CN105683378B - 用于精细化学品的改进生产的重组微生物 - Google Patents

Abstract

本申请提供了重组核酸分子、重组微生物和生产丙氨酸的方法。还提供了所述重组核酸分子或重组微生物发酵生产丙氨酸的用途。

Description

用于精细化学品的改进生产的重组微生物

本申请要求2013年9月25日提交的申请号61/881968,61/881969,61/881975和61/881972的优先权，将所述文件完整并入本文作为参考。

发明领域

本申请涉及重组核酸分子、重组微生物，涉及生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的方法，并且涉及所述重组核酸分子或重组微生物发酵生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的用途。

发明描述

氨基酸是具有羧基和氨基的有机化合物。最重要的氨基酸是α-氨基酸，其中氨基与羧基相邻。蛋白质是基于α-氨基酸。

丙氨酸已经引起了很大兴趣，因为它已经在食品、饲料和制药工业中用作添加剂。此外，丙氨酸是工业生产N,N-二(羧甲基)丙氨酸三钠盐(MGDA，商品名Trilon M)的原料，MGDA是一种强螯合剂，在溶解有机和无机污垢中显示出优秀性能(WO94/29421,WO2012/150155)。M级Trilon根据标准OECD测试是容易生物降解的。由于极好的生态学和毒物学谱，M级Trilon尤其适合用于最终消费者的产品中并且对此类生物可降解的复杂增洁剂的需要不断上升。

丙氨酸可以通过用棒杆菌属细菌(Hermann,2003:Industrial production ofamino acids by Coryneform bacteria,J.of Biotechnol,104,155-172.)或大肠杆菌(WO2007/120198,WO2008/119009)发酵生产。

最近已经描述了大肠杆菌，其中ygaW基因的过表达提高了微生物的丙氨酸发酵生产力(WO2012/172822)。

大肠杆菌中的丙氨酸生产更有效并且广泛用于作为化学工业原料的丙氨酸的工业生产。由于对丙氨酸的化学工业的需求增加，需要提高丙氨酸的发酵生产的生产力。

本发明的一个目的是提供可用于以高产率和效率发酵生产丙氨酸的微生物。

发明详述

通过大肠杆菌(E.coli)家族的重组微生物促成了实现上述目标，所述微生物与各自参比微生物相比具有以下的至少一种：i)lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或ii)zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或iii)ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ ID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达。

例如，关于酶的表达和/或活性或产率或生产力的术语“更高”、“增加”或“增强的”意指显著更高的、增加的或增强的表达和/或活性或产率或生产力。

术语“减少的、抑制的或缺失的酶表达和/或活性”意指显著减少、抑制或缺失的表达和/或活性并且也包括各自酶的检测不到的表达和/或活性。

术语“改变的”酶表达和/或活性意指重组微生物中酶的表达和/或活性，其与野生型、非重组微生物中各自酶的表达和/或活性显著不同。

令人惊奇地，已经发现具有以下的至少一种：i)lpd基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或编码的蛋白质的表达，和/或ii)zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或编码的蛋白质的表达和/或iii)ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的中或者在其同源物或功能等同物的对应位置中包含突变的微生物与不包含各自lpd基因的引入的、增加的、增强的活性和/或表达和/或各自zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或不包含各自突变的ygaW基因的相同微生物相比时在发酵生产中具有丙氨酸的更高产率和/或生产力。

因此，当前本发明的一个实施方案是重组微生物，其与各自参比微生物相比包含以下的至少一种：i)编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或ii)编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或iii)ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ ID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达，并且所述重组微生物与各自参比微生物相比在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。

当前本发明的一个实施方案中，与各自参比微生物相比包含以下的至少一种：i)编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或ii)编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或iii)ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ IDNO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达，并且与各自参比微生物相比在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力的重组微生物进一步包含如引入本文作为参考的WO2007/120198和WO2008/119009中所述的缺失的和引入的酶活性。

如本文所用的术语“参比微生物”意指重组微生物与之比较的对照微生物。该参比微生物具有与所述重组微生物基本相同的基因型，待分析的差异除外。优选地，参比微生物是重组微生物所来源的菌株。例如，将基因引入了野生型微生物，从而产生重组微生物，在这种情况下，野生型将是该重组微生物的合适的参比微生物。还可能的是向重组微生物A中引入另一突变，从而产生重组微生物B。重组微生物A将是重组微生物B的合适的参比微生物。如果将比较重组微生物和各自参比微生物的性能，那么两种微生物生长在基本相同的条件下。

对于本领域技术人员显而易见的是，具有增加的丙氨酸产率和/或生产力的微生物也可以用于生产与丙氨酸密切相关的其他代谢物，例如，为丙氨酸途径中间体的代谢物，与丙氨酸途径有共同中间体的代谢物或为使用丙氨酸作为其途径中中间体的代谢物的代谢物。通过增加或引入某些酶活性或通过敲除或降低某些酶活性，本发明的微生物也可以容易地适应于具有此类相关代谢物的增加的产率和/或生产力。

此类代谢物是例如丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和亮氨酸。

例如，为了使用本发明的重组微生物产生琥珀酸，必须在本发明微生物的基因组中敲除基因ldh,pfl,pta和adhE并且必须引入PEP羧化酶基因和/或丙酮酸羧化酶基因。例如在Zhang et al.(2009),PNAS(106)pp20180-20185中描述了各自途径和必要的突变。

因此，当前本发明的另一实施方案是重组微生物，其与各自参比微生物相比包含以下的至少一种：i)编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或ii)编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或iii)ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ ID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达，并且所述重组微生物与各自参比微生物相比在发酵生产中具有更高的丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸产率和/或生产力。

在一些实施方案中，所述微生物是原核细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阳性、革兰氏阴性和革兰氏可变细菌细胞，优选革兰氏阴性细胞。

从而，可用于本发明的微生物包括但不限于，氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans),浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii),带马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae),粘无色杆菌(Achromobacter viscosus),乳无色杆菌(Achromobacterlacticum),根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter),粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis),柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus),肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens),石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus),Arthrobacter hydrocarboglutamicus,氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans),天牛短小杆菌(Aureobacterium saperdae),印度固氮菌(Azotobacterindicus),产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes),Brevibacterium divaricatum,Brevibacterium lactofermentum,黄色短杆菌(Brevibacterium flavum),Brevibacterium globosum,暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum),酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum),Brevibacterium helcolum,Brevibacteriumpusillum,Brevibacterium testaceum,Brevibacterium roseum,Brevibacteriumimmariophilium,扩展短杆菌(Brevibacterium linens),Brevibacteriumprotopharmiae,嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum),谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),美棒杆菌(Corynebacterium callunae),嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum),醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum),产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),解淀粉杆菌(Erwiniaamylovora),胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora),草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola),菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi),奇异稳杆菌(Flavobacteriumperegrinum),染色假杆菌(Flavobacterium fucatum),Flavobacterium aurantinum,莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum),塞沃尼假杆菌(Flavobacterium sewanense),短黄杆菌(Flavobacterium breve),脑膜败血金黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum,微球菌属种(Micrococcus sp.)CCM825,摩氏变形菌(Morganella morganii),红串红球菌(Nocardia opaca),粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa),Planococcus eucinatus,Proteusrettgeri,谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii),成黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha),氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans),Pseudomonas jluorescens,卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis),施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),Pseudomonasacidovolans,霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens),睾丸酮丛毛单胞菌(Pseudomonastestosteroni),绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),红串红球菌(Rhodococcuserythropolis),玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous),红球菌属种(Rhodococcussp.)ATCC15592),红球菌属种ATCC 19070),脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),Vibrio metschnikovii,Vibrio tyrogenes,马杜拉马杜拉放线菌(Actinomadura madurae),Actinomyces violaceochromogenes),Kitasatosporia parulosa,除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis),天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor),Streptomyces flavelus,浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus),浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans),橄榄链霉菌(Streptomycesolivaceus),田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis),Streptomyces virginiae),抗菌素链霉菌(Streptomyces antibioticus),可可链霉菌(Streptomyces cacaoi),淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae),绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes),杀鲑变形菌(Aeromonas salmonicida),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),环状芽孢杆菌(Bacillus circulans),解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus),弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii),Microbacterium ammoniaphilum,粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens),鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium),Salmonella schottmulleri,柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri),集胞蓝细菌属种(Synechocystis sp.),细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus),Thermosynechococcus elongatus,铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa),霉状串珠菌(属(Nostoc sp.),N.commune,N.sphaericum,点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme),盘状螺旋蓝细菌(Spirulina platensis),巨大鞘丝蓝细菌(Lyngbya majuscula),L.lagerheimii,纤细席蓝细菌(Phormidium tenue),假鱼腥蓝细菌属种(Anabaena sp.),Leptolyngbya sp等。

