biomasse aus der Fermentation;
b) 1 bis 90 Gew.-%, insbesondere 5 bis 85 Gew.-%, speziell 10 bis 80 Gew.-% und ganz speziell 15 bis 75 Gew.-% nicht-stärkehaltige Bestandteile der Stärkequelle, insbesondere Fasern; c) 0,01 bis 10 Gew.-%, insbesondere 0,1 bis 5 Gew.-%, speziell 0,2 bis 5 Gew.-% und ganz speziell 0,3 bis 5 Gew.-% eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N- Atom;
d) 0 bis 90 Gew.-%, insbesondere 5 bis 80 Gew.-% und speziell 10 bis 70 Gew.-% übliche Formulierungshilfsstoffe; und
e) 0 bis 40 Gew.-%, insbesondere 0,5 bis 30 Gew.-% und speziell 1 bis 20 Gew.-% nicht metabolisierte weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe, insbesondere Reste an Zucker, Stärke, Nährsalzen und/oder Puffersalzen;
wobei sich die Komponenten a) bis e) zu 100 Gew.-% an Trockenmasse addieren. Der Ausdruck „im Wesentlichen" bedeutet hier, dass der Anteil weiterer, von a) bis e) ver- schiedener Bestandteile gering ist, in der Regel wird dieser Anteil 10 Gew.-% und insbesondere 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf die gesamte Trockenmasse der Proteinzusammensetzung, nicht überschreiten; speziell beträgt dieser Anteil weniger als 1 Gew.- %, insbesondere etwa 0 Gew.-%.
Zur Biomasse (Komponente a)) zählt insbesondere der Anteil an Rohprotein in der Proteinzusammensetzung. Dieser Anteil beträgt üblicherweise mindestens 40 Gew.-%, und liegt insbesondere im Bereich von 40 bis 90 Gew.-%, speziell im Bereich von 45 bis 85 Gew.-% und speziell im Bereich von 50 bis 80 Gew.-%, jeweils bezogen auf die gesamte Trockenmasse der Proteinzusammensetzung.
Die erfindungsgemäßen Proteinzusammensetzungen enthalten üblicherweise eine oder mehrere essentielle Aminosäuren, insbesondere wenigstens eine unter Lysin, Methionin, Threonin und Tryptophan ausgewählte Aminosäure. Die essentiellen Aminosäuren, insbesondere die genannten, liegen in der Regel jeweils in einer Menge vor, die gegenüber einem herkömmlichen DDGS-Nebenprodukt, das bei einer fermentativen Bioethanolproduktion anfällt, um einen Faktor von wenigstens 1 ,5 erhöht ist. Sofern die jeweilige Aminosäure in der Proteinzusammensetzung enthalten ist, weist diese in der Regel einen Gehalt an Lysin von wenigstens 1 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1 bis 5 Gew.-%, einen Gehalt an Methionin von wenigstens 0,8 Gew.-%, ins- besondere im Bereich von 0,8 bis 5 Gew.-%, einen Gehalt an Threonin von wenigstens 1 ,5 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1 ,5 bis 5 Gew.-% und/oder einen Gehalt an Tryptophan von wenigstens 0,4 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.- %, jeweils bezogen auf die gesamte Trockenmasse der Proteinzusammensetzung, auf.
Die erfindungsgemäßen Proteinzusammensetzungen enthalten üblicherweise noch einen geringen Anteil Wasser, häufig im Bereich von 0 bis 25 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,5 bis 15 Gew.-%, speziell im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und ganz speziell im Bereich von 1 bis 5 Gew.-% Wasser, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Proteinzusammensetzung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass man
(i) dem in Schritt a) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nichtstärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A) durchführt; und
(ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durchführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils des zuckerhaltigen Flüssigmediums maximal 50 Gew.-%, bevorzugt maximal 30 Gew.- %, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-% beträgt.
Diese Vorgehensweise ermöglicht es, in der separaten Fermentation gemäß (iii) Mikroorganismen einzusetzen, für die bestimmte Mindestanforderungen erfüllt sein müssen, z.B. bezüglich der Sauerstofftransferrate. Für solche in der separaten Fermentation gemäß (iii) eingesetzten Mikroorganismen kommen z.B. Bacillus species, bevorzugt Bacillus subtilis in Betracht. Die durch derartige Mikroorganismen in der separaten Fermentation produzierten Verbindungen sind insbesondere unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden und Nukleotiden, Lipi- den, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, aromatischen Verbindungen, Proteinen, Carotenoiden, speziell unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Proteinen und Carotenoiden und ganz speziell unter Riboflavin und Calciumpantothenat ausgewählt.
Insbesondere ermöglicht diese Vorgehensweise, das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft auch dann einzusetzen, wenn die produzierte Feinchemikalie bei der Fermentation als Feststoff anfällt.
Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Vorgehensweise betrifft die parallel betriebene Herstellung gleicher Stoffwechselprodukte (A) und (B) in zwei separaten Fermentationen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn für verschiedene Anwendungen des gleichen Stoffwechselprodukts unterschiedliche Anforderungen an die Reinheit zu stel- len sind. Demnach wird das erste Stoffwechselprodukt (A), z.B. eine als Futtermitteladditiv zu verwendende Aminosäure, z.B. Lysin, unter Einsatz der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe und das gleiche zweite Stoffwechselprodukt (B), z.B. die gleiche als Nahrungsmitteladditiv zu verwendende Aminosäure, hier z.B. Lysin, unter Einsatz der gemäß (ii) feststoffabgereicherten Fermentationsbrühe hergestellt. Durch die vollstän- dige oder teilweise Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile kann der Reinigungsaufwand bei der Aufarbeitung des Stoffwechselprodukts, dessen Anwendungsbereich eine höhere Reinheit erfordert, z.B. als Nahrungsmitteladditiv, reduziert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlen- stoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie folgt vorgegangen werden. Man implementiert eine vorzugsweise großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z.B. von Feinchemikalien wie Lysin, entsprechend den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten a) bis c). Gemäß (i) wird ein Teil des nach Schritt a) erhaltenen, zuckerhaltigen Flüssigmediums entnommen und gemäß (ii) durch übliche Verfahren, z.B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit. Das daraus gewonnene, im Wesentlichen vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird gemäß (ii) einer Fermentation zur Produktion eines Stoffwechselprodukts B, z.B. Riboflavin, zugeführt. Der gemäß (ii) abgetrennte Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.
Die auf diese Art und Weise gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in DE 4037441, EP 464582, EP 438767 und DE 3819745. Nach Lyse der Zellmasse erfolgt die Abtren- nung des kristallin vorliegenden Riboflavins vorzugsweise durch Dekantieren. Andere Arten der Feststoffabtrennung, z.B. Filtration, sind ebenfalls möglich. Anschließend wird das Riboflavin getrocknet, bevorzugt mittels Sprüh- und Wirbelschichttrocknern. Alternativ dazu kann das gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsgemisch nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie z.B. in der EP 1048668 und EP 730034 beschrieben. Nach Pasteurisierung wird die Fermentationsbrühe hier zentrifugiert und die zurückbleibende feststoffhaltige Fraktion mit einer mineralischen Säure behandelt. Das gebildete Riboflavin wird aus dem wässrig- sauren Medium filtriert, gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet.
Die abgetrennten Feststoffe können im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens wie bereits zuvor beschrieben zu einem Nebenprodukt verarbeitet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Koh- lenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.
Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fer- mentation gemäß (ii) zur Produktion von Pantothensäure zugeführt. Dabei ist die im Vergleich zum feststoffhaltigen Flüssigmedium verringerte Viskosität besonders vorteilhaft. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.
Die gemäß (ii) erzeugte, Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Fest- Stoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Caiciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet.
Die abgetrennten Feststoffe können im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens wie bereits zuvor beschrieben zu einem Nebenprodukt verarbeitet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Polyhydroxyalkanoate. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.
Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fermentation gemäß (ii) zur Produktion von Polyhydroxyalkanoaten zugeführt. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmedi- ums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.
Die gemäß (ii) erzeugte, Polyhydroxyalkanoat-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der US 4310684 und EP 355307. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Caiciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet. Die weitere Aufreinigung der Polyhydroxyal- kanoate erfolgt in an sich bekannter Weise, wie z.B. in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben.
Die abgetrennten Feststoffe können im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens wie bereits zuvor beschrieben zu einem Nebenprodukt verarbeitet werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung einzelner Aspekte der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen. Beispiele
I. Vermählen der Stärkequelle
Die im folgenden eingesetzten Mahlgüter wurden wie folgt hergestellt. Ganze Maiskörner wurden unter Verwendung einer Rotormühle vollständig vermählen. Unter Einsatz unterschiedlicher Schlägerwerke, Mahlbahnen bzw. Siebeinbauten wurden dabei drei verschiedene Feinheiten erzielt. Eine Siebanalyse des Mahlgutes mittels Labor- Vibrationssieb (Vibrations-Analysenmaschine: Retsch Vibrotronic Typ VE1 ; Siebzeit 5 min; Amplitude: 1 ,5 mm) ergab die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse.
Tabelle 1
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II. Enzymatische Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung
11.1. Ohne Phytase im Verzuckerungsschritt
II.1 a) Enzymatische Stärkeverflüssigung Aus 320 g trocken vermahlenem Maismehl (T71/03) wurde unter stetem Rühren eine Suspension in 480 g Wasser angesetzt und mit 310 mg Caiciumchlorid versetzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 6,5 und Erhitzen auf 35 °C wurden 2,4 g Termamyl 120L Typ L (Novozymes A/S) zugegeben. Über 40 min wurde das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von 86,5 °C erhitzt, wobei der pH gegebenenfalls mit NaOH auf den zuvor eingestellten Wert nachjustiert wurde. Innerhalb von 30 min wurden weitere 400 g des trocken vermahlenen Maismehls (T71/03) zugegeben, wobei die Temperatur auf 91 °C erhöht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ca. 100 min bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wurden weitere 2,4 g Termamyl 120L zugegeben und die Temperatur ca. 100 min gehalten. Der Fortschritt der Verflüssigung wurde während der Durchführungsdauer mit der Jod-Stärke-Reaktion verfolgt. Die Temperatur wurde abschließend auf 100 °C erhöht und das Reaktionsgemisch weitere 20 min gekocht. Zu diesem Zeitpunkt war keine Stärke mehr nachzuweisen. Der Reaktor wurde auf 35 °C abgekühlt.
