CN111172204A - 一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法 - Google Patents

一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，将淀粉质原料液化后加入糖化酶、真菌酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶酶解，将糊精和低聚糖尽可能转化为还原糖，将部分玉米蛋白转化为氨基酸，得到的糖化水解液用于黑曲霉发酵柠檬酸生产，并且在发酵过程前期再加入糖化酶、真菌酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶。使用该方法发酵生产柠檬酸，有效地提高发酵转化率，降低发酵液残总糖，降低生产粮耗，节约生产成本。

Description

一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种通过添加复合酶提高柠檬酸发酵效率的制备方法。
背景技术
中国是人口大国，也是农业大国，由于人均耕地偏少，随着粮食深加工产业的发展，粮食需求量日益增加，每年通过进口粮食来弥补粮食短缺问题。
每年用于柠檬酸发酵的粮食总量约为200万吨，而现有的柠檬酸发酵方法不仅转化率低，发酵液残总糖高，造成粮耗高，且柠檬酸提取难度大，收率低，环保处理费用高，生产成本居高不下。
发明内容
本发明旨在现有柠檬酸发酵技术转化率低，发酵液残糖高，生产粮耗高的缺点，提供一种通过添加糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶的复合酶来提高柠檬酸发酵效率的制备方法，该方法可以大幅度提高柠檬酸发酵的转化率，降低发酵液残糖，降低生产粮耗，达到节约用粮。
本发明的发明人惊讶的发现，现有发酵技术生产柠檬酸时，黑曲霉在发酵过程中虽然可以产糖化酶分解淀粉多糖为还原糖，但是由于发酵过程pH下降较快，发酵液pH值很快将至3.0以下，发酵液中的糊精和低聚麦芽糖和低聚木糖很难彻底被酶解成可利用的还原糖，以不可发酵多糖的形式残留在发酵液中，导致发酵转化率低，而在原料处理时和在发酵前期添加一定量的糖化酶、真菌酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶组合能彻底酶解成还原糖，进而全部转化为柠檬酸，大大提高了发酵转化率，降低发酵液残糖，本发明采用的技术方案如下：
一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、发酵前，将淀粉质原料液化后加入适量的糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶，控制适宜的温度和酶解时间进行酶解，酶解后制得液体酶解液，用来配制成柠檬酸发酵培养基。
②、柠檬酸发酵培养基高温灭菌降温后接入产柠檬酸黑曲霉菌种进行发酵，发酵过程前期再添加一定量的糖化酶、真菌酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶。
进一步地，步骤①中酶解方法如下：
将按照已知的柠檬酸发酵要求对淀粉质原料进行液化处理后的液化液温度控制为50～60℃，调节pH值为4.5～5.5，添加糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶酶解，糖化酶添加量为0.1～1kg/吨淀粉质原料干基，真菌酶添加量为0.01～0.1kg/吨淀粉质原料干基，木聚糖酶添加量为0.01～0.1kg/吨淀粉质原料干基，酸性蛋白酶添加量为0.01～0.2kg/吨淀粉质原料干基，酶解时间为2～24小时；
优选地，步骤①中酶解方法如下：
将按照已知的柠檬酸发酵要求对淀粉质原料进行液化处理后的液化液温度控制为50～60℃，调节pH值为4.5～5.5，添加糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶酶解，糖化酶添加量为0.4～0.6kg/吨淀粉质原料干基，真菌酶添加量为0.04～0.06kg/吨淀粉质原料干基，木聚糖酶添加量为0.04～0.06kg/吨淀粉质原料干基，酸性蛋白酶添加量为0.08～0.12kg/吨淀粉质原料干基，酶解时间为20～24小时；
进一步地，步骤②中发酵方法如下：
发酵开始后0～12小时，加入糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶，糖化酶添加量为0.01～0.2kg/m3，真菌酶的添加量为0.001～0.02kg/m3，木聚糖酶的添加量为0.002～0.02kg/m3，酸性蛋白酶的添加量为0.002～0.04kg/m3。
优选地，步骤②中发酵方法如下：
发酵开始后0～1小时，加入糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶，糖化酶添加量为0.1～0.15kg/m3，真菌酶的添加量为0.01～0.015kg/m3，木聚糖酶的添加量为0.01～0.015kg/m3，酸性蛋白酶的添加量为0.02～0.03kg/m3。