在一些实施方案中，微生物是真核细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞，例如，酵母属物种，如酿酒酵母，汉逊酵母属，如多形汉逊酵母,裂殖酵母属,如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，耶氏酵母属物种，如解脂耶氏酵母，毕赤酵母属物种，如甲醇毕赤酵母，树干毕赤酵母和巴斯德毕赤酵母，接合酵母属物种，如鲁氏接合酵母和拜耳接合酵母，假丝酵母属物种，如博伊丁假丝酵母，产朊假丝酵母，Candida freyschussii，光滑假丝酵母和Candida sonorensis，许旺酵母属物种，如西方许旺酵母，Arxula属物种，如Arxula adeninivorans，Ogataea属物种如Ogataea minuta，克雷伯菌属物种，如肺炎克雷伯菌。

许多细菌的工业菌株特别适合于在本文公开的方法使用。在一些实施方案中，所述微生物是棒杆菌属物种的，例如嗜乙酰棒杆菌,谷氨酸棒杆菌,美棒杆菌,嗜乙酰乙酸棒杆菌,醋谷棒杆菌。在一些实施方案中，微生物是芽孢杆菌属物种，例如，苏云金芽孢杆菌，炭疽杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌,环状芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,灿烂芽孢杆菌,凝固芽孢杆菌,短芽孢杆菌,坚强芽孢杆菌,B.alkaophius,地衣芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌,耐盐芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施方案中，微生物是欧文氏菌属的种，如,噬夏孢欧文氏菌,胡萝卜软腐欧文氏菌,E.ananas,草生欧文氏菌,E.punctata和E.terreus.在一些实施方案中，微生物是埃希氏菌属的种，例如，大肠杆菌。在其他实施方案中，微生物是泛菌属的种，例如，柠檬泛菌或成团泛菌。在其他实施方案中，微生物是链霉菌属的种，例如，产二素链霉菌,不产色链霉菌,除虫链霉菌,天蓝色链霉菌,生金色链霉菌,金色链霉菌,杀真菌素链霉菌,灰色链霉菌或浅青紫链霉菌。在其他实施方案中，所述微生物是发酵单胞菌属的种，例如，运动发酵单胞菌或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。在其他实施方案中，所述微生物是红球菌属的种，例如，混浊红球菌。

优选所述微生物选自肠杆菌科，优选埃希氏菌属，例如大肠杆菌(E.coli)，优选菌株大肠杆菌W，其对应于DSMZ1116，其对应于ATCC9637。

除了编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因，该ygaW基因在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ ID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(a)编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中pflB基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(b)编码双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶)的adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中adhE基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(c)编码依赖NAD的发酵性D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中ldhA基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(d)编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中pta基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达，本发明的重组微生物可以进一步包含(e)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中frdA基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达，本发明的重组微生物可以进一步包含(f)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，其中alaD基因的活性和/或表达的增加或增强与各自参比微生物比较进行测定。

优选地，编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因(其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ ID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达)的本发明的微生物额外具有选自下组特征的至少两个，更优选至少三个，甚至更优选至少四个，甚至更优选至少五个，最优选全部特征：

(a)编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(b)编码双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶)的adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(c)编码依赖NAD的发酵性D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(d)编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(e)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(f)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达,

其中基因的活性和/或表达的减少、抑制、缺失、增加或增强与各自参比微生物比较进行测定。

alaD基因可以来自任何生物并且可以是由人设计的合成基因，例如，具有为在本发明的重组微生物中表达优化的密码子选择或者为酶活性进行优化，例如，具有改善的Vmax或Km。优选地，alaD基因来自芽孢杆菌属(Bacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)之一的微生物。在更优选的实施方案中，alaD基因来自土芽孢杆菌属。在最优选实施方案中，alaD基因来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilu)。

在优选实施方案中，所述alaD基因为在本发明的重组微生物中表达进行密码子优化。

本发明的微生物可以包含其他遗传修饰，如突变、敲除或增强的或引入的酶活性，其进一步改善丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸的产率和/或生产力。

在进一步的实施方案中，编码在本发明的重组微生物中具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因选自下组：

(i)包含SEQ ID NO:49的序列的核酸分子,或

(ii)与SEQ ID NO:49的核酸分子有至少80％，优选至少85％，例如至少90％，更优选至少95％，例如至少96％，甚至更优选至少97％例如至少98％，最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(iii)与具有SEQ ID NO:49的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(iv)编码SEQ ID NO:50的多肽的核酸分子,或

(v)编码与SEQ ID NO:50的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(ii),(iii)或(v)编码的多肽具有SEQ ID NO:50的多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％。

在一个实例中，编码在本发明的重组微生物中具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因具有SEQ ID NO:51的序列，编码具有SEQ IDNO:52的蛋白质。

在另一实施方案中，编码在本发明的重组微生物中具有引入的、增加的、增强或改变的活性和/或表达的涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因选自下组：

(i)包含SEQ ID NO:45的序列的核酸分子，或

(ii)与SEQ ID NO:45的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(iii)与具有SEQ ID NO:45的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(iv)编码SEQ ID NO:46的多肽的核酸分子,或

(v)编码与SEQ ID NO:46的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(ii),(iii)或(v)编码的多肽具有SEQ ID NO:46的多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％。

在一个实例中，编码在本发明的重组微生物中具有引入的、增加的、增强或改变的活性和/或表达的涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因具有SEQ ID NO:47的序列，编码具有SEQ ID NO:48的蛋白质。

在另一实施方案中，编码在本发明的重组微生物中具有改变的活性和/或表达的编码丙氨酸转运蛋白的ygaW基因选自下组：

(i)包含SEQ ID NO:1的序列的核酸分子，或

(ii)与SEQ ID NO:1的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(iii)与具有SEQ ID NO:1的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(iv)编码SEQ ID NO:2的多肽的核酸分子,或

(v)编码与SEQ ID NO:2的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(i)到(v)项下的基因的对应于SEQ ID NO:1的13-15位的密码子不是编码氨基酸谷氨酰胺并且不是终止密码子或者(i)到(v)项下的基因编码的蛋白质的对应于SEQID NO:2的5位的氨基酸不是谷氨酰胺，并且

其中如(1)到(5)中上面定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:2的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

在一个实例中，编码在本发明的重组微生物中具有改变的活性和/或表达的丙氨酸转运蛋白的ygaW基因具有SEQ ID NO:3,56,58或60的序列，编码具有SEQ ID NO:4,57,59或61的蛋白质。

包含编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，和/或编码zipA基因的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达和/或ygaW基因(其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ ID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达)的本发明的重组微生物可以进一步包含在(a)到(f)下如上文定义的任意一个、两个、三个、四个、五个或全部特征，

其中pflB基因选自以下组成的组：

(A)包含SEQ ID NO:5的序列的核酸分子，或

(B)与SEQ ID NO:5的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(C)与具有SEQ ID NO:5的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(D)编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子,或

(E)编码与SEQ ID NO:6的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(B),(C)或(E)编码的多肽具有具SEQ ID NO:6多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中adhE基因选自以下组成的组：

(F)包含SEQ ID NO:7的序列的核酸分子，或

(G)与SEQ ID NO:7的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(H)与具有SEQ ID NO:7的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(I)编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子,或

(J)编码与SEQ ID NO:8的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(G),(H)或(J)编码的多肽具有具SEQ ID NO:8多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中ldhA基因选自以下组成的组：

(K)包含SEQ ID NO:9的序列的核酸分子，或

(L)与SEQ ID NO:9的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(M)与具有SEQ ID NO:9的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(N)编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子,或

(O)编码与SEQ ID NO:10的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(L),(M)或(O)编码的多肽具有具SEQ ID NO:10多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中pta基因选自以下组成的组：

(P)包含SEQ ID NO:11的序列的核酸分子，或

(Q)与SEQ ID NO:11的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(R)与具有SEQ ID NO:11的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(S)编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子,或

(T)编码与SEQ ID NO:12的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(Q),(R)或(T)编码的多肽具有具SEQ ID NO:12多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中frdA基因选自以下组成的组：

(U)包含SEQ ID NO:13的序列的核酸分子，或

(V)与SEQ ID NO:13的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(W)与具有SEQ ID NO:13的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(X)编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子,或

(Y)编码与SEQ ID NO:14的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(V),(W)或(Y)编码的多肽具有具SEQ ID NO:14多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中alaD基因选自以下组成的组：

(Z)包含SEQ ID NO:15的序列的核酸分子，或

(AA)与SEQ ID NO:15的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(BB)与具有SEQ ID NO:15的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(CC)编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子,或

