CN1981045A - 精细化学品的发酵产生 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过基于糖的微生物发酵的方法产生至少一种微生物代谢物的方法,所述代谢物具有至少3个碳原子或至少2个碳原子和至少一个氮原子,所述方法包括:a)从淀粉原料中制备单糖含量按重量计大于20%的含糖液体培养基,含糖液体培养基还含有淀粉原料的非淀粉固体成分;b)发酵含糖液体培养基以制备代谢物;和c)从发酵液中排出或分离至少一种代谢物,其中产生目的代谢物的微生物菌株使用含糖液体培养基培养,所述液体培养基获得自:a1)研磨淀粉原料;和a2)将研磨料液化在含有至少一种淀粉液化酶的水性液体中,然后使用至少一种糖化酶糖化,其中至少一些研磨料通过连续或分批添加至水性液体中而被液化。
Description
发明领域
本发明涉及通过研磨、液化和糖化淀粉原料发酵产生精细化学品,以及产生的糖溶液作为发酵培养基的用途。
背景技术
已公知通过微生物产生精细化学品(如氨基酸、维生素和类胡萝卜素)的发酵方法。根据多种方法的条件使用不同的碳原料。它们包括从甜菜和甘蔗糖蜜产生的纯蔗糖到众所周知的优质糖蜜(转化的甘蔗糖蜜)到来自淀粉水解产物的葡萄糖。另外,乙酸和乙醇作为可用于以工业规模生物技术产生L-赖氨酸的共底物被提及(Pfefferle等,BiotechnologicalManufacture of Lysine,Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,卷79(2003),59-112)。
根据上述碳原料建立了多种以糖为基础发酵产生精细化学品的方法和工艺。以L-赖氨酸为例,例如Pfefferle等(上文)描述了关于菌株发展、方法发展和工业生产的方法。
微生物介导发酵产生精细化学品的一个重要碳原料为淀粉。在发酵中用作碳原料之前,应在之前的反应步骤中首先将淀粉液化并糖化。为此,通常从天然淀粉原料例如马铃薯、木薯、谷物(如小麦、玉米、大麦、黑麦、小黑麦或稻)中获得预纯化形式的淀粉,随后酶促液化并糖化,然后用于实际发酵以产生精细化学品。
除这类预纯化的淀粉原料外,还描述了未预处理的淀粉原料制备用于发酵产生精细化学品的碳原料的用途。通常先通过研磨粉碎淀粉原料。然后液化并糖化粉末。由于该粉末除淀粉外还包含一些负面影响发酵的非淀粉成分,在发酵前通常去除这些成分。可在研磨后(WO02/277252;JP2001-072701;JP56-169594;CN1218111),液化后(WO02/277252;CN1173541)或糖化后(CN1266102;Beukema等:Production offermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes;potatosaccharification to give culture medium(Conference Abstract),Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983),6;NL8302229)直接去除。然而,所有的变化形式均涉及在发酵中使用基本纯净的淀粉水解产物。
更新的技术特别涉及改进的方法,所述方法旨在可能在发酵前纯化例如液化的和糖化的淀粉溶液(JP57159500)和从可更新资源中纯化发酵培养基(EP1205557)。
相反的,已知在发酵产生生物酒精中大规模使用未处理的淀粉原料。大规模工业中确立了本文中淀粉原料的所谓的“干磨法”、液化和糖化。适当的方法描述可见于例如《The Alcohol Textbook-A reference for thebeverage,fuel and industrial alcohol industries》,Jaques等编,NottinghamUniv.Press 1995,ISBN 1-8977676-735和McAloon等,《Determining thecost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks》,NREL/TP-580-28893,National Renewable Energy Laboratory,2000年10月。
干磨法的第一步将完整的谷粒,优选玉米、小麦、大麦、小米和黑麦细磨。与所谓的湿磨法相反,不添加额外的液体。将材料研磨成细小成分的目的是使颗粒中存在的淀粉在随后的液化和糖化中能够受到水和酶的作用。
由于在发酵生产生物乙醇时有价值的产物通过蒸馏获得,使用干磨法得到的未预纯化形式的淀粉原料并不造成特殊的问题。然而,使用干磨法产生精细化学品时,通过糖溶液引入发酵的固体流是有问题的,因为它不但可对发酵起到负面作用,还显著地使后续步骤更加困难。
因此,在许多发酵中,为所使用的微生物供应的氧气是一个限制因素,特别是当微生物有大量氧气需求时。通常不清楚高固体浓度对氧气从气相到液相的转移和氧气转移速率的影响。另一方面,已知随提高的固体浓度而提高的粘度引起氧气转移率降低。另外,如果与固体一起向发酵培养基中引入表面活性物质,它们影响气泡凝结的倾向。从而产生的气泡大小对氧气转移具有显著的影响(Mersmann,A。等:Selection and Design ofAerobic Bioreactors,Chem.Eng.Technol.13(1990),357-370)。
作为引入固体的结果,使用的培养基可在制备含淀粉悬液时达到临界粘度值,因为例如含有以重量计磨碎玉米多于30%的水悬液不能够再被均匀混和(《Industrial Enzymology》第二版,T.Godfrey,S.West,1996)。这限制了传统方法中的葡萄糖浓度。结果,出于经济原因,使用更低浓度的溶液是不利的,因为这引起发酵液的不成比例的稀释。这使得目的产物可达到的终浓度降低(引起分离时的额外成本)和时空产量降低(当产生等量产物时引起更高的体积需要,即更高的投资成本)。
检查时,提高的固体浓度可引起使用具体方法的具体困难。因此,例如通过离子交换层析纯化发酵液时,需要考虑使用的层析柱往往会堵塞(即封闭)。
由于这些困难,干磨法的现有技术变化形式不适合产生用于发酵产生精细化学品的淀粉原料,并因此不具有特别的经济重要性。迄今为止,将干磨法概念和原则上与该方法相关的优点应用于工业规模产生精细化学品的努力只被描述为使用木著作为淀粉原料。
因此,在JP2001/275693描述的发酵产生氨基酸的方法(其中使用在干燥条件下被研碎的剥皮的木薯块茎作为淀粉原料)中,必须进行将研磨料(millbase)颗粒大小调节为≤150μm的步骤。在为此进行的过滤步骤中,按重量计大于10%的使用的研磨料(包括非淀粉成分)被去除,然后液化/糖化并随后发酵获得的淀粉。此外,该方法免除了在旨在用作饲料添加剂的发酵产物(例如赖氨酸)中去除非淀粉成分()的问题,从而非淀粉木薯成分可留在有价值的产物中。
JP2001/309751描述了产生含有氨基酸饲料添加剂的类似方法。类似的,不需要纯化或去除固体。
然而,在干磨法中与其他淀粉原料相比木薯应该相对的没有问题。干木薯根中淀粉按重量计通常达到至少80%(Menezes等,Fungal cellulosesas an aid for the saccharification of Cassava,Biotechnology andBioengineering,第20卷(4),1978,John Wiley and Sons,Inc.,表1,558页),而谷物中的淀粉含量(干物质)相对更低,按重量计通常低于70%,例如在玉米中为约68%和小麦中约65%(Jaques等,The Alcohol Textbook,ibid.)。因此,使用干磨木薯与使用另一干磨的淀粉原料相比,液化和糖化后获得的葡萄糖溶液含有更少的成分,特别是更少的固体。
提高的污染物量增加反应混合物的粘度。然而木薯淀粉应相对容易操作。虽然在吸涨温度时它与玉米淀粉相比具有更高的粘度,相反的,在提高温度时与玉米淀粉相比粘度降低得更快(Menezes,T.J.B.de,Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production,ProcessBiochemistry,1978,24页,right column)。此外,木薯淀粉的吸涨和胶凝温度比来自谷物(如玉米)的淀粉低,这是其更容易被细菌α-淀粉酶作用的原因(Menezes,T.J.B.de,上述引文)。
木薯淀粉与其他淀粉原料相比的其他优点为它的低纤维素含量和它的低肌醇六磷酸含量。纤维素和半纤维素可转化为糖醛,特别是在酸性糖化条件下(Jaques等,The Alcohol Textbook,ibid.;Menezes,T.J.B.de,ibid.),其反过来可对发酵中使用的微生物具有抑制作用。肌醇六磷酸同样抑制发酵中使用的微生物。
因此虽然从技术方面可能在对应干磨法的方法中使用木薯作为淀粉原料,这类基于木薯的方法仍然是复杂的、未优化的并从而未被广泛使用。
发明内容
因此本发明的目的为提供发酵产生精细化学品的有效方法,所述方法允许使用多种含有淀粉的、全世界地域可获得的植物(如谷物或马铃薯)作为淀粉原料。该方法的特征在于使用的培养基的简单加工并特别避免发酵前复杂的预纯化或主纯化步骤,例如去除非淀粉固体成分。此外,其允许容易地加工发酵混合物。根据申请公司进行的工作,惊奇地发现尽管其本身提高了固体的引入,这类方法可以以有效的方式完成。
因此本发明涉及通过基于糖的微生物发酵方法产生至少一种微生物代谢物的方法,所述代谢物具有至少3个碳原子或至少2个碳原子和至少一个氮原子,所述方法包括:
a)从淀粉原料中制备单糖含量按重量计大于20%的含糖液体培养基,含糖液体培养基还含有淀粉原料的非淀粉固体成分;
b)发酵含糖液体培养基以制备代谢物;和
c)从发酵液中排出或分离至少一种代谢物,
其包括用含糖液体培养基培养产生目的代谢物的微生物菌株,所述液体培养基获得自:
a1)研磨淀粉原料;和
a2)将研磨料液化在含有至少一种淀粉液化酶的水性液体中,然后使用至少一种糖化酶糖化,其中至少一些研磨料通过连续或分批添加至水性液体中而被液化。
适于用作淀粉原料的主要为干谷物或种子,其中干燥状态下淀粉达到按重量计至少40%并优选按重量计至少50%。这样的原料见于目前大规模种植的谷物植物,如玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、黑小麦、稻和多种高粱和小米种类,如芦黍和买罗高梁。淀粉原料优选选自谷粒,特别优选玉米、黑麦、黑小麦和小麦麦粒。一般的,本发明的方法还可使用其他淀粉原料进行,例如马铃薯、木薯/木薯淀粉或多种含淀粉水果或种子的混和物。
含糖液体培养基中存在的糖优选单糖,例如己糖和戊糖,如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖和核糖,特别是葡萄糖。葡萄糖外的单糖数量可根据使用的淀粉原料和其中含有的非淀粉成分变化;其可被反应过程影响,例如被通过添加纤维素酶分解纤维素成分影响。含糖液体培养基的单糖有利地含有按重量计占含糖液体培养基中存在的糖总量的至少60%,优选按重量计至少70%,特别优选按重量计至少80%的葡萄糖。通常,葡萄糖总量按重量计占含糖液体培养基中存在的糖总量的从75%到99%的范围内,特别是按重量计80%到97%并特别是按重量计85到95%。
根据本发明,(产生目的代谢物的微生物在其中培养的)含糖液体培养基含有至少一些,优选按重量计至少20%,特别优选按重量计至少50%,特别是按重量计至少90%并非常特别按重量计至少99%的存在于研碎的谷粒中的非淀粉固体成分,这取决于提取率。含糖液体培养基中的非淀粉固体成分优选按重量计达到研磨料中的淀粉成分(从而占含糖液体培养基中单糖数量)的至少10%,特别是按重量计至少25%,例如按重量计25和75%之间,特别是按重量计30%和60%之间。
为了制备含糖液体培养基,在步骤a1)中研碎所述淀粉原料,其间添加或不添加液体(如水),优选不添加液体。还可能将干磨与随后的湿磨步骤结合。通常用于干磨的设备为锤式粉碎机、旋转粉碎机或辊式破碎机;适用于湿磨法的为桨叶混合机、搅拌球式粉碎机、循环粉碎机、盘式粉碎机、环室粉碎机、振荡粉碎机或行星式球磨机。原则上其他粉碎机也是合适的。例行实验中湿磨法需要的液体数量可由本领域技术工人决定。通常调整为干物质含量按重量计在10%到20%之间。
研磨产生适用于后续方法步骤的颗粒大小。在本文上下文中,在a1)步骤的研磨步骤特别是干磨步骤中获得的研磨料具有按重量计30%到100%,优选按重量计40%到95%,特别优选按重量计50%到90%数量的颗粒大小为100到630μm范围的粉末颗粒(即微粒成分)是有利的。优选获得的研磨料含有按重量计50%的粉末颗粒颗粒大小为大于100μm。通常,按重量计至少95%的获得的粉末颗粒具有小于2mm的颗粒大小。在本文上下文中,使用振动分析仪通过筛选分析测量颗粒大小。原则上小的颗粒大小有利于获得高产物产量。然而,在液化或加工中研磨料成浆时,如发酵步骤后干燥固体时,过小的颗粒大小可能引起问题,特别是归于成块/结块的问题,
通常,粉末由提取率或粉末等级表征,它们的相互关系为粉末等级的性质随着提取率的上升而上升。提取率对应于基于按重量计使用的100份研磨料所获得的按重量计粉末的数量。在研磨方法中,最先获得例如来自谷粒内部的纯净的细小的粉末,而随着粉末中粗纤维和外壳成分数量的提高,淀粉的比例下降。从而提取率还反映了所谓的粉末等级,其用作分类粉末(特别是谷物粉末)的数值并基于粉末的灰分含量(称为灰分比例)。粉末等级或类型号指出将100g粉末固体烧成灰后留下的灰分(矿物质)的mg量。对谷物粉末而言,更高的类型号意味着更高的提取率,因为谷粒核心含有按重量计约0.4%的灰分,而外壳含有按重量计约5%的灰分。因此,对于更低的提取率,谷物粉末主要由粉碎的胚乳(即谷粒的淀粉内容)组成;对于更高的提取率,谷物粉末也含有粉碎的、含有蛋白质的谷粒糊粉层;对于粗磨而言,它们还含有含蛋白质和含脂肪的胚胎成分和外壳成分(包括粗纤维和灰分)。就本发明而言,原则上优选具有高提取率或高类型号的粉末。如果使用谷物作为淀粉原料,优选研磨并加工的完整谷物及其外壳。
如果合适,在研磨之前将淀粉原料分割成适合研磨的大小,例如当使用相对较大的材料如马铃薯或木薯时。对谷物而言,可省却该分割步骤并使用和研磨完整的谷粒。
a2)步骤中为了液化研磨料中存在的淀粉,在液化步骤过程中糖化步骤之前将至少一些,优选按重量计至少40%,特别是按重量计至少50%并特别优选按重量计至少50%的研磨料引入反应器。通常加入的量按重量计不超过90%,特别是按重量计85%并特别优选按重量计80%。优选的,在处理过程中加入的这部分研磨料是在液化步骤使用的条件下加入反应器的。添加可以分为若干批(即分步)或连续进行,优选每部分占待液化研磨料总量的按重量计总计不多于20%,特别优选按重量计不多于10%,例如按重量计1%到20%,特别是按重量计2%到10%。本发明中基本上只有一些研磨料,优选按重量计不多于60%,特别优选按重量计不多于50%并非常优选按重量计不多于45%的研磨料在液化处理开始时存在于反应器中,剩余的研磨料在液化步骤中加入。液化也可连续进行,例如在多步骤反应级联中。
根据本发明,a2)步骤中的液化在至少一种淀粉液化酶存在下进行,所述酶优选选自α-淀粉酶。同样,可以使用其他在反应条件下有活性而且稳定并液化稳定淀粉的酶。
α-淀粉酶(或使用的淀粉液化酶)可首先引入反应容器中或在a2)步骤的过程中加入。优选的,a2)步骤需要的一些α-淀粉酶在a2)步骤开始时加入或首先放入反应器中。基于使用的淀粉原料的总量,α-淀粉酶的总量通常按重量计位于0.002%到3.0%范围内,优选按重量计从0.01%到1.5%并特别优选按重量计从0.02%到0.5%。
可在胶凝温度之上或之下进行液化。优选的,在至少部分高于使用的淀粉的胶凝温度下进行a2)步骤中的液化(称为烹饪过程)。通常选择从70℃到165℃之间,优选80℃到125℃之间,特别优选85℃和115℃之间的温度,温度优选比胶凝温度高至少5℃并特别优选至少高10℃。
为了达到最佳的α-淀粉酶活性,步骤a2)至少部分在弱酸性范围的pH值下进行,优选4.0和7.0之间,特别优选5.0和6.5之间,pH值通常在步骤a2)之前或开始时调节;优选在液化中检查及适当时重新调节该pH。优选使用稀释的矿物酸(如H2SO4或H3PO4)或稀释的氢氧化物碱(如NaOH或KOH)调节pH。
在优选的实施方案中,本发明方法的步骤a2)如下进行:按重量计占研磨料总量总计不多于60%,优选按重量计不多于50%,特别优选按重量计不多于45%,例如按重量计10%到60%,特别是按重量计15%到50%,特别优选按重量计20%到45%的部分起初悬浮于水性液体(如新鲜水,例如来自发酵或加工步骤的循环加工水或这些液体的混合物)中,然后进行液化。
为了实施本发明的方法,可以预加热使用的液体以使得悬液具有适度提高的温度,例如从40℃到60℃。然而,优选使用室温的液体。
然后,向悬液中加入所述至少一种淀粉液化酶,优选α-淀粉酶。如果使用α-淀粉酶,只加入一些α-淀粉酶是有利的,例如步骤a2)中使用的α-淀粉酶总量按重量计的10%到70%,特别是按重量计20%到65%。在该时间加入的α-淀粉酶数量取决于所述α-淀粉酶在反应条件下对所使用的淀粉原料的活性,并通常占使用的淀粉原料总量的按重量计从0.0004%到2.0%,优选按重量计从0.001%到1.0%,特别优选按重量计从0.02%到0.3%的范围。另一种选择是,α-淀粉酶部分可在制备悬液之前与使用的液体混和。
在本文上下文中,优选在开始加热至用于液化的温度之前加入α-淀粉酶部分,特别是在室温下或仅适度提高温度,例如从20℃到30℃。
有利地,α-淀粉酶和研磨料的数量按照下述方式选择:胶凝过程中的粘度足够降低从而可能有效地混和悬液(如通过搅拌方法)。优选凝胶时反应混合物的粘度不大于20Pas,特别优选不大于10Pas并非常特别优选不大于5Pas。通常用Roto Visko RV20型Haake粘度计使用M5系统和MVDIN设备在50℃的温度下和200s-1的切割率下测量粘度。
然后加热如此产生的悬液,优选在高于使用的淀粉的胶凝温度的温度下。通常选择在70℃到165℃之间,优选80℃到125℃之间,特别优选85℃和115℃之间的温度,温度优选比胶凝温度高至少5℃并特别优选高至少10℃。监控粘度时,向含有淀粉的悬液中逐渐加入其他淀粉原料部分,例如每次按重量计占所有使用淀粉的2%到20%,特别是按重量计5%到10%。优选将待加入的研磨料部分在液化步骤过程中以至少2个级分,优选至少4个级分并特别优选至少6个级分加入反应混合物中。另外,未用作制造悬液的研磨料部分可在液化步骤中连续加入。加入时,应有利地保持温度高于淀粉的胶凝温度。
加入所有粉末后,通常将反应混合物在设定为高于淀粉胶凝温度的温度下保持某段时间(即烹饪),如30到60分钟或需要时更长。然后在加入另外的α-淀粉酶部分(优选主要部分)之前将反应混合物冷却至略微高于胶凝温度的温度,例如75℃到90℃。根据使用的α-淀粉酶在反应条件下的活性,在该时间点加入的α-淀粉酶数量占使用的淀粉原料总量的优选按重量计0.002%到2.0%,特别优选按重量计0.01%到1.0%,尤其特别优选按重量计0.02%到0.4%。
在这些温度下,淀粉的颗粒结构被破坏(胶凝),使得酶淀粉降解成为可能。为了将淀粉完全降解为糊精,将反应混合物保持在固定温度下,或适当时加热更久直到通过碘测试淀粉或合适的其他检测淀粉的测试为阴性或至少基本上为阴性。适当时可在此时向反应混合物中加入一种或多种其他α-淀粉酶部分,例如按重量计占使用的淀粉原料总量的0.001%到0.5%并优选按重量计0.002%到0.2%。
淀粉液化结束后,液体培养基中存在的糊精被连续或分批糖化(即降解为葡萄糖),优选连续糖化。液化的培养基可在特定的糖化罐中持续糖化然后加入发酵步骤(b)。另一方面,证明发酵之前只进行部分糖化是有利的。例如,可随后进行将液体培养基中存在的糊精部分糖化并在发酵中使用得到的含糖液体培养基,所述部分占糊精(或起始淀粉)总重量的例如按重量计10%到90%,特别是按重量计20%到80%。然后可直接在发酵培养基中原位进行进一步糖化。糖化还可直接在发酵罐中(原位)进行,省略了分开的糖化罐。
原位糖化(即部分或全部在发酵罐中进行的糖化)的优点首先是降低了花费,其次,葡萄糖的延迟释放在每批的开始提供较高的葡萄糖浓度而不抑制使用的微生物或改变其代谢。例如对大肠杆菌(E.coli)而言,过高的葡萄糖浓度引起有机酸(醋酸)的形成,而例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在这种情况下进入发酵,尽管通气发酵罐中存在足够的氧气(Crabtree效应)。葡萄糖的延迟释放可通过控制葡糖淀粉酶浓度调节。这样做可能抑制上述效应,并且在开始时能产生更多的物质从而降低提供的补料流引起的稀释。
对糖化罐中的糖化而言,通常将液化的淀粉溶液冷却或加热至糖化酶的最佳温度或略低,例如50℃到70℃,优选60℃到65℃,并随后用葡糖淀粉酶处理。
如果在发酵罐中进行糖化,通常会在加入发酵罐之前将液化的淀粉溶液冷却至发酵温度(即32℃到37℃)。这种情况下,用于糖化的葡糖淀粉酶(或至少一种糖化酶)直接加入发酵液中。步骤a2)中液化淀粉的糖化此时与步骤b)中描述的微生物的糖代谢同时发生。
在加入葡糖淀粉酶之前,有利地将液体培养基的pH调节至使用的葡糖淀粉酶最佳活性范围内的数值,优选3.5和6.0之间,特别优选4.0和5.5之间并非常特别优选4.0和5.0之间。然而,特别是直接在发酵罐中进行糖化时,也可能调节pH至位于上述范围之外的数值,例如6.0到8.0之间。这通常是有利的,或是由于待建立的发酵条件而必需的,例如在制备赖氨酸、泛酸和维生素B2时,尽管标准葡糖淀粉酶的活性在该pH范围内受到限制。
在优选的实施方案中,糖化在特殊的糖化罐中进行。为此,将液化的淀粉溶液加热至酶最佳的温度或略低,并将pH按照上述方法调节至酶最佳的值。
通常向含糊精液体培养基中加入按重量计占使用的淀粉原料总量0.001%到5.0%,优选按重量计0.005%到3.0%,特别优选按重量计0.01%到1.0%数量的葡糖淀粉酶。加入葡糖淀粉酶后,优选将含糊精悬液在糊精糖化产生单糖的固定温度下保持一段时间(例如2到72小时或需要时更长),特别是5到48小时的时间。可使用熟练技术人员公知的方法(例如HPLC、酶测定或葡萄糖检测带)监测糖化过程的进展。糖化在单糖浓度不再显著上升或甚至下降时完成。
