CN102925517B - 转植酸酶玉米的用途和制备液化液和糖化液及发酵产品的方法 - Google Patents
转植酸酶玉米的用途和制备液化液和糖化液及发酵产品的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种制备玉米淀粉液化液的方法，包括如下步骤：(1)将转植酸酶玉米粉碎得到玉米粉，(2)将所述玉米粉与水混合，得到玉米粉浆；(3)将所得玉米粉浆预处理；(4)将经预处理的玉米粉浆在液化酶存在下进行液化得到玉米淀粉液化液；还提供了一种制备玉米淀粉糖化液的方法及玉米淀粉发酵产品的方法；还提供了它们的用途。通过本发明的技术方案，采用转植酸酶玉米进行玉米淀粉液化液、玉米淀粉糖化液和玉米淀粉发酵产品的工业化生产，可以提高玉米液化效果、糖化效果及发酵效率，从而提高乙醇的生产效率，表明转植酸酶玉米在工业上在具有较大的应用价值，还为通过转基因技术解决工业生产中的问题提供一条新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及转植酸酶玉米在制备玉米淀粉液化液、玉米淀粉糖化液或玉米淀粉发酵产品中的用途；还涉及一种制备玉米淀粉液化液的方法、一种制备玉米淀粉糖化液的方法和一种制备玉米淀粉发酵产品的方法。
背景技术
我国2011年玉米产量高达1.92亿吨，其中有22％作为原料，被应用于工业生产中。其主要产品通过包括生产各种醇类、有机酸、抗坏血酸中间体、氨基酸或蛋白质等。其中，液化通常是玉米籽粒在工业化应用中的第一步反应，其主要目的是将玉米淀粉降解为流动性较好的液体糊精。目前液化反应的工艺大致有两种，其一是利用高温(125-140℃)蒸煮，其二是利用酶催化水解液化反应(80-105℃)。其中，利用酶法能耗低、水耗低，应用前途广阔。液化酶是一种可内切玉米淀粉α-1，4-糖苷键的内切水解酶，该酶通常来源于各种芽孢杆菌或真菌，但由于玉米粉中的成份复杂，许多成份会影响到该酶的效率，因此有些研究希望通过外加酶制剂(如脂酶、纤维素酶等)来去除抑制液化酶活性的物质，但外加酶制剂会使生产成本增加，同时由于酶的用量通常比较大，而玉米粉在水中又不能完全溶解，因此酶制剂很难完全去除玉米浆中的酶抑制剂，其效率一般较低。因此到目前为止，以玉米为原料在工业化生产中仍然存在玉米液化效果差及发酵效率低的问题。
发明内容
为了克服以玉米作为工业原料进行发酵生产中存在玉米淀粉液化效果差及发酵效率低，以及降低外加酶制剂的成本，提高生产效率的问题，在本专利中提出了一种制备玉米淀粉液化液的方法、一种制备玉米淀粉糖化液的方法和一种制备玉米淀粉发酵产品的方法。
本发明提供了一种制备玉米淀粉液化液的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将转植酸酶玉米粉碎得到玉米粉，
(2)将所述玉米粉与水混合，得到玉米粉浆；
(3)将所得玉米粉浆预处理；
(4)将经预处理的玉米粉浆在液化酶存在下进行液化，从而得到玉米淀粉液化液；
液化酶对转植酸酶玉米的液化效果比未转植酸酶的玉米以及在未转植酸酶的玉米粉中填加与转植酸酶玉米等酶活的植酸酶两种条件下的液化效果都好；其中，所述转植酸酶玉米是将植酸酶植物重组表达载体转化受体玉米并培育和筛选再生玉米后得到；
该植酸酶植物重组表达载体为PHP20754AO如图1所示，含有以下序列：启动子序列、来源于微生物的植酸酶基因、信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列；其中，所述的启动子序列是SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述的来源于微生物的植酸酶基因是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的信号肽和蛋白体定位序列是SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；所述的终止子序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