(DD)编码与SEQ ID NO:16的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(AA),(BB)或(DD)编码的多肽具有具SEQ ID NO:16多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％。

优选地，如(Z)到(DD)中定义的核酸分子在微生物中处于作为启动子发挥功能的序列的控制下，所述启动子具有序列：

(1)包含SEQ ID NO:54或55的序列的核酸分子，或

(2)与SEQ ID NO:54或55的核酸分子具有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(3)与具有SEQ ID NO:54或55的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子或

(4)具有SEQ ID NO:54或55的核酸分子的至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸,至少30个核苷酸或至少40个核苷酸的片段，更优选至少50个核苷酸,至少75个核苷酸或至少100个核苷酸,甚至更优选至少150或至少200个核苷酸的片段。优选地，SEQ ID NO:54或55的片段是包含SEQ ID NO:54或55的3’区的片段，因此，该片段在SEQ ID NO:54或55的5’末端包含缺失。

本发明的另一实施方案是包含如上文定义的一种或多种重组微生物的组合物。该组合物可以进一步包含允许本发明的重组微生物生长的培养基。该培养基可以额外包含碳源，如己糖、戊糖或多元醇，如蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、木酮糖、甘油、甘露醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、淀粉、纤维素、木质纤维素或其组合。优选地，碳源是葡萄糖或蔗糖，更优选地，碳源是葡萄糖。

在优选实施方案中，组合物包含本发明的微生物和NBS培养基、AM1培养基或PPM01培养基。更优选地，组合物包含碳源，优选糖。这些培养基的成分是技术人员公知的。

优选NBS培养基每升包含

1-5g,优选3.5g KH₂PO₄和

1-10g,优选5.0g K₂HPO₄和

1-5g,优选3.5g(NH₄)₂HPO₄和

0.1-1g,优选0.25g MgSO₄–7H₂O和

5-25mg,优选15mg CaCL₂-2H₂O和

0.1-1mg,优选0.5mg硫胺素和

0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,

其中所述微量金属贮存液包含0.5-5g,优选1.6g FeCL₃–6H₂O；0.05-0.5g,优选0.2g CoCl₂–6H₂O；0.01-0.5g,优选0.1g CuCl₂-2H₂O；0.1-0.5g,优选0.2g ZnCl₂；0.05-0.5g,优选0.2g NaMoO₄–2H₂O；0.001-0.1g,优选0.05g H₃BO₃每升0.01-1M,优选0.1M HCL。

NBS培养基中优选的碳源是葡萄糖或蔗糖，优选2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。

优选地，AM 1培养基包含每升0.1-10mM,优选1mM甜菜碱溶液

1-10g,优选2.6g(NH4)₂HPO₄和

0.1-5g,优选0.87g NH₄H₂PO₄和

0.05-2.5g,优选0.15g KCl和

0.05-5g,优选0.37g MgSO₄-7H₂O和

0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,

其中微量金属贮存液每升包含0.01-1M,优选0.12M HCL,1-5g,优选2.4g FeCL₃-6H₂O；0.1-1g,优选0.3g CoCl₂-6H₂O；0.1-1g,优选0.21g CuCl₂-2H₂O；0.1-1g,优选0.3gZnCl₂；0.1-1g,优选0.27g NaMoO4–2H₂O；0.01-0.5g,优选0.068g H₃BO₃和0.1-1g,优选0.5gMnCl₂–4H₂O,

和任选地1-30g,优选15g(NH₄)₂SO₄。

NBS培养基中优选的碳源是葡萄糖或蔗糖,优选2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。

优选地，PPM01培养基每升包含

0.05-5g,优选0.37g MgSO₄–7H₂O和

0.1-10g,优选1g(NH₄)₂SO₄和

0.05-5g,优选0.46g甜菜碱和

0.001-0.5g,优选0.05g氰钴胺(B12)和

1-10g,优选3.74g KH₂PO₄和

0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,

其中微量金属贮存液每升包含10-100mM,优选60mM硫酸,1-10g,优选3.48g(NH₄)₂Fe(II)(SO₄)₂-7H₂O；0.1-1g,优选0.35g CoSO₄-7H₂O；0.1-1g,优选0.31g CuSO₄-5H₂O；0.1-5g,优选0.63g ZnSO₄-7H₂O；0.1-1g,优选0.27g MnSO₄-H₂O；0.01-1g,优选0.07g NaMoO₄-2H₂O和0.1-5g,优选0.43g H₃BO₃。

PPM01培养基中优选的碳源是一水合葡萄糖，优选每升培养基10-500g,更优选140g一水合葡萄糖。

本发明的另一实施方案是产生具有增强的丙氨酸，丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸产率或生产力的重组微生物的方法，所述方法包括以下步骤：

(I)在微生物中引入、增加或增强i)lpd基因的一种或多种活性和/或表达，和/或ii)引入,增加,增强或改变zipA基因的一种或多种活性和/或表达，和/或iii)引入ygaW基因，其在SEQ ID NO:1的位置13－15的密码子中或者在SEQ ID NO:1的功能等同物的对应密码子中包含突变，其中所述突变是改变ygaW基因编码的丙氨酸转运蛋白的活性和/或表达和任选地进一步引入一种或多种如上面(a)到(e)项定义的修饰；和

(II)产生、鉴定和分离重组微生物，其与没有如上文(I)项定义的修饰的相应微生物相比具有增强的丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸产率或生产力。

在优选实施方案中，具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的lpd基因具有SEQ ID NO:51的序列和/或编码SEQ ID NO:52的多肽。

在优选实施方案中，具有引入的,增加的,增强的或改变的活性和/或表达的zipA基因具有SEQ ID NO:47的序列和/或编码SEQ ID NO:48的多肽。

在优选实施方案中，具有改变的活性和/或表达的ygaW基因具有SEQ ID NO:3,56,58或60的序列和/或编码SEQ ID NO:4,57,59或61的多肽。

在产生本发明的重组微生物的方法的优选实施方案中，该方法进一步包括减少,抑制或缺失如上文(A)到(Y)定义的pflB基因,adhE基因,ldhA基因,pta基因或frdA基因的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部的活性和/或表达的步骤和/或引入,增加或增强如上文(Z)到(DD)定义的alaD基因的活性和/或表达的步骤。

在产生本发明重组微生物的方法的进一步优选的实施方案中，如(Z)到(DD)中定义的核酸分子处于作为启动子发挥功能的序列的控制下，所述启动子具有序列：

(1)包含SEQ ID NO:54或55的序列的核酸分子，或

(2)与SEQ ID NO:54或55的核酸分子具有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(3)与具有SEQ ID NO:54或55的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子或

(4)具有SEQ ID NO:54或55的核酸分子的至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸,至少30个核苷酸或至少40个核苷酸的片段，更优选至少50个核苷酸,至少75个核苷酸或至少100个核苷酸,甚至更优选至少150或至少200个核苷酸的片段。优选地，SEQ ID NO:54或55的片段是包含SEQ ID NO:54或55的3’区的片段，因此，该片段在SEQ ID NO:54或55的5’末端包含缺失。

产生本发明重组微生物的最优选方法包括步骤i)减少,抑制或缺失pflB基因,adhE基因,ldhA基因,pta基因和frdA基因全部的活性和/或表达和ii)引入,增加或增强优选处于包含SEQ ID NO:54或55的序列的启动子控制下的alaD基因的活性和/或表达的步骤和iii)引入,增加或增强具有SEQ ID NO:51的序列和/或编码SEQ ID NO:52的多肽的lpd基因的活性和/或表达和iv)引入或改变优选具有SEQ ID NO:47的序列和/或编码SEQ ID NO:48的多肽的zipA基因的活性和/或表达和v)引入具有改变的活性和/或表达的ygaW基因或引入突变到内源ygaW基因中，其具有SEQ ID NO:3,56,58或60的序列和/或编码SEQ ID NO:4,57,59或61的多肽。

在用于生产本发明的重组微生物的方法的一个实施方案中，微生物选自棒杆菌属的种，例如，嗜乙酰棒杆菌,谷氨酸棒杆菌,美棒杆菌,嗜乙酰乙酸棒杆菌,醋谷棒杆菌，芽孢杆菌属物种，例如，苏云金芽孢杆菌，炭疽杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌,环状芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,灿烂芽孢杆菌,凝固芽孢杆菌,短芽孢杆菌,坚强芽孢杆菌,B.alkaophius,地衣芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌,耐盐芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,和解淀粉芽孢杆菌，欧文氏菌属的种，例如,噬夏孢欧文氏菌,胡萝卜软腐欧文氏菌,E.ananas,草生欧文氏菌,E.punctata和E.terreus，埃希氏菌属的种，例如，大肠杆菌，泛菌属的种，例如，柠檬泛菌，成团泛菌，链霉菌属的种，例如，产二素链霉菌,不产色链霉菌,除虫链霉菌,天蓝色链霉菌,生金色链霉菌,金色链霉菌,杀真菌素链霉菌,灰色链霉菌，浅青紫链霉菌，发酵单胞菌属的种，例如，运动发酵单胞菌或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)和红球菌属的种，例如，混浊红球菌。