11.1 b) Verzuckerung
Die aus 11.1 a) erhaltene Reaktionsmischung wurde unter stetem Rühren auf 61 °C er- hitzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 wurden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozy- me GA (Novozymes A/S) zugegeben. Die Temperatur wurde ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wurde. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 aufgeführt. An- schließend wurde das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Es wurden ca. 1180 g flüssiges Produkt mit einer Dichte von ca. 1 ,2 kg/l und einem mittels Infrarottrockner bestimmten Gehalt an Trockenmasse von etwa 53,7 Gew.-% erhalten. Der Gehalt an Trockenmasse (ohne wasserlösliche Inhaltsstoffe) betrug nach Waschen mit Wasser etwa 14 Gew.-%. Der durch HPLC bestimmte Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch betrug 380 g/l (vgl. Tab. 2, Probe Nr. 7).
Tabelle 2
Figure imgf000045_0001
11.2. Mit Phytase im Verzuckerungsschritt
ll.2a) Stärkeverflüssigung
Eine trocken vermahlene Maismehlprobe wird entsprechend 11.1 a) verflüssigt.
II.2b) Verzuckerung
Die aus II.2a) erhaltene Reaktionsmischung wird unter stetem Rühren auf 61 °C erhitzt. Das Rühren wird während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 werden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) und 70 μl Phytase (700 Units Phytase, Natuphyt Liquid 10000L von der BASF Aktiengesellschaft) zugegeben. Die Temperatur wird ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wird. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Das erhaltene Produkt wird mittels Infrarottrockner getrocknet und mit Wasser gewaschen. Der Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch wird durch HPLC bestimmt.
II.3 Weitere Arbeitsvorschriften zur enzymatischen Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung
ll.3a) Maismehl
360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. 1 ,54 ml CaCI2 Stammlösung (100 g CaCI2 x 2 H2O / 1) werden bis zu einer Endkonzentration von etwa 70 ppm Ca2+ in der Maische zugegeben. Unter stetem Rühren lässt man 240 g Maismehl langsam in das Wasser einrieseln. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 4,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf bis zu 85 °C erhitzt. Hierbei muss der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls ange- passt werden.
Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 50 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCI2 Stammlösung zu, um die Ca2+-Konzentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (50 g Mehl und 0,13 ml CaCI2 Stammlösung) zugibt. Nach Zugabe von zwei Portionen gibt man 1 ,67 ml Termamyl zu; anschließend gibt man zwei weitere Portionen (jeweils 50 g Mehl und 0,13 ml CaCI2 Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100 °C und kocht die Maische 10 min. Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g I und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1 ,67 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.
Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungs- reaktion auf 61 °C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61 °C gehalten. 5,74 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozym GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivie- rung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85 °C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4 °C.
II.3b) Roggenmehl (inklusive Cellulase/Hemicellulase-Vorbehandlung)
360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Roggenmehl langsam in das Wasser einrieseln. Die Temperatur wird konstant bei 50 °C gehalten. Nach Einstellung des pH auf 5,5 mit 50 Gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Viscozyme L (Novozymes A/S) zu. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man erneut 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.
1 ,7 ml CaCI2 Stammlösung (100 g CaCI2 x 2 H2O / 1) werden zugegeben. Nach Einstel- lung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 5,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf 85 °C erhitzt. Hierbei wird der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst.
Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 60 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCI2 Stammlösung zu, um die Ca2+-Koncentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (40 g Mehl und 0,1 ml CaCI2 Stammlösung) zugibt. Man gibt 1 ,1 ml Termamyl zu; anschließend gibt man eine weitere Portionen (40 g Mehl und 0,1 ml CaCI2 Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100 °C und kocht die Maische 10 min. Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g I und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1 ,1 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.
Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungsreaktion auf 61 °C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61 °C gehalten. 5,74 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivie- rung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85 °C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4 °C.
ll.3c) Weizenmehl (inklusive Xylanase-Vorbehandlung)
360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Das Wasser wird auf 55 °C erhitzt und der pH mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung auf 6,0 eingestellt. Nach Einstellung von Temperatur und pH gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Shearzyme 500L (Novozymes A/S) zu. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Weizenmehl langsam in die Lösung einrieseln. Die Temperatur und der pH werden konstant gehalten. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.
Die Verflüssigung und Verzuckerung werden wie unter ll.3b beschrieben durchgeführt.
III. Konstruktion eines Lysin überproduzierenden C. glutamicum Stamms ATCC13032 lysC r
II 1.1 Konstruktion des Plasmids pCIS lysC
Im ersten Schritt der Stammkonstruktion wurde ein allelischer Austausch des für das Enzym Aspartatkinase kodierenden Wildtypgens (lysC) in C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Dabei wurde im lysC Gen ein Nukleotidaustausch vorgenommen, so dass im resultierenden Protein die Aminosäure Thr an der Position 311 durch ein lle ausgetauscht wurde. Ausgehend von der chromosomalen DNA aus ATCC13032 als Template für eine PCR Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern 5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC -3' (SEQ ID NO:1) und 5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3' (SEQ ID NO:2) lysC mit Hilfe des Pfu-Turbo PCR Systems (Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 oder Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828 präpariert. Das amplifizierte Fragment wird an seinem 5'-Ende von einer Sall Restriktionsschnittstelle und an seinem 3'-Ende von einer Mlul Restriktionsschnittstelle flankiert. Vor der Klonierung wurde das amplifizierte Fragment durch diese beiden Restriktionsenzyme verdaut und mit GFX™PCR, DNA and Gel Band Purificati- on Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) aufgereinigt.
