CN101177695B - 一种高浓度酒精发酵的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种高浓度酒精发酵的方法。该方法克服了现有酒精发酵中存在的发酵效率低、发酵时间长等缺点。本发明采用前期通入无菌空气，发酵至8～30h时补料和添加发酵促进剂，经25～35℃、振荡或搅拌转速为10～500r/min、时间50～66h发酵，得到高浓度乙醇，发酵液中乙醇的体积比浓度达16％～18％。本发明能快速、高效地生产高浓度酒精。

Description

一种高浓度酒精发酵的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及到一种发酵生产高浓度酒精的方法，能快速、高效地生产高浓度酒精。
背景技术
随着能源危机的到来，利用可再生资源(粮食或植物纤维)发酵生产乙醇，作为生物能源来代替或部分代替石油被提上了日程。燃料乙醇作为清洁能源，在日益重视环保的今天，更是倍受关注。
目前，以淀粉质原料作为底物，美国的酒精厂可以达到12％(V/V，下同)。而我国的燃料乙醇生产技术主要是以淀粉质为原料的酒精生产技术，发酵液中乙醇含量为8％～10％，低于世界水平，乙醇发酵效率为88％～90％。该生产技术能耗高，废水多，COD负荷大。高浓度酒精发酵(Very High Gravity，简称VHG)，可以降低能耗、提高产率，降低蒸馏费用，从而有效降低成本。高浓度酒精发酵技术将是酒精发酵工艺的重大技术进步之一。
国内外有许多关于酒精浓醪发酵的报道，但往往为理想状态下的实验结果，并且只考虑乙醇浓度一个指标，因此存在发酵效率低、发酵时间长、发酵温度低等不足，以致综合效能不高。
1.发酵效率低于现有的生产工艺(88％～90％)。如，国外专利报道(专利号DE3207676-A)，以红薯为原料高浓度发酵，43h可以得到16.9％的乙醇，但是发酵效率只有84％。Alfenore等(Alfenore S，Molina-Jouve C，et al.Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60：67～72)描述了一种以葡萄糖为碳源，经45h发酵，乙醇浓度达到19％的流加糖发酵工艺，但是发酵效率只有82.2％。
2.发酵温度低，发酵时间长达100h以上。如，Hayashida等(HayashidaS，Ohta K.Formation of high concentrations of alcohol by various yeasts.J InstBrew，1981，87：42～44)报道的一种生产乙醇浓度为20.5％的工艺，发酵时间为20天。Thomas等(Thomas K C，Ingledew W M.Production of 21％(v/v)ethanol by fermentation of very high gravity(VHG)wheat mashes.J IndMicrobiol，1992，10：61～68)发明了一种20℃发酵小麦淀粉生产浓度为21％乙醇的方法，发酵时间为175h。这种低温发酵工艺，需要大量冷却水。而且发酵时间太长，生产过程能耗大，设备利用率低，无疑增加了成本。
纵观这些发酵工艺，未能兼顾乙醇浓度、发酵效率和时间。若能寻找到一种更优的发酵工艺，在追求高浓度乙醇的同时，若发酵效率高、时间短，则将大大降低乙醇生产成本。
要得到高浓度的乙醇必然需要高浓度的可发酵糖。过高的糖浓度所产生的渗透压会使酵母死亡，较高的乙醇浓度对酵母细胞有毒性。因此解决渗透压和乙醇毒性对酵母菌的影响成为高浓度酒精发酵的关键因素。在发酵培养基里加入相应的酵母生长的必需物质，创造条件使酵母菌维持旺盛的生长繁殖能力，可得到较高浓度的乙醇，并使糖发酵彻底。
研究高浓度酒精发酵的学者对促进剂的研究也很多，如添加抗坏血酸，吐温，不饱和脂肪酸，固醇，大豆粉，氨基酸，酵母膏，蛋白胨等等。这些促进剂对酵母乙醇发酵有一定的促进作用，但是不明显，酒精浓度不高。如国内专利(CN 200410094105)报道了一种酒曲促进剂，发酵淀粉质原料，乙醇浓度也只有15％～16％，最终发酵醪的乙醇浓度提高1°～2°。而且有的促进剂成本高。因此，寻找一种廉价而又适合于大生产的酒精发酵促进剂，降低乙醇对酵母的毒害，是实现高浓度乙醇发酵的关键因素之一。
发明内容
本发明的目的是针对现有高浓度酒精发酵工艺的不足，提出一种发酵生产高浓度酒精的新方法。该方法简单、有效，是以酿酒酵母为菌种，采用通气、补料、添加发酵促进剂和均一发酵体系，从而提供了一种提高发酵速率和乙醇浓度的方法，最终发酵得到高浓度酒精。
本发明发酵生产高浓度酒精的技术包括：发酵前期通入无菌空气，使发酵液的溶解氧为50％～100％；发酵至8～30h时补加高浓度糖液、发酵促进剂和相应比例的无机盐等其它营养成分；振荡或搅拌，使发酵液为均一的发酵体系。