微生物优选选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae),优选埃希氏菌属(Escherichia),例如大肠杆菌(E.coli),优选菌株大肠杆菌W,其对应于DSMZ 1116,其对应于ATCC9637。

本发明的另一实施方案是产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的方法，包括在允许产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的条件下培养如上文定义的一种或多种重组微生物。

在一些实施方案中，本发明包括的重组微生物在分批或连续发酵条件下生长。典型的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不受到人工改变。分批系统的变型是补料分批发酵。在该变型中，随着发酵进行，底物作为增量加入。当分解代谢抑制可能抑制细胞的代谢和希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是也有用的。分批发酵和补料分批发酵在本领域是常见和公知的。在本发明中也可使用的连续发酵是这样的系统，其中向生物反应器连续加入确定的发酵培养基并且通常取出等量的条件培养基(例如，含有希望的终产物)用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要在生长期，其中终产物的产生被增强。连续发酵系统努力保持稳态生长条件。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术是工业微生物领域公知的。

在一些实施方案中，在约10℃到约60℃,约15℃到约50℃,约20℃到约45℃,约25℃到约45℃,约30℃到约45℃和约25℃到约40℃范围内的温度下进行发酵。在优选实施方案中，温度是约34℃,35℃或36℃。在最优选实施方案中，温度是约37℃或38℃。

在一些其他实施方案中，发酵进行约8小时到240小时，约8小时到240小时,约8小时到约168小时,约10小时到约144小时,约15小时到约120小时,或约20小时到约72小时的时间。优选地，发酵进行约20小时到约40小时。

在一些其他实施方案中，发酵在约4到约9的范围内、约4.5到约8.5的范围内、约5到约8的范围内、约5.5到约7.5的范围内的pH下进行。发酵将优选在7的pH下进行。

在产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的方法的一个实施方案中，微生物培养在包含1％和30％(w/v)之间的糖,5％和25％(w/v)之间的糖,10％和20％(w/v)之间的糖,14％和18％(w/v)之间的糖的培养基中。微生物优选培养在包含15％和17％(w/v)之间的糖的培养基中。

在产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的方法的另一实施方案中，丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸的产率是至少80％例如至少81％,至少82％,至少83％,至少84％或至少85％。产率优选是至少86％,至少87％,至少88％,至少89％或至少90％。产率更优选是至少90.5％,至少91％,至少91.5％,至少92％,至少92.5％,至少93％,至少93.5％,至少94％或至少94.5％。在甚至更优选的实施方案中，产率是至少95％或至少95.5％。在最优选的实施方案中，产率是至少96％。产率百分数计算为从培养基中葡萄糖克数产生的产物克数。所以，当培养基含有100g葡萄糖并且发酵产生98g丙氨酸时，产率将是98％。

在产生丙氨酸的方法的另一实施方案中，优选产生L-丙氨酸，其中L-丙氨酸的手性纯度是至少90％,至少91％,至少92％,至少93％或至少94％。在优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少95％或至少95.5％。在更优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少96％或至少96.5％或至少97％。在甚至更优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少97.5％,至少98％或至少98.5％例如至少99％。甚至更优选地，L-丙氨酸的手性纯度是至少99.5％或至少99.6％例如至少99.7％,至少99.8％,或至少99.9％。在最优选实施方案中，产生手性纯的L-丙氨酸。

本发明的另一实施方案是培养或生长如上文定义的遗传修饰的微生物的方法，该方法包括用一种或多种遗传修饰的微生物接种培养基并在如上文定义的条件下在培养基中培养或生长所述遗传修饰的微生物。

如上文定义的重组微生物或如上文定义的组合物用于发酵生产丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的用途是本发明的额外实施方案。

根据本发明的重组微生物的特征在于，与各自的参比微生物，如野生型相比，由lpd基因编码的酶的表达和/或活性增加了和/或由zipA基因编码的酶的表达和/或活性增加了或改变了和/或通过在SEQ ID NO:1的13－15位密码子或SEQ ID NO:1的功能等同物的相应密码子中引入突变，改变了ygaW基因的活性和/或表达。

在一个实施方案中，通过失活、突变或敲除基因实现该基因的表达和/或活性的减少。这可以如下进行：通过缺失该基因的编码区和/或启动子的部分或全部，通过突变该基因，如插入或缺失许多核苷酸，例如，一个或两个核苷酸，导致该基因编码区的移码，在编码区中引入终止密码子，通过例如缺失或突变启动子框，如核糖体进入位点，TATA框等失活该基因的启动子。减少也可以通过例如通过引入核酶、dsRNA、反义RNA或反义寡核苷酸降解基因的转录物来实现。基因活性的减少可以通过在细胞中表达特异结合靶标酶的抗体或适体来实现。减少基因的表达和/或活性的其他方法是技术人员已知的。

在本发明的一个实施方案中，通过在基因中引入突变，优选导致SEQ ID 50的蛋白质的70位氨基酸从丙氨酸改变为脯氨酸的点突变，实现lpd基因表达和/或活性的增加。

优选地，通过在lpd基因中引入突变实现lpd基因表达和/或活性的增加，其中突变的lpd基因具有编码SEQ ID NO:52的蛋白质的SEQ ID NO:51的序列。

在本发明的一个实施方案中，通过在基因中引入突变，优选点突变实现zipA基因表达和/或活性的增加。更优选地，将点突变引入SEQ ID NO:45编码的zipA基因或其功能等同物的密码子913-915中，导致各自蛋白质305位氨基酸精氨酸交换成甘氨酸或另一脂族氨基酸或与甘氨酸相关的氨基酸，如表2中所示。

优选地，通过在zipA基因中引入突变实现zipA基因的表达和/或活性的增加，其中所示突变的zipA基因具有编码SEQ ID NO:48的蛋白质的SEQ ID NO:47的序列。

本文公开的酶的减少的表达和/或活性，尤其乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)、双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶(adhE)、磷酸乙酰基转移酶(pta)和/或延胡索酸还原酶(frdA)编码的酶的减少的表达和/或减少的活性可以是与各自参比微生物，如野生型微生物中所述酶的表达和/或活性相比，表达和/或酶活性减少至少50％，或表达和/或酶活性减少至少90％，或更优选表达和/或酶活性减少至少95％，或更优选表达和/或酶活性减少至少98％，或甚至更优选表达和/或酶活性减少至少99％，或甚至更优选表达和/或酶活性减少至少99.9％。在最优选的实施方案中，在本发明的微生物中检测不到酶的表达和/或活性。

本文公开的酶的增强的或增加的表达和/或活性，尤其lpd-基因和/或zipA-基因和/或ygaW基因编码的酶的增强的或增加的表达和/或活性可以是表达和/或酶活性与各自参比微生物例如野生型微生物中所述酶的表达和/或活性相比增加至少25％，或表达和/或酶活性增加至少50％，或更优选表达和/或酶活性增加至少100％，或更优选表达和/或酶活性增加至少3倍，例如至少5倍，或甚至更优选表达和/或酶活性增加至少10倍，或甚至更优选表达和/或酶活性增加至少20倍。

lpd基因和/或zipA基因和/或ygaW基因的表达和/或活性的增加导致与各自参比微生物相比在本发明的重组微生物中丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的提高的产率和/或生产力。因此，通过测量与各自参比微生物相比，本发明的重组微生物的丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸产率或生产力可以测定lpd基因和/或zipA基因和/或ygaW基因的表达和/或活性的增加。发酵生产代谢物，例如丙氨酸的方法是技术人员已知的并且也在本文中描述。与各自参比微生物发酵中丙氨酸的产率相比，本发明微生物的发酵中例如丙氨酸的提高的产率是lpd基因和/或zipA基因和/或ygaW基因的表达和或活性增加的度量。

测定乳酸脱氢酶(ldhA)表达或活性的方法例如由Bunch et al.在“The ldhAgene encoding the fermentative lactate de hydrogenase of Escherichia Coli”,Microbiology(1997),Vol.143,pages 187-155；or Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer J.andGrassl,M.(1983-1986)在“Methods of Enzymatic Analysis”,3rd Edition,Volume III,pages 126-133,Verlag Chemie,Weinheim；或Enzymes in Industry:Production andApplications,Second Edition(2004),Wolfgang Aehle,page 23中公开。优选最后一种方法。