Das erhaltene Polynukleotid wurde über die Sall und Mlul Restriktionsschnitte in pCLIKδ MCS integrativ SacB, im folgenden pCIS genannt, (SEQ ID NO: 3) kloniert und in E.coli XL-1 blue transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20μg/ml) haltigem LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 :190) erreicht. Das Plasmid wurde isoliert und durch Sequenzierung die erwartete Nukleotidsequenz bestätigt. Die Präparation der Plasmid DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Firma Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet. Das erhaltene Plasmid wurde als pCIS lysC (SEQ ID NO:4) bezeichnet. Es umfasst folgende wesentliche Teilbereiche:
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III.2 Mutagenese des lysC Gens aus C. glutamicum
Die gerichtete Mutagenese des lysC Gens aus C. glutamicum wurde mit dem Quick- Change Kit (Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Muta- genese wurde im Plasmid pCIS lysC (SEQ ID NO:4) durchgeführt. Für den Austausch von thr 311 nach 311 ile mit Hilfe der Quickchange Methode (Stratagene) wurden folgende Oligonukleotidprimer synthetisiert: 5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG -3' (SEQ ID NO:5)
5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG -3' (SEQ ID NO:6)
Der Einsatz dieser Oligonukleotidprimer in der Quickchange Reaktion führt in dem lysC Gen (SEQ ID NO:7) zu einem Austausch des Nukleotids in Position 932 (von C nach T). Der resultierende Aminosäureaustausch Thr3111le im lysC Gen wurde nach Transformation in E.coli XL1 -blue und Plasmidpräparation durch eine Sequenzierungsreaktion bestätigt. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pCIS lysC thr311 ile (SEQ ID NO:8). Es umfasst folgende wesentliche Teilbereiche:
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III.3 Transformation von pCIS lysC thr311 ile in C. glutamicum (Stamm ATCC13032)
Das Plasmid pCIS lysC thr311 ile wurde in C. glutamicum ATCC13032 mittels Elektro- poration, wie bei Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 53:299-303 (1989) beschrieben, transformiert. Modifikationen des Protokolls sind in der DE 10046870 beschrieben. Die chromosomale Anordnung des lysC-Lokus einzelner Transformanten wurde mit Standardmethoden durch Southernblot und Hybridisierung, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989), beschrieben, ü- berprüft. Dadurch wurde sichergestellt, dass es sich bei den Transformanten um solche handelt, die das transformierte Plasmid durch homologe Rekombination am lysC- Lokus integriert haben. Nach Wachstum solcher Kolonien über Nacht in Medien, die kein Antibiotikum enthalten, werden die Zellen auf ein Saccharose-CM-Agarmedium (10% Saccharose) ausplattiert und 24 Stunden bei 30°C inkubiert.
Da das im Vektor pCIS lysC thr311 ile enthaltende sacB Gen Saccharose in ein toxisches Produkt umwandelt, können nur solche Kolonien anwachsen, die das sacB Gen durch einen zweiten homologen Rekombinationsschritt zwischen dem Wildtypgen lysC und dem mutierten Gen lysC thr311ile deletiert haben. Während der homologen Rekombination kann entweder das Wildtypgen oder das mutierte Gen zusammen mit dem sacB Gen deletiert werden. Wenn das sacB Gen zusammen mit dem Wildtypgen entfernt wird, resultiert eine mutierte Transformante.
Anwachsende Kolonien wurden gepickt und auf einen Kanamycin-sensitiven Phänotyp hin untersucht. Klone mit deletiertem SacB Gen müssen gleichzeitg Kanamycin- sensitives Wachstumsverhalten zeigen. Solche Kanamycin-sensitiven Klone wurden in einem Schüttelkolben auf ihre Lysin-Produktivität hin untersucht. Zum Vergleich wurde der nicht behandelte C. glutamicum ATCC13032 angezogen. Klone mit einer gegenüber der Kontrolle erhöhten Lysin-Produktion wurden selektiert, chromosomale DNA gewonnen und der entsprechende Bereich des lysC Gens durch eine PCR-Reaktion (Pfu-Turbo PCR Systems; Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert und sequenziert (nach Sanger et al., a.a.O.). Ein solcher Klon mit der Eigenschaft er- höhter Lysin-Synthese und nachgewiesener Mutation in lysC an Position 932 wurde mit ATCC13032 lysCfbr bezeichnet.
Beispiel 1 a) Enzymatische Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung
500 g trocken vermahlenes Maismehl wurden in 750 ml Wasser suspendiert und in einem Rührmixer erneut fein vermählen. Die Suspension wurde in 4 Proben Nr. 1 bis 4 geteilt, die jeweils mit ca. 3 g hitzestabiler α-Amylase (Proben Nr. 1 und 2: Termamyl L; Proben Nr. 3 und 4: Spezyme) behandelt wurden. Die Proben Nr. 2 und 4 wurden nachfolgend mit ca. 7 g/l Glucoamylase (Probe Nr. 2: Dextrozyme GA; Probe Nr. 4: Optidex) behandelt. Es wurden gelbliche, viskose Proben erhalten, deren Feststoffanteil jeweils durch Zentrifugation abgetrennt wurde, wobei über der klaren Flüssigphase eine Schicht hydrophober Feststoffe aufschwamm.