在优选的实施方案中,存在步骤a2)中所述至少一种α-淀粉酶和所述至少一种葡糖淀粉酶时,按照如下方式不连续或连续(优选不连续,特别是分步)加入研磨料:液体培养基的粘度不大于20Pas,特别是不大于10Pas并特别优选不大于5Pas。为了有助于控制粘度,证明在高于研磨料中存在淀粉的胶凝温度下加入按重量计为所加入研磨料总量的至少25%,优选按重量计至少35%,特别优选按重量计至少50%是有利的。另外,还可通过分步加入所述至少一种淀粉液化酶(优选α-淀粉酶)和/或所述至少一种糖化酶(优选葡糖淀粉酶)来影响粘度控制。
进行a1)和a2)步骤时,可能产生单糖含量优选按重量计大于30%,特别优选按重量计大于35%,尤其特别优选按重量计大于40%的含糖液体。
可用于液化研磨料中淀粉部分的酶一般为所有的α-淀粉酶(EC3.2.1.1类酶),特别是得自蓟样芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus staerothermophilus)的α-淀粉酶,特别是用于液化得自涉及产生生物乙醇的干磨法的材料的那些酶。适用于液化的α-淀粉酶也可商业购得,例如来自Novozymes的Termamyl120 L,L型或来自Genencor的Spezyme。不同α-淀粉酶的组合也可用于液化。
可用于糖化液化的淀粉溶液中的糊精(即寡糖)的酶一般是所有的葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3类酶),特别是得自曲霉(Aspergilus)的葡糖淀粉酶,特别是用于糖化得自涉及产生生物乙醇的干磨法的材料的那些酶。适用于糖化的葡糖淀粉酶也可商业购得,例如来自Novozymes的Dextrozyme GA或来自Genencor的Optidex。也可使用不同葡糖淀粉酶的组合。
为了稳定使用的酶,适当时应例如使用CaCl2将Ca2+离子浓度调节至酶特异的最佳值。合适的浓度值可由常规实验的技术人员决定。例如如果使用Termamyl作为α-淀粉酶,有利地将液体培养基中Ca2+浓度调节至例如50到100ppm,优选60到80ppm,特别优选约70ppm。
由于全部淀粉原料都用于产生a)的含糖液体培养基(如谷物的整个谷粒),也存在淀粉原料的非淀粉固体成分。这经常引起引入来自谷物的大量肌醇六磷酸,其数量不可忽略。为了避免由此引起的抑制效应,在步骤a2)中在将含糖液体培养基进行发酵步骤b)之前向液体培养基中加入至少一种肌醇六磷酸酶是有利的。
如果肌醇六磷酸酶在各个高温下足够稳定,可在糖化之前、之中或之后加入。
只要在每种情况中反应条件下其活性不超过临界影响,可使用任何肌醇六磷酸酶。使用的肌醇六磷酸酶优选具有>50℃的热稳定性(T50)并特别优选>60℃。
肌醇六磷酸酶的数量通常为1到10000单位/kg淀粉原料,特别是10到2000单位/kg淀粉原料。
为了提高总体糖产量或获得游离的氨基酸,在产生含糖液体培养基时可向反应混合物中额外添加其他酶,例如支链淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶或蛋白酶。加入这些酶可对粘度具有正面影响,即降低粘度(例如通过切割长链葡聚糖和/或(阿拉伯)木聚糖),并引起可代谢的葡糖苷释放和(残余的)淀粉的释放。蛋白酶的使用具有类似的正面影响,其还可能释放作为发酵生长因子作用的氨基酸。
含糖液体培养基可有利地用于发酵产生微生物代谢物,所述产物具有至少3个碳原子或至少两个碳原子和至少一个氮原子。为此,将步骤a)中产生的含糖液体培养基如b)所述进行发酵。发酵时由微生物产生精细化学品,即具有至少3个碳原子和/或至少一个氮原子和至少两个碳原子的化合物。通常,可按照技术人员公知的一般方式进行发酵操作。进料的含糖液体培养基和最初引入并含有微生物的液体培养基的体积比例通常在约1∶10到10∶1的范围内,例如约1∶2或约2∶1,特别是约1∶1。发酵液中的糖含量可具体通过含糖液体培养基的进料率调节。通常,进料率会以发酵液中单糖含量在按重量计≥0%到按重量计约5%范围内的方式调节,然而,发酵也可在发酵液中明显更高的单糖含量下进行,如按重量计约10%到20%。
如果糖化和发酵分开进行,如果合适时可在进行发酵前将在步骤a)中产生的含糖液体培养基灭菌,在该操作中微生物被通过热方法、化学方法或机械方法破坏。为此,液体通常被加热到80℃以上的温度。细胞的破坏或裂解可在发酵前即刻进行。为此,所有的含糖液体培养基被裂解或破坏。这可通过热方法、机械方法或化学方法完成。然而,就本发明方法而言,如本文所述在发酵前进行灭菌步骤证明不是必须的;而证明不进行这类灭菌步骤是有利的。因此,本发明优选的实施方案涉及下述方法:其中步骤a)中产生的液体培养基被直接发酵(即不预先灭菌)或进行至少部分原位完成的糖化。
发酵产生液体培养基,所述培养基除所需的不挥发微生物代谢物外含有基本上在发酵中产生的生物量、糖化淀粉溶液的不可代谢组分,尤其是淀粉来源的非淀粉固体组分(例如纤维和不可利用的糖以及不可利用的缓冲盐和营养盐)。该液体培养基也作为发酵液在本申请中提及,术语发酵液还包括(含糖)液体培养基,所述培养基中存在的糖最初发生了部分或不完全的发酵转化,即单糖的部分或不完全的微生物代谢。
下文中,术语精细化学品包括特别是有机单、双和三羧酸,其优选具有3到10个碳原子并适当时具有一个或多个(如1、2、3或4个)羟基基团连结其上,如酒石酸、亚甲基丁二酸、丁二酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、2,5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、戊二酸、乙酰丙酸、乳酸、丙酸、葡糖酸、丙烯三羧酸和二氨基庚二酸、柠檬酸;成蛋白质和非成蛋白质氨基酸,如赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、门冬氨酸和苏氨酸;嘌呤和嘧啶碱基;核苷和核苷酸,如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺苷-5,-一磷酸(AMP);脂质;具有优选10到22个碳原子的饱和和不饱和脂肪酸,如γ-亚麻酸、二高(dihomo)-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸;具有优选3到8个碳原子的二醇,如丙二醇和丁二醇;具有3个或更多(如3、4、5或6个)OH基团的较高功能性醇,如丙三醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇;具有至少4个碳原子(如4到22个碳原子)的长链醇,如丁醇;碳水化合物如玻璃酸酶和海藻糖;芳香族化合物,如芳香胺、香草醛和靛蓝;维生素和维生素原,例如抗坏血酸、维生素B6、维生素B12和核黄素、辅因子和公知的营养品;蛋白质如酶,例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶和gluconases;类胡萝卜素类,如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素和斑蝥黄;具有优选3到10个碳原子和适当时1个或多个羟基基团的酮,例如丙酮和3-羟基丁酮;内酯,如γ-丁内酯、环糊精、生物多聚体(如多羟醛、多元酯、多糖、聚类异戊二烯、聚酰胺)、多羟基链烷酸酯(如聚-3-羟基丁酸)以及与其他如3-羟基缬氨酸、4-羟基丁酸和其他由Steinbiichel编《Biopolymers》第一版,2003,Wiley-VCH,Weinheim和其中引文描述的有机羟基羧酸的共多元酯;以及上述化合物的前体和衍生物。其他适合作为精细化学品的化合物由Gutcho在《Chemicals by Fermentation》,Noyes Data Corporation(1973),ISBN:0818805086描述。
术语“辅因子”包括正常酶活性发生必需的非蛋白质化合物。这些化合物可以是有机或无机的;优选本发明的辅因子分子为有机的。这类分子的实例为NAD和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP);这些辅因子的前体为烟酸。
术语“营养制品”包括促进植物和动物特别是人的健康的食品添加剂。这类分子的实例为维生素、抗氧化剂和某些脂质,如多不饱和脂肪酸。
具体而言,产生的代谢物选自酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个碳原子的脂肪族单羧酸或双羧酸、具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个碳原子的酮、具有4到10个碳原子的链烷醇、具有3到8个碳原子的链烷二醇和多羟基链烷酸酯。
本领域技术人员明白通过本发明发酵途径产生的化合物在每种情况下均以由使用的微生物产生的对映体形式获得(如果存在不同的对映体)。例如对氨基酸而言,通常获得各自的L对映体。
本发明的方法优选用于产生不挥发的微生物代谢物。就本发明而言,不挥发代谢物应理解为通常不经分解不能通过蒸馏从发酵液中去除的化合物。通常这些化合物在大气压下具有高于水沸点的沸点,通常高于150℃,特别是高于200℃。通常它们是在标准条件下(298K,101·3kPa)为固相的化合物。
然而,也可能使用本发明方法产生非挥发性的微生物代谢产物,所述产物在标准条件下具有低于水沸点的熔点和/或油的稠度。在这种情款下,通常在制备(特别是干燥)时控制最高温度。这些化合物还可以下述方式产生:以基本上固体形式(假固体形式)形成在吸附剂上。在这类情况下,根据步骤c),通常应在消耗或分离目的产物之前去除发酵液的固体成分。
适用于上述目的的吸附剂为例如活性木炭、氧化铝、硅胶、硅酸、粘土、煤烟、沸石、无机碱金属和碱土金属盐(如钠、钾、镁和钙的氢氧化物、碳酸盐、硅酸盐硫酸盐和磷酸盐,特别是镁盐和钙盐,例如Mg(OH)2,MgCO3、MgSiO4、CaSO4、CaCO3)、碱土金属氧化物(如MgO和CaO)、其他无机磷酸盐和硫酸盐(如ZnSO4)、无机酸盐(特别是其碱金属和碱土金属盐,特别是其钠盐和钾盐,例如醋酸钠、甲酸钠、甲酸氢钠、柠檬酸钠、醋酸钾、甲酸钾、甲酸氢钾和柠檬酸钾)和高分子量有机载体如碳水化合物(如糖,任选的变性淀粉、纤维素、木质素)和一般的下文所述与产物形成有关的载体材料。通常上述载体材料应含有非常少量的卤素(如氯离子和硝酸盐),特别是只有痕量或完全不含。
在标准条件下具有低于水沸点的熔点和/或油的稠度并有利地通过本发明方法产生的化合物的实例为γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,以及丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇和丙酮。就本发明而言,这些假固体形式的化合物同样被认为是固体形式的不挥发微生物代谢物。
如下文所详细说明,发酵中使用的微生物以本身已知的方式取决于所需精细化学品基础上。它们可以是天然来源或遗传修饰的。合适的微生物和发酵方法实例为下文表A中给出的那些。
表A:
物质 | 微生物 | 参考文献 |
酒石酸 | 乳酸杆菌(Lactobacilli),(如德式乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)) | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
衣康酸 | 土曲霉(Aspergillusterreus),Aspergillusitaconicus | Jakubowska,在Smith和Pateman编,《Genetics andPhysiology of Aspergillus 》中,London:Academic Press 1977;Miall,在Rose编,《EconomicMicrobiology》,卷2,47-119页, |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
London:Academic Press 1978;US3044941(1962). | ||
琥珀酸 | 放线杆菌属(Actinobacillus sp.)130Z,产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniproducens),丁二酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes),大肠杆菌 | Int.J.Syst.Bacteriol.26,498-504(1976);EP 249773(1987),发明者:Lemme和Datta;US5504004(1996),发明者:Guettler,Jain和Soni;Arch.Microbiol.167,332-342(1997);Guettler MV,Rumler D,JainMK.,《Actinobacillus succinogenessp.nov.,a novelsuccinic-acid-producing strain fromthe bovine rumen》.Int J SystBacteriol.1999 Jan;49 Pt 1:207-16;US5723322,US5573931,US5521075,WO99/06532,US5869301,US5770435 |
羟基丙酸 | 德式乳酸杆菌,L.leichmannii或Sporolactobacillus inulinus | RMPP在线2.2版 |
丙酸 | 丙酸菌(Propionibacterium)例如P.arabinosum. | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes Data |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
P.schermanii,P.freudenreichii,丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum), | Corporation(1973), | |
二氨基庚二酸 | 谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
柠檬酸 | 黑曲霉(Aspergillusniger)、温特曲霉(Aspergilluswentii) | Crit.Rev.Biotechnol.3,331-373(1986);Food Biotechnol.7,221-234(1993);10,13-27(1996). |
丙烯三羧酸 | 黑曲霉、温特曲霉 | Crit.Rev.Biotechnol.3,331-373(1986);Food Biotechnol.7,221-234(1993);10,13-27(1996).;Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995; |
2-羟基丁二酸 | 曲霉如黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲 | US3063910 |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
霉、米曲霉(A.oryzae)、棒杆菌属(Corynebacterium) | ||
葡糖酸 | 曲霉如黑曲霉 | Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
丁酸 | 梭状芽胞杆菌(Clostridium)(例如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutlicum,C.butyricum)) | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995; |
乳酸 | Lactobacillus for exampleL.delbrückii,L.leichmannii, | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995; |
赖氨酸 | 谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) | Ikeda,M.:《Amino AcidProduction Process》(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
谷氨酸 | 谷氨酸棒杆菌 | Ikeda,M.:《Amino AcidProduction Process》(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. |
甲硫氨酸 | 谷氨酸棒杆菌 | Ikeda,M.:《Amino AcidProduction Process》(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. |
苯丙氨酸 | 谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌 | Trends Biotechnol.3,64-68(1985);J.Ferment.Bioeng.70,253-260(1990). |
苏氨酸 | 大肠杆菌 | Ikeda,M.:《Amino AcidProduction Process》(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. |
门冬氨酸 | 大肠杆菌 | Ikeda,M.:《Amino AcidProduction Process》(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35及其中所用引文,Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973) |
嘌呤和嘧啶碱基 | 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
物质 | 微生物 | 参考文献 | |
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) | 枯草芽孢杆菌 | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), | |
腺苷-5’-一磷酸(AMP) | 枯草芽孢杆菌 | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), | |
γ-亚麻酸 | 毛霉(Mucor)、Mortiella、曲霉属(Aspergillusspp.) | Gill,I.,Rao,V.:《Polyunsaturated fatty acids》,第一部分:occurence,biologicalactivities and applications(1997).Trends in Biotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:《Utilization ofRice Brain by Pythium irregulare forLipid Production》.Master ThesisLousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). | |
二高-γ-亚麻酸 | Mortiella,Conidiobolus,水霉属(Saprolegniaspp.) | Gill,I.,Rao,V.:《Polyunsaturated fatty acids》,第一部分:occurence,biologicalactivities and applications(1997).Trends in Biotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:《Utilization of |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
Rice Brain by Pythium irregulare forLipid Production》.Master ThesisLousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). | ||
花生四烯酸 | Mortiella,腐霉属(Phytiumspp.) | Gill,I.,Rao,V.:《Polyunsaturated fatty acids》,第一部分:occurence,biologicalactivities and applications(1997).Trends in Biotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:《Utilization ofRice Brain by Pythium irregulare forLipid Production》.Master ThesisLousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). |
二十碳五烯酸 | Mortiella,腐霉属、Rhodopseudomonas,Shewanellaspp. | Gill,I.,Rao,V.:《Polyunsaturated fatty acids》,第一部分:occurence,biologicalactivities and applications(1997).Trends in Biotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:《Utilization ofRice Brain by Pythium irregulare forLipid Production》.Master ThesisLousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
二十二碳六烯酸 | 破囊壶菌(Thraustochytrium)、Entomophthoraspp.,Rhodopseudomonas,Shewanellaspp. | Gill,I.,Rao,V.:《Polyunsaturated fatty acids》,第一部分:occurence,biologicalactivities and applications(1997).Trends in Biotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:《Utilization ofRice Brain by Pythium irregulare forLipid Production》.Master ThesisLousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). |