测定丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)表达或活性的方法例如公开于Knappe J,Blaschkowski HP,Grobner P,Schmitt T(1974)."Pyruvate formate-lyase ofEscherichia coli:the acetyl-enzyme intermediate."Eur J Biochem 1974；50(1)；253-63.PMID:4615902；KNAPPE,Joachim,et al."Pyruvate Formate‐Lyase ofEscherichia coli:the Acetyl‐Enzyme Intermediate."European Journal ofBiochemistry 50.1(1974):253-263；in Wong,Kenny K.,et al."Molecular propertiesof pyruvate formate-lyase activating enzyme."Biochemistry 32.51(1993):14102-14110和Nnyepi,Mbako R.,Yi Peng,and Joan B.Broderick."Inactivation of E.colipyruvate formate-lyase:Role of AdhE and small molecules."Archives ofbiochemistry and biophysics 459.1(2007):1-9。

测定双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶(adhE)表达或活性的方法例如公开于Membrillo-Hernández,Jorge,et al."Evolution ofthe adhE Gene Product of Escherichia coli from a Functional Reductase to aDehydrogenase GENETIC AND BIOCHEMICAL STUDIES OF THE MUTANT PROTEINS."Journalof Biological Chemistry 275.43(2000):33869-33875和Mbako R.Nnyepi,Yi Peng,JoanB.Broderick,Inactivation of E.coli pyruvate formate-lyase:Role of AdhE andsmall molecules,Archives of Biochemistry and Biophysics,Volume 459,Issue 1,1March 2007,Pages 1-9。

测定磷酸乙酰基转移酶(pta)表达或活性的方法例如公开于Dittrich,CherylR.,George N.Bennett,and Ka‐Yiu San."Characterization of the Acetate‐ProducingPathways in Escherichia coli."Biotechnology progress 21.4(2005):1062-1067和Brown,T.D.K.,M.C.Jones-Mortimer,and H.L.Kornberg."The enzymic interconversionof acetate and acetyl-coenzyme A in Escherichia coli."Journal of generalmicrobiology 102.2(1977):327-336。

测定延胡索酸还原酶(frdA)表达或活性的方法例如公开于Dickie,Peter,andJoel H.Weiner."Purification and characterization of membrane-bound fumaratereductase from anaerobically grown Escherichia coli."Canadian journal ofbiochemistry 57.6(1979):813-821；Cecchini,Gary,et al."Reconstitution ofquinone reduction and characterization of Escherichia coli fumarate reductaseactivity."Journal of Biological Chemistry 261.4(1986):1808-1814或

I.,et al."Identification of active site residues of Escherichia coli fumaratereductase by site-directed mutagenesis."Journal of Biological Chemistry266.21(1991):13572-13579。

测定丙氨酸脱氢酶(alaD)表达或活性的方法例如公开于Sakamoto,Y.,Nagata,S.,Esaki,N.,Tanaka,H.,Soda,K."Gene cloning,purification and characterizationof thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus"JFermen.Bioeng.69(1990):154-158。

术语“酶的减少的表达”包括例如所述遗传操作的(例如，基因工程化的)微生物对所述酶的表达处于比各自参比微生物例如所述微生物的野生型表达的水平更低的水平。用于酶的减少表达的遗传操作可以包括但不限于，缺失编码所述酶的基因或其部分，改变或修饰与编码所述酶的基因相关的调节序列或位点(例如，通过去除强启动子或抑制性启动子)，修饰涉及编码所述酶的基因的转录的蛋白质(例如，调节蛋白，抑制基因，增强子，转录激活子等)和/或基因产物的翻译，或本领域常规的减少特定基因表达的任何其他常规手段(包括但不限于，使用反义核酸分子或其他方法敲除或阻断靶蛋白的表达)。此外，可以在mRNA中引入去稳定元件或引入遗传修饰，导致RNA的核糖体结合位点(RBS)的恶化。还可能以降低翻译效率和速度的方式改变基因的密码子选择。

通过引入导致酶的减少的活性的一个或多个有害的基因突变也可以获得酶的减少的活性。此外，酶活性的减少也可以包括活化酶的失活(或减少的表达)，所述活化酶是活化待减少其活性的酶必要的。通过后一方法，待减少其活性的酶优选保持在失活状态。

根据本申请的有害突变是包含启动子和编码区的基因内的任何突变，所述突变导致该基因的编码区编码的蛋白质的减少的或缺失的蛋白质活性。此类有害突变包括例如，移码，编码区中终止密码子的引入，启动子元件如TATA框的阻止转录的突变，等。

具有lpd-基因和/或zipA-基因和/或ygaW-基因编码的酶的增加的或增强的表达和/或活性的微生物可以天然发生，即由于自发突变。通过多种技术，如化学处理或辐射，可以修饰微生物以具有一种或多种所述基因编码的酶的显著增加的活性。为此，通过例如诱变化学剂、X射线或紫外线处理微生物。在随后步骤中，将选择具有一种或多种所述基因编码的酶的增加的表达和/或活性的那些微生物。通过同源重组技术也可以获得重组微生物，所述技术旨在将一种或多种所述基因用相应基因替换，所述相应基因编码与野生型基因编码的酶相比具有增加的表达和/或活性的酶。

根据本发明重组微生物的一个实施方案，lpd-基因和/或zipA-基因和/或ygaW-基因编码的酶的表达和/或活性的增加可以通过修饰lpd-基因和/或zipA-基因和/或ygaW-基因实现，其中这个/这些基因修饰优选通过如下实现：微生物基因组中lpd基因和/或zipA-基因和/或ygaW-基因拷贝数的扩增，将自身复制表达载体上的基因引入微生物中，将lpd-基因和/或zipA-基因和/或ygaW-基因的启动子与强启动子交换或将该基因的内源启动子转换成强启动子，例如，通过将点突变引入启动子序列中。此外，lpd-基因和/或zipA-基因和/或ygaW-基因的活性可以通过突变该基因增强以便实现蛋白质中氨基酸交换，其提高了该基因的活性。此类方法是技术人员已知的。

向上面基因的突变可以如下引入，例如通过定向或随机诱变，接着通过重组将经修饰的基因引入微生物的基因组中。通过PCR突变基因序列可以产生基因的变体。“Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit”(Stratagene)可以用于实施定向诱变。在整个编码序列或仅仅其部分上的随机诱变可以借助“GeneMorph II RandomMutagenesis Kit”(Stratagene)实施。通过使用的模板DNA的量将诱变率设置成所希望的突变量。通过各个突变的靶向组合或者通过几个诱变循环的顺序实施产生多个突变。

在下文中，描述了用于重组，尤其用于引入突变或缺失序列的合适技术。

该技术在本文有时也被称作“坎贝尔重组”(“Campbell recombination”)(Leenhouts et al.,Appl Env Microbiol.(1989),Vol.55,pages 394-400)。如本文所用的“坎贝尔进”(“Campbell in”)指原始宿主细胞的转化体，其中整个环状双链DNA分子(例如，质粒)已经通过单次同源重组事件(事件中一次杂交)整合到染色体中，并且有效导致所述环状DNA分子的线性化形式插入到染色体的第一个DNA序列中，所述第一个DNA序列与所述环状DNA分子的第一个DNA序列同源。“被坎贝尔进”(“Campbelled in”)指线性化DNA序列，其已经整合到“坎贝尔进”转化体的染色体中。“坎贝尔进”含有第一个同源DNA连续的副本，其每个拷贝包括并且围绕同源重组交换点的一个拷贝。

如本文所用的“坎贝尔出”(“Campbell out”)指“坎贝尔进”转化体的后代细胞，其中已经在“被坎贝尔进”DNA的线性化插入的DNA上含有的第二个DNA序列和与所述线性化插入序列的第二个DNA序列同源的染色体来源的第二个DNA序列之间发生了第二次同源重组事件(交换出事件)，所述第二次重组事件导致缺失(抛弃)一部分整合的DNA序列，但是重要的是也导致一部分(这可以小至单个碱基)整合的“被坎贝尔进”的DNA保留在染色体中，使得与最初的宿主细胞相比，“坎贝尔出”细胞在染色体中含有一个或多个有意的改变(例如，单碱基替代、多个碱基替代、插入异源基因或DNA序列、插入额外的一个或多个拷贝的同源基因或经修饰的同源基因，或者插入包含一个以上的上面列出的这些前述实例的DNA序列)。“坎贝尔出”细胞优选通过对一部分(希望被抛弃的部分)“被坎贝尔进”的DNA序列中所含的基因进行反选择得到，所述基因如枯草芽孢杆菌sacB基因，其当在约5％到10％蔗糖存在下生长的细胞中表达时是致死性的。使用或不使用反选择，可以通过使用任一种可筛选的表型，通过筛选希望的细胞得到或鉴定所希望的“坎贝尔出”细胞，所述表型为诸如但不限于，菌落形态、菌落颜色、抗生素抗性的存在或缺失、通过聚合酶链式反应检测的给定DNA序列的存在或缺失、辅源营养的存在或缺失、酶的存在或缺失、菌落核酸杂交、抗体筛选等等。术语“坎贝尔进”和“坎贝尔出”也可以在多种时态中用作动词指上述方法或过程。