本发明所述的微生物来源的植酸酶来源于真菌Aspergillus niger963(黑曲霉)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心的保藏号为CGMCC：0332，所述的玉米胚乳特异表达的启动子和终止子序列可根据文献(Woo，et al.2001，Plant cell.Oct.13(10)：2297-317)来设计引物分离得到。所述的信号肽和蛋白体定位序列为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(引导基因产物分泌和定位的信号肽序列，控制基因产物的定位，该信号肽和蛋白体定位序列可以引导植酸酶定位到细胞的蛋白体中)。
优选地，相对于每升的水，玉米粉的用量为290-385克。
优选地，粉碎得到的玉米粉的粒度为15-25目。
优选地，对玉米粉浆进行预处理的方法包括：在pH值5-6且温度为35-40℃下保持20-60分钟。
优选地，根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为2-8U。
优选地，液化的温度为60-90℃，时间为20-150分钟，pH值为5.0-7.0。本发明还提供了一种制备玉米淀粉糖化液的方法，其中，该方法包括如下步骤：
(1)按本发明提供的方法制备玉米淀粉液化液的方法制备玉米淀粉液化液；
(2)将所述玉米淀粉液化液进行热变性并在糖化酶的存在下进行糖化，得到玉米淀粉糖化液。
优选地，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为40-100U。
优选地，糖化的温度为50-70℃，pH值4.5-6.0，时间为5-30分钟。
另一方面，本发明还提供了一种制备玉米淀粉发酵产品的方法，该方法包括如下步骤：
(1)按照本发明所述的制备玉米淀粉糖化液的方法制备玉米淀粉糖化液；
(2)将所述玉米淀粉糖化液进行发酵，得到发酵液，并从所述发酵液中提取发酵产品。
优选地，发酵产品为醇、有机酸、抗坏血酸中间体、氨基酸或蛋白质。
优选地，发酵产品为乙醇，发酵的条件包括：菌种为酿酒酵母，发酵温度为30-36℃、时间为36-96小时。
另一方面，本发明提供了转植酸酶玉米在制备玉米淀粉液化液中的用途，其中，按照权利要求1的方法制备玉米淀粉液化液。
另一方面，本发明提供了转植酸酶玉米在制备玉米淀粉糖化液中的用途，其中，按照权利要求6的方法制备玉米淀粉糖化液。
另一方面，本发明提供了转植酸酶玉米在制备玉米淀粉发酵产品中的用途，其中，按照权利要求8的方法制备玉米淀粉发酵产品。该植酸酶植物重组表达载体为PHP20754AO如图1所示，含有以下序列：启动子序列、来源于微生物的植酸酶基因、信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列；其中，所述的启动子序列是SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述的来源于微生物的植酸酶基因是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的信号肽和蛋白体定位序列是SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；所述的终止子序列是SEQID NO：3所示的核苷酸序列。
转基因玉米是利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到玉米中，从而改造玉米的性质向人们所需要的目标转变。虽然转基因玉米在食用中的安全性评价仍然是有很长的路要走，但这并不影响转基因玉米的工业应用，例如在工业乙醇和燃料乙醇中的应用。并且通过将现在分子生物技术与工业生产相结合，能够为解决工业生产中长期无法解决的问题提供了新的解决路径。
通过本发明的技术方案，采用转植酸酶玉米进行玉米淀粉液化液、玉米淀粉糖化液和玉米淀粉发酵产品的工业化生产，可以提高玉米液化效果及发酵效率，同时也解决了转基因玉米的应用问题，通过转基因技术还为解决工业生产中的问题提供一条新的思路。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1是植酸酶植物重组表达载体PHP20754AO的示意图。
图2是转植酸酶玉米、未转植酸酶玉米以及外加植酸酶玉米在37℃预处理对植酸的降解试验的结果图。
图3是转植酸酶玉米、未转植酸酶玉米以及外加植酸酶玉米的液化试验结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种制备玉米淀粉液化液的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将转植酸酶玉米粉碎得到玉米粉，