本发明所涉及的促进剂为VB1、VB6、烟酸和对氨基苯甲酸的混合物，其每升发酵液的添加量为：VB1 10～200mg，VB65～300mg，烟酸5～300mg，对氨基苯甲酸5～150mg。
本发明的工艺步骤为：
1.培养基制备
保存培养基为普通麦芽汁斜面培养基或YEPD斜面培养基。
种子培养基成分为(g L-1)：葡萄糖60～100，酵母粉5～10，(NH4)2SO41.5，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.05～0.1，pH6.0～6.5。
发酵培养基为(g L-1)：总糖(碳源)270～310；酵母粉4～10；蛋白胨4～10；(NH4)2SO41.5～2.5；KH2PO4或K2HPO41～2；MgSO4.7H2O 0.4～1.0；CaCl21～4；pH值6.0～6.5。
总糖分2～5次加入，首次加入150～180g L-1，其余的于发酵至8～30h时分1～4次补料加入；补料时添加发酵促进剂和相应比例的无机盐等其它营养成分。
本发明的碳源可以是葡萄糖或淀粉质原料(包括木薯粉、米粉、红薯粉、玉米粉等)，但淀粉质原料需经水解等方法处理后得到葡萄糖、果糖等可利用糖。
2.制备种子液：从斜面上挑取一铲酵母菌接种至种子培养基中，25～35℃，100～300r/min摇床通风培养14～18h。
3.淀粉质原料的处理：淀粉质原料在温度90～95℃下液化1h，液化酶用量为10～30U/g原料，冷却至55℃，稀硫酸调节pH 4.5左右，添加糖化酶，糖化1h，糖化酶用量200～600U/g原料。经固液分离，以糖清液用于发酵。
4.发酵：将灭菌后的发酵液接种前或接种后通入无菌空气，使其溶解氧为50％～100％。种子接种量为8％～12％(种子液与发酵液的体积比)。在发酵至8～30h时补加高浓度糖液、发酵促进剂和相应比例的无机盐等其它营养成分，并在温度为25～35℃，转速为10～500r/min振荡或搅拌下发酵，优选发酵温度为27～33℃，优选转速为100～300r/min，经50～66h发酵结束。
发酵结束后，测量发酵液中最终乙醇浓度、残糖、菌体量以及菌体生长状况。发酵液的乙醇浓度为16％～18％(20℃，体积比浓度)，残糖0.5％(g/100mL)左右。用紫外可见分光光度计测定菌体浓度(吸光度)为1.5～1.8(在波长620nm处以蒸馏水为空白，发酵液稀释10倍后测定吸光度)，菌体生长健壮、整齐。
本发明的优点如下：
(1)发酵初期通入空气的方法使发酵液有足够的溶解氧，酵母能快速生长繁殖，有效缩短发酵时间。通气量适量，不会造成酵母过度繁殖，也尽可能避免了酵母有氧呼吸。且只有一次通气，与已报道的多次通气相比，大大简化了工序，节约了成本。
(2)振荡或转动发酵提供均一的发酵状态使酵母能够充分接触营养物质，酵母生长良好，肥壮、整齐，发酵能力强。
(3)本发明所涉及的发酵生产高浓度酒精的促进剂为多种维生素，用量小，成本低，添加方便。添加该促进剂增加了酵母细胞抗渗透压能力，增强酵母抗乙醇毒性的能力，发酵过程中酵母活性高，能有效提高乙醇浓度，提高2.5°～3.5°。
(4)该发明工艺简单，可操作性强。发酵速度快，最终酒精浓度高，发酵效率高，残糖低。能有效地降低酒精生产成本，具有良好的经济效益。
具体实施方式
实施例1：以本实验室筛选的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SY-1为菌种发酵，该菌于2006年10月23日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 206111。
(1)发酵培养基中总糖为305g L-1，其余成分为(g L-1)：酵母粉5，蛋白胨5，(NH4)2SO41.5，KH2PO41.5，MgSO4.7H2O 0.6，CaCl23.0，pH6.0～6.5。促进剂添加量为(mg L-1)：VB110，VB630，烟酸30，对氨基苯甲酸5。0.08MPa条件下灭菌15min。通入无菌空气，溶解氧90％。接种，30℃，200r/min摇床振荡发酵。发酵中，补料两次，时间分别为8h和24h。发酵时间为54h。最终乙醇浓度18.12％(20℃，V/V，以下同)，发酵效率为91.73％，残糖0.25％(g/100mL)。菌体OD值为1.617。
(2)发酵培养基中总糖为300g L-1，其余成分为(g L-1)：酵母粉6，蛋白胨5，(NH4)2SO42.0，KH2PO41.8，MgSO4.7H2O 0.8，CaCl22.0，pH6.0～6.5。发酵体积为1L。促进剂添加量为(mg L-1)：VB120，VB640，烟酸30，对氨基苯甲酸10。0.08MPa条件下灭菌15min。通入无菌空气，溶解氧70％。接种，30℃，100r/min搅拌发酵。发酵中，补料两次，时间分别为8h和24h。发酵至54h结束。乙醇浓度为17.84％，残糖降至0.42％，发酵效率为91.82％。菌体OD值为1.523。