丙二醇 | 大肠杆菌 | DE3924423,US440379,WO9635799,US5164309 |
丁二醇 | Enterobacter aerogenes、枯草芽孢杆菌、催产克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973),H.G.SCHLEGEL and H.W.JANNASCH,1981;Afschar等:MikrobielleProduktion von 2,3-Butandiol,CIT64(6),2004,570-571 |
丁醇 | 梭状芽胞杆菌(Clostridium)(例如丙酮丁 | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noves Data |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
醇梭菌,C.propionicum) | Corporation(1973), | |
丙三醇 | 酵母(Yeast)、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii) | Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
甘露醇 | 亮白曲霉(Aspergilluscandidus)、,Torulopsismannitofaciens | Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
阿拉伯糖醇 | 鲁氏酵母、S.mellis、Sclerotiumglucanicum、奥默毕赤酵母(Pichiaohmeri) | Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
木糖醇 | 酿酒酵母 | Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
玻璃酸酶 | 链球菌属(Streptococcu | Reh m,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995; |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
sspp.) | ||
海藻糖 | 短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌、属、Microbacterium,节杆菌(Arthrobacterspp.)、Pleurotusgenus,Filobasidiumfloriforme | JP05099974,JP06311891,FR2671099,EP0555540,JP3053791,Miyazaki,J.-I.,Miyagawa,K.-I.,Sugiyama,Y.:TrehaloseAccumulation by BasidiomycotinousYeast,Filobasidium floriforme.Journal of Fermentation andBioengineering 81,(1996)4,315-319. |
抗坏血酸 | Gluconobactermelanogenes | ROMPP在线2.2版 |
维生素B12 | 丙酸菌属、脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans) | Chem.Ber.1994,923-927;RMPP在线2.2版 |
核黄素 | 枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii) | WO01/011052,DE19840709,WO98/29539,EP1186664;Fujioka,K.:New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of thisriboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48. |
维生素B6 | 热带根瘤 | EP0765939 |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
菌(Rhizobiumtropici)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti) | ||
酶 | 曲霉(如黑曲霉、米曲霉)、木霉属(Trichoderma)、大肠杆菌、Hanseluna或毕赤酵母属(Pichia)(如Pichiapastorius),芽孢杆菌(Bacillus)(如蓟样芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌)和许多其他的 | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
玉米黄素 | Dunaliellasalina | Jin等(2003)Biotech.Bioeng.81:115-124 |
斑蝥黄 | 短杆菌(Brevibacterium) | Nelis等(1991)J Appl Bacteriol70:181-191 |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
番茄红素 | 三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、Candida utilis | WO03/056028,EP01/201762,WO01/12832,WO00/77234,Miura等(1998)Appl EnvironMicrobiol 64:1226-1229 |
β-胡萝卜素 | 三孢布拉霉、Candidautilis | Kim S.,Seo W.,Park Y.,Enhanced production ofbeta-carotene from Blakesleatrispora with Span 20,BiotechnologyLetters,卷19,No 6,1997,561-562;Mantouridou F.,Roukas T.:Effect ofthe aeration rate and agitation speedon beta-carotene production andmorphology of Blakeslea trispora in astirred tank reactor:mathematicalmodelling,Biochemical EngineeringJournal 10(2002),123-135;WO93/20183;WO98/03480,Miura等(1998)Appl Environ Microbiol64:1226-1229 |
虾青素 | PhaffiaRhodozyma;Candida utilis | US00/5599711;US90/00558;WO91/02060,Miura等(1998)Appl EnvironMicrobiol 64:1226-1229 |
多羟基链烷酸酯,多元酯 | 大肠杆菌,肥大产碱杆菌(Alcaligenes | S.Y.Lee,Plastic Bacteria?Progress and Prospects forpolvhvdroxvalkanoate production in |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
latus)和许多其他的 | bacteria,Tibtech,卷14,(1996),431-438页,Steinbüchel,2003;Steinbüchel编,《Biopolymers》,第一版,2003,Wiley-VCH,Weinheim及其中所用引文 | |
多糖 | Leuconostocmesenteroides,L.dextranicum,Xanthomonascampestris,和许多其他的 | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
聚类异戊二烯 | Lactariussp.,Hygrophorussp.,Russula sp. | Steinbüchel编,《Biopolymers》,第一版,2003,Wiley-VCH,Weinheim及其所列引文 |
丙酮 | 梭状芽胞杆菌(例如丙酮丁醇梭菌,C.propionicum) | Rehm,H.-J.:《Biotechnology》,Weinheim,VCH,1980和1993-1995;Gutcho,《Chemicals byFermentation》,Noyes DataCorporation(1973), |
3-羟基丁酮 | Enterobacter aerogenes,Clostridiumacetobutvlicum. | Lengeler,J.W.,Drews,G.,Schlegel,H.G.:编《Biology of theProcaryotes》,Thieme,Stuttgart(1999),307页;RMPP在线版 |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) | ||
香草醛 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、,Amycolatopsissp. | Priefert,H.,Rabenhorst,J.,Seinbüchel,A.Biotechnologicalproduction of vanillin.Appl.Microbiol.Biotechnol.56,296-314(2001) |
Thurigensin | 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis) | Jian-Zhong Jong等:Fed-batchculture of Bacillus thuringiensis forthuringensin production in a towertype bioreactor.Biotechnology andBioengineering 48(3)(2004),207-213. |
多聚乙酰 | 弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)、Sorangiumcellulosum | Kirst:Fermentation-derivedcompounds as a source for newproducts.Pure&Appl.Chem.70(2),(1998),335-338;Zirkle等:Heterologous production of theantifungal polyketide antibioticsoraphen A of Sorangium cellulosumSo ce26 in Streptomyces lividans.Microbiology 150(8),(2004),2761-74. |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
赤霉酸 | Gibberellafujikuroi | Hollmann等:Extraktiv-Fermentation vonGibberellinsure mit Gibberellafujikuroi.CIT 7(1995),892-895. |
靛蓝 | 大肠杆菌JB 102 | Berry,A.,Dodge,T.C.,Pepsin,M.,Weyler,W.:Application ofmetabolic engineering to improveboth the production and use ofbiotech indigo.Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology 28(2002),127-133. |
本发明方法优选的实施方案涉及产生酶(如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶),氨基酸(例如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸),维生素(例如泛酸和核黄素),它们的前体和衍生物;以及产生上述单、双或三羧酸,特别是具有3到10个碳原子的脂肪族单和双羧酸(例如丙酸和琥珀酸),具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸(例如乳酸);产生上述长链链烷醇,特别是具有4到10个碳原子的链烷醇(如丁醇);产生上述二醇;特别是具有3到8个碳原子的链烷二醇如丙二醇;产生上述酮,特别是具有3到10个碳原子的酮(如丙酮);产生上述碳水化合物,特别是二糖(如海藻糖);以及产生多羟基链烷酸酯。
因此在优选的实施方案中,发酵中使用的微生物选自能够产生至少一种下述代谢物的天然或重组的微生物:酶(如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶),氨基酸(例如赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸),维生素(例如泛酸和核黄素),它们的前体和衍生物;二糖(如海藻糖);特别是具有3到10个碳原子的脂肪族单和双羧酸(例如丙酸和琥珀酸),具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸(例如乳酸);具有3到10个碳原子的酮(如丙酮);具有4到10个碳原子的链烷醇(如丁醇);具有3到8个碳原子的链烷二醇如丙二醇;以及多羟基链烷酸酯。
具体而言,微生物选自棒杆菌属、芽孢杆菌属、阿舒囊霉、埃希氏菌(Escherichia)、曲霉、产碱菌属(Alcaligenes)、放线杆菌、厌氧螺菌、乳酸杆菌属、丙酸菌和梭状芽孢杆菌,特别是选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉、大肠杆菌、黑曲霉或肥大产碱杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、丁二酸放线杆菌、德式乳酸杆菌、莱氏乳杆菌(Lactobacillusleichmanni)、阿拉伯糖丙酸杆菌(Propionibacterium arabinosum)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium schermanii)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、丙酸梭菌和丙酮丁醇梭菌菌株。
在特别优选的实施方案中,发酵中由微生物产生的代谢物为赖氨酸。为了进行发酵,可使用如Pfefferle等上述引文和US3,708,395中用于其他碳原料的类似条件和操作。原则上连续的和不连续的(分批或补料分批)操作模式是合适的,优选补料分批的模式。
在另一特别优选的实施方案中,发酵中由微生物产生的代谢物为甲硫氨酸。为了进行发酵,可使用如WO03/087386和WO03/100072中所述的用于其他碳原料的类似条件和操作。
在另一特别优选的实施方案中,发酵中由微生物产生的代谢物为泛酸。为了进行发酵,可使用如WO01/021772的用于其他碳原料的类似条件和操作。
在另一特别优选的实施方案中,发酵中由微生物产生的代谢物显示为多羟基链烷酸酯(例如聚-3-羟基丁酸)和与其他有机羟基羧酸(如3-羟基戊酸、4-羟基丁酸和其他在上文Steinbüchel中描述的,包括例如长链羟基羧酸如3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十四烷酸及其混合物)的共多元酯的形式。为了进行发酵,可使用如S.Y.Lee,Plastic Bacteria Progress andprospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria,Tibtech,卷14,(1996),431-438页中所述的用于其他碳原料的类似的条件和操作。
在另一特别优选的实施方案中,发酵中由微生物产生的代谢物为核黄素。为了进行发酵,可使用如WO01/011052、DE 19840709、WO98/29539、EP 1186664和Fujioka,K:New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48所述的用于其他碳原料的类似条件和操作。
在另一特别优选的实施方案中,发酵中由微生物产生的代谢物为肌醇六磷酸酶。为了进行发酵,本文也可使用如WO98/55599所述用于其他碳原料的类似条件和操作。
如果合适,在进一步加工发酵液之前(即在步骤c之前)如上述方式进行灭菌步骤。
通常按照如下方式完成根据步骤c)从发酵液中分离或排出代谢物:至少一种代谢物从发酵液中排出或分离从而剩余发酵液中该代谢物的含量按重量计不多于20%,特别是按重量计不多于10%,优选按重量计不多于5%,非常优选按重量计不多于2.5%,各情况均基于剩余发酵液总重量。
根据步骤c)从发酵液中分离或排出精细化学品(即微生物代谢物)可一步或多步进行。本文中一个必要的步骤是从发酵液中去除固体成分。这可在分离有价值产物之前或之后进行。本领域常规使用的用于分离有价值产物和用于分离固体(即固液相分离)的方法(其还包括用于粗提和精制有价值产物和用于配制的步骤)是公知的(例如Belter,P.A,《Bioseparations:Downstream Processing for Biotechnology》,JohnWiley&Sons(1988)和《Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry》第五版on CD-ROM,Wiley-VCH中所描述)。
为了分离有价值的产物,随后可有利地进行下述操作:其中首先从发酵液中去除固体成分(例如通过离心或过滤方法),然后从液相中分离有价值产物(如通过结晶、沉淀、吸附或蒸馏)。另外,还可直接从发酵液中分离有价值的产物,例如通过使用层析法或抽提法。必须特别提到的层析法为离子交换层析,有价值的产物可在层析柱上选择性地分离。在这种情况下,有利地通过例如滗析、蒸发和/或干燥从发酵液中去除残留的固体。
常规的过滤方法实例为滤饼过滤和深度过滤(如A.Rushton,A.S.Ward,R.G.Holdich:《Solid-Liquid Filtration and SeparationTechnology》,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim 1996,pp.177 ff.,K.J.Ives,in A.Rushton编:《Mathematical Models and Design Methodsin Solid-Liquid Separation》,NATO ASI series E No.88,Martinus Nijhoff,Dordrecht 1985,pp.90 ff.所述)和交叉流过滤,特别是用于去除>0.1μm固体的微量过滤法(如J.Altmann,S.Ripperger,J.Membrane Sci.124(1997)119-128所述)。
常规的离心方法描述于例如D.B.Purchas,《Solid-LiquidSeparation》,Upland Press,Croydon 1977,493-559页的G.Hultsch,H.Wilkesmann,″Filtering Centrifuges,″和H.Trawinski,Die quivalenteKlrflche von Zentrifugen[The equivalent clarifying area of centrifuges],Chem.Ztg.83(1959)606-612。可使用多种设计如管式离心机,篮式离心机,特别是推杆(pusher)离心机、滤纸条(slip-filter)离心机和盘式分离器。
常规的抽提方法包括分批或分步骤方法和直流或逆流的不同的连续方法。在本文上下文中,方法可涉及两个或更多流动相。有价值产物和待去除的次级组分在两相内的溶解性可特别受到溶剂选择、平衡离子的变化和改变pH的影响(Treybal,R.E.,《Mass Transfer Operations》,第三版,New York,McGraw-Hill,1979;Kula,M.,Kroner,K.H.,Hustedt,H.和Schutee,H.,Technical aspects of extractive enzyme purification,Ann.N.Y.Acad.Sci.,341(1981);Robinson,R.G.和Cha,D.Y.,Controlled pHextraction in the separation of weak acids and bases,Biotech.Progress,1(1),18(1985))。
常规吸附方法描述于例如D.M.Ruthven:《Principles of Adsorptionand Adsorption Processes》,J.Wiley&Sons,New York 1984;G.Wedler:《Adsorption》,Verlag Chemie,Weinheim 1970.可以使用固体床、移动床和流动床吸附器。可分批或连续进行吸附(K.Hauffe,S.R.Morrison:De Gruyter Studienbuch″Adsorption,″De Gruyter,Berlin 1974.;W.Kast:Adsorptionstechnik[Adsorption techniques],VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim 1988)。除了许多其他的吸附剂外,可使用活性炭、离子交换树脂、天然或合成沸石和活性氧化铝。另外,也可使用亲和吸附法(如Arnold,F.H.,Blanch,H.W.和Wilke,C.R.,Analysis ofAffinity separations.Chem.Engr.J.,30,B9(1985)所述)。