(2)将所述玉米粉与水混合，得到玉米粉浆；
(3)将所得玉米粉浆预处理；
(4)将经预处理的玉米粉浆在液化酶存在下进行液化，从而得到玉米淀粉液化液；
其中，所述转植酸酶玉米是将植酸酶植物重组表达载体转化受体玉米并培育和筛选再生玉米后得到；
该植酸酶植物重组表达载体为PHP20754AO如图1所示，含有以下序列：启动子序列、来源于微生物的植酸酶基因、信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列；其中，所述的启动子序列是SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述的来源于微生物的植酸酶基因是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的信号肽和蛋白体定位序列是SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；所述的终止子序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
为了便于筛选成功转化的玉米，同时也为了更好的符合安全性的要求，上述方法中还包括构建植物选择标记基因表达载体，将植物重组表达载体与植物选择标记基因表达载体共同转化玉米，选育得到表达植酸酶而不含筛选标记基因的转基因玉米。
所述的植物选择标记基因表达载体的构建可按照常规方法进行，所述的选择标记基因可选自Bar基因(除草剂抗性的选择性标记)、Npt-II基因(新霉素磷酸转移酶基因)、DHFR基因(二氢叶酸还原酶基因)、Gent基因(庆大霉素抗性基因)等，优选为Bar基因。作为本发明的一个最优的实施方案，所述的选择标记基因表达载体为PHP17042Bar，其构建方法参见中国专利CN101153285A或常规的方法构建。
所述的植物重组表达载体转化玉米的方法可为本领域的常规转化方法，例如可以是农杆菌侵染法、基因枪法、PEG介导法、种质系统介导法、电击穿孔法或微注射法，本发明优选农杆菌侵染法或基因枪法，转化方法可以为按照CN101153285A中公开的转植酸酶玉米的制备方法制备转植酸酶玉米。植酸酶的活性一个单位(U)的植酸酶为：在pH5.5，37℃的条件下，每分钟从底物植酸钾、镁(肌醇六磷酸钾、镁)释放出1μmol无机磷酸所需要的酶量。测定方法详见中国专利CN101153285A。
根据本发明的制备玉米淀粉液化液的方法，其中，相对于每升的水，玉米粉的用量可以为玉米淀粉液化液制备领域常规的选择，例如为290-385克。
根据本发明的制备玉米淀粉液化液的方法，其中，所述粉碎得到的玉米粉的粒度可以为15-25目，优选为18-22目。
根据本发明的制备玉米淀粉液化液的方法，所述对玉米粉浆进行预处理的条件为本领域技术人员所公知，例如，在pH值5-6且温度为35-40℃下保持20-60分钟。
根据本发明的制备玉米淀粉液化液的方法，其中，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量可以为玉米淀粉液化液制备领域常规的选择，例如为10-15U/克玉米粉。本发明的发明人通过实验发现，在使用转植酸酶玉米的情况下，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为2-8U的情况下，更优选为2-4U的情况下，能够取得同样甚至更佳的液化效果，从而降低液化酶的消耗量。同时还发现利用同样的液化酶对玉米粉进行液化，如每克玉米粉中填加8U的液化酶，液化酶对转植酸酶玉米的液化效果要好于在未转植酸酶的玉米粉中填加与转植酸酶玉米等酶活的植酸酶。
根据本发明的制备玉米淀粉液化液的方法，其中，液化酶可以为常规的商购得到的各种能用于玉米淀粉液化的酶，例如购自诺维信的商品牌号为LiQuoFlow的液化酶。液化酶的活力单位为：一个酶活力单位(U)定义为：在60℃，每分钟释放出1μmol还原糖所需的酶量。采用二硝基水杨酸(DNS)法，测定酶活性，测定方法详见论文(硕士毕业论文“来源于枯草芽孢杆菌的中温淀粉酶基因的克隆及在原核微生物中的表达”，山东师范大学，杨雅亭，2007年)。
根据本发明的制备玉米淀粉液化液的方法，其中，液化的温度可以为60-90℃，时间可以为20-150分钟，pH值可以为5.0-7.0。
再次，本发明还提供了一种制备玉米淀粉糖化液的方法，其中，该方法包括如下步骤：
(1)按本发明提供的方法制备玉米淀粉液化液的方法制备玉米淀粉液化液；