Von den so erhaltenen Proben wurde unter Vernachlässigung bzw. unter Einbeziehung des abzentrifugierten Pellets jeweils der klare Überstand in konzentrierter Form und in 10-facher Verdünnung mittels HPLC analysiert. Bei Berücksichtigung des Pellets wurde ein Gehalt an Trockenmasse für das Pellet von 50 Gew.-% angenommen. Die Er- gebnisse, bezogen auf die Ausgangsprobe, sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3
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b) Fermentation
Zwei gemäß Beispiel 11.1 erhaltene Maismehlhydrolysate wurden in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt (Kolben 4-9). Außerdem wurde parallel ein analog Beispiel 11.1 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 1 -3) verwendet.
1 b.1 ) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 4; 20 min bei 121°C) 48 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD600 = 1 bei 600 nm erreicht.
Tabelle 4: Zusammensetzung des CM-Agar
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1 b.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5: Kolbenmedien
Figure imgf000053_0001
mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen Glucosekonzentration im Hydrolysat * Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Zuckern und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC wurde mit einem 1100 Series LC System von Agilent durchgeführt. Eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäure, die Auftrennung des Produktgemischs erfolgt mit einer Hypersil AA-Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.
Tabelle 6
Figure imgf000053_0002
In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 30 bis 40 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute. Beispiel 2: Fermentation
Unter Verwendung eines gemäß Beispiel 11.1 erhaltenen Maismehlhydrolysats wird eine Fermentation analog Beispiel 1 b) durchgeführt, wobei der unter III. beschriebene Stamm ATCC13032 lysCfbr verwendet wurde. Die Zellen werden auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung Tabelle 4; 20 min bei 121 °C) 48 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums 1 bzw. 2 (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 1 bei 610 nm erreicht. Die Proben werden dann bei 200 Upm und 30 °C in einem befeuchteten Schüttelschrank (85% rel. Luftfeuchte) 48 h inkubiert. Die Konzentration des Lysins in den Medien wird mittels HPLC bestimmt. In allen Fällen wurden annähernd gleiche Mengen an Lysin produziert.
Beispiel 3
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum (ATCC13032 lysCfbr) eingesetzt (Kolben 1+2). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 3+4) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 5+6) ver- wendet.
3.1) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammen- setzung: siehe Tabelle 7; 20 min bei 121°C) 48 h bei 30 °C inkubiert, dann auf eine neue Platte überimpft und über Nacht bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 23 ml des Mediums (siehe Tabelle 8) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreicht.
Tabelle 7: Zusammensetzung der CM+CaAc-Agarplatten
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3.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 6 sind in Tabelle 8 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet.
Tabelle 8: Kolbenmedien
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Figure imgf000056_0001
mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen * Glucosekonzentration im Hydrolysat ** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Aminosäurebestimmung erfordert eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd, die Auftrennung erfolgt auf einer Zorbax Extend C18 Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengestellt.
Tabelle 9
Figure imgf000056_0002
In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 10 bis 12 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute. ι
3.3) Isolierung des Lysin
Zur Isolierung des Lysin werden in einem ersten Schritt üblicherweise die Feststoffe aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugation abgetrennt. Alternativ zur Zentrifugation können auch Filtrationsverfahren wie z.B. Membranfiltrationen eingesetzt werden. Die feststofffreie Fermentationsbrühe wird dann angesäuert (z.B. mit Schwefelsäure), wodurch Lysin in ein- oder zweifach protonierter Form vorliegt. Anschließend wird diese angesäuerte Brühe dann über einen Kationentauscher geleitet, so dass das Lysin am lonentauscher bindet. Nach Spülen mit Wasser wird dann Ammoniakwasser zur Elution des Lysins über den lonentauscher geleitet. Das Eluat wird eingedampft; anschließend wird das im Eluat als freie Base vorliegende Lysin durch Zugabe von Salzsäure in Lysinhydrochlorid überführt und auskristallisiert. Die Abtrennung der Kristalle aus der Kristallsuspension erfolgt durch Zentrifugation, bevor sie abschließend getrocknet werden. Durch dieses Vorgehen wird ein kristallines Lysin hoher Reinheit (> 98,5 Gew.-% Lysin*HCI) erzeugt. Detaillierte Beschreibungen dieses Vorgehens wie auch alternativer Methoden zur Lysinaufarbeitung finden sich in „Ikeda, M.: Amino Acid Production Processes. Advances in Biochemical Engineering /Biotechnology, Vol. 79 (2003), 1-35" und "Hermann, T.: Industrial production of amino acids by coryneform bacteria. Journal of Biotechnology 104 (2003), 155-172".
Beispiel 4
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen verwendet (Kolben 1-3). Als Panthothenat-produzierender Stamm wurde Bacillus PA824 eingesetzt (genaue Beschreibung in WO 02/061108). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet. 4.1) Herstellung des Inokulums
42 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 10) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 0,4 ml einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 43 °C unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.
Tabelle 10: Zusammensetzung des Vorkulturmediums
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mit verdünnter wässriger KOH-Lösung einzustellen 42 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 11 ) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 1 ml Vorkultur angeimpft.
4.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 11 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet. Tabelle 1 1 : Kolbenmedien
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* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 24 h bei 43 °C und unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Pantothensäure per HPLC bestimmt. Die Bestimmung der Glucose erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule der Firma Bio-Rad. Die Bestimmung der Pantothensäurekonzentration erfolgte mittels Auftrennung auf einer Aqua C18-Säule der Firma Phenomenex. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt. Tabelle 12
Figure imgf000059_0001
In allen Kolben wurde Pantothensäure in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 1 ,5 bis 2 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.