可特别用于纯化精细化学品的方法为例如层析、沉淀、超滤、微量过滤、纳膜过滤、逆向渗透、电泳、电透析和等电聚焦。
可分批或连续进行层析法。连续层析包括例如连续旋转环层析(CRAC)(如A.J.P.Martin,Diseuss.Farraday Soc.7(1949)所述)、真移动床层析(TMBC)(如K.Takeuchi,T.Miyauchi,Y.Uraguchi,J.Chem.Eng.Japan 11(1978)216-220所述)和模拟移动床层析(SMB)(如D.B.Broughton,Universal Oil Products Co.,US2,985,589,1961所述)。使用的固相为例如活性氧化铝、硅胶、浸透乙二醇的硅藻土、葡聚糖、多聚磺化苯乙烯、聚丙烯酰胺和多聚体凝结蛋白质(Arnold,F.H.,Blanch,H.W.和Wilke,C.R.,Analysis of Affinity separations.Chem.Engr.J.,30,B9(1985);Gibbs,S.J.和Lightfoot,E.N.,Scaling up gradient elutionchromatography,IEC Fund.,25,490(1986);King,C.J.,SeparationProcesses,第二版,New York,McGraw-Hill(1979);Yau,W.W.,Kirlland,J.J.和Bly,D.D.,Modern Size-Exclusion LiquidChromatography,Wiley,New York(1979))。
沉淀可涉及有价值产物或次级组分的沉淀(J.W.Mullin:Crystallization,第三版,Butterworth-Heinemann,Oxford 1993)。可通过例如添加更多溶剂、添加盐和改变温度来引起沉淀。产生的沉淀可通过上述用于分离固体的常规方法从液体中分离。
可用于微量过滤、超滤、纳米过滤和逆向渗透的材料实例为微孔膜(E.S.Perry编辑:《Progress in Separation and Purification》,第一卷,Interscience Publ.,New York 1968中A.S.Michaels:″Ultrafiltration,″)、均质膜(J.Crank,G.S.Park编辑:《Diffusion in Polymers》,AcademicPress,New York 1968;P.Meares编辑:《Membrane SeparationProcesses》,Elsevier,Amsterdam 1976中S.A.Stern:″The Separation ofGases by Selective Permeation,″)、非对称膜(R.E.Kesting:《SyntheticPolymeric Membranes,A Structural Perspective》,Wiley-Interscience,New York 1985)和带电膜(F.Helfferich:《Ion-Exchange》,McGraw-Hill,London 1962),所有这些均通过不同方法产生(R.Zsigmondy,US1 421 341,1922;D.B.Pall,US4 340 479,1982;S.Loeb,S.Sourirajan,US3 133 132,1964)。通常的材料为纤维素酯、尼龙、聚氯乙稀、丙烯腈、聚丙烯、聚碳酸和陶器。这些膜用作板构件(R.F.Madsen,Hyperfiltrationand Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems,Elsevier,Amsterdam1977)、螺旋构件(US3 417 870,1968(D.T.Bray))、管束或中空纤维构件(H.Strathmann:″Synthetic Membranes and their Preparation,″inM.C.Porter(ed.):Handbook of Industrial Membrane Technology,NoyesPublication,Park Ridge,NJ 1990,pp.1-60)。另外,可能使用液膜(N.N.Li:″Permeation Through Liquid Surfactant Membranes,″AIChE J.17(1971)459;S.G.Kimura,S.L.Matson,W.J.Ward III:″IndustrialApplications of Facilitated Transport,″in N.N.Li(ed.):RecentDevelopments in Separation Science,卷V,CRC Press,Boca Raton,Florida,1979,pp.11-25)。目的有价值产物不仅可在加料侧富集并通过渗余物流(retentate stream)取出,也可以在加料侧耗尽并通过过滤/渗透流取出。
电泳法描述于例如《Separation Recovery and Purification inBiotechnology》,J.Asenjo and J.Hong编辑,ACS Symposium Series,314,122(1986)中Rudge,S.R.,Ladisch,M.R.,Process considerations forscale-up of liquid chromatography and electrophoresis。使用大量的变化形式,如粒状凝胶层中的等电聚焦、使用再循环的连续等电聚焦、“Rotofor”小室、使用再循环的自由流动聚焦和使用等电膜的多室电解。使用的基质材料为(特别是)乙酸纤维素、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
常规的结晶方法描述于例如Janeic,S.J.,Grootscholten,P.A.,《Industrial Crystallization》,New York,Academic,1984;A.W.Bamforth:《Industrial Crystallization》,Leonard Hill,London 1965;G.Matz:《Kristallisation》,第二版,Springer Verlag,Berlin 1969;J.N
vlt:《Industrial Crystallization-State of the Art.》VCH Verlagsges.,Weinheim 1982;S.J.Janci
,P.A.M.Grootscholten:《IndustrialCrystallization》,Reidel,Dordecht 1984;O.Shnel,J.Garside:《Precipitation》,Butterworth-Heinemann,Oxford,1992;A.S.Myerson编辑:《Handbook of Industrial Crystallization》,Butterworth-Heineman,Boston 1993;J.W.Mullin:《Crystallization》,第三版,Butterworth-Heinemann,Oxford 1993;A.Mersmann编辑:《Crystallization Technology Handbook》,Marcel Dekker,NeW York1995。可通过例如冷却、蒸发、真空结晶(绝热冷却)、反应结晶和盐析完成结晶。结晶可在例如搅动或不搅动槽中、直接接触操作中、蒸发结晶器中(R.K.Multer,Chem Eng.(N.Y.)89(1982)March,87-89)、真空结晶器中分批或连续地,例如在强制循环结晶器(Swenson强制循环结晶器)或流化床结晶器(Oslo型)中进行(A.D.Randolph,M.A.Larson:《Theoryof Particulate Processes》,第二版,Academic Press,New York 1988;J.Robinson,J.E.Roberts,Can.J.Chem.Eng.35(1957)105-112;J.N
vlt:《(Design of Crystallizers》,CRC Press,Boca Raton,1992)。也可能分步结晶(L.Gordon,M.L.Salutsky,H.H.Willard:《Precipitation fromHomogeneous Solution》,Wiley-Interscience,NeW York 1959)。类似的,可分离对映异构物和外消旋化合物(J.Jacques,A.Collet,S.H.Willen:《Enantiomers,Racemates and Resolutions》,Wiley,NeW York 1981;R.A.Sheldon:《Chirotechnology》,Marcel Dekker,New York 1993;A.N.Collins,G.N.Sheldrake,J.Crosby编辑《Chirality in Industry》,Wiley,New York 1985)。
常规的干燥方法描述于例如O.Krischer,W.Kast:《Diewissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik[The scientificbases of drying technology]》,第三版,Springer,Berlin-Heidelberg-NewYork 1978;R.B.Keey:《Drying:Principles and Practice》,Pergamon Press,Oxford 1972;K.Krll:《Trockner und Trocknungsverfahren[Dryersand drying methods]》,第二版,Springer,Berlin-Heidelberg-New York1978;Williams-Gardener,A.:《Industrial Drying》,Houston,Guif,1977;K.Krll,W.Kast:《Trocknen und Trockner in der Produktion[Dryingand dryers in production]》,Springer,Berlin-Heidelberg-New York 1989。干燥方法的实例包括用于如在干燥箱、洞道干燥器、带状干燥器、盘式干燥器、喷射干燥器、流化床干燥器、充气和旋转鼓旋转器、喷雾干燥器、气体对流干燥器、旋流干燥器、混和干燥器、研磨干燥器(也用于糊剂)、环状干燥器、管道干燥器、旋转干燥器、圆盘干燥器中对流干燥的方法。其他方法通过接触(如桨式干燥器、真空或冷冻干燥箱、圆锥体干燥器、抽吸干燥器、盘式干燥器、通过接触作用的胶片干燥器、转鼓式干燥器、粘稠相干燥器、平板干燥器、旋转螺管干燥器、双锥干燥器)或热辐射(红外的,如红外旋转干燥器)或电解体能量(微波)进行干燥。大部分情况下,用于热干燥法的干燥设备通过蒸汽、油、燃气或电加热,在一些情况下可在减压情况下进行,取决于它们的设计。
除干燥之外,还可能使用如下文所述用于制备蛋白质组合物的配制方法。如下文所述,这些方法还包括添加配制辅料。
在优选的实施方案中,通过离子交换层析进行从c)的发酵液中分离精细化学品。其中,通常的条件和操作为技术工人公知并描述于例如《Rmpp Lexikon der Chemie[Dictionary of Chemistry]》第十版,1997,Georg Thieme Verlag,Stuttgart;Weis,《Handbuch derIonenchromatographie[Ion Chromatography Manual]》,1991,VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim。一般而言,在洗脱微生物产生的化合物之前,应进行这样的操作,即由微生物产生的化合物选择性地结合在离子交换柱上并用例如水洗涤离子交换柱。
在含有固体的发酵液应用于离子交换层析柱之前,适当时应通过技术人员熟悉的常规方法(如过滤和离心)去除固体。
在特别优选的实施方案中,在含有固体的发酵液应用于离子交换层析柱之前不去除固体。在这种情况下,含有固体的发酵液有利地逆重力流入离子交换柱从而存在的固体不引起离子交换柱的封闭(即堵塞)。
如果由微生物产生的代谢物为基本氨基酸,后者可使用酸性阳离子交换柱通过离子交换层析从发酵液中有利地取出。在这种情况下,基本氨基酸(如赖氨酸)选择性地结合在离子交换柱上。在洗脱之前通过洗涤(特别是用水)纯化是可能的。然后用合适的洗脱液例如氨水(优选用5%体积浓度的氨水)洗脱基本氨基酸。
离子交换层析用于取出或纯化基本氨基酸(如赖氨酸)的用途描述于例如WO01/072689和Lee等,The use of ion exclusion chromatography asapproved to the normal ion exchange chromatography to achieve a moreefficient lysine recovery from fermentation broth,Enzyme and MicrobialTechnology 30(2002),798-303。
残余的发酵残渣可类似于下文所述整理(即处理和/或加工),产生蛋白质副产品。
如果由微生物产生的代谢物为甲硫氨酸,有价值产物有利地通过离心或过滤分离。其中可使用已描述的(如之前的申请DE10359668.2中)用于其他碳原料的类似的条件和操作。发酵结束后,加热产生的发酵液至溶解所有甲硫氨酸。然后通过离心或过滤分离固体。固体分离步骤的澄清流出物优选通过部分或完全蒸发浓缩,在该操作中甲硫氨酸结晶析出。此后干燥甲硫氨酸,适当时在此之前进行前述的额外过滤步骤。
通过离心或过滤分离的固体基本上包含发酵时产生的生物量和糖化淀粉溶液的不可代谢组分(如纤维)。该残余的发酵残渣可类似于下文所述处理或加工,产生含蛋白质次级产物。
如果由微生物产生的代谢物为泛酸,有价值产物类似地有利地通过过滤或离心分离。在本文上下文中,可使用已描述的(如EP1050219和WO01/83799中)用于其他碳原料的类似的条件和操作。另外,可类似于上述甲硫氨酸情况下描述的进行整理。在泛酸的情况下,优选在固体分离之前对所有发酵液额外进行巴氏消毒。固体分离步骤获得的澄清流出物优选部分蒸发,适当时用氯化钙处理并干燥(优选喷雾干燥)。
为了获得泛酸,还可在步骤c)之后进行操作,其中通过滗析、离心、过滤技术或膜技术(微量过滤、超滤、纳米过滤)和/或这些方法的组合将细胞和不溶物或固体、非淀粉组分分离。固体含量低或不含固体的流含有泛酸。该流可被例如进一步浓缩和/或进行干燥或配制步骤。含固体流可如下文所述进行处理以产生蛋白质副产品。
适当时将细胞裂解或破坏。这可在发酵后直接进行。为此,将所有的发酵液进行裂解或破坏步骤,该步骤可以热、机械或化学方法进行。细胞还可在去除固体后裂解。这样做时,只对富含固体的流进行上述裂解步骤。
在优选的实施方案中,泛酸的整理以如下方式进行:在发酵后热破坏细胞并通过滗析、离心、过滤技术或膜技术和/或其组合去除细胞和非淀粉固体组分。固体含量低或不含固体的流含有泛酸。该流可进一步(例如)浓缩。在浓缩步骤之前、期间或之后向固体含量低的液体中加入佐剂(如下文所述)是有利的。这使得可能降低泡沫的形成和/或覆盖物(coating)的形成。然后干燥或直接配制浓缩的流。此外,在干燥或配制步骤之前、之中或之后可加入下文所述的佐剂以降低产物的吸湿性、改善产物的流动性和/或提高贮藏稳定性。在这种情况下,类似于下文所要描述的,优选加工含固体流以产生蛋白质副产品。
用于处理泛酸的另一优选的实施方案提供了在发酵步骤间尽早加入含特殊阳离子的佐剂的可能性。这描述于例如WO02/072857。
而用于通过离心、滗析、超滤和/或透析过滤处理泛酸的另一优选实施方案描述于WO05/028659。
还可能通过电泳或离子交换从发酵液中分离泛酸。然而,这些方法并不优选,因为预计可能出现问题。
分离或取出泛酸后残留的发酵残渣(即特别是被分离出来的固体)可类似于下文描述处理或加工,产生蛋白质次级产物。
如果微生物产生的代谢物是多羟基链烷酸酯形式,有价值产物的分离有利地通过使用溶剂抽提来进行,如US4310684或EP355307所描述。残留的固体可以常规方法去除,例如通过过滤或离心。另外,可类似于甲硫氨酸情况下所描述的进行操作。在多羟基链烷酸酯情况下,优选在分离出固体之前对所有发酵液额外进行巴氏消毒。固体分离步骤获得的澄清流出物优选部分蒸发,适当时用氯化钙处理并干燥(优选喷雾干燥)。多羟基链烷酸酯的进一步纯化以已知方法进行,例如如US4310684或EP355307所述。
残留的发酵残渣(即特别是被分离出来的固体)可类似于下文描述处理或加工,产生蛋白质次级产物。
取出目的产物(如基本氨基酸,如赖氨酸)后残余的发酵液基本上包含发酵时产生的生物量和糖化淀粉溶液的不可代谢组分(如纤维和不可利用的糖和不可利用的缓冲液和营养盐)。这些固体可获得自发酵液,所述发酵液类似于生物醇产生中产生的次级产物(在其上下文中被称为可溶性蒸馏器干燥颗粒(DDGS),并以该名称进入市场)而留下。在本文上下文中,发酵液可基本上完全地或仅从某种程度上从固体中分离。由该方法获得的蛋白质次级产物(本文下文也称为蛋白质组合物)可在进一步处理或加工步骤之前或之后用作食品或饲料添加剂以喂养动物,特别是农业家畜,特别优选牛、猪和家禽,尤其特别优选牛。
产生蛋白质组合物的发酵液整理或加工可通过技术人员公知的方法进行,特别是通过改变干物质含量(例如通过干燥或蒸发)、研磨和配制(例如添加添加剂、成型方法如造粒和挤压)。次级产物的整理和加工还包括与其他食品或饲料添加剂混和,例如以稳定营养成分。
通常,以以下方式制备蛋白质组合物:在取出或分离至少一种步骤c)代谢物之后去除发酵液的至少一些挥发组分。这产生固体或半固体形式的蛋白质组合物。通常,在残留的发酵液中取出的或分离的代谢物含量按重量计不多于20%,特别是按重量计不多于15%,特别是按重量计不多于10%,非常特别是按重量计不多于5%,每种情况均以残余发酵液的总重量为根据。
为了在取出目的产物后获得蛋白质组合物,通常在蒸发步骤中部分蒸发所有残余液(通常为多级操作)然后分离出产生的固体(例如使用滗析器),或从所有发酵液中直接分离固体。为了去除固体,可能使用离心、微量过滤、超滤、纳米过滤、逆向渗透或这些方法的组合(如在多级设备中)。分离出的固体通常具有以重量计10%到80%,优选以重量计15%到60%并特别优选以重量计20%到50%范围内的干物质含量。进一步整理或加工得到的最终蛋白质组合物有利地具有按重量计约90%的干物质含量,从而降低了保存时变质的风险。
还可使用热方法(如蒸发)、机械方法(如使用滤纸、滗析器、离心机)和上述技术人员惯用的各个方法的组合通过浓缩步骤c)后残留的发酵液中的固体组分获得蛋白质组合物。浓缩液体产生固体或半固体(如糊状)残渣,所述残渣还包含少量根据本发明产生的代谢物(以基于残渣总重量通常在按重量计0%到10%范围内,特别是按重量计0%到5%的范围内)和淀粉来源的非挥发性的,通常是固体的非淀粉组分或至少大量的这些物质(通常按重量计至少90%),或淀粉来源的所有固体非淀粉组分,以及发酵产生的生物量。该半固体或固体残渣可类似于步骤c)后残留的浓缩的发酵液进行干燥或配制。
部分获得次级产物时分离出的液相可作为加工水再循环。该液相的再循环部分可有利地全部或部分用在根据步骤a)制备的含糖液体中,或用于产生发酵中使用的缓冲液或营养盐溶液。在步骤a)中混和再循环的加工水时,必须考虑到过高的比例可对发酵产生不良作用(作为某些矿物和离子如钠离子和乳酸根离子供给过多的结果)。因此优选制备用于淀粉液化目的的本发明混悬液时,再循环加工水的数量应限制在按重量计不多于75%,优选按重量计不多于60%并特别优选按重量计不多于50%,每种情况均以用于制备混悬液的所有水为基础。在步骤a2)优选的实施方案中制备混悬液时,加工水的数量有利地位于按重量计5%到60%范围内并优选位于按重量计10%到50%范围内,每种情况均基于以用于制备混悬液的所有水。
没有再循环进入加工的液相部分可在多级蒸发操作中被浓缩产生浆。浆通常具有按重量计20%到90%,优选按重量计30%到80%,特别优选按重量计40%到70%范围内的干物质含量。该浆可与滗析步骤(或任何其他方法)中分离出的固体混和然后干燥。干燥可通过例如转鼓式干燥器、喷雾干燥器或桨式干燥器进行,优选使用转鼓式干燥器。优选以如下方式进行干燥:产生的固体具有按重量计不大于30%,优选按重量计不大于20%,特别优选按重量计不大于10%的残留水分含量。
与固体发酵组分共同存在的干燥的次级产物(即蛋白质组合物)的性质以本身已知的涉及大量参数的方式了解,如颗粒大小、颗粒形状、撒粉的敏感性、吸湿性、稳定性特别是保存稳定性、颜色、气味、流动性、凝结敏感性、静电荷的产生、对光和高温的敏感性、机械稳定性以及通过添加配制辅料(例如载体和包衣材料、粘合剂和其他添加剂)的再分散性。
方便使用的配制辅料包括例如粘合剂、载体、粉末包衣材料/流动改进剂,以及彩色颜料、杀虫剂、分散剂、消泡剂、粘度调节剂、酸、碱液、抗氧化剂、酶稳定剂、酶抑制剂、吸附剂、脂肪、脂肪酸、油或这些的混合物。当使用配制和干燥方法(如喷雾干燥、流化床干燥和冻干法)时,这类配制辅料有利地用作干燥辅料。
粘合剂的实例为碳水化合物,特别是糖类如单糖、双糖、寡糖和多糖(如糊精、海藻糖、葡萄糖、葡萄糖浆、麦芽糖、蔗糖、果糖和乳糖);胶状物质如动物蛋白质(例如明胶、酪素特别是酪蛋白酸钠)、植物蛋白质(如大豆蛋白质、豌豆蛋白质、黄豆蛋白质、羽扇豆、玉米、小麦蛋白质、玉米蛋白质和稻蛋白质)、合成聚合物(如聚乙二醇、聚乙烯醇特别是来自BASF的Kollidon商标)、任选地修饰的生物多聚体(如木质素、甲壳质、壳聚糖、聚交酯)和变性淀粉如辛烯基琥珀酸酐(OSA);树胶如阿拉伯树胶;纤维素衍生物,如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC);粉末如玉米粉、小麦粉、黑麦粉、大麦粉和米粉。