(2)将所述玉米淀粉液化液进行热变性并在糖化酶的存在下进行糖化，得到玉米淀粉糖化液。
根据本发明的制备玉米淀粉糖化液的方法，糖化酶的用量可以为玉米淀粉糖化液制备领域常规的选择，例如相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为120-180U；本发明的发明人通过实验发现，在使用转植酸酶玉米的情况下，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为40-100U，更优选为40-60U，能够取得同样甚至更佳的糖化效果，从而降低糖化酶的消耗量。
所述热变性的条件为本领域技术人员所公知，例如：温度可以为100-105℃，时间可以为5-30分钟。
根据本发明的制备玉米淀粉糖化液的方法，其中，糖化的温度可以为50-70℃，时间可以为5-30分钟。
根据本发明的制备玉米淀粉糖化液的方法，其中，糖化酶可以为常规的商购得到的各种能用于玉米淀粉糖化的酶，例如购自诺维信的商品牌号为GA2X的糖化酶。糖化酶酶活测定：按QB746-80标准，原轻工部部颁标准测定。酶活定义：1克固体酶粉(或1mL液体酶)，于40℃、pH＝4.6的条件下，1小时分解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。测定方法详见QB746-80标准及论文(硕士毕业论文“糖化酶生产菌的遗传改良”，江南大学，姚婷婷，2006年)。
并且，本发明还提供了一种制备玉米淀粉发酵产品的方法，其中，该方法包括如下步骤：
(1)按照本发明所述的制备玉米淀粉糖化液的方法制备玉米淀粉糖化液；
(2)将所述玉米淀粉糖化液进行发酵，得到发酵液，并从所述发酵液中提取发酵产品。
根据本发明提供的制备玉米淀粉发酵产品的方法，其中，所述发酵产品可以为以植酸酶玉米为原料制得的产品；优选为醇、有机酸、抗坏血酸中间体、氨基酸或蛋白质。
其中，所述发酵产品为乙醇时，发酵的条件包括：菌种为酿酒酵母，发酵温度为30-36℃、时间为36-96小时。
本发明还提供了转植酸酶玉米在制备玉米淀粉液化液、玉米淀粉糖化液或玉米淀粉发酵产品中的用途，其中，所述转植酸酶玉米植酸酶是将植酸酶植物重组表达载体转化受体玉米并培育和筛选再生玉米后得到；
该植酸酶植物重组表达载体为PHP20754AO如图1所示，含有以下序列：启动子序列、来源于微生物的植酸酶基因、信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列；其中，所述的启动子序列是SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述的来源于微生物的植酸酶基因是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的信号肽和蛋白体定位序列是SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；所述的终止子序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
按照CN101153285A中公开的转植酸酶玉米的制备方法制备转植酸酶玉米。转化的玉米为常规的玉米品种，转化方法为采用基因枪法或农杆菌侵染法；所述植酸酶植物重组表达载体是PHP20754AO；PHP20754AO的图谱为图1所示。
载体PHP20754AO的构建：
根据文献(Woo，et al.2001，Plant cell.Oct.13(10)：2297-317)设计引物分离用于玉米中胚乳特异表达的Legumin1启动子(ZM-LEG1A PRO)和终止子(ZM-LEG 1TERM)：
启动子片段：
上游引物：5’AAGCTTGATATCGAGTCAGGTCAA3’；
下游引物：5’CCATGGCAGCGCTGCCTCTGCTCGCT3’。
PCR反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。得到来自玉米基因组DNA中玉米胚乳蛋白的启动子片段，该启动子片段的5’端和3’端分别包含HindIII和NcoI位点(Seq ID No：2)；
终止子片段：
上游引物：5’CCCGGGAGATCCGCACAACCTCA3’；
下游引物：5’GAATTCAGTATAACTATGCCGAGGTT3’。