可以理解导致“坎贝尔进”或“坎贝尔出”的同源重组事件可以在同源DNA序列的DNA碱基范围内发生，并且因为同源序列将对于该范围的至少部分是彼此相同的，所以通常不可能精确地指出交换事件发生的地方。换句话说，不可能精确地指出哪个序列最初来自所插入的DNA，哪个最初来自染色体DNA。此外，第一个同源DNA序列和第二个同源DNA序列通常通过部分非同源区域分隔，并且该非同源区域保留在“坎贝尔出”细胞的染色体中。

优选地，第一个和第二个同源DNA序列通常长为至少约200个碱基对，并且可以长达几千个碱基对。然而，该程序可以改变以用于更短或更长的序列。例如，第一个和第二个同源序列的长度可以为约500到2000个碱基，并且通过将第一个和第二个同源序列以大约相同的长度排列，优选具有小于200个碱基对的不同，最优选两个序列较短者为较长者长度(碱基对)的至少70％，方便从“坎贝尔进”得到“坎贝尔出”。

在一个实施方案中，通过活化编码硫辛酰胺脱氢酶的lpd-基因实现lpd的表达和/或活性的诱导。

在一个实施方案中，通过活化编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因实现zipA的表达和/或活性的诱导。

如在本发明上下文中使用的术语“丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸”必须以它们最广的意义上理解并且也包括其盐，例如丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的碱金属盐，像Na⁺和K⁺-盐，或碱土金属盐，像Mg²⁺和Ca²⁺-盐，或者铵盐或酐类。

优选地，丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸在微好氧条件下产生。也可以使用好氧或缺氧条件。

微好氧指氧气的浓度小于空气中氧气的浓度。根据一个实施方案，微好氧指5到27mm Hg，优选10到20Hg的氧张力(Megan Falsetta et al.(2011),The composition andmetabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms,Frontiers inMicrobiology,Vol 2,page 1to 11)。优选地，用0.1到1vvm通气量建立微好氧条件。

缺氧条件可以通过常规技术建立，例如通过对反应培养基中的成分脱气并通过例如以0.1到1或0.2到0.5vvm的流速导入二氧化碳或氮气或其混合物和任选地氢气维持缺氧条件。好氧条件可以通过常规技术建立，例如，通过以0.1到1或0.2到0.5vvm的流速导入空气或氧气。如果合适，可以在该过程中应用0.1到1.5巴的轻度超压。

根据本发明的方法的一个实施方案，可同化的碳源可以是葡萄糖、甘油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、棉子糖和其组合。

在优选实施方案中，可同化的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘油或其组合。优选的碳源是葡萄糖、蔗糖、葡萄糖和蔗糖、葡萄糖和木糖和/或葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。根据本发明的方法的一个实施方案，可同化的碳源可以是蔗糖、甘油和/或葡萄糖。

可同化的碳源的初始浓度，优选初始浓度优选被调节到5到250g/l,优选50到200g/l并且更优选125到150g/l的范围，最优选约140g/l的值并且可以在培养期间保持在所述范围内。反应培养基的pH可以通过加入合适的碱来控制，例如气体氨，NH₄OH_,NH₄HCO₃,(NH₄)₂CO₃,NaOH,Na₂CO₃,NaHCO₃,KOH,K₂CO₃,KHCO₃,Mg(OH)₂,MgCO₃,Mg(HCO₃)₂,Ca(OH)₂,CaCO₃,Ca(HCO₃)₂,CaO,CH₆N₂O₂,C₂H₇N，和/或其混合物。

本发明的另一实施方案是发酵产生丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸的方法，包括步骤

I)在发酵罐中培养如上文定义的根据本发明的微生物和

II)从I)中含有的培养液回收丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸。

根据本发明的发酵步骤I)可以例如在搅拌发酵罐、鼓泡塔和环式反应器中进行。可能的方法类型包括搅拌器类型和几何设计的广泛综述可以见Chmiel:“Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,Volume 1。在本发明的方法中，可用的典型的变型是本领域技术人员已知的或在例如Chmiel,Hammes andBailey:“Biochemical Engineering”中解释的以下变型，如分批、补料分批、重复补料分批或其他连续发酵，使用和不用生物量的回收。取决于生产菌株，可以实现用空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或合适的其他混合物进行喷射以便实现良好的产率(YP/S)。

方法步骤I)中用于产生丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸的尤其优选的条件是：

可同化的碳源： 葡萄糖

温度: 30到45℃

pH: 6.0到7.0

微好氧条件

在方法步骤II)中，从方法步骤I)中获得的发酵液回收产物。

通常，回收方法包括从发酵液分离重组微生物如所谓的“生物量”的步骤。去除生物量的方法是本领域技术人员已知的，并且包括过滤、沉降、浮选或其组合。因此，例如用离心机、分离器、倾板器、过滤器或在浮选装置中去除生物量。为了最大回收价值产物，通常建议例如，以渗滤的形式洗涤生物量。方法的选择取决于发酵液中的生物量含量和生物量的性质，以及生物量与有机化合物(即价值产物)的相互作用。在一个实施方案中，可以对发酵液灭菌或巴氏消毒。在另一实施方案中，浓缩发酵液。取决于需要，该浓缩可以分批进行或连续进行。应该选择压力和温度范围使得首先不发生产物损坏，其次装置和能量的最小使用是必要的。多级蒸发的压力和温度水平的有技巧的选择尤其使得能够节省能量。

回收方法可以进一步包含额外的纯化步骤，其中进一步纯化发酵产物。然而，发酵产物通过化学反应转化为次级有机产物，那么取决于反应类型和反应条件，发酵产物的进一步纯化不是必需的。对于纯化方法步骤II)中获得的发酵产物，可以使用本领域技术人员已知的方法，例如结晶、过滤、电渗析和层析。可以通过离子交换层析进一步纯化所得溶液以便去除不想要的残留离子。

在一个实施方案中，通过向野生型基因中引入突变实现lpd基因的增强的或增加的表达和/或活性。优选地，其通过在具有SEQ ID NO:1的野生型基因或其功能变体的208-210位的密码子中引入特定突变实现。

因此，本发明的另一实施方案是重组核酸分子，其具有选自下组的序列

(1)包含SEQ ID NO:49的序列的核酸分子，或

(2)与SEQ ID NO:49的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(3)与具有SEQ ID NO:49的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(4)编码SEQ ID NO:50的多肽的核酸分子,或

(5)编码与SEQ ID NO:50的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中在(1)到(5)项下基因的对应于SEQ ID NO:49的208-210位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者在(1)到(5)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:50的70位的氨基酸不是丙氨酸，并且

其中在上面(1)到(5)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有增强的丙氨酸产率。

优选地，重组核酸分子具有选自下组的序列

(6)包含SEQ ID NO:51的序列的核酸分子，或

(7)与SEQ ID NO:51的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(8)与具有SEQ ID NO:51的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(9)编码SEQ ID NO:52的多肽的核酸分子,或

(10)编码与SEQ ID NO:52的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中在(7)到(10)项下基因的对应于SEQ ID NO:51的208-210位的密码子编码氨基酸脯氨酸或者在(7)到(10)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:52的70位的氨基酸是脯氨酸，并且

其中在上面(7)到(10)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:52的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有增强的丙氨酸产率。

在另一实施方案中，通过在野生型基因中引入突变实现zipA基因的增强的、增加的或改变的表达和/或活性。优选地，其通过在具有SEQ ID NO:45的野生型基因或其功能变体的913-915位密码子中引入特定突变实现。

因此，本发明的另一实施方案是重组核酸分子，其具有选自下组的序列

(1)包含SEQ ID NO:45的序列的核酸分子，或

(2)与SEQ ID NO:45的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(3)与具有SEQ ID NO:45的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(4)编码SEQ ID NO:46的多肽的核酸分子,或

(5)编码与SEQ ID NO:46的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，并且

其中在(1)到(5)项下基因的对应于SEQ ID NO:45的913-915位的密码子不编码氨基酸精氨酸并且不是终止密码子或者在(1)到(5)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:46的305位的氨基酸不是精氨酸，并且

其中在上面(1)到(5)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:46的蛋白质相比具有增强的或增加或改变的活性，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

优选地，重组核酸分子具有选自下组的序列

(6)包含SEQ ID NO:47的序列的核酸分子，或

(7)与SEQ ID NO:47的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(8)与具有SEQ ID NO:47的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(9)编码SEQ ID NO:48的多肽的核酸分子,或