载体材料的实例为碳水化合物(特别是上述作为粘合剂提高的糖)和淀粉(如玉米淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉和木薯淀粉);变性淀粉如辛烯基琥珀酸酐;纤维素和微晶纤维素;无机矿物质或壤土,如粘土、煤、硅藻土、硅酸、云母和高岭土;粗磨粉(如粗磨小麦粉)、麸(如麦麸)、上述作为粘合剂提到的粉末;盐如金属盐,特别是碱金属和碱土金属的有机酸盐(如Mg,Ca,Zn,Na和K的柠檬酸盐、醋酸盐、甲酸盐和甲酸氢盐)、无机盐(如Mg,Ca,Zn,Na和K的硫酸盐、碳酸盐、硅酸盐或磷酸盐);碱土金属氧化物如CaO和MgO;无机缓冲液如碱土金属的磷酸氢盐,特别是钠和钾的磷酸氢盐,例如K2HPO4,KH2PO4和Na2HPO4;以及通常在本发明代谢物产生中提到的具有低熔点或油浓度的吸附剂。
粉末包衣剂或流动佐剂的实例为硅藻土、硅酸(如来自Degussa的Sipernat商标);粘土、煤、动物脂和高岭土;淀粉、变性淀粉、无机盐、有机酸盐和上述作为载体提到的缓冲液;纤维素和微晶纤维素。
就其他添加剂而言,可提到的实例为彩色颜料(如TiO2)、杀虫剂、分散剂、消泡剂、粘度调节剂、无机酸(如磷酸、硝酸、盐酸、硫酸)、有机酸(如饱和或不饱和单或二羟酸,如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、软脂酸、硬脂酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸)、碱液(如碱金属氢氧化物如NaOH和KOH)、抗氧化剂、酶稳定剂、酶抑制剂、吸附物、脂肪、脂肪酸和油。
上述添加剂以及适当时的其他添加剂(如包衣材料)的数量可在广阔范围内变化,取决于所述代谢物的特定要求并取决于所使用的添加剂的性质,例如在按重量计0.1%到80%范围内,特别是在按重量计5%到70%范围内,最特别按重量计10%到60%范围内,每种情况均以完成的配制产物总重量为基础,或每种情况均以完成的配制产物或组合物的总重量为基础。
配制辅料的添加(也称为产物成型或固体涉及)可在加工发酵液之前、之中或之后(特别是在干燥中)进行。在浓缩步骤c)后残余的发酵液之前添加配制辅料对促进待整理的物质或产物的可操作性是特别有利的。配制辅料可添加进(以固体形式获得的)次级产物和含有所述次级产物的溶液或混悬液中,如它们可直接添加进步骤c)后的发酵液中,或在整理中和最后干燥步骤之前加入获得的溶液或混悬液中。
因此,辅料可与例如通过浓缩步骤c)之后剩余的发酵液得到的混悬液混和;这类混悬液也可通过例如混和应用于载体材料。配制辅料的添加具体在干燥后进行,例如对干燥的颗粒涂布包衣或多层包衣时。其他佐剂可在干燥后和已经进行的任何包衣步骤后添加。通过配制方法获得的颗粒可通过使用上述干燥方法干燥至目的残余水分含量。
所有以固体形式获得的次级产物(如颗粒、颗粒体和渗出物)可用包衣包被(即至少再用一层物质)。包衣在例如混和器或流化床上进行,在那里使等待包衣的颗粒流动然后喷上包衣材料。包衣材料可以是干燥形式(如粉末形式)或溶剂(如水、有机溶剂及其混合物,特别是水)中的溶液、分散液、乳浊液或混悬液。如果存在溶剂,其可在喷在颗粒表面时或之后通过蒸发去除。此外,包衣材料如脂肪也可以熔化物的形式应用。
可以以水分散系或混悬液形式喷雾的包衣材料描述于例如WO03/059087。这些材料包括(特别是)聚烯烃(如聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯蜡、蜡、无机和有机盐)、Acronals(如butyl acrolate/methyl acrolate共聚体)、来自BASF的Styrofan商标(如以苯乙烯和丁二烯为基础的那些)和如WO03/059086中所述的疏水物质。当应用这类材料时,包衣材料的固体含量通常在按重量计0.1%到20%范围内,特别是按重量计0.2%到10%范围内,最特别是按重量计0.4%到5%范围内,每种情况均以配制完毕的产物总重量为基础。
可以以溶液形式喷雾的包衣材料为例如聚乙二醇、纤维素衍生物(如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和乙基纤维素)、聚乙烯醇、蛋白质(如明胶)、无机和有机盐、碳水化合物如糖(如葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖和海藻糖)、淀粉和变性淀粉。应用这类材料时,包衣材料的固体含量通常在按重量计0.1%到20%范围内,特别是按重量计0.2%到10%范围内,最特别是按重量计0.4%到5%范围内,每种情况均以配制完毕的产物总重量为基础。
可以以熔化物的形式喷雾的包衣材料描述于例如DE199 29 257和WO92/12645。这些材料包括(特别是)聚乙二醇、合成脂肪和蜡(如来自BASF的Polygen WE)、天然脂肪如动物脂肪(如蜂蜡)和植物脂肪(如小烛树蜡)、脂肪酸(如动物蜡、动物脂肪酸、软脂酸、硬脂酸、甘油三酸酯)、Edenor产品、Vegeole产品、Montan酯蜡(如来自BASF的LuwaxE)。应用这类材料时,包衣材料的固体含量通常在按重量计1%到25%范围内,特别是按重量计2%到25%范围内,最特别是按重量计3%到20%范围内,每种情况均以配制完毕的产物总重量为基础。
干燥和/或配制步骤后,完整的或磨碎的谷物颗粒(优选玉米、小麦、大麦、小米/高粱和/或黑麦)可添加进次级产物或蛋白质组合物。
因此本发明还涉及来自基于糖的微生物发酵的蛋白质组合物,所述发酵根据本发明进行以产生具有至少3个碳原子或具有至少2个碳原子和至少一个N原子的代谢物,所述蛋白质产物可如上所述获得。该蛋白质组合物通常包含蛋白质材料(即来自发酵的生物量)、淀粉来源的非淀粉组分(特别是纤维)和发酵产物(代谢物)。具体而言,蛋白质组合物基本上包含下列干物质组分:
a)按重量计1%到90%,优选按重量计5%到85%,特别优选按重量计10%到75%的来自发酵的生物量;
b)按重量计1%到90%,特别是按重量计5%到85%,更特别是按重量计10%到80%,非常特别是按重量计15%到75%的淀粉来源的非淀粉组分,特别是纤维;
c)按重量计0.01%到10%,特别是按重量计0.1%到5%,特别是按重量计0.2%到5%,非常特别是按重量计0.3%到5%的具有至少3个碳原子或具有至少2个碳原子和至少一个N原子的微生物代谢物;
d)按重量计0%到90%,特别是按重量计5%到80%,更特别是按重量计10%到70%的常规配制辅料;和
e)按重量计0%到40%,特别是按重量计0.5%到30%,更特别是按重量计1%到20%的发酵液的不可代谢的其他组分,特别是糖、淀粉、营养盐和/或缓冲液盐残渣。
其中组分a)到e)总计干物质重量的100%。在本文上下文中,术语“基本上”是指不同于a)到e)的其他组分数量较低。通常该数量按重量计将不超过10%,特别是按重量计5%,每种情况均以蛋白质组合物干物质总量为基础;优选该数量按重量计少于1%,特别是按重量计约0%。
生物量(组分a))包括(特别是)蛋白质组合物中粗蛋白的数量。该数量通常占按重量计至少40%,一般按重量计在40%到90%范围内,特别是按重量计在40%到90%范围内,特别是按重量计在45%到85%范围内,最特别按重量计在50%到80%范围内,每种情况均以蛋白质组合物的总干物质为基础。
本发明的蛋白质组合物通常包含一种或多种必需氨基酸,特别是至少一种选自赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和色氨酸的氨基酸。必需氨基酸(特别是所提到的)通常在每种情况下均以下述数量存在:所述数量与发酵产生生物醇时产生的传统DDGS次级产物相比提高因子至少为1.5倍。如果所述氨基酸存在于蛋白质组合物中,后者通常具有按重量计至少1%(特别是按重量计在1%到5%范围内)的赖氨酸含量,按重量计至少0.8%(特别是按重量计在0.8%到5%范围内)的甲硫氨酸含量,按重量计至少1.5%(特别是按重量计1.5%到5%范围内)的苏氨酸含量和/或按重量计至少0.4%(特别是按重量计0.4%到5%范围内)的色氨酸含量,每种情况均以蛋白质组合物的总干物质为基础。
通常本发明的蛋白质组合物包含少量水,一般按重量计在0%到25%范围内,优选按重量计在0.5%到15%范围内,更优选按重量计在1%到10%范围内,非常优选按重量计1%到5%范围内的水,每种情况均以蛋白质组合物总重量为基础。
本发明还涉及如上所述的方法,其中
(i)从步骤a)获得的含糖液体培养基中去除按重量计不多于50%的部分(其包含淀粉原料的非淀粉固体组分)并用剩余物进行如b)中所述的发酵以产生第一代谢物(A);和
(ii)将所有或一些淀粉原料的非淀粉固体组分从该部分中分离并用该部分进行如b)所述的发酵以产生第二代谢物(B),其与代谢物(A)一致或不同。
在优选的实施方案中,按照如下方式进行(ii)的非淀粉固体组分的去除:含糖液体培养基剩余物的固体含量总计按重量计不大于50%,优选按重量计不大于30%,特别优选按重量计不大于10%,非常特别优选按重量计不大于5%。
该操作使得在(iii)的独立发酵中可能使用其最低要求(如氧气转移率)必需被满足的微生物。用于(iii)独立发酵的合适微生物为例如芽孢杆菌物种,优选枯草芽孢杆菌。这类微生物在独立发酵中产生的化合物选自(特别是)维生素、辅因子和营养制品、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸、脂质、饱和和不饱和脂肪酸、芳香族化合物、蛋白质、类胡萝卜素,优选来自维生素、辅因子和营养制品、蛋白质和类胡萝卜素,特别优选来自核黄素和泛酸钙。
具体而言,该操作允许有利地使用本发明的方法,即使当产生的精细化学品在发酵中以固体形式获得。
该操作的优选的实施方案涉及在两个独立的发酵中类似产生相同的代谢物(A)和(B)。这在相同代谢物的不同应用具有不同纯度要求的情况下特别有利。因此,第一个代谢物(A)如将用作饲料添加剂的氨基酸(如赖氨酸)使用含固体发酵液产生,而相同的第二个代谢物(B)如将用作食品添加剂的相同氨基酸(在本案例中为例如赖氨酸)使用(ii)的不含固体发酵液。由于完全或部分去除非淀粉固体组分,可降低整理代谢物(其应用领域具有更高的纯度要求)时纯化的复杂性。
在该操作的另一优选的实施方案中,微生物在发酵中产生的代谢物B为核黄素。为了进行发酵,可使用已描述用于其他碳原料的如WO01/011052,DE19840709,WO98/29539,EP1186664和Fujioka,K.:New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of thisriboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48中的类似条件和操作。
例如下面的操作可用于实施本方法的变化形式。根据本发明方法步骤
a)到c)使用优选的大体积发酵产生代谢物A如精细化学品(如赖氨酸)。
根据(i),根据(ii)通过常规方法(如离心或过滤)从一些步骤a)获得的含糖
液体培养基中完全或部分去除或分离固体。由此获得的含糖液体培养基
(其基本上完全或部分不含固体)根据(ii)加入发酵以产生代谢物B,如核
黄素。根据(ii)分离的固体流有利地送回大体积发酵的含糖液体培养基流。
根据(ii)产生的含核黄素发酵液可使用已描述用于其他碳原料的如
DE4037441,EP464582,EP438767和DE3819745中的类似条件和操作进
行加工。细胞生物量的以下裂解液(以晶体形式存在的赖氨酸)优选通过
滗析分离。其他分离固体的方法如过滤也是可能的。此后干燥核黄素,优
选通过喷雾干燥器和流化床干燥器。另外,根据(ii)产生的含核黄素发酵
混合物可在类似条件下使用类似方法(如描述干如EP1048668和
EP730034的)加工。巴氏消毒后离心发酵液,然后用矿物酸处理残余的
含固体部分。通过过滤从酸性水培养基中取出形成的核黄素,洗涤,适当
时随后干燥。
已经分离出的固体可在如上所述大体积发酵方法范围内加工,如前述,其平行操作以产生次级产物。
在该操作的另一优选的实施方案中,微生物在发酵中产生的代谢物B为泛酸。为了进行发酵,可使用已描述用于其他碳原料的如WO01/021772中的类似条件和操作。
为了实施该方法的变化形式,可随后进行如上所述用于核黄素的操作。将已经按照(ii)纯化和优选已经基本上不含固体的含糖液体培养基加入根据(ii)的发酵以产生泛酸。此处与含固体液体培养基相比粘度降低的事实特别有利。分离的固体流优选送回大体积发酵的含糖液体培养基流。
根据(ii)产生的含泛酸发酵液可在类似条件下使用类似操作(如在EP1050219和WO01/83799中已描述用于其他碳原料的)加工。巴氏消毒发酵液后通过例如离心或过滤分离残余固体。部分蒸发固体分离步骤中获得的澄清流出液,适当时用氯化钙处理并干燥(特别是喷雾干燥)。
已经分离出的固体可在如上所述大体积发酵方法范围内加工如前述,其平行操作以产生次级产物。
在该操作的另一优选的实施方案中,微生物在发酵中产生的代谢物B为多羟基链烷酸酯。为了进行发酵,可使用已描述用于其他碳原料的如S.Y.Lee,Plastic Bacteria?Progress and prospects forpolyhydroxyalkanoate production in bacteria,Tibtech,第14卷,(1996),431-438页中的类似条件和操作。
为了实施该方法的变化形式,可随后进行如上所述用于核黄素的操作。将已经按照(ii)纯化和优选已经基本上不含固体的含糖液体培养基加入根据(ii)的发酵以产生多羟基链烷酸酯。部分蒸发固体分离步骤中获得的澄清流出液,适当时用氯化钙处理并干燥(特别是喷雾干燥)。
根据(ii)产生的含多羟基链烷酸酯发酵液可在类似条件下使用类似操作(如在US4310684和EP355307中已描述用于其他碳原料的)加工。巴氏消毒发酵液后通过例如离心或过滤分离残余固体。部分蒸发固体分离步骤中获得的澄清流出液,适当时用氯化钙处理并干燥(特别是喷雾干燥)。多羟基链烷酸酯的进一步纯化以本身已知(例如如US4310684或EP355307所述)的方式进行。
已经分离出的固体可在如上所述大体积发酵方法范围内加工如前述,其平行操作以产生次级产物。
下列实施例旨在说明本发明的单个方面,但绝不应理解为限制。
实施例
I、粉碎淀粉原料
下文使用的研磨料如下产生。使用旋转粉碎机完全粉碎完整的玉米颗粒。使用不同的杵、粉碎路径或筛选元件,获得三种不同程度的细度。通过实验室震动筛选(振动分析仪:Retsch Vibrotronic VE1型;筛选时间5分钟,振幅:1.5mm)筛选分析研磨料,给出表1列出的结果。
表1
实验数 | T70/03 | T71/03 | T72/03 |
<2mm/% | 99.4 | 100 | 100 |
<0.8mm/% | 66 | 100 | 99 |
<0.63mm/% | 58.6 | 98.5 | 91 |
<0.315mm/% | 48.8 | 89 | 65 |
<0.1mm/% | 25 | 9.6 | |
<0.04mm/% | 8 | 3.2 | |
总研磨料 | 20kg | 11.45kg | 13.75kg |
II.酶促淀粉液化和淀粉糖化
II.1.糖化步骤中不使用植酸酶
II.1a)酶促淀粉液化
用480g水混悬320g干磨玉米粉(T71/03)并与310mg氯化钙通过连续搅拌混和。在整个实验中持续搅拌。用H2SO4将pH调至6.5并将混合物加热至35℃后,添加2.4g L型Termamyl120(Novozymes A/S)。在40分钟过程内,将反应混合物加热至86.5℃的温度,必需时用NaOH将pH调至上述值。在30分钟内,再加入400g干磨玉米粉(T71/03),在该方法中将温度升至91℃。反应混合物在该温度下持续约100分钟。随后再加入2.4gTermamyl120L并将温度保持约100分钟。实验中使用碘-淀粉反应监控液化进展。温度最终升至100℃并将反应混合物再煮沸20分钟。此时不能再检测到淀粉。将反应器冷却至35℃。
II.1b)糖化
将II.1a)获得的反应混合物加热至61℃并持续搅拌。在整个实验中持续搅拌。用H2SO4将pH调至4.3后,添加10.8g(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。将温度保持约3小时,该时间段中用葡萄糖测试条(Boehringer的S-Glucotest)监控反应进展。结果在下文表2中列出。随后将反应混合物加热至80℃然后冷却。这产生约1180g液体产物,所述产物具有约1.2kg/l的密度和按重量计总计约53.7%(由红外干燥器决定)的干物质含量。用水洗涤后,干物质含量(不含水溶性组分)按重量计约14%。反应混合物的葡萄糖含量总计380g/l(由HPLC决定)(见表2,样品编号7)。
表2
样品编号 | 分钟(从添加葡萄糖淀粉酶起) | 上清液中的葡萄糖浓度[g/l] |
1 | 5 | 135 |
2 | 45 | 303 |
3 | 115 | 331 |
4 | 135 | 334 |
5 | 165 | 340 |
6 | 195 | 359 |
7 | 225 | 380 |
II.2.糖化步骤中使用植酸酶
II.2a)淀粉液化
如II.1a)中所述液化干磨的玉米粉样品。
II.2b)糖化
将II.1a)中获得的反应混合物加热至61℃并持续搅拌。在整个实验中持续搅拌。用H2SO4将pH调至4.3后,添加10.8g(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)和70μl植酸酶(700单位植酸酶,来自BASF AG的Natuphyt Liquid 10000L)。将温度保持约3小时,该时间段中用葡萄糖测试条(Boehringer的S-Glucotest)监控反应进展。随后将反应混合物加热至80℃然后冷却。获得的产物通过红外干燥器干燥并用水洗涤。用HPLC确定反应混合物中的葡萄糖含量。
II.3用于酶促淀粉液化和淀粉糖化的其他方案
II.3a)玉米粉
将360g去离子水倒入反应管中。加入1.54ml CaCl2储存溶液(100gCaCl2×2H2O/l)至醪液终浓度约70ppm Ca2+。将240g玉米粉缓慢加入水中并持续搅拌。使用按重量计50%的NaOH水溶液将pH调至6.5后,加入4.0ml(=酶/干物质按重量计2%)的Termamyl120L型L(NovozymesA/S)。然后将醪液快速加热至85℃。在该方法中,必需持续监控并在适当时调节pH。
到达最终温度后,开始加入更多粉末(开始50g粉末)。此外,向醪液中加入0.13ml CaCl2储存液以保持Ca2+浓度在70ppm。添加中,温度持续保持在85℃。听任维持至少10分钟的时间以保证在添加另一部分(50g粉末和0.13ml CaCl2储存液)之前反应完全。添加两部分后加入1.67mlTermamyl;然后再添加两部分(每种情况50g粉末和0.13ml CaCl2储存液)。达到按重量计55%的干物质含量。添加后将温度升至100℃并将醪液煮沸10分钟。
取出一份样品并冷却至室温。用去离子水稀释样品(约1∶10)后,加入一滴浓缩的Lugol’s溶液(每升5g I和10g KI)。深蓝色指出残留的淀粉含量;当所有淀粉已水解后颜色变为褐色。当测试指出仍残余淀粉时,再次将温度降至85℃并保持不变。加入另外1.67ml Termamyl直至碘/淀粉反应为阴性。
然后将测试对淀粉阴性的混合物降至61℃以进行随后的糖化反应。通过加入50%浓度的硫酸将pH调至4.3。反应过程中将pH维持在该数值。温度保持在61℃。加入5.74ml(=按重量计酶/干物质1.5%)的Dextrozym GA(Novozymes A/S)将液化的淀粉转化为葡萄糖。允许反应进行一小时。将混合物加热至85℃以灭活酶。将热混合物装入无菌容器并在冷却后贮存在4℃。
II.3b)黑麦粉(包括用纤维素/半纤维素预处理)
将360g去离子水引入反应容器中。将155g黑麦粉缓慢加入水中并持续搅拌。温度保持在50℃不变。使用按重量计50%的NaOH水溶液将pH调至5.5后,加入3.21ml(=酶/干物质按重量计2.5%)的Viscozyme L(Novozymes A/S)。30分钟后,开始加入更多粉末;开始加入55g粉末。再过30分钟后,加入另外50g粉末;30分钟后,再加入另外40g粉末。液化可在最后一次添加后30分钟开始。
加入1.7ml CaCl2储存溶液(100g CaCl2×2H2O/l)。使用按重量计50%的NaOH水溶液将pH调至6.5后,加入5.0ml(=酶/干物质按重量计2%)的Termamyl120L型L(Novozymes A/S)。然后将醪液快速加热至85℃。在该方法中,必需持续监控并在适当时调节pH。
到达最终温度后,开始加入更多粉末(开始60g粉末)。此外,向醪液中加入0.13ml CaCl2储存液以保持Ca2+浓度在70ppm。添加中,温度持续保持在85℃。听任维持至少10分钟的时间以保证在添加另一部分(40g粉末和0.1ml CaCl2储存液)之前反应完全。添加两部分后添加1.1mlTermamyl;然后添加更多部分(40g粉末和0.1ml CaCl2储存液)。达到按重量计55%的干物质含量。添加后将温度升至100℃并将醪液煮沸10分钟。
取出一份样品并冷却至室温。用去离子水稀释样品(约1∶10)后,加入一滴浓缩的Lugol’s溶液(每升5g I和10g KI)。深蓝色指出残留的淀粉含量;当所有淀粉已水解后颜色变为褐色。当测试指出仍残余淀粉时,再次将温度降至85℃并保持不变。加入另外1.1ml Termamyl直至碘/淀粉反应为阴性。
然后将测试对淀粉阴性的混合物降至61℃以进行随后的糖化反应。通过加入50%浓度的硫酸将pH调至4.3。反应过程中将pH维持在该数值。温度保持在61℃。加入5.74ml(=按重量计酶/干物质1.5%)的Dextrozym GA(Novozymes A/S)将液化的淀粉转化为葡萄糖。允许反应进行一小时。将混合物加热至85℃以灭活酶。将热混合物装入无菌容器并在冷却后在4℃保藏。
II.3c)小麦粉(包括用木聚糖酶预处理)
将360g去离子水引入反应容器中。将水加热至55℃并使用按重量计50%的NaOH水溶液将pH调至6.0。调节温度和pH后,加入3.21ml(=酶/干物质按重量计2.5%)Shearzyme 500L(Novozymes A/S)。将115g小麦粉缓慢加入水中并持续搅拌。温度和pH保持不变。30分钟后,开始加入更多粉末;最初加入55g粉末。再过30分钟后,加入两外50g粉末;30分钟后,再加入另外40g粉末。液化可在最后一次添加后30分钟开始。
如II.3b所述进行液化和糖化。
III.构建超量生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032 lysCfbr
III.1构建质粒pCIS lysC