Eine Aufarbeitung des Produkts kann z.B. wie in der WO 02/24001 , WO 02/072857 und WO 05/028659 beschrieben erfolgen.
Beispiel 5
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt (Kolben 1 -3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4- 6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.
5.1 ) Stämme
Ein Aspergillus niger Phytase-Produktionsstamm mit 6 Kopien des phyA-Gens aus Aspergillus ficuum unter der Kontrolle des glaA-Promotors wurde analog zur im Detail in WO98/46772 beschriebenen Herstellung von NP505-7 erzeugt. Als Kontrolle wurde ein Stamm mit 3 modifizierten glaA Ampikons (analog ISO505), jedoch ohne integrierte phyA-Expressionskassetten verwendet.
5.2) Herstellung des Inokulums
20 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 13) in 100 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 100 μl einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 34 °C unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Tabelle 13: Zusammensetzung des Vorkulturmediums
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* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen
50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 14) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft
5.3) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 14 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet. Tabelle 14: Kolbenmedien
Figure imgf000060_0002
Figure imgf000061_0001
* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays bestimmt. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Phytinsäure als Substrat und auf einem geeignetem Phytaseaktivitätsniveau (Standard: 0,6 U/ml) in 250 mM Essigsäure / Natriumacetat / Tween 20 (0,1 Gew.-%), pH 5,5 Puffer bestimmt. Der Assay wurde standardisiert für die Anwendung in Mikrotiterplatten (MTP). 10 μl der Enzymlösung wurden mit 140 μl 6,49 mM Phytatlösung in 250 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5 (Phy- tat: Dodecanatriumsalz der Phytinsäure) gemischt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens (150 μl) Trichloressig- säure gestoppt. Ein Aliquot dieser Mischung (20 μl) wurde überführt in 280 μl einer Lösung, die 0,32 N H2SO4, 0,27 Gew.-% Ammoniummolybdat und 1 ,08 Gew.-% As- corbinsäure enthält. Anschließend erfolgte eine 25-minütige Inkubation bei 50°C. Die Absorption der blau gefärbten Lösung wurde bei 820 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengestellt.
Tabelle 15
Figure imgf000061_0002
) FTU = Formazin-Turbidity-Einheit
Das Produkt kann aufgearbeitet werden wie in der WO 98/55599 beschrieben.
Beispiel 6
Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Ashbya gossypii eingesetzt (Kolben 1-4). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 5- 8) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 9-12) verwendet. 6.1) Stamm
Bei dem eingesetzten Riboflavin-produzierenden Stamm handelt es sich um Ashbya gossypii ATCC 10895 (s.a. Schmidt G , et al. Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbya gossypii. Microbiology 142: 411 -417, 1996).
6.2) Herstellung des Inokulums Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem HMG-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 16; 20 min bei 121 °C) 72 h bei 28 °C inkubiert.
Tabelle 16: Zusammensetzung der HMG-Agarplatten
Figure imgf000062_0001
Anschließend werden 50 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 17) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen jeweils mit einer Impföse voll Zellen angeimpft und 24 h bei 28 °C unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.
Tabelle 17: Zusammensetzung des Vorkulturmediums
Figure imgf000062_0002
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen 50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 18) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft
6.3) Herstellung der Fermentationsbrühe Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 12 sind in Tabelle 18 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.
Tabelle 18: Kolbenmedien
Figure imgf000063_0001
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 28 °C und unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Vitamin B2 per HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 zusammengestellt.
Tabelle 19
Figure imgf000063_0002
Das Produkt kann aufgearbeitet werden wie in der EP 00345717 beschrieben.
Beispiel 7
Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt (Kolben 1-3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.
7.1 ) Stämme Stämme von Corynebacterium, die Methionin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in Kumar D. Gomes J. Biotechnology Advances, 23(1):41-61 , 2005; Kumar D. et al., Process Biochemistry, 38:1165-1171 , 2003; WO 04/024933 und WO 02/18613 beschrieben.
7.2) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+Kan-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 20; 20 min bei 121°C) 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreicht. garplatten
Figure imgf000064_0001
7.3) Herstellung der Fermentationsbrühe Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 21 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.
Tabelle 21 : Kolbenmedien
Figure imgf000064_0002
Figure imgf000065_0001
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht war. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Methionin per HPLC bestimmt (Säule: Agilent ZORBAX Eclipse AAA; Methode It. Eclipse AAA protocol, Technical Note 5980-1193). Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 zusammengestellt.
Tabelle 22
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000066_0001
Die Aufarbeitung des Produkts kann z.B. wie in der WO 05/007862 und der früheren Anmeldung DE 10359668.2 beschrieben erfolgen. Beispiel 8
Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Bacterium 130Z eingesetzt. 8.1 ) Stamm
Als Succinat-produzierender Stamm wurde Bacterium 130Z eingesetzt (ATCC No. 55618). 8.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 23) in 120 ml Serumflaschen werden jeweils mit 1 ml einer Gefrierkultur angeimpft. Vor dem Verschließen wird auf die Serumflaschen CO2 aufgepresst (0,7 bar).
Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 23 aufgeführt (vgl. US 5,504,004). Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet (Endkonzentration Glucose: 100 g/l). Tabelle 23: Medium*
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000067_0001
* begast mit und abgefüllt unter C02/N2 ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Serumflaschen 46 h bei 37 °C und unter Bewegen (160 Upm) in einem Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Succinat per HPLC bestimmt. Die Bestimmung erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 zusammengestellt.
Tabelle 24
Figure imgf000067_0002
Beispiel 9
Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wird in Schüttelkolbenversu- chen unter Verwendung von Escherichia coli eingesetzt (Kolben 1 -3). Ebenso werden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.
9.1) Stamm
Escherichia co/-Stämme, die L-Threonin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in der EP 1013765 A1 , EP 1016710 A2, US 5,538,873 beschrieben.
9.2) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden auf sterilem LB-Agar ausgestrichen. Dem LB-Agar werden Antibioti- ka zugefügt, wenn geeignete Resistenz-Gene als Marker in dem entsprechenden Stamm existieren. Hierfür können z.B. Kanamycin (40 μg/mL) oder Ampicillin (100 mg/l) verwendet werden. Die Stämme werden 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 25) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreicht. 9.3) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 25 aufgeführt. Im Kontrollmedium wird statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.
Tabelle 25: Kolbenmedien
Figure imgf000068_0001
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen werden die Kolben bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht ist. Nach dem Abbruch der Fermentation kann der Gehalt an L-Threonin durch reversed-phase- HPLC bestimmt werden, wie von Lindroth et al., Analytical Chemistry 51 : 1167-1174, 1979 beschrieben.
Anschließend kann die Fermentationsbrühe geerntet werden und das in der Fermenta- tionsbrühe enthaltene L-Threonin isoliert, gereinigt oder anderweitig verarbeitet werden, wie z.B. in der US 5,538,873 und von Okamoto et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61 (11), 1877-1882, 1997 beschrieben.
Beispiel 10
In analoger Weise wie in Beispiel 9 beschrieben werden durch Einsatz entsprechender Stämme die weiteren L-Aminosäuren Glutamat, Lysin, Histidin, Prolin und Arginin hergestellt. Die jeweiligen Stämme sind z.B. in der EP 1016710 beschrieben. Beispiel 11
Ein analog Beispiel II.3 erhaltenes Cassavamehlhydrolysat wurde in Schüttelkolben- versuchen unter Verwendung des unter 11.2) beschriebenen Lysin-produzierenden Stamms von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt (Kolben 1 -4). Das eingesetzte Mehl wies folgende Größenverteilung auf: 45 % < 100 μm, 56 % < 200 μm, 79 % < 630 μm.
Bereits zu Beginn des Verflüssigungsschritts war die Viskosität der Suspension relativ hoch, so dass anfangs Cassavamehl in einer Menge eingesetzt wurde, die einem Trockenmassegehalt von 35 Gew.-% entsprach. Es erfolgte eine entsprechend vermehrte Zugabe von Mehl, um letztlich einen Trockenmassegehalt von 55 Gew.-% zu erreichen. Die Viskosität der Suspension blieb während der gesamten Verflüssigung und Verzuckerung relativ hoch. Des Weiteren neigte das Cassavamehl zur Verklumpung; die Klümpchen lösten sich im weiteren Verlauf nur zum Teil wieder auf. Vorhandene Klümpchen färbten sich im lod-Stärke-Test nach einigen Minuten tiefblau; dies deutet darauf hin, dass die verklumpte Stärke trotz mehrfachem Aufkochen und längerer Wartezeit nicht vollständig umgesetzt werden konnte. 11.1 ) Stamm
Es wurde der unter III. beschriebene modifizierte Wildtyp mit feedback-deregulierter Aspartokinase ATCC13032 lysCfbr verwendet. 1 1.2) Herstellung des Inokulums
Die Zellen wurden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 26; 20 min bei 121°C) 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 23 ml des Mediums (siehe Tabelle 27) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen wurden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreichte.
Tabelle 26: Zusammensetzung der CM+CaAc-AgarpIatten
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
11.3) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzung des Kolbenmediums ist in Tabelle 27 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.
Tabelle 27: Kolbenmedien
Figure imgf000070_0002
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Glucose wurde mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho- Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 28 zusammengestellt.
Tabelle 28
Figure imgf000071_0001
In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 10 bis 14 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.
Beispiel 12
Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt.
12.1) Verflüssigung und (Teil-) Verzuckerung
Die Verflüssigung wurde analog Beispiel II.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61 °C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eisbad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.
12.2) Fermentation
Es wurde der in Beispiel 5.1) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Ino- kulums erfolgte wie in Beispiel 5.2) beschrieben. Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 29 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden zwei Kolben angesetzt.
Tabelle 29: Kolbenmedien
Figure imgf000072_0001
* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen *** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays (wie in Beispiel 5.3 beschrieben) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 30 zusammengestellt. Tabelle 30
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
Beispiel 13
Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt.
13.1) Verflüssigung und (Teil-) Verzuckerung
Die Verflüssigung wurde analog Beispiel Il.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61 °C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eis- bad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.
13.2) Fermentation
Es wurde der in Beispiel 3) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Inoku- lums erfolgte wie in Beispiel 3.1) beschrieben.
Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 31 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden drei Kolben angesetzt.
Tabelle 31 : Kolbenmedien
Figure imgf000073_0002
Figure imgf000074_0001
mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Glucose wurde mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho- Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 zusammengestellt.