PCR反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。得到来自玉米基因组DNA中玉米胚乳蛋白的终止子片段，该终止子片段的5’端和3’端分别包含Sma I和EcoRI位点(Seq ID No：3)；
利用基因合成的方法，合成基因定位序列元件(Seq ID No：4)，片段两端的酶切位点分别为Nco I和BamH I。将启动子元件和定位序列元件融合，即HindIII-Nco I启动子元件和Nco I-BamH I定位序列元件融合后，得到HindIII-BamH I片段，将HindIII-BamH I片段再与终止子即Sma I-EcoR I片段先后克隆到pSP72载体(构自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，构建成表达载体PHP20754。
将来源于真菌Aspergillus niger 963(黑曲霉)(专利号为ZL 97121731.9，在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心的保藏登记号为：CGMCC：0332)的植酸酶基因序列为Seq ID No：1，克隆进表达载体PHP20754，根据基因序列及载体上表达盒各元件的连接点序列，合成以下一对引物：上游引物序列为：CAATTGATCAATGCTGGCAGTCCCCGCCT(下划线所示为BclI位点)，下游引物序列GCTCTAGACCCGGGCTAAGCAAAACACTCCGCCC(下划线为酶切位点XbaI和SmaI)。从上述黑曲霉基因组DNA中扩增(反应条件94℃，5分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；72℃，1分半钟；35个循环；72℃延伸10分钟)植酸酶基因，经BclI和SmaI酶切后的产物分别与经过BamHI和SmaI酶切处理的PHP20754连接(由于BamHI和BclI为同尾酶，可以进行酶切连接)，构建得到PHP20754AO，重组载体示意图见图1。
植物选择标记载体为PHP17042Bar，其构建过程见中国专利CN101153285A。采用农杆菌侵染法或基因枪法，转化常规的玉米品种，最终经筛选可以得到转植酸酶的玉米材料。玉米转化方法详见中国专利CN101153285A。
实施例2
将实施例1制得的转植酸酶玉米(购自奥瑞金公司，品种为蠡玉16)粉碎为能通过20目网眼的转植酸酶玉米粉(每公斤1.6万U)。将转植酸酶玉米粉与水混合，相对于每升的水，玉米粉的用量为333克，并在pH值5.5下和37℃下保持1小时，得到玉米粉浆。
向玉米粉浆中加入液化酶(购自诺维信的商品牌号为LiQuoFlow的液化酶)，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为8U，在80℃的温度下和5.5的pH值下，维持120分钟，得到玉米淀粉液化液。
对照试验1
将野生型玉米(购自奥瑞金公司，品种为蠡玉16)粉碎为能通过20目网眼的玉米粉。将玉米粉与水混合，相对于每升的水，玉米粉的用量为333克，并在pH值5.5下和37℃下保持1小时，得到玉米粉浆。
向玉米粉浆中加入液化酶(购自诺维信，商品牌号为LiQuoFlow的液化酶)，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为8U，在80℃的温度下和5.5的pH值下，维持120分钟，得到玉米淀粉液化液。
对照试验2
将野生型玉米(购自奥瑞金公司，品种为蠡玉16)粉碎为能通过20目网眼的玉米粉。将玉米粉与水和植酸酶(购自挑战生物，品牌为特节磷植酸酶)混合，相对于每升的水，玉米粉的用量为333克，植酸酶的用量为5.33万U(活力单位同转植酸酶玉米中的植酸酶活力)，并在pH值5.5下和37℃下保持1小时，得到玉米粉浆。
向玉米粉浆中加入液化酶(购自诺维信，商品牌号为LiQuoFlow)，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为8U，在80℃的温度下和5.5的pH值下，维持120分钟，得到玉米淀粉液化液。
测试试验1
(1)将转植酸酶玉米粉碎为能通过20目网眼的转植酸酶玉米粉(每公斤1.6万U)。将转植酸酶玉米粉与水混合，相对于每升的水，玉米粉的用量为333克，并在pH值5.5下和37℃下保持1小时，得到玉米粉浆。