(10)编码与SEQ ID NO:48的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中在(7)到(10)项下基因的对应于SEQ ID NO:47的913-915位的密码子编码氨基酸甘氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸或者在(7)到(10)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:48的305位的氨基酸是甘氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸，并且

其中在上面(7)到(10)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:48的蛋白质相比具有增强的、增加或改变的活性，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

在另一实施方案中，通过在野生型ygaW基因中引入突变实现丙氨酸或相关化合物的增强的或增加的产率和/或生产力。

因此，本发明的一个实施方案是重组核酸分子，其具有选自下组的序列

(1)包含SEQ ID NO:1的序列的核酸分子，或

(2)与SEQ ID NO:1的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(3)与具有SEQ ID NO:1的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(4)编码SEQ ID NO:2的多肽的核酸分子,或

(5)编码与SEQ ID NO:2的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，并且

其中在(1)到(5)项下基因的对应于SEQ ID NO:1的13-15位的密码子不编码氨基酸谷氨酰胺并且不是终止密码子或者在(1)到(5)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:2的5位的氨基酸不是谷氨酰胺，并且

其中在上面(1)到(5)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:2的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

优选地，重组核酸分子具有选自下组的序列

(6)包含SEQ ID NO:3,56,58或60的序列的核酸分子，或

(7)与SEQ ID NO:3,56,58或60的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(8)与具有SEQ ID NO:3,56,58或60的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(9)编码SEQ ID NO:4,57,59,或60的多肽的核酸分子,或

(10)编码与SEQ ID NO:4,57,59,或60的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中在(7)到(10)项下基因的对应于SEQ ID NO:3的13-15位的密码子编码氨基酸组氨酸或相关氨基酸或另一碱性氨基酸或者编码氨基酸精氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸或编码氨基酸精氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸或编码氨基酸酪氨酸或相关氨基酸或另一芳族氨基酸或在(7)到(10)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:2的5位的氨基酸是组氨酸或相关氨基酸或另一碱性氨基酸或者是天冬酰胺或相关氨基酸或另一脂族氨基酸或者是精氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸或是酪氨酸或相关氨基酸或另一芳族氨基酸，并且

其中在上面(7)到(10)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:2的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

术语“相关氨基酸”或“保守氨基酸取代”指氨基酸被具有相似侧链的氨基酸替代。相关氨基酸列表在下面的表2中给出。保守取代表是本领域公知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds)和下面的表2)。

表2:保守氨基酸取代的实例

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu,Val

在优选实施方案中，重组核酸分子具有SEQ ID NO:3,56,58,60,47或51并且编码具有SEQ ID NO:4,57,59,61,48或52的蛋白质。

本发明的另一实施方案是具有选自下组的序列的重组氨基酸分子

(11)包含SEQ ID NO:52的序列的氨基酸分子，或

(12)与SEQ ID NO:52的多肽有60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，

其中(12)下蛋白质的对应于SEQ ID NO:52的70位的氨基酸是脯氨酸，并且

其中上面在(12)下定义的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:52。

本发明的另一实施方案是具有选自下组的序列的重组氨基酸分子

(11)包含SEQ ID NO:48的序列的氨基酸分子，或

(12)与SEQ ID NO:48的多肽有60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，

其中(12)下蛋白质的对应于SEQ ID NO:48的305位的氨基酸是甘氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸，并且

其中上面在(12)下定义的蛋白质与具有SEQ ID NO:46的蛋白质相比具有增强的、增加的或改变的活性，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:48。

本发明的另一实施方案是具有选自下组的序列的重组氨基酸分子

(11)包含SEQ ID NO:4,57,59或61的序列的氨基酸分子，或

(12)与SEQ ID NO:4,57,59或61的多肽有60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，

其中(12)下蛋白质的对应于SEQ ID NO:4的5位的氨基酸是组氨酸或相关氨基酸或另一碱性氨基酸，并且

其中(12)下蛋白质的对应于SEQ ID NO:57的5位的氨基酸是天冬酰胺或相关氨基酸或另一脂族氨基酸，并且

其中(12)下蛋白质的对应于SEQ ID NO:59的5位的氨基酸是精氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸，并且

其中(12)下蛋白质的对应于SEQ ID NO:61的5位的氨基酸是酪氨酸或相关氨基酸或另一脂族氨基酸，并且

如上面在(12)下定义的蛋白质与具有SEQ ID NO:2的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:4,57,59或61。

本发明的另一实施方案是重组表达构建体，其包含与上面(1)到(5)项中定义的核酸有效连接的在微生物中有功能的启动子。

本发明的另一实施方案是重组载体，其包含上面(1)到(5)项中定义的核酸分子或上文定义的重组表达构建体。

本发明的另一实施方案是在微生物例如大肠杆菌中有功能的启动子，其具有选自下组的序列：

(I)包含SEQ ID NO:54或55的序列的核酸分子，或

(II)与SEQ ID NO:54或55的核酸分子具有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(III)与具有SEQ ID NO:54或55的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子或

(IV)具有SEQ ID NO:54或55的核酸分子的至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸,至少30个核苷酸或至少40个核苷酸的片段，更优选至少50个核苷酸,至少75个核苷酸或至少100个核苷酸,甚至更优选至少150个或至少200个核苷酸的片段。优选地，SEQ ID NO:54或55的片段是包含SEQ ID NO:54或55的3’区的片段，因此，该片段在SEQ ID NO:54或55的5’末端包含缺失。

优选地，如(II)到(IV)中定义的核酸分子在本文定义的微生物中具有启动子活性。

本发明的另一实施方案是重组表达构建体，其包含在微生物中有功能的上面(I)到(IV)项中定义的启动子，该启动子有效连接待与上面(I)到(IV)项中定义的启动子异源表达的核酸。

本发明的另一实施方案是重组载体，其包含如上面(I)到(IV)项中定义的核酸分子或如上面定义的重组表达构建体。

本发明的另一实施方案是重组微生物，其包含如上文定义的重组表达构建体或如上文定义的载体。优选地，所述微生物选自本文列出的微生物。

本发明的另一实施方案是在微生物中表达核酸分子的方法，包括将如上文定义的启动子功能连接到待表达的异源核酸分子，从而产生重组表达构建体并将所述表达构建体引入微生物中。本发明的启动子可以通过重组DNA技术在微生物外功能连接到待表达的核酸分子并随后引入到微生物中或者其可以通过引入待表达的核酸到微生物的基因组中位于微生物中存在的本发明的启动子附近而功能连接，从而将待表达的的核酸连接到本发明的启动子。

本发明的另一实施方案是如上定义的启动子、如上文定义的重组表达构建体或如上文定义的载体在微生物中表达核酸分子的用途。

定义

将理解本发明不限于具体的方法学或方案。还将理解本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意在限制本发明的范围，所述范围将仅受到所附权利要求的限定。必须指出如本文和所附权利要求书所用的，单数形式“一个”和“这个”包括其复数指代，除非上下文清楚地指出相反意思。从而，例如，对“一个载体”的指代是对一个或多个载体的指代并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。术语“约”在本文中用于指大约、大概、大抵或在区域中。当术语“约”与数字范围连用时，其通过将所给出的数字值上面和下面的边界延伸而修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于将所述值上面和下面的数值修饰20％上下，优选10％上下的变化(更高或更低)。如本文所用的术语“或”指具体列表的任一成员并且也包括该列表中成员的任一组合。术语“包含”和“包括”当用于说明书中和下面的权利要求时，意在说明存在一个或多个所述特征、整数、成分或步骤，但是它们不排除存在或加入一个或多个其他特征，整数、成分、步骤或其组。为了清楚起见，说明书中使用的某些术语在下文中定义和使用：

编码区：如本文所用的术语“编码区”当参考结构基因使用时，指核苷酸序列，其编码由于mRNA分子翻译的结果在新生多肽中发现的氨基酸。编码区在真核生物中结合在编码起始氨基酸甲硫氨酸的核苷酸三联体"ATG"的5’侧，原核生物也使用三联体“GTG”和“TTG”作为起始密码子。在3’侧，其被指定终止密码子(即,TAA,TAG,TGA)的三个三联体之一结合。此外，基因可以包括存在于RNA转录物上的序列的5’和3’末端两者上的序列。这些序列被称作“侧翼”序列或区域(这些测序序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可以含有调节序列，如启动子和增强子，其控制或影响基因的转录。3’侧翼区可以含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。