Tabelle 32
Figure imgf000074_0002
Figure imgf000075_0001
Beispiel 14 Bei einer analog Beispiel 3 durchgeführten Fermentation zur Herstellung von Lysin wurde nach Abreicherung des Lysins aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) als getrockneter Fermentationsrückstand eine Proteinzusammensetzung erhalten. In Tabelle 33 sind wesentliche Bestandteile der Zusammensetzung mit ihren Gewichtsanteilen angegeben und mit einer herkömmlichen DDGS-Zusammensetzung verglichen. Tabelle 33: Analysenergebnisse bezogen auf Trockenmasse in Gew.-% **
Figure imgf000075_0002
* für DDGS (Distiller's dried grain with solubles, das Nebenprodukt aus der Bioethanol- Herstellung) nach National Research Council (NRC), Nutrient Requirements for Dairy Cattle, Seventh Revised Edition, National Academy Press, 2001 (bzw. Spiehs M.J., Whitney M.H. and Shurson G.G.: Nutrient database for distiller's dried grains with solu- bles produced from new ethanol plants in Minnesota and South Dakota, Journal of Animal Science 80, 2002, 2639-2645)
** die genannten Parameter und die dazu erforderlichen Analysenmethoden sind dem Fachmann bekannt

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 5 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend: a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosac- charidgehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile o der Stärkequelle umfasst; b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und 5 c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechsel- produkt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit dem zuckerhaltigen Flüs-0 sigmedium kultiviert, welches man erhält durch: a1 ) Vermählen der Stärkequelle; und a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart5 mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt. 0
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das zuckerhaltige Flüssigmedium mindestens 20 Gew.-% der gesamten nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindes-5 tens eine Stärke verflüssigende Enzym unter α-Amylasen und das mindestens eine verzuckernde Enzym unter Glucoamylasen ausgewählt ist.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stärkequelle Getreidekörner verwendet.0
5. Verfahren nach Anspruch 4, -dadurch gekennzeichnet, dass das Getreide ausgewählt ist unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das beim Vermählen im Schritt a1 ) erhaltene Mahlgut mindestens 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm enthält.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verflüssigen und Verzuckern des Mahlguts im Schritt a2) derart erfolgt, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas beträgt.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 25 Gew.-% der Gesamtmenge des während der Verflüssigung zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a2) eine Teilmenge der mindestens einen α-Amylase während des Ver- flüssigens zu der wässrigen Flüssigkeit zugegeben wird.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zuckerhaltiges Flüssigmedium mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 40 Gew.-% erhält.
11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vor dem Fermentationsschritt b) mindestens eine Phytase zusetzt.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte unter nicht-flüchtigen Stoffen ausgewählt sind.
13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte unter organischen, gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C- Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Py- rimidinbasen, Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, Diolen mit 3 bis 10 C-Atomen, höherwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, längerkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofakto- ren, Nutrazeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lac- tonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt sind.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte ausgewählt sind unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen, Alkandiolen mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoaten.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme, Aminosäuren, Vitamine, Disaccharide, aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanole mit 4 bis 10 C- Atomen, Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoate.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganis- men ausgewählt sind unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum und Clostridium acetobutlicum.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abreicherung oder Isolierung der Stoffwechselprodukte aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) mittels lonenaustauschchromatographie durchführt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffwechsel- produkt selektiv auf dem Ionenaustauscher gebunden wird und gegebenenfalls der Ionenaustauscher vor der Elution des Produkts gewaschen wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher entgegen der Schwerkraft mit der feststoffbeladenen Fer- mentationsbrühe angeströmt wird.
20. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man (i) dem in Schritt a) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nichtstärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A) durchführt; und
(ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durch- führt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so erfolgt, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils der zuckerhaltigen Flüssigkeit maximal 50 Gew.-% beträgt.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffwechselprodukt (B) unter Phytase, Riboflavin, Pantothensäure und Polyhydroxy- alkanoaten ausgewählt ist.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man im Anschluss an die Abreicherung oder Isolierung des Stoffwechselprodukts gemäß Schritt c) die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe wenigstens teilweise entfernt, wobei man eine feste oder halbfeste Proteinzusammensetzung erhält.
24. Proteinzusammensetzung, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 23.
25. Proteinzusammensetzung nach Anspruch 24, im Wesentlichen enthaltend die folgenden Trockenmasse-Bestandteile: a) 1 bis 90 Gew.-% Biomasse aus der Fermentation; b) 1 bis 90 Gew.-% nicht-stärkehaltige Bestandteile der Stärkequelle; c) 0,01 bis 10 Gew.-% eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N- Atom; d) 0 bis 90 Gew.-% übliche Formulierungshilfsstoffe; und e) 0 bis 40 Gew.-% nicht metabolisierte weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe; wobei sich die Komponenten a) bis e) zu 100 Gew.-% an Trockenmasse addieren.
26. Proteinzusammensetzung nach Anspruch 24 oder 25 mit einem Gehalt an Rohprotein im Bereich von 40 bis 90 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse der Proteinzusammensetzung.
27. Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, die wenigstens eine unter Lysin, Methionin, Threonin und Tryptophan ausgewählte essentielle Aminosäure aufweist.
28. Verwendung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 22 zur fermentativen Herstellung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C- Atomen und mindestens 1 N-Atom.
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