向玉米粉浆中加入液化酶(购自诺维信的商品牌号为LiQuoFlow的液化酶)，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为8U，在80℃的温度下和5.5的pH值下，维持120分钟，其中，每隔20分钟按照文献(中国农业科学院，硕士毕业论文“转植酸酶基因玉米中植酸酶的亚细胞定位”，杨文竹，2008年)中的方法测定一次植酸的含量(相对于玉米粉与水混合起始时间点的植酸含量的百分比)，并同时按照文献(山东师范大学，硕士毕业论文“来源于枯草芽孢杆菌的中温淀粉酶基因的克隆及在原核微生物中的表达”，杨雅亭，2007年)中的方法测定一次还原糖含量。
(2)将野生型玉米(购自奥瑞金公司，品种为蠡玉16)粉碎为能通过20目网眼的玉米粉。将玉米粉与水混合，相对于每升的水，玉米粉的用量为333克，并在pH值5.5下和37℃下保持1小时，得到玉米粉浆。
向玉米粉浆中加入液化酶(购自诺维信，商品牌号为LiQuoFlow的液化酶)，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为8U，在80℃的温度下和5.5的pH值下，维持120分钟，其中，每隔20分钟按照文献(中国农业科学院，硕士毕业论文“转植酸酶基因玉米中植酸酶的亚细胞定位”，杨文竹，2008年)中的方法测定植酸的含量(相对于玉米粉与水混合起始时间点的植酸含量的百分比)，并同时按照文献(山东师范大学，硕士毕业论文“来源于枯草芽孢杆菌的中温淀粉酶基因的克隆及在原核微生物中的表达”，杨雅亭，2007年)中的方法测定一次还原糖含量。
(3)将野生型玉米(购自奥瑞金公司，品种为蠡玉16)粉碎为能通过20目网眼的玉米粉。将玉米粉与水和植酸酶(购自挑战生物，品牌为特节磷植酸酶)混合，相对于每升的水，玉米粉的用量为333克，植酸酶的用量为0.53万U(活力单位同转植酸酶玉米中的植酸酶活力)，并在pH值5.5下和37℃下保持1小时，得到玉米粉浆。
向玉米粉浆中加入液化酶(购自诺维信，商品牌号为LiQuoFlow)，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为8U，在80℃的温度下和5.5的pH值下，维持120分钟，其中，每隔20分钟按照文献(中国农业科学院，硕士毕业论文“转植酸酶基因玉米中植酸酶的亚细胞定位”，杨文竹，2008年)中的方法测定一次植酸的含量(相对于玉米粉与水混合起始时间点的植酸含量的百分比)，并同时按照文献(山东师范大学，硕士毕业论文“来源于枯草芽孢杆菌的中温淀粉酶基因的克隆及在原核微生物中的表达”，杨雅亭，2007年)中的方法测定一次还原糖含量。
将以上(1)、(2)和(3)中测得的植酸含量相对于预处理时间做出植酸降解曲线，如图2所示。该结果表明：在对照材料中植酸的含量变化不大，转植酸酶玉米中的植酸可以很快被植酸酶降解，其降解效果好于在未转植酸酶玉米中填加与转植酸酶玉米等量酶活性的外源植酸酶的玉米材料。
将以上(1)、(2)和(3)中测得的还原糖含量相对于液化的时间做出还原糖生成曲线，如图3所示。该结果表明液化酶对转植酸酶玉米的液化效果更好，其效果好于未转植酸酶玉米及未转植酸酶玉米中填加与转植酸酶玉米等量酶活性的外源植酸酶的玉米材料。
实施例3
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每升的水，玉米粉的用量为385克，玉米粉的粒度为15目。
实施例4
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每升的水，玉米粉的用量为357克，玉米粉的粒度为25目，对玉米粉浆进行预处理的方法包括：在pH值5且温度为35℃下保持20分钟。
实施例5
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每升的水，玉米粉的用量为313克，对玉米粉浆进行预处理的方法包括：在pH值6且温度为40℃下保持60分钟。
实施例6
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每升的水，玉米粉的用量为290克，对玉米粉浆进行预处理的方法包括：在pH值5.5且温度为38℃下保持40分钟。
实施例7
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为10U，液化的温度为80℃，时间为100分钟，pH值为5.5。
对照试验3
采用与对照试验1和2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为10U，液化的温度为80℃，时间为100分钟，pH值为5.5。