在构建菌株的第一步,在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中进行编码天冬氨酸激酶(lysC)的野生型基因的等位基因替代。其中在lysC基因中进行核苷酸替代,从而在产生的蛋白质中,位置311的氨基酸苏氨酸被异亮氨酸取代。以来自ATCC13032的染色体DNA为模板,按照制造商说明借助于Pfu-Turbo PCR系统(Stratagene,USA)进行PCR反应,用下述寡聚核苷酸引物扩增lysC:
5’-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3’(SEQ ID NO:1)
和
5’-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3’(SEQ ID NO:2)
通过Tauch等(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等(1994)Microbiology 140:1817-1828的方法制备来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA。扩增的片段5’侧翼添加SaII限制性切割位点,3’侧翼添加MluI限制性切割位点。克隆之前用这两种限制性内切酶消化扩增的片段并用GFXTMPCR,DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia,Freiburg)将其纯化。
将通过SalI和MluI限制性切割将产生的多核苷酸克隆进pCLIK5MCS integrativ SacB,下文称为pCIS(SEQ ID NO:3)并转化进大肠杆菌XL-1 blue。通过在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂上涂板选择含有质粒的细胞(Lennox,1955,Virology,1:190)。分离质粒并通过测序验证目的核苷酸序列。使用Quiagen的方法和材料制备质粒DNA。测序反应通过Sanger等(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences USA74:5463-5467的方法进行。通过ABI Prism 377(PE Applied Biosystems,Weiterstadt)分离测序反应并进行评估。产生的质粒称为pCIS lysC(SEQID NO:4)。其包含下列重要部分:
位置 | 序列类型 | 说明 |
155-1420 | CDS | lysC |
套(coplement)(3935..5356) | CDS | sacB枯草芽孢杆菌 |
套(5357..5819) | 启动子 | 启动子sacB |
套(3913..3934) | C区 | sacB下游区 |
1974..2765 | CDS | 卡那霉素抗性 |
套(3032..3892) | CDS | 复制起点E.coli质粒pMB |
III.2诱变谷氨酸棒杆菌lysC基因
使用QuickChange Kit(Stratagene,USA)按照制造商说明定向突变谷氨酸棒杆菌lysC基因。诱变在质粒pCIS lysC(SEQ ID NO:4)中进行。合成下列寡聚核苷酸引物用于借助Quickchange方法(Stratagene)用311异亮氨酸取代311苏氨酸:
5’-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3’(SEQ ID NO:5)
5’-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3’(SEQ ID NO:6)
在Quickchange反应中使用这些寡核苷酸引物在lysC基因(SEQ IDNO:7)中引起932位的核苷酸替代(用T替代C)。转化进大肠杆菌XL-1 blue并制备质粒后通过测序反应验证产生的lysC基因中thr311ile的氨基酸替代。质粒命名为pCIS lysC thr311ile(SEQ ID NO:8)。其包含下列重要部分:
位置 | 序列类型 | 说明 |
155-1420 | CDS | LysC(thr311ile) |
套(3935..5356) | CDS | sacB枯草芽孢杆菌 |
套(5357..5819) | 启动子 | 启动子sacB |
套(3913..3934) | C区 | sacB下游区 |
1974..2765 | CDS | 卡纳霉素抗性 |
套(3032..3892) | CDS | 复制起点E.coli质粒pMB |
III.3转化pCIS lysC thr311ile进入谷氨酸棒杆菌(菌株ATCC13032)
通过如Liebl等FEMS Microbiology Letters 53:299-303(1989)所述的电穿孔法将质粒pCIS lysC thr311ile转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC13032。该方案的改良形式描述于DE10046870。通过Sambrook等,《MolecularCloning:A Laboratory Manual》,Cold Spring Harbor(1989)描述的Southern印迹和杂交,使用标准方法验证单个转化体中lysC基因座的染色体排列。从而确认转化体为其中转化的质粒通过同源重组整合在lysC基因座上的转化体。这类菌落在不含抗生素的培养基上培养过夜后,将细胞涂布在蔗糖CM琼脂培养基(10%蔗糖)上并在30℃孵育24小时。
由于载体pCIS lysC thr311ile中存在的sacB基因将蔗糖转化为有毒产物,只有下述菌落能够生长:其中sacB基因通过野生型基因lysC和突变基因lysC thr311ile之间的又一个次同源重组步骤被删除。同源重组时,野生型基因或突变基因均可与sacB基因一起被删除。当sacB基因与野生型基因一起被删除时,产生突变的转化体。
挑出生长的菌落并研究其卡那霉素敏感表型。删除了sacB的克隆必需同时显示卡那霉素敏感的生长行为。在摇瓶中研究这类卡那霉素敏感克隆的赖氨酸生产力。为了比较,培养未处理的谷氨酸棒杆菌ATCC13032。选择具有比对照提高的赖氨酸生产的克隆,获得染色体DNA,按照制造商说明通过PCR反应(Pfu-Turbo PCR Systems;Stratagene,USA)扩增lysC基因的相应区域并测序(通过Sanger等的方法,上述引文)。具有增强的赖氨酸合成特性并证实位置932的lysC突变的克隆称为ATCC13032lysCfbr。
实施例1
a)酶促淀粉液化和淀粉糖化
500g干磨的玉米粉混悬于750ml水并在搅拌器中再次细磨。将混悬液分为4个样品编号1到4,各自用约3g热稳定α-淀粉酶处理(样品编号1和2:Termamyl L;样品编号3和4:Spezyme)。样品编号2和4随后用约7g/l葡糖淀粉酶处理(样品编号2:Dextrozyme GA;样品编号4:Optidex)。这产生淡黄色粘稠样品,各通过离心分离其固体内容物,在该方法中一层疏水固体漂浮在澄清液相上方。
产生样品的(浓缩形式和10倍稀释的)澄清上清液通过HPLC分析,忽略或考虑离心沉下的沉淀物。考虑沉淀物时,假定50%的沉淀物干物质含量。基于起始样品的结果在下文表3中列出。
表3
样品编号 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | |
上清液,10倍稀释,不含沉淀物 | ||||
葡萄糖[g/kg] | 73.0 | 287.3 | 63.7 | 285.1 |
果糖[g/kg] | 3.4 | 2.3 | 5.3 | 2.7 |
低聚糖[g/kg] | 202.1 | 38.2 | 150.8 | 31.5 |
总糖[g/kg] | 278 | 328 | 220 | 319 |
上清液,10倍稀释,含有沉淀物 | ||||
葡萄糖[g/kg] | 178 | 168 | ||
总糖[g/kg] | 172 | 203 | 130 | 188 |
上清液,不稀释,不含沉淀物 | ||||
葡萄糖[g/kg] | 198 | 189 |
b)发酵
使用谷氨酸棒杆菌的摇瓶实验中使用根据实施例II.1获得的两种玉米粉水解产物(瓶4-9)。此外,同时使用类似实施例II.1制备的小麦粉水解产物(瓶1-3)。
1b.1)制备接种物
将细胞在无菌CM琼脂(成分:见表4;121℃20分钟)上划线然后在30℃孵育48小时。随后从板上刮下细胞并重悬在盐水中。用这样数量的细胞悬液各自接种250ml三角瓶中的25ml培养基(见表5)从而使600nm处达到光密度OD600值为1。
表4:CM琼脂的组成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
10.0g/l | Bacto蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
22.0g/l | 琼脂 |
1b.2)制备发酵液
表5列出瓶培养基1到9的组成。
表5:瓶培养基
瓶编号 | |||
1-3 | 4-6 | 7-9 | |
小麦 399.66g/kg** | 250g/l*** | ||
玉米I 283.21g/kg** | 353g/l*** | ||
玉米II 279.15g/kg** | 358g/l*** | ||
(NH4)2SO4 | 50g/l | ||
MgSO4·7H2O | 0.4g/l | ||
KH2PO4 | 0.6g/l |
FeSO4·7H2O | 2mg/l |
MnSO4·H2O | 2mg/l |
硫胺.HCl | 0.3mg/l |
生物素 | 1mg/l |
CaCO3 | 50g/l |
pH* | 7.8 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的重量
接种后将瓶在30℃潮湿摇床中摇动(200rpm)培养48小时。发酵结束后,通过HPLC确定糖和赖氨酸含量。使用Agilent 1100系列LC系统进行HPLC。柱前用正酞己炔酯衍生化允许定量形成的氨基酸;使用AgilentHypersil AA柱分离产物混合物。结果在表6中列出。
表6
瓶编号 | 果糖g/l | 葡萄糖g/l | 蔗糖g/l | 总糖g/l | |
1 | 0.00 | 0.00 | 4.71 | 4.71 | |
2 | 0.00 | 7.75 | 4.82 | 12.57 | |
3 | 0.00 | 13.85 | 4.57 | 18.42 | |
4 | 0.00 | 17.20 | 11.38 | 28.58 | |
5 | 0.00 | 21.08 | 11.31 | 32.39 | |
6 | 0.00 | 25.51 | 11.29 | 36.80 | |
7 | 0.00 | 32.59 | 9.83 | 42.42 | |
8 | 0.00 | 24.10 | 10.01 | 34.11 | |
9 | 0.00 | 39.26 | 9.94 | 49.20 |
在所有瓶中,赖氨酸以相当于约30到40g/l(相应于使用葡萄糖培养液的标准发酵获得的产量)的量产生。
实施例2:发酵
使用如实施例II.1中描述获得的玉米粉水解产物,使用III描述的菌株ATCC13032 lysCfbr,类似实施例1b)进行发酵。将细胞在无菌CM琼脂(构成:见表4;121℃20分钟)上在30℃孵育48小时。随后从板上刮下细胞并重悬在盐水中。用这样数量的细胞悬液各自接种250ml三角瓶中的25ml培养基1或2(见表5)从而使光密度达到610nm处OD600值为1。然后将样品在30℃潮湿摇床(相对大气湿度85%)中200rpm培养48小时。通过HPLC确定培养基中的赖氨酸含量。在所有情况下均产生约相同的赖氨酸数量。
实施例3
使用谷氨酸棒杆菌(ATCC13032 lysCfbr)的摇瓶实验中使用根据实施例II.3a获得的两种玉米粉水解产物(瓶1+2)。此外,同时使用类似实施例II.3制备的黑麦粉水解产物(瓶5+6)和小麦粉水解产物(瓶3+4)。
3.1)制备接种物
将细胞在无菌CM+CaAc琼脂(成分:见表7;121℃20分钟)上划线然后在30℃孵育48小时,然后接种至新板并在30℃孵育过夜。随后从板上刮下细胞并重悬在盐水中。用这样数量的细胞悬液各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的23ml培养基(见表8)从而使光密度达到610nm处OD610值为0.5。
表7:CM+CaAc琼脂平板的构成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D-葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
5.0g/l | 细菌培养用蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
20.0g/l | 酪蛋白氨基酸 |
20.0g/l | 琼脂 |
3.2)制备发酵液
表8显示瓶培养基1到6的构成。对照培养基中使用合适数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物。
表8:瓶培养基
瓶编号 | |||
1+2 | 3+4 | 5+6 | |
玉米 344g/kg** | 174g/l*** | ||
小麦 343g/kg** | 175g/l*** | ||
黑麦 310g/kg** | 194g/l*** | ||
(NH4)2SO4 | 20g/l | ||
尿素 | 5g/l | ||
KH2PO4 | 0.113g/l | ||
K2HPO4 | 0.138g/l | ||
ACES | 52g/l | ||
MOPS | 21g/l | ||
柠檬酸×H2O | 0.49g/l | ||
3,4-二羟苯甲酸 | 3.08mg/l | ||
NaCl | 2.5g/l | ||
KCl | 1g/l | ||
MgSO4×7H2O | 0.3g/l | ||
FeSO4×7H2O | 25mg/l | ||
MnSO4×4-6H2O | 5mg/l | ||
ZnCl2 | 10mg/l | ||
CaCl2 | 20mg/l | ||
H3BO3 | 150μg/l |
CoCl×6H2O | 100μg/l |
CuCl2×2H2O | 100μg/l |
NiSO4×6H2O | 100μg/l |
Na2MoO4×2H2O | 25μg/l |
生物素(维生素H) | 1050μg/l |
硫胺×HCl(维生素B1) | 2100μg/l |
烟酰胺 | 2.5mg/l |
泛酸 | 125mg/l |
氰钴胺素(维生素B12) | 1μg/l |
4-氨基苯甲酸(PABA;维生素H1) | 600μg/l |
叶酸 | 1.1μg/l |
吡哆醇(维生素B6) | 30μg/l |
核黄素(维生素B2) | 90μg/l |
CSL | 40ml/l |
pH* | 6.85 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在30℃潮湿摇床中摇动(200rpm)培养48小时。发酵结束后,通过HPLC确定葡萄糖和赖氨酸含量。使用Agilent 1100系列LC系统进行HPLC。氨基酸定量需要用正酞己炔酯衍生化,使用Agilent ZorbaxExtend C18柱进行分离。结果在表9中列出。
表9
瓶编号 | 葡萄糖[g/l] | 赖氨酸[g/l] | |
1 | 1.2 | 12.0 |
2 | 1.2 | 10.8 | |
3 | 0.2 | 10.6 | |
4 | 0.2 | 10.0 | |
5 | 0.0 | 11.1 | |
6 | 0.0 | 9.5 |
在所有瓶中,赖氨酸以相当于约10到12g/l(相应于使用葡萄糖培养液的标准发酵获得的产量)的量产生。
3.3)分离赖氨酸
为了分离赖氨酸,通常第一步从发酵液中离心分离固体。也可使用过滤方法(如膜过滤)作为离心的替代选择。然后将现已不含固体的发酵液酸化(如使用硫酸),由此赖氨酸以单或双质子化的形式存在。随后将该酸化的溶液经过阳离子交换器从而赖氨酸结合在离子交换器上。用水洗涤后,用氨水经过离子交换器以洗脱赖氨酸。蒸发洗脱液;随后通过添加盐酸将目前以游离碱形式存在于洗脱液中的赖氨酸转化为赖氨酸盐酸盐并结晶析出。通过离心将晶体从晶体混悬液中分离并在最终步骤中干燥。该操作给出高纯度(按重量计≥98.5%的赖氨酸*HCl)的结晶赖氨酸。该操作的详细描述以及赖氨酸整理的其他方法可见于Ikeda,M.:Amino AcidProduction Processes.Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,第79卷,(2003),1-35和Hermann,T.:Industrial production of amino acids by coryneform bacteria.Journal ofBiotechnology 104(2003),155-172。
实施例4
摇瓶实验中使用如实施例II.3a所述获得的两种玉米粉水解产物(瓶1-3)。使用芽孢杆菌PA824(详细描述于WO02/061108)作为产泛酸菌株。此外,同时使用类似实施例II.3制备的黑麦粉水解产物(瓶7-9)和小麦粉水解产物(瓶4-6)。
4.1)制备接种物
用0.4ml冰冻培养物各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的42ml预培养物培养基(见表10)并在潮湿摇床中43℃下摇动(250rpm)培养24小时。
表10:预培养物培养基的组成
成分 | 浓度 |
麦芽糖 | 28.6g/l |
大豆粉 | 19.0g/l |
(NH4)2SO4 | 7.6g/l |
谷氨酸钠 | 4.8g/l |
柠檬酸钠 | 0.95g/l |
FeSO4×7H2O | 9.5mg/l |
MnCl2×4H2O | 1.9mg/l |
ZnSO4×7H2O | 1.4mg/l |
CoCl2×6H2O | 1.9mg/l |
CuSO4×5H2O | 0.2mg/l |
Na2MoO4×2H2O | 0.7mg/l |
K2HPO4×3H2O | 15.2g/l |
KH2PO4 | 3.9g/l |
MgCl2×6H2O | 0.9g/l |
CaCl2×2H2O | 0.09g/l |
MOPS | 59.8g/l |
pH* | 7.2 |
*用稀释的KOH水溶液调节
用1ml预培养物各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的42ml主要培养基(见表11)。
4.2)制备发酵液
表11显示瓶培养基1到9的组成。对照培养基中使用合适数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物。
表11:瓶培养基
瓶编号 | |||
1-3 | 4-6 | 7-9 | |
玉米 381.4g/kg** | 75g/l*** | ||
小麦 342.0g/kg** | 84g/l*** | ||
黑麦 303.0g/kg** | 94g/l*** | ||
大豆粉 | 19.0g/l | ||
(NH4)2SO4 | 7.6g/l | ||
谷氨酸钠 | 4.8g/l | ||
柠檬酸钠 | 0.95g/l | ||
FeSO4×7H2O | 9.5mg/l | ||
MnCl2×4H2O | 1.9mg/l | ||
ZnSO4×7H2O | 1.4mg/l | ||
CoCl2×6H2O | 1.9mg/l | ||
CuSO4×5H2O | 0.2mg/l | ||
Na2MoO4×2H2O | 0.7mg/l | ||
K2HPO4×3H2O | 15.2g/l | ||
KH2PO4 | 3.9g/l | ||
MgCl2×6H2O | 0.9g/l | ||
CaCl2×2H2O | 0.09g/l | ||
MOPS | 59.8g/l | ||
pH* | 7.2 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中43℃下摇动(250rpm)培养24小时。发酵结束后,通过HPLC确定葡萄糖和泛酸含量。借助于来自Bio-Rad的AminexHPX-87H柱测定葡萄糖。泛酸浓度通过在来自Phenomenex的Aqua C18-柱上分离测定。结果在表12中列出。
表12
瓶编号 | 葡萄糖[g/l] | 泛酸[g/l] | |
1 | 0.00 | 1.75 | |
2 | 0.00 | 1.70 | |
3 | 0.00 | 1.73 | |
4 | 0.10 | 1.80 | |
5 | 0.10 | 1.90 | |
6 | 0.19 | 1.96 | |
7 | 0.12 | 2.01 | |
8 | 0.12 | 2.12 | |
9 | 0.13 | 1.80 |
在所有瓶中,赖氨酸以相对于约1.5到2g/l(相应于使用葡萄糖培养液的标准发酵获得的产量)的量产生。
可例如如WO02/24001,WO02/072857和WO05/028659所述整理产物。
实施例5
使用黑曲霉的摇瓶实验中使用如实施例II.3a所述获得的玉米粉水解产物(瓶1-3)。此外,同时使用类似实施例II.3制备的黑麦粉水解产物(瓶7-9)和小麦粉水解产物(瓶4-6)。
5.1)菌株
类似于制备NP505-7(详细描述于WO98/46772)制备带有glaA启动子控制下的无花果曲霉(Aspergillus ficuum)phyA基因的6个拷贝的黑曲霉产植酸酶菌株。使用带有3个修饰的glaA扩增子(类似于ISO505)而不带有整合的phyA表达盒的菌株作为对照。
5.2)制备接种物
用100μl冰冻培养物各自接种装有一个挡板的100ml三角瓶中的20ml预培养物培养基(见表13)并在潮湿摇床中34℃下摇动(170rpm)培养24小时。
表13:预培养物培养基的组成
成分 | 浓度 |
葡萄糖 | 30.0g/l |
酪素蛋白胨 | 10.0g/l |
酵母提取物 | 5.0g/l |
KH2PO4 | 1.0g/l |
MgSO4×7H2O | 0.5g/l |
ZnCl2 | 30mg/l |
CaCl2 | 20mg/l |
MnSO4×1H2O | 9mg/l |
FeSO4×7H2O | 3mg/l |
吐温80 | 3.0g/l |
青霉素 | 50 000IU/l |