本发明的有益效果：
(1)本发明可以大幅度提高柠檬酸的转化率，降低生产粮耗，节约用粮成本。
(2)本发明发酵液残糖大幅度降低，降低提取难度，减少废水排放。
具体实施方式
实施例1
一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法：
①、液体酶解液的制备
取5300kg干物浓度为25％的玉米液化液，将温度控制在58℃，调pH值为5.2，依次加入800g糖化酶、80g真菌酶、80g木聚糖酶、160g酸性蛋白酶，控温58℃酶解24小时，制得液体酶解液；
②、种子液的制备
将步骤①中的500kg液体酶解液加水稀释至总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
③、发酵培养基制备
将步骤①中的4800kg液体酶解液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
④、复合酶制剂的制备
称取500g糖化酶、50g真菌酶、50g木聚糖酶、100g酸性蛋白酶，混合后加热至60℃，维持10分钟灭菌，快速降温至35℃，备用
⑤、发酵培养
向步骤③的发酵培养基中接入步骤②中的种子液和步骤④中的复合酶制剂，起始通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.15MPa，温度36℃，起始溶解氧100％，0小时发酵液总糖为15.5％，待溶解氧降低至15％以下时，通过增加通气比，控制溶解氧为15-25％，发酵至发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量16.2％，残总糖为0.2％，发酵周期为58小时。
对比试验1
一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法：
①、液体酶解液的制备
取5300kg干物浓度为25％的玉米液化液，将温度控制在58℃，调pH值为5.2，依次加入800g糖化酶、80g真菌酶、80g木聚糖酶、160g酸性蛋白酶，控温58℃酶解24小时，制得液体酶解液；
②、种子液的制备
将步骤①中的500kg液体酶解液加水稀释至总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
③、发酵培养基制备
将步骤①中的4800kg液体酶解液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
④、发酵培养
向步骤③的发酵培养基中接入步骤②中的种子液，起始通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.15MPa，温度36℃，起始溶解氧100％，0小时发酵液总糖为15.5％，待溶解氧降低至15％以下时，通过增加通气比，控制溶解氧为15-25％，发酵至发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量15.6％，残总糖为0.6％，发酵周期为60小时。
对比试验2
一种通过添加真菌酶提高柠檬酸发酵效率的制备方法：
①、种子液的制备
取500kg玉米液化液加水稀释至总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
②、复合酶制剂的制备
称取500g糖化酶、50g真菌酶、50g木聚糖酶、100g酸性蛋白酶，混合后加热至60℃，维持10分钟灭菌，快速降温至35℃，备用
③、发酵培养基制备
取4800kg玉米液化液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
④、发酵培养
向步骤③的发酵培养基中接入步骤①中的种子液和步骤②中的复合酶制剂，起始通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.15MPa，温度36℃，起始溶解氧100％，0小时发酵液总糖为15.5％，待溶解氧降低至15％以下时，通过增加通气比，控制溶解氧为15-25％，发酵至发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量15.8％，残总糖为0.5％，发酵周期为59小时。
对比试验3
一种柠檬酸发酵的制备方法：
①、液体酶解液的制备
取5300kg干物浓度为25％的玉米液化液，将温度控制在58℃，调pH值为5.2，加入800g糖化酶，控温58℃酶解24小时，制得液体酶解液；
②、种子液的制备
将步骤①中的500kg液体酶解液加水稀释至总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
③、发酵培养基制备
将步骤①中的4800kg液体酶解液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