实施例8
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为6U，液化的温度为60℃，时间为20分钟，pH值为5.0。
对照试验4
采用与对照试验1和2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为6U，液化的温度为60℃，时间为20分钟，pH值为5.0。
实施例9
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为4U，液化的温度为90℃，时间为150分钟，pH值为7.0。
对照试验5
采用与对照试验1和2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为4U，液化的温度为90℃，时间为150分钟，pH值为7.0。
实施例10
采用与实施例2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为2U，液化的温度为70℃，时间为50分钟，pH值为6.0。
对照试验6
采用与对照试验1和2的方法制备玉米粉浆和玉米淀粉液化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为2U，液化的温度为70℃，时间为50分钟，pH值为6.0。
测试试验2
按照文献(山东师范大学，硕士毕业论文“来源于枯草芽孢杆菌的中温淀粉酶基因的克隆及在原核微生物中的表达”，杨雅亭，2007年)，中的方法分别测定实施例2-10、对照试验1-6玉米淀粉液化液中的还原糖含量(相对于玉米粉与水混合起始时间点的还原糖含量的百分比)，结果如表1所示。
表1
从表1的数据可以看出，本发明提供的方法能够提高液化的生产效率，并且，相对于未转植酸酶的玉米通过外加相同量的植酸酶，能够取得更好的液化效果，如每克玉米粉中填加8U的液化酶，液化酶对转植酸酶玉米的液化效果要好在未转植酸酶的玉米粉中填加与转植酸酶玉米等酶活的植酸酶；并且能提高液化酶的使用效率，降低液化酶的消耗量。
实施例11
将实施例2得到的玉米淀粉液化液在100℃的热变性温度下维持15分钟，得到热变性后的玉米淀粉液化液。然后，将玉米淀粉液化液与糖化酶(购自诺维信的商品牌号为GA2x的糖化酶)混合，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为60U，并且在60℃的糖化温度下维持为10分钟，得到玉米淀粉糖化液。
对照试验7
采用与实施例11的方法制备玉米淀粉糖化液，所不同的是，使用的玉米淀粉液化液为对照试验1得到的玉米淀粉液化液。
对照试验8
采用与实施例11的方法制备玉米淀粉糖化液，所不同的是，使用的玉米淀粉液化液为对照试验2得到的玉米淀粉液化液。
实施例12
采用与实施例11的方法制备玉米淀粉糖化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为100U，糖化的温度为60℃，pH值5.0，时间为20分钟。
实施例13
采用与实施例11的方法制备玉米淀粉糖化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为80U，糖化的温度为50℃，pH值4.5，时间为5分钟。
实施例14
采用与实施例11的方法制备玉米淀粉糖化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为40U，糖化的温度为70℃，pH值6.0，时间为30分钟。
实施例15
采用与实施例11的方法制备玉米淀粉糖化液，所不同的是，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为20U。
测试试验3
采用SBA-90生物传感分析仪，分别测定实施例11-15、对照试验3和对照试验4的玉米淀粉糖化液中的葡萄糖含量，结果如表2所示。
表2
从表2的数据可以看出，本发明提供的方法能够提高糖化的生产效率，并且，相对于每克的玉米粉，糖化酶的用量为40-80U的情况下，能够取得更好的糖化效果，该效果好于未转植酸酶玉米，以及外加相同量植酸酶的未转植酸酶的玉米。
实施例16
向实施例11得到的玉米淀粉糖化液中接种发酵菌种(购自安琪酵母的商品牌号为安琪超级酿酒干酵母的菌种)，接种量为每升醪液接种0.3g干酵母，进行好氧发酵7小时(30℃，pH 4.5)，然后进行厌氧发酵48小时，温度为34℃、发酵结束后，得到含有乙醇的发酵液。