链霉素 | 50mg/l |
pH* | 5.5 |
*用稀释的硫酸调节
用5ml预培养物各自接种装有一个挡板的250ml三角瓶中的50ml主要培养基(见表14)。
5.3)制备发酵液
表14显示瓶培养基1到9的构成。对照培养基中使用合适数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物。
表14:瓶培养基
瓶编号 | |||
1-3 | 4-6 | 7-9 |
玉米 381.4g/kg** | 184g/l*** | ||
小麦 342.0g/kg** | 205g/l*** | ||
黑麦 303.0g/kg** | 231g/l*** | ||
酪素蛋白胨 | 25.0g/l | ||
酵母提取物 | 12.5g/l | ||
KH2PO4 | 1.0g/l | ||
K2SO4 | 2.0g/l | ||
MgSO4×7H2O | 0.5g/l | ||
ZnCl2 | 30mg/l | ||
CaCl2 | 20mg/l | ||
MnSO4×1H2O | 9mg/l | ||
FeSO4×7H2O | 3mg/l | ||
青霉素 | 50 000 IU/l | ||
链霉素 | 50mg/l | ||
pH* | 5.6 |
*用稀释的硫酸调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中34℃下摇动(170rpm)培养6天。发酵结束后,借助于测定法确定植酸酶活性。发酵结束后,使用植酸作为底物在合适的植酸酶活性水平(标准0.6 U/ml)下、250 mM醋酸/醋酸钠/吐温20,pH5.5缓冲液中确定植酸酶活性。标准化测定以便在微孔滴定板(MTP)上使用。将10μl酶溶液与140μl 6.49mM植酸盐溶液在250mM醋酸钠缓冲液,pH5.5中混和(植酸盐:植酸十二钠盐)。在37℃孵育一小时后,通过加入等体积(150μl)三氯乙酸终止反应。将该混合物的等分式样转移至280μl含有0.32N H2SO4,按重量计0.27%钼酸铵和按重量计1.08%抗坏血酸的溶液中。随后在50℃孵育25分钟。在820nm处测量蓝色溶液的吸光度。结果在表15中列出。
表15
植酸酶活性[FTU/ml]* | |
玉米 | 433 |
小麦 | 476 |
黑麦 | 564 |
对照 | 393 |
*)FTU=福尔马肼(formazine)浊度单位
可如WO98/55599所述整理产物。
实施例6
使用棉阿舒囊霉的摇瓶实验中使用如实施例II.3a所述获得的玉米粉水解产物(瓶1-4)。此外,同时使用类似实施例II.3制备的黑麦粉水解产物(瓶9-12)和小麦粉水解产物(瓶5-8)。
6.1)菌株
使用的产核黄素菌株为棉阿舒囊霉ATCC 10895(参阅Schmidt G.等,Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalateas potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbyagossypii.Microbiology 142:411-417,1996)。
6.2)制备接种物
将细胞在无菌的HMG琼脂(构成:见表16;121℃20分钟)上划线然后在28℃孵育72小时。
表16:HMG琼脂平板的构成
成分 | 浓度 |
D-葡萄糖 | 4.0g/l |
酵母提取物 | 4.0g/l |
麦芽提取物 | 10.0g/l |
琼脂 | 30.0g/l |
pH | 7.2 |
随后用一满环细胞各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的50ml预培养物培养基(见表17)并在潮湿摇床中28℃下摇动(180rpm)培养24小时。
表17:预培养物培养基的构成
成分 | 浓度 |
细菌培养用蛋白胨 | 10.0g/l |
酵母提取物 | 1.0g/l |
肌醇 | 0.3g/l |
D-葡萄糖 | 10.0g/l |
pH* | 7.0 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
用5ml预培养物各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的50ml主要培养基(见表18)。
6.3)制备发酵液
表18显示瓶培养基1到12的构成。对照培养基中使用合适数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物。
表18:瓶培养基
瓶编号 | |||
1-4 | 5-8 | 9-12 | |
玉米 381.4g/kg** | 26.2g/l*** | ||
小麦 342.0g/kg** | 29.2g/l*** | ||
黑麦 303.0g/kg** | 33.0g/l*** | ||
细菌培养用蛋白胨 | 10.0g/l | ||
酵母提取物 | 1.0g/l | ||
肌醇 | 0.3g/l |
pH* | 7.0 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中28℃下摇动(180rpm)培养6天。发酵结束后,通过HPLC确定维生素B2含量。结果在表19中列出。
表19
维生素B2 | |
玉米 | 2.73g/l |
小麦 | 2.15g/l |
黑麦 | 2.71g/l |
对照 | 0.12g/l |
可如EP00345717所述整理产物。
实施例7
使用谷氨酸棒杆菌的摇瓶实验中使用如实施例II.3a所述获得的玉米粉水解产物(瓶1-3)。此外,同时使用类似实施例II.3制备的黑麦粉水解产物(瓶7-9)和小麦粉水解产物(瓶4-6)。
7.1)菌株
技术人员知道产生甲硫氨酸的棒状杆菌菌株。这类菌株的制备描述于例如Kumar D.Gomes J.Biotechnology Advances,23(1):41-61,2005;Kumar D.等Process Biochemistry,38:1165-1171,2003;WO04/024933和WO02/18613。
7.2)制备接种物
将细胞在无菌CM+Kan琼脂(成分:见表20;121℃20分钟)上划线然后在30℃孵育24小时。随后从板上刮下细胞并重悬在盐水中。用这样数量的细胞悬液各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的35ml培养基(见表5)从而使光密度达到610nm处OD610值为0.5。
表20:CM+Kan琼脂平板的构成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D-葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
10.0g/l | 细菌培养用蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
20μg/ml | 卡纳霉素 |
25.0g/l | 琼脂 |
7.3)制备发酵液
表21显示瓶培养基1到9的构成。对照培养基中使用合适数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物。
表21:瓶培养基
瓶编号 | |||
1-3 | 4-6 | 7-9 | |
玉米 381.4g/kg** | 157.2g/l*** | ||
小麦 342.0g/kg** | 175.6g/l*** | ||
黑麦 303.0g/kg** | 198.0g/l*** | ||
(NH4)2SO4 | 20g/l | ||
尿素 | 5g/l | ||
KH2PO4 | 0.113g/l | ||
K2HPO4 | 0.138g/l |
ACES | 52g/l |
MOPS | 21g/l |
柠檬酸×H2O | 0.49g/l |
3,4-二羟苯甲酸 | 3.08mg/l |
NaCl | 2.5g/l |
KCl | 1g/l |
MgSO4×7H2O | 0.3g/l |
FeSO4×7H2O | 25mg/l |
MnSO4×4-6H2O | 5mg/l |
ZnCl2 | 10mg/l |
CaCl2 | 20mg/l |
H3BO3 | 150μg/l |
CoCl×6H2O | 100μg/l |
CuCl2×2H2O | 100μg/l |
NiSO4×6H2O | 100μg/l |
Na2MoO4×2H2O | 25μg/l |
生物素(维生素H) | 1050μg/l |
硫胺×HCl(维生素B1) | 2100μg/l |
烟酰胺 | 2.5mg/l |
泛酸 | 125mg/l |
氰钴胺素(维生素B12) | 1μg/l |
4-氨基苯甲酸 |
(PABA;维生素H1) | 600μg/l |
叶酸 | 1.1μg/l |
吡哆醇(维生素B6) | 30μg/l |
核黄素(维生素B2) | 90μg/l |
CSL | 40ml/l |
卡纳霉素 | 25μg/ml |
pH* | 6.85 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中30℃下摇动(200rpm)培养直至葡萄糖耗尽。发酵结束后,通过HPLC确定甲硫氨酸含量(柱:Agilent ZORBAXEclipse AAA;Method It.Eclipse AAA protocol,Technical Note5980-1193)。结果在表22中列出。
表22
瓶 | 甲硫氨酸[μmol/l] | |
玉米 | 123 | 9643.19509.29395.3 |
小麦 | 56 | 6839.97133.97028.9 |
黑麦 | 8 | 7894.77526.5 |
9 | 6998.9 | |
对照 | 101111 | 1920.81916.3 |
可如例如WO05/007862和之前的申请DE10359668.2所述整理产物。
实施例8
使用细菌130Z的摇瓶实验中使用如实施例II.3a所述获得的玉米粉水解产物。
8.1)菌株
使用细菌130Z(ATCC No.55618)作为产琥珀酸菌株。
8.2)制备发酵液
用1ml冰冻培养物各自接种装有两个挡板的120ml血清瓶中的50ml主要培养基(见表23)。密封血清瓶前注入CO2(0.7bar)。
表23列出培养基的组成(参照US5,504,004)。对照培养基中使用相应数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物(葡萄糖终浓度:100g/l)。
表23:培养基*
成分 | 浓度 |
玉米 381.4g/kg** | 262g/l*** |
NaCl | 0.1g/l |
K2HPO4 | 0.3g/l |
MgCl2×6H2O | 20mg/l |
CaCl2×H2O | 20mg/l |
(NH4)2SO4 | 0.1g/l |
生物素 | 200μg/l |
CSL | 15.0g/l |
10%酵母提取物 | 15.0g/l |
MgCO3 | 80.0mg/l |
*CO2/N2大气下,也包括灌注瓶时
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中37℃下摇动(200rpm)培养46小时。发酵结束后,通过HPLC确定葡萄糖和琥珀酸含量。测定借助于来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱进行。结果在表24中列出。
表24
No. | 葡萄糖[g/l] | 琥珀酸[g/l] |
1 | 30.93 | 42.501 |
2 | 29.273 | 44.114 |
对照 | 17.414 | 47.73 |
实施例9
使用大肠杆菌的摇瓶实验中使用如实施例II.3a所述获得的玉米粉水解产物(瓶1-3)。此外,同时使用类似实施例II.3制备的黑麦粉水解产物(瓶7-9)和小麦粉水解产物(瓶4-6)。
9.1)菌株
本领域技术人员公知产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株。这类菌株的制备描述于例如EP1013765,A1、EP1016710 A2、US5,538,873。
9.2)制备接种物
将细胞在无菌LB琼脂上划线。如果存在合适的抗性基因作为所述菌株的标记物,向LB琼脂中加入抗生素。例如可为此目的加入卡那霉素(40μg/ml)或氨苄青霉素(100mg/l)。将菌株在30℃下孵育24小时。随后从扳上刮下细胞并重悬在盐水中。用这样数量的细胞悬液各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的25ml培养基(见表25)从而使光密度达到610nm处OD610值为0.5。
9.3)制备发酵液
表25显示瓶1到9培养基的组成。对照培养基中使用合适数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物。
表25:瓶培养基
瓶编号 | |||
1-3 | 4-6 | 7-9 | |
玉米 381.4g/kg** | 157.2g/l*** | ||
小麦 342.0g/kg** | 175.6g/l*** | ||
黑麦 303.0g/kg** | 198.0g/l*** | ||
(NH4)2SO4 | 22g/l | ||
K2HPO4 | 2g/l | ||
NaCl | 0.8g/l | ||
MgSO4×7H2O | 0.8g/l | ||
FeSO4×7H2O | 20mg/l | ||
MnSO4×5H2O | 20mg/l | ||
硫胺×HCl(维生素B1) | 200mg/l | ||
酵母提取物 | 1.0g/l | ||
CaCO3(sterilizedseparately) | 30g/l | ||
卡纳霉素 | 50mg/l | ||
氨苄青霉素 | 100mg/l | ||
pH | 6.9±0.2 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中30℃下摇动(200rpm)培养直至葡萄糖耗尽。发酵结束后通过Lindroth等,Analytical Chemistry 51:1167-1174,1979所述反向HPLC确定L-苏氨酸含量。
之后,收集发酵液并分离、纯化或以其他方式整理发酵液中存在的L-苏氨酸,如US5,538,873和Okamoto等,Bioscience,Biotechnology andBiochemistry 61(11),1877-1882,1997所述。
实施例10
其他L-氨基酸谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸和精氨酸通过使用合适的菌株类似于实施例9中描述的操作产生。所述菌株描述于例如EP1016710。
实施例11
使用11.2)所述产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的摇瓶实验中使用类似实施例II.3获得的木薯粉水解产物(瓶1-4)。使用的粉末具有如下大小分布:45%<100μm、56%<200μm、79%<630μm。
甚至在液化步骤开始,混悬液的粘度相对较高从而最初使用的木薯粉数量相应于按重量计35%的干物质含量。然后合适地添加更多粉末以达到最终按重量计55%的干物质含量。在整个液化和糖化过程中混悬液的粘度保持相对较高。另外,木薯粉具有结团的倾向;在该方法过程中,团块只溶解到某种程度。在碘-淀粉测试中,存在的团块在几分钟后被染成深蓝;这提示尽管重复煮沸和延长等待时间,结团的淀粉仍未完全转化。
11.1)菌株
使用III.所述具有解除反馈调节的天冬氨酸激酶ATCC13032 lysCfbr的修饰的野生型。
11.2)制备接种物
将细胞在无菌CM+CaAc琼脂(成分:见表26;121℃20分钟)上划线然后在30℃孵育24小时。随后从板上刮下细胞并重悬在盐水中。用这样数量的细胞悬液各自接种装有两个挡板的250ml三角瓶中的23ml培养基(见表27)从而使光密度达到610nm处OD610值为0.5。
表26:CM+CaAc琼脂平板的组成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D-葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
5.0g/l | 细菌培养用蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
20.0g/l | 酪蛋白氨基酸 |
20.0g/l | 琼脂 |
11.3)制备发酵液
表27显示瓶培养基的组成。对照培养基中使用合适数量的葡萄糖溶液代替粉末水解产物。
表27:瓶培养基
木薯 362g/kg** | 164g/l*** |
(NH4)2SO4 | 20g/l |
尿素 | 5g/l |
KH2PO4 | 0.113g/l |
K2HPO4 | 0.138g/l |
ACES | 52g/l |
MOPS | 21g/l |
柠檬酸×H2O | 0.49g/l |
3,4-二羟苯甲酸 | 3.08mg/l |
NaCl | 2.5g/l |
KCl | 1g/l |
MgSO4×7H2O | 0.3g/l |
FeSO4×7H2O | 25mg/l |
MnSO4×4-6H2O | 5mg/l |
ZnCl2 | 10mg/l |
CaCl2 | 20mg/l |
H3BO3 | 150μg/l |
CoCl×6H2O | 100μg/l |
CuCl2×2H2O | 100μg/l |
NiSO4×6H2O | 100μg/l |
Na2MoO4×2H2O | 25μg/l |
生物素(维生素H) | 1050μg/l |
硫胺×HCl(维生素B1) | 2100μg/l |
烟酰胺 | 2.5mg/l |
泛酸 | 125mg/l |
氰钴胺素(维生素B12) | 1μg/l |
4-氨基苯甲酸(PABA;维生素H1) | 600μg/l |
叶酸 | 1.1μg/l |
吡哆醇(维生素B6) | 30μg/l |
核黄素(维生素B2) | 90μg/l |
CSL | 40ml/l |
pH* | 6.85 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
**水解产物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中30℃下摇动(200rpm)培养48小时。发酵结束后,通过HPLC确定葡萄糖和赖氨酸含量。使用Agilent 1100系列LC系统进行HPLC分析。借助于来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱测定葡萄糖。通过在Agilent 1100系列LC系统中进行高压液相层析确定氨基酸浓度。使用正酞己炔酯的柱前衍生化允许定量形成的氨基酸;从Hypersil AA柱(Agilent)上分离氨基酸混合物。结果列在表28中。
表28
瓶编号 | 葡萄糖[g/l] | 赖氨酸[g/l] |
1 | 0.0 | 12.87 |
2 | 0.0 | 14.00 |
3 | 0.1 | 12.44 |
对照 | 0.1 | 10.15 |
在所有瓶中,赖氨酸以相当于约10到14g/l(对应使用葡萄糖培养液的标准发酵获得的产量)的量产生。
实施例12
在使用米曲霉的摇瓶实验中使用部分糖化的玉米粉水解产物。
12.1)液化和(部分)糖化
类似实施例II.3a进行液化。将混悬液冷却到61℃并将pH调节到4.3之后,加入5.38ml(=按重量计1.5%的酶/干物质)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。添加酶后每10、15、20、30、45和60分钟后取出50g样品并混悬于25ml无菌、冰冷的完全软化水中。将样品置于冰浴中并立刻用于瓶测试中。没有发生酶的失活。
12.2)发酵
使用实施例5.1)中使用的菌株。如实施例5.2所述制备接种物。
使用表29所列的瓶培养基组成制备发酵液。每个样品用于两瓶。
表29:瓶培养基
玉米 | 10g/l*** |
酪素蛋白胨 | 25.0g/l |
酵母提取物 | 12.5g/l |
KH2PO4 | 1.0g/l |
K2SO4 | 2.0g/l |
MgSO4×7H2O | 0.5g/l |
ZnCl2 | 30mg/l |
CaCl2 | 20mg/l |
MnSO4×1H2O | 9mg/l |
FeSO4×7H2O | 3mg/l |
青霉素 | 50000 IU/l |
链霉素 | 50mg/l |
pH* | 5.6 |
*用稀释的硫酸调节
***每升培养基中部分糖化的水解产物量
接种后将瓶在潮湿摇床中34℃下摇动(170rpm)培养6天。发酵结束后,借助于测定法(如实施例5.3中描述)确定植酸酶活性。结果在表30中列出。
表30
标准糖化结束后x分钟 | 瓶 | 植酸酶活性[FTU/ml] |
10 | 1 | 425 |
2 | 387 | |
15 | 3 | 312 |
4 | 369 | |
20 | 5 | 366 |
6 | 316 | |
30 | 7 | 343 |
8 | 454 | |
45 | 9 | 372 |
10 | 358 | |
60 | 11 | 298 |
12 | 283 |
实施例13
在使用谷氨酸棒杆菌的摇瓶实验中使用部分糖化的玉米粉水解产物。
13.1)液化和(部分)糖化
类似实施例II.3a进行液化。将混悬液冷却到61℃并将pH调节到4.3之后,加入5.38ml(=按重量计1.5%的酶/干物质)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。添加酶后每10、15、20、30、45和60分钟后取出50g样品并混悬于25ml无菌、冰冷的完全软化水中。将样品置于冰浴中并立刻用于瓶测试中。没有发生酶的失活。
13.2)发酵
使用实施例3)中使用的菌株。如实施例3.1)所述制备接种物。
使用表31所列的瓶培养基组成制备发酵液。每个样品用于三瓶。
表31:瓶培养基
玉米 | 4.5g/l*** |
(NH4)2SO4 | 20g/l |
尿素 | 5g/l |
KH2PO4 | 0.113g/l |
K2HPO4 | 0.138g/l |
ACES | 52g/l |
MOPS | 21g/l |
柠檬酸×H2O | 0.49g/l |
3,4-二羟苯甲酸 | 3.08mg/l |
NaCl | 2.5g/l |