④、酶制剂的制备
称取500g糖化酶加热至60℃，维持10分钟灭菌，快速降温至35℃，备用
⑤、发酵培养
向步骤③的发酵培养基中接入步骤②中的种子液和步骤④中的复合酶制剂，起始通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.15MPa，温度36℃，起始溶解氧100％，0小时发酵液总糖为15.5％，待溶解氧降低至15％以下时，通过增加通气比，控制溶解氧为15-25％，发酵至发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量15.0％，残总糖为0.8％，发酵周期为62小时。
对比试验4
一种柠檬酸发酵的制备方法：
①、液体酶解液的制备
取5300kg干物浓度为25％的玉米液化液，将温度控制在58℃，调pH值为5.2，加入80g真菌酶，控温58℃酶解24小时，制得液体酶解液；
②、种子液的制备
将步骤①中的500kg液体酶解液加水稀释至总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
③、发酵培养基制备
将步骤①中的4800kg液体酶解液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
④、酶制剂的制备
称取50g真菌酶加热至60℃，维持10分钟灭菌，快速降温至35℃，备用
⑤、发酵培养
向步骤③的发酵培养基中接入步骤②中的种子液和步骤④中的复合酶制剂，起始通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.15MPa，温度36℃，起始溶解氧100％，0小时发酵液总糖为15.5％，待溶解氧降低至15％以下时，通过增加通气比，控制溶解氧为15-25％，发酵至发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量15.1％，残总糖为0.5％，发酵周期为66小时。
对比试验5
一种柠檬酸发酵的制备方法：
①、液体酶解液的制备
取5300kg干物浓度为25％的玉米液化液，将温度控制在58℃，调pH值为5.2，加入80g木聚糖酶，控温58℃酶解24小时，制得液体酶解液；
②、种子液的制备
将步骤①中的500kg液体酶解液加水稀释至总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
③、发酵培养基制备
将步骤①中的4800kg液体酶解液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
④、酶制剂的制备
称取50g木聚糖酶加热至60℃，维持10分钟灭菌，快速降温至35℃，备用
⑤、发酵培养
向步骤③的发酵培养基中接入步骤②中的种子液和步骤④中的复合酶制剂，起始通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.15MPa，温度36℃，起始溶解氧100％，0小时发酵液总糖为15.5％，待溶解氧降低至15％以下时，通过增加通气比，控制溶解氧为15-25％，发酵至发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量15.2％，残总糖为0.5％，发酵周期为66小时。
对比试验6
一种柠檬酸发酵的制备方法：
①、液体酶解液的制备
取5300kg干物浓度为25％的玉米液化液，将温度控制在58℃，调pH值为5.2，加入160g酸性蛋白酶，控温58℃酶解24小时，制得液体酶解液；
②、种子液的制备
将步骤①中的500kg液体酶解液加水稀释至总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
③、发酵培养基制备
将步骤①中的4800kg液体酶解液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
④、酶制剂的制备
称取100g酸性蛋白酶加热至60℃，维持10分钟灭菌，快速降温至35℃，备用
⑤、发酵培养
向步骤③的发酵培养基中接入步骤②中的种子液和步骤④中的复合酶制剂，起始通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.15MPa，温度36℃，起始溶解氧100％，0小时发酵液总糖为15.5％，待溶解氧降低至15％以下时，通过增加通气比，控制溶解氧为15-25％，发酵至发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量14.9％，残总糖为1.0％，发酵周期为60小时。
对比试验7
一种柠檬酸发酵的制备方法：
①、种子液的制备
取500kg干物浓度为25％的玉米液化液，加水稀释至残总糖9.5％，121℃灭菌30分钟后，降温至35℃，接入产柠檬酸黑曲霉孢子，通气比0.5v/v·min，搅拌转速200r/min，培养24小时，pH值下降至2.0，柠檬酸0.95％，菌球大小均匀，菌丝短粗，即可用于发酵接种使用。