对照试验9
采用与实施例16的方法制备含有乙醇的发酵液，所不同的是，使用的玉米淀粉糖化液为对照试验7得到的玉米淀粉糖化液。
对照试验10
采用与实施例16的方法制备含有乙醇的发酵液，所不同的是，使用的玉米淀粉糖化液为对照试验8得到的玉米淀粉糖化液。
测试试验4
采用SBA-90生物传感分析仪，分别测定实施例16、对照试验5和对照试验6的含有乙醇的发酵液中的乙醇含量(体积百分比)，结果如表3所示。
表3
从表3的数据可以看出，本发明提供的方法能够提高发酵生产乙醇的生产效率，该效果好于相应的未转植酸酶的玉米，同时也较在未转植酸酶的玉米粉中填加与转植酸酶玉米等酶活植酸酶的对照处理。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (11)
1.一种制备玉米淀粉液化液的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将转植酸酶玉米粉碎得到玉米粉，
(2)将所述玉米粉与水混合，得到玉米粉浆；相对于每升的水，玉米粉的用量为290-385克；
(3)将所得玉米粉浆预处理；其中，对玉米粉浆进行预处理的方法包括：在pH值5-6且温度为35-40℃下保持20-60分钟；
(4)将经预处理的玉米粉浆在液化酶存在下进行液化，从而得到玉米淀粉液化液；
液化酶对转植酸酶玉米的液化效果比未转植酸酶的玉米以及在未转植酸酶的玉米粉中填加与转植酸酶玉米等酶活的植酸酶两种条件下的液化效果都好；
其中，所述转植酸酶玉米是将植酸酶植物重组表达载体转化受体玉米并培育和筛选再生玉米后得到；
该植酸酶植物重组表达载体为PHP20754AO，含有以下序列：启动子序列、来源于微生物的植酸酶基因、信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列；其中，所述的启动子序列是SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述的来源于微生物的植酸酶基因是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的信号肽和蛋白体定位序列是SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；所述的终止子序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，粉碎得到的玉米粉的粒度为15-25目。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于每克的玉米粉，液化酶的用量为2-8U，液化的温度为60-90℃，时间为20-150分钟，pH值为5.0-7.0。
4.一种制备玉米淀粉糖化液的方法，其中，该方法包括如下步骤：
(1)按照权利要求1-3中任一所述的方法制备玉米淀粉液化液；
(2)将所述玉米淀粉液化液进行热变性并在糖化酶的存在下进行糖化，得到玉米淀粉糖化液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，相对于每克的玉米粉糖化酶的用量为40-100U，糖化的温度为50-70℃，pH值4.5-6.0，时间为5-30分钟。
6.一种制备玉米淀粉发酵产品的方法，该方法包括如下步骤：
(1)按照权利要求4-5中任意一项所述的方法制备玉米淀粉糖化液；
(2)将所述玉米淀粉糖化液进行发酵，得到发酵液，并从所述发酵液中提取发酵产品。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述发酵产品为醇、有机酸、抗坏血酸中间体、氨基酸或蛋白质。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述发酵产品为乙醇，发酵的条件包括：菌种为酿酒酵母，发酵温度为30-36℃、时间为36-96小时。
9.转植酸酶玉米在制备玉米淀粉液化液中的用途，其中，按照权利要求1的方法制备玉米淀粉液化液。
10.转植酸酶玉米在制备玉米淀粉糖化液中的用途，其中，按照权利要求4的方法制备玉米淀粉糖化液。
11.转植酸酶玉米在制备玉米淀粉发酵产品中的用途，其中，按照权利要求6的方法制备玉米淀粉发酵产品。
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