KCl | 1g/l |
MgSO4×7H2O | 0.3g/l |
FeSO4×7H2O | 25mg/l |
MnSO4×4-6H2O | 5mg/l |
ZnCl2 | 10mg/l |
CaCl2 | 20mg/l |
H3BO3 | 150μg/l |
CoCl×6H2O | 100μg/l |
CuCl2×2H2O | 100μg/l |
NiSO4×6H2O | 100μg/l |
Na2MoO4×2H2O | 25μg/l |
生物素(维生素H) | 1050μg/l |
硫胺×HCl(维生素B1) | 2100μg/l |
烟酰胺 | 2.5mg/l |
泛酸 | 125mg/l |
氰钴胺素(维生素B12) | 1μg/l |
4-氨基苯甲酸(PABA;维生素H1) | 600μg/l |
叶酸 | 1.1μg/l |
吡哆醇(维生素B6) | 30μg/l |
核黄素(维生素B2) | 90μg/l |
CSL | 40ml/l |
pH* | 6.85 |
*用稀释的NaOH水溶液调节
***每升培养基中水解产物的量
接种后将瓶在潮湿摇床中30℃下摇动(200rpm)培养48小时。发酵结束后,通过HPLC确定葡萄糖和赖氨酸含量。HPLC分析使用Agilent 1100系列LC体系进行。借助于来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱测定葡萄糖。通过在Agilent 1100系列LC体系上进行高压液相层析测定氨基酸浓度。柱前用正酞己炔酯衍生化允许定量形成的氨基酸;使用AgilentHypersil AA柱(Agilent)分离产物混合物。结果在表32中列出。
表32
标准糖化结束后x分钟 | 瓶 | 赖氨酸[g/l] |
10 | 1 | 15.05 |
2 | 11.71 | |
3 | 14.24 | |
15 | 4 | 14.91 |
5 | 15.27 | |
6 | 12.20 | |
20 | 7 | 13.19 |
8 | 13.65 | |
9 | 11.14 | |
30 | 10 | 15.38 |
11 | 12.45 | |
12 | 11.56 | |
45 | 13 | 13.13 |
14 | 14.64 | |
15 | 13.48 | |
60 | 16 | 14.58 |
17 | 13.72 | |
18 | 14.27 |
实施例14
在类似实施例3进行的产生赖氨酸的发酵中,从步骤c)的发酵液中取出赖氨酸后作为干燥的发酵残渣获得蛋白质组合物。表33列出组合物的主要成分及其重量,并将它们与传统DDGS组合物比较。
表33:基于干物质重量百分比的分析结果**
蛋白质构成 | 列表数值* | 比例 | |
粗蛋白 | 68.1 | 29.7 | 2.29 |
粗脂肪 | 8.4 | 10.0 | 0.84 |
粗纤维 | 1.5 | (8.8) | 0.17 |
粗灰分 | 7.9 | 5.2 | 1.52 |
酸性去污纤维(ADF) | 4.6 | 19.7 | 0.23 |
中性去污纤维(ADF) | 17.9 | 38.8 | 0.46 |
赖氨酸 | 3.72 | 0.67 | 5.55 |
甲硫氨酸 | 0.87 | 0.54 | 1.61 |
苏氨酸 | 1.93 | 1.02 | 1.89 |
色氨酸 | 0.46 | 0.26 | 1.77 |
磷 | 0.54 | 0.83 | 0.65 |
钙 | <0.11 | 0.22 | - |
*根据National Research Council(NRC),Nutrient Requirements forDairy Cattle,第七修订版,National Academy Press,2001(或SpiehsM.J.,Whitney M.H.和Shurson G.C:Nutrient database for distiller’sdried grains with solubles produced from new ethanol plants inMinnesota and South Dakota,Journal of Animal Science 80,2002,2639-2645)的DDGS(可溶性蒸馏器干燥谷物,生物醇产生的次级产物)
**提到的参数和所需的分析方法为技术人员公知。
序列表
<110>巴斯福股份公司
<120>精细化学品的发酵产生
<130>M/44156
<160>8
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>1
gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc 35
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>2
ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg 34
<210>3
<211>4327
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pCIS
<400>3
tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60
tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120
tttaaatgat ccgctagcgg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca 180
gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc 240
aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc 300
ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 360
gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg 420
atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 480
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 540
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 600
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 660
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 720
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct 780
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 840
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 900
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 960
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 1020
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 1080
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 1140
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 1200
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg 1260
actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 1320
tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 1380
atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccacgctag cggcgcgccg 1440
gccggcccgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc 1500
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 1560
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 1620
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 1680
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 1740
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 1800
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 1860
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 1920
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 1980
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 2040
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 2100
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 2160
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 2220
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 2280
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 2340
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aaggccggcc gcggccgcca 2400
tcggcatttt cttttgcgtt tttatttgtt aactgttaat tgtccttgtt caaggatgct 2460
gtctttgaca acagatgttt tcttgccttt gatgttcagc aggaagctcg gcgcaaacgt 2520
tgattgtttg tctgcgtaga atcctctgtt tgtcatatag cttgtaatca cgacattgtt 2580
tcctttcgct tgaggtacag cgaagtgtga gtaagtaaag gttacatcgt taggatcaag 2640
atccattttt aacacaaggc cagttttgtt cagcggcttg tatgggccag ttaaagaatt 2700
agaaacataa ccaagcatgt aaatatcgtt agacgtaatg ccgtcaatcg tcatttttga 2760
tccgcgggag tcagtgaaca ggtaccattt gccgttcatt ttaaagacgt tcgcgcgttc 2820
aatttcatct gttactgtgt tagatgcaat cagcggtttc atcacttttt tcagtgtgta 2880
atcatcgttt agctcaatca taccgagagc gccgtttgct aactcagccg tgcgtttttt 2940
atcgctttgc agaagttttt gactttcttg acggaagaat gatgtgcttt tgccatagta 3000
tgctttgtta aataaagatt cttcgccttg gtagccatct tcagttccag tgtttgcttc 3060
aaatactaag tatttgtggc ctttatcttc tacgtagtga ggatctctca gcgtatggtt 3120
gtcgcctgag ctgtagttgc cttcatcgat gaactgctgt acattttgat acgtttttcc 3180
gtcaccgtca aagattgatt tataatcctc tacaccgttg atgttcaaag agctgtctga 3240
tgctgatacg ttaacttgtg cagttgtcag tgtttgtttg ccgtaatgtt taccggagaa 3300
atcagtgtag aataaacgga tttttccgtc agatgtaaat gtggctgaac ctgaccattc 3360
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cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag 5160
aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa 5220
tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt 5280
gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag taaaggttaa tactgttgct tgttttgcaa 5340
actttttgat gttcatcgtt catgtctcct tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc 5400
ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa 5460
tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact ttgcccttta cacattttag gtcttgcctg 5520
ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac ttttcgacct cattctatta gactctcgtt 5580
tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt gtttgataga aaatcataaa aggatttgca 5640
gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta tctgtttctt ttcattctct gtatttttta 5700
tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc tttttaatca caattcagaa aatatcataa 5760
tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg caggtatatg tgatgggtta aaaaggatcg 5820
gcggccgctc gatttaaatc tcgagaggcc tgacgtcggg 5860
Claims (28)
1.通过基于糖的微生物发酵的方法产生至少一种微生物代谢物的方法,所述代谢物具有至少3个碳原子或至少2个碳原子和至少一个氮原子,所述方法包括:
a)从淀粉原料中制备单糖含量按重量计大于20%的含糖液体培养基,含糖液体培养基还含有淀粉原料的非淀粉固体成分;
b)发酵含糖液体培养基以制备代谢物;并
c)从发酵液中排出或分离至少一种代谢物,
其包括用含糖液体培养基培养产生目的代谢物的微生物菌株,所述液体培养基获得自:
a1)研磨淀粉原料;和
a2)将研磨料液化在含有至少一种淀粉液化酶的水性液体中,然后使用至少一种糖化酶糖化,其中至少一些研磨料通过连续或分批添加至水性液体中而被液化。
2.根据权利要求1的方法,其中含糖液体培养基包含总的淀粉来源非淀粉固体成分按重量计的至少20%。
3.根据权利要求1或2的方法,其中至少一种淀粉液化酶选自α-淀粉酶且至少一种糖化酶选自淀粉糖化酶。
4.根据前述权利要求任一项的方法,其中使用谷物颗粒作为淀粉原料。
5.根据权利要求4的方法,其中谷物选自玉米、黑麦、小黑麦和玉米颗粒。
6.根据前述权利要求任一项的方法,其中步骤a1)中粉碎获得的研磨料包含按重量计至少50%的具有大于100μm颗粒大小的粉末颗粒。
7.根据前述权利要求任一项的方法,其中步骤a2)中的研磨料液化和糖化以下述方式进行:液体培养基的粘度总计不超过20Pas。
8.根据前述权利要求任一项的方法,其中液化时添加的研磨料总量中按重量计至少25%在高于研磨料中存在的淀粉的胶凝温度下添加。
9.根据权利要求3到8中任一项的方法,其中在步骤a2)中所述至少一种α-淀粉酶的部分在液化时添加进水性液体。
10.根据前述权利要求任一项的方法,其中获得具有按重量计大于40%单糖含量的含糖液体培养基。
11.根据前述权利要求任一项的方法,其中至少一种植酸酶在发酵步骤b)之前添加进含糖液体培养基。
12.根据前述权利要求任一项的方法,其中产生的代谢物选自非挥发性物质。
13.根据前述权利要求任一项的方法,其中产生的代谢物选自任选地连有羟基基团和具有3到10个碳原子的有机单、双和三羧酸,如成蛋白质和非成蛋白质氨基酸、嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸、脂质、饱和和不饱和脂肪酸、具有优选3到10个碳原子的二醇、具有3个或更多羟基基团的较高功能性醇、具有至少4个碳原子的长链醇、碳水化合物、芳香族化合物、维生素、维生素原、辅因子、营养品、蛋白质、类胡萝卜素类、具有3到10个碳原子的酮、内酯、生物多聚体和环糊精。
14.根据前述权利要求任一项的方法,其中产生的代谢物选自酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个碳原子的脂肪族单羧酸和双羧酸、具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个碳原子的酮、具有4到10个碳原子的链烷醇、具有3到8个碳原子的链烷二醇和多羟基链烷酸酯。
15.根据前述权利要求任一项的方法,其中使用的微生物选自能够产生至少一种下述代谢物的天然或重组的微生物,所述代谢物为酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个碳原子的脂肪族单羧酸和双羧酸、具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个碳原子的酮、具有4到10个碳原子的链烷醇、具有3到8个碳原子的链烷二醇和多羟基链烷酸酯。
16.根据权利要求15的方法,其中微生物选自棒杆菌属、芽孢杆菌属、阿舒囊霉、埃希氏菌、曲霉、产碱菌属、放线杆菌、厌氧螺菌、乳酸杆菌属、丙酸菌和梭状芽孢杆菌,特别是选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉、大肠杆菌、黑曲霉或肥大产碱杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、丁二酸放线杆菌、德式乳酸杆菌、莱氏乳杆菌、阿拉伯糖丙酸杆菌、谢氏丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、丙酸梭菌和丙酮丁醇梭菌菌株。
17.根据前述权利要求任一项的方法,其中通过离子交换层析从步骤c)中描述的发酵液中取出或分离代谢物。
18.根据权利要求17的方法,其中代谢物选择性结合在离子交换器上,适当时在洗脱产物之前洗涤离子交换器。
19.根据权利要求17或18的方法,其中带有固体的发酵液逆重力流入离子交换器。
20.根据前述权利要求任一项的方法,其中
(i)从步骤a)获得的含糖液体培养基中去除按重量计不多于50%的部分(其包含淀粉原料的非淀粉固体组分)并用剩余物进行如b)中所述的发酵以产生第一代谢物(A);和
(ii)将所有或一些淀粉原料的非淀粉固体组分从该部分中分离并用该部分进行如b)所述的发酵以产生第二代谢物(B),其与代谢物(A)一致或不同。
21.根据权利要求20的方法,其中(ii)的非淀粉固体成分分离以如下方式进行:含糖液体残留物的固体含量总计按重量计不超过50%。
22.根据权利要求20到21的方法,其中代谢物(B)选自植酸酶、核黄素、泛酸和多羟基链烷酸酯。
23.根据前述权利要求任一项的方法,其中取出或分离根据步骤c)的代谢物后,在某种程度上去除发酵液的挥发性成分,产生固体或半固体蛋白质组合物。
24.蛋白质组合物,其可通过根据权利要求23的方法获得。
25.根据权利要求24的蛋白质组合物,主要包含下列干物质成分:
a)按重量计1%到90%的来自发酵的生物量;
b)按重量计1%到90%的淀粉来源的非淀粉组分;
c)按重量计0.01%到10%的具有至少3个碳原子或至少2个碳原子和至少一个N原子的微生物代谢物;
d)按重量计0到90%的常规配制辅料;和
e)按重量计0到40%的发酵液的不可代谢的其他组分
其中组分a)到e)总计达干物质重量的100%。
26.根据权利要求24或25的蛋白质组合物,其具有基于蛋白质组合物干物质按重量计40%到90%范围内的粗蛋白含量。
27.根据权利要求24到26中任一项的蛋白质组合物,其特征是具有来自赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和色氨酸的至少一种主要氨基酸。
28.权利要求1到22中任一项定义的含糖液体培养基在发酵产生具有至少3个碳原子或具有至少2个碳原子和至少1个氮原子的微生物代谢物中的用途。
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