②、发酵培养基制备
取4800kg干物浓度为25％的玉米液化液，固液分离得到3950kg稀糖液和850kg滤渣，称取90kg滤渣加入到稀糖液中，加入5kg糖蜜、2.25kg重量比为1:1:1的氨水、硫酸铵、氯化铵、5kg磷酸二氢钾、2g生物素，加水稀释至发酵液总糖16％。升温至85℃维持30分钟灭菌，快速降温至36℃。
③、发酵培养
向步骤②的发酵培养基中接入步骤①中的种子液，发酵通气比0.15v/v·min，搅拌转速200r/min，罐压0.05MPa，温度36，℃0小时发酵液总糖为15.5％，发酵液还原糖为0，停止发酵，柠檬酸含量14.8％，残总糖为1.2％，发酵至66小时。
一、实施例1和对比试验1-7之间发酵结果，见下表1。
表1、实施例1和对比试验1-7发酵结果对比
Figure BDA0002410026300000091
与本申请的实施例1相比，对比试验1-2是分别在步骤①或②添加4中酶的制备方法。对比试验1-4分别为单独添加糖化酶、真菌酶、木聚糖酶或酸性蛋白酶的与本申请其他参数相同的制备方法，对比文件5是不添加酶解步骤的制备方法。
从上表1可以看出，施例1采用本发明提供的发酵柠檬酸的方法，添加真菌酶等4种复合酶制剂后大幅度提高发酵转化率，缩短了发酵周期，其中实施例1在玉米液化液和发酵前阶段加入真菌酶等4种复合酶对发酵效率影响最大，相比对比试验7发酵转化率提高9.5％，发酵液残总糖降低了83.3％，从而有效降低了单位发酵粮耗，提高了发酵技术水平。

Claims (6)

1.一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、发酵前，将淀粉质原料液化后加入糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶，控制适宜的温度和酶解时间进行酶解，酶解后制得液体酶解液，用来配制成柠檬酸发酵培养基；
②、柠檬酸发酵培养基高温灭菌降温后接入产柠檬酸黑曲霉菌种进行发酵，发酵过程前期再添加糖化酶、真菌酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，其特征在于，步骤①中酶解方法如下：
将按照已知的柠檬酸发酵要求对淀粉质原料进行液化处理后的液化液温度控制为50～60℃，调节pH值为4.5～5.5，添加糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶酶解，糖化酶添加量为0.1～1kg/吨淀粉质原料干基，真菌酶添加量为0.01～0.1kg/吨淀粉质原料干基，木聚糖酶添加量为0.01～0.1kg/吨淀粉质原料干基，酸性蛋白酶添加量为0.01～0.2kg/吨淀粉质原料干基，酶解时间为2～24小时。
3.根据权利要求2所述的一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，其特征在于，步骤①中酶解方法如下：
将按照已知的柠檬酸发酵要求对淀粉质原料进行液化处理后的液化液温度控制为50～60℃，调节pH值为4.5～5.5，添加糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶酶解，糖化酶添加量为0.4～0.6kg/吨淀粉质原料干基，真菌酶添加量为0.04～0.06kg/吨淀粉质原料干基，木聚糖酶添加量为0.04～0.06kg/吨淀粉质原料干基，酸性蛋白酶添加量为0.08～0.12kg/吨淀粉质原料干基，酶解时间为20～24小时。
4.根据权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，其特征在于，步骤②中发酵方法如下：
发酵开始后0～12小时，加入糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶，糖化酶添加量为0.01～0.2kg/m3，真菌酶的添加量为0.001～0.02kg/m3，木聚糖酶的添加量为0.002～0.02kg/m3，酸性蛋白酶的添加量为0.002～0.04kg/m3。
5.根据权利要求4所述的一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，其特征在于，步骤②中发酵方法如下：
发酵开始后0～1小时，加入糖化酶、真菌酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶，糖化酶添加量为0.1～0.15kg/m3，真菌酶的添加量为0.01～0.015kg/m3，木聚糖酶的添加量为0.01～0.015kg/m3，酸性蛋白酶的添加量为0.02～0.03kg/m3。
6.根据权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵效率的制备方法，其特征在于，所述淀粉质原料液化后选25％的玉米液化液。
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