(3)培养基同(2)，葡萄糖浓度为281g L-1，发酵体积为10L。溶氧60％。转速为100～300r/min。发酵至54h结束。最终乙醇浓度为16.81％，发酵效率为92.37％，残糖为0.58％。菌体OD值为1.629。
(4)培养基同(2)，葡萄糖浓度为300g L-1，发酵体积为10L。溶氧60％。发酵时间66h。最终乙醇浓度为17.73％，发酵效率为91.25％，残糖为0.52％。菌体OD值为1.678。
(5)发酵培养基中总糖为300g L-1，其余成分为(g L-1)：酵母粉7，蛋白胨5，(NH4)2SO41.5，KH2PO42.0，MgSO4.7H2O 1.0，CaCl21.8，pH6.0～6.5。发酵体积为10L。促进剂添加量为(mg L-1)：VB130，VB6100，烟酸50，对氨基苯甲酸50。接种后通气，使溶氧量为80％。32℃，100～150r/min搅拌发酵。发酵中，补料次数为四次，补料时间分别为8h、13h、17h和23h。发酵时间65h。最终乙醇浓度为17.92％，发酵效率为92.23％，残糖为0.41％。菌体OD值为1.695。
(6)将木薯淀粉液化、糖化后得到糖清液，以糖清液作为碳源，其余培养基成分同(1)。总糖为285g L-1，发酵体积为1L。溶氧90％。发酵至55h结束。最终乙醇浓度为16.76％，发酵效率为90.80％，残还原糖0.49％，残总糖为0.92％。
实施例2：以安琪耐高温活性干酵母(Saccharomyces cerevisiae)为菌种发酵，发酵体积为1L。
(1)将干酵母活化后接种于培养基中发酵。发酵培养基中总糖为295gL-1，其余成分同实施例1(1)。通入无菌空气，溶解氧65％。发酵中，补料三次，时间分别为8h、15h、24h。发酵时间60h。最终乙醇浓度17.47％，残糖0.39％，发酵效率为91.44％。
(2)将木薯淀粉液化、糖化后得到的糖清液为碳源。总糖为275g L-1，发酵条件同实施例1(6)，发酵至54h结束。最终乙醇浓度为16.15％，发酵效率为90.68％，残还原糖0.45％，残总糖为0.89％。

Claims (7)

1.一种高浓度酒精发酵的方法，包括酿酒酵母菌种、培养基和发酵工艺，其特征是：接种前或接种后发酵反应之前通入无菌空气，发酵至8～30h时补料并添加发酵促进剂，经25～35℃、振荡或搅拌转速为10～500rpm、时间50～66h发酵，得到高浓度乙醇，在20℃温度下，测量发酵液中乙醇的体积比浓度为16％～18％；
所述的发酵促进剂为VB1、VB6、烟酸和对氨基苯甲酸的混合物，按每升发酵液的添加量为：VB1 10～200mg，VB6 5～300mg，烟酸5～300mg，对氨基苯甲酸5～150mg。
2.根据权利要求1所述的高浓度酒精发酵的方法，其特征是：所述的培养基分为种子培养基和发酵培养基，种子培养基的成分和含量为：葡萄糖60～100gL-1，酵母粉5～10gL-1，(NH4)2SO4 1.5gL-1，MgSO4·7H2O 0.1gL-1，CaCl2 0.05～0.1gL-1，pH6.0～6.5；发酵培养基的成分和含量为：总糖270～310gL-1，酵母粉4～10gL-1，蛋白胨4～10gL-1，(NH4)2SO4 1.5～2.5gL-1，KH2PO4或K2HPO4 1～2gL-1，MgSO4.7H2O 0.4～1.0gL-1，CaCl2 1～4gL-1，pH6.0～6.5。
3.根据权利要求1所述的高浓度酒精发酵的方法，其特征是：所述的酿酒酵母菌种为Saccharomyces cerevisiae SY-1，保藏号为CCTCC M 206111。
4.根据权利要求2所述的高浓度酒精发酵的方法，其特征是：碳源是葡萄糖或经处理后得到葡萄糖、果糖的木薯粉、米粉、红薯粉、玉米粉淀粉质原料。
5.根据权利要求1所述的高浓度酒精发酵的方法，其特征是：通入无菌空气的时间为接种前或接种后发酵反应之前，通入的量为使发酵液的溶解氧为50％～100％。
6.根据权利要求2所述的高浓度酒精发酵的方法，其特征是：发酵培养基的总糖分2～5次加入，首次加入150～180g L-1，其余的于发酵至8～30h时分1～4次补料加入；补料时添加发酵促进剂和相应比例的无机盐等其它营养成分。
7.根据权利要求1所述的高浓度酒精发酵的方法，其特征是：发酵温度优选为27～33℃，振荡或搅拌转速优选为100～300rpm。
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