互补的：“互补的”或“互补性”指包含反向平行核苷酸序列的两个核苷酸序列，当反向平行核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键时，所述反向平行核苷酸序列能够彼此配对(通过碱基配对原则)。例如，序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'互补。互补性可以是“部分的”或“完全的”。“部分”互补性是其中根据碱基配对原则，一个或多个核酸碱基不匹配。核酸分子之间的“完全”或“全部”互补性是其中根据碱基配对原则，每个核酸碱基与另一个碱基匹配。核酸分子之间的互补性程度对核酸分子链之间杂交的有效性和强度有重要影响。如本文所用的核酸序列的“互补序列”指核苷酸序列，其核酸分子显示出与该核酸序列的核酸分子的完全互补性。

内源的：“内源”核苷酸序列指核苷酸序列，其存在于野生型微生物的基因组中。

增强的表达：“增强”或“增加”微生物中核酸分子的表达在本文等同使用并且意指与参比微生物，如野生型相比，在微生物中核酸分子的表达水平更高。如本文所用的术语“增强的”或“增加的”指待表达的核酸分子的更高，优选显著更高的表达。如本文所用的，试剂，如蛋白质、mRNA或RNA的水平的“增强”或“增加”指相对于在基本相同的条件下生长的基本相同的微生物，水平增加了。如本文所用的，试剂，如靶基因表达的preRNA,mRNA,rRNA,tRNA和/或其编码的蛋白质产物水平的“增强”或“增加”意指相对于合适的参比微生物，水平增加50％或以上，例如，100％或以上，优选200％或以上，更优选5倍或以上，甚至更优选10倍或以上，最优选20倍或以上，例如50倍。通过技术人员熟悉的方法可以确定增强或增加。从而，核酸或蛋白质量的增强或增加可以例如通过蛋白质的免疫学检测来测定。此外，诸如蛋白质测定法、荧光、Northern杂交、核酸酶保护测定法、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、蛋白质印迹、放射免疫测定法(RIA)或其他免疫测定法和荧光激活的细胞分析(FACS)的技术可以用于测量微生物中的特定蛋白质或RNA。取决于所诱导的蛋白质产物的类型，也可以测定其活性或对微生物表型的影响。测定蛋白质的量的方法是技术人员已知的。可以提及的实例是micro-Biuret方法(Goa J(1953)Scand J Clin LabInvest 5:218-222),Folin-Ciocalteau方法(Lowry OH et al.(1951)J Biol Chem 193:265-275)或测量CBB G-250的吸收(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。

表达：“表达”指基因产物的生物合成，优选指核苷酸序列，例如内源基因或异源基因在细胞中的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mRNA，并且任选地，mRNA随后翻译成一种或多种多肽。在其他情况下，表达可以仅仅指含有RNA分子的DNA的转录。

外来的：术语“外来的”指通过实验操作导入细胞的任何核酸分子(例如，基因序列)并且可以包括在细胞中发现的序列，只要所引入的序列含有一些修饰(例如，点突变、存在选择标记基因等)并且因此相对于天然存在的序列是不同的。

功能连接：术语“功能连接”或“功能连接的”等同于术语“有效连接”或“有效连接的”并且将被理解为指例如调节元件(例如，启动子)与待表达的核酸序列和如果合适，其他调节元件(例如，终止子)以这样的方式顺序排列，使得每个调节元件都可以完成其预期的功能以允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达。可以使用“有效连接”或“有效连接的”作为同义词。该表述可取决于核酸序列关于有义或反义RNA的排列。为此，化学意义上的直接连接不是必需的。遗传控制序列，如增强子序列，也可以从远处或实际上从其他DNA分子对靶序列发挥功能。优选的排列是这样的排列，其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列的后面，从而两个序列彼此共价连接。在优选实施方案中，待转录的核酸序列以这样的方式位于启动子后面，使得转录起始与本发明的嵌合RNA的期望起始相同。功能连接和表达构建体可以通过如所述的惯用重组和克隆技术产生(例如，在Maniatis T,Fritsch EF and Sambrook J(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy et al.(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor(NY)；Ausubel et al.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience；Gelvin et al.(Eds)(1990)PlantMolecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlands中)。然而，例如，作为具有限制酶的特定切割位点的接头或作为信号肽的其他序列也可以位于两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调节区如启动子与待表达的核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在或者可以例如通过转化插入基因组中。

基因：术语“基因”指有效连接合适的调节序列的区域，所述调节序列能够以某种方式调节基因产物(例如，多肽或功能RNA)的表达。基因包括编码区(可读框，ORF)前面(上游)和后面(下游)的DNA的非翻译调节区(例如，启动子、增强子、抑制子，等)。如本文所用的术语“结构基因”意指这样的DNA序列，其被转录成mRNA，mRNA然后被翻译成特定多肽特征性的氨基酸序列。

基因组和基因组DNA：术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包括拟核的DNA以及自主复制质粒的DNA。

异源的：关于核酸分子或DNA的术语“异源的”指核酸分子，其有效连接或被操作而变得有效连接到第二个核酸分子，该第二个核酸分子天然不有效连接所述核酸分子，或者第二个核酸分子与所述核酸分子天然有效连接在不同的位置。包含核酸分子和与其连接的一个或多个调节核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是通过实验操作产生的构建体，其中a)所述核酸分子，或b)所述调节核酸分子或c)两者(即(a)和(b))不位于其天然(自然)遗传环境或已经通过实验操作进行修饰，修饰的例子是一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境指来源生物中天然的遗产基因座或者指在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，优选保留，至少部分保留核酸分子序列的天然遗传环境。所述环境在所述核酸分子的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1,000bp,非常特别优选至少5,000bp长度的序列。天然发生的表达构建体，例如启动子与对应基因的天然发生的组合当被非天然、合成的“人工”方法如诱变修饰时，变成转基因表达构建体。已经描述了此类方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，认为有效连接启动子(其不是该核酸分子的天然启动子)的编码蛋白质的核酸分子与该启动子是异源的。优选地，异源DNA与其所引入的细胞不是内源的或不天然结合，但是已经从另一细胞获得或已经合成。异源DNA也包括含有某种修饰的内源DNA序列，内源DNA序列的非天然发生的多拷贝，或与物理上与其连接的另一DNA序列不天然结合的DNA序列。通常，尽管不是必要的，异源DNA编码这样的RNA或蛋白质，所述RNA或蛋白质通常不是由所述异源DNA在其中表达的细胞产生的。

杂交：如本文所用的术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基配对与互补链结合的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,NewYork)。杂交和杂交的强度(即，核酸分子之间结合的强度)受到诸如核酸分子之间互补性程度，所涉及的条件的严格性，所形成的杂合体的Tm和核酸分子内G:C比例的因素的影响。如本文所用，术语“Tm”参考“解链温度”使用。解链温度是双链核酸分子群体变得半解离为单链时的温度。计算核酸分子的Tm的方程是本领域公知的。如标准参考书所指出，当核酸分子在1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计可以通过以下方程计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)[见例如，Anderson and Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic AcidHybridization(1985)]。其他参考文献包括更复杂的计算，其对于Tm的计算考虑结构以及序列特征。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以见Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。合适的杂交条件是在这样的条件下与包含序列的互补序列的至少50个，优选至少100个，更优选至少150个，甚至更优选至少200个，最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交，所述条件等同于在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4,1mM EDTA，50℃下在2X SSC,0.1％SDS,50℃(低严格性)下洗涤。其他合适的杂交条件是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4,1mM EDTA，50℃下与包含序列的互补序列的至少50个，优选至少100个，更优选至少150个，甚至更优选至少200个，最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交，在1X SSC,0.1％SDS 50℃(中等严格性)或65℃(高严格性)下洗涤。

同一性：当关于两个或多个核酸或氨基酸分子比较使用时，“同一性”指所述分子的序列共有某种程度的序列相似性，所述序列是部分相同的。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸分子的百分数同一性(如果提及核酸序列，同源性在本文可互换使用)，将序列一个写在另一个的下方用于最佳比较(例如，可以在蛋白质或核酸的序列中插入空位以便产生与另一蛋白质或另一核酸的最佳比对)。

然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上氨基酸残基或核酸分子。如果一条序列中的位置与另一条序列中相应位置被相同的氨基酸残基或相同的核酸分子占据，那么所述分子在该位置上是相同的。两条序列之间的百分数同一性是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数x 100)。当提及核酸序列时，术语“同源性”和“同一性”从而被认为是同义词。当提及氨基酸序列时，术语同一性指序列中特定位置上相同氨基酸，术语同源性指序列中特定位置上的同源氨基酸。同源氨基酸是具有相似侧链的氨基酸。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。

编码与本发明的蛋白质同源的蛋白质的核酸分子可以如下来产生：在核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，从而在所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术，如位点定向诱变或PCR介导的诱变向本发明的序列中引入突变。优选地，在一个或多个预期的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β－分支侧链氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。从而，本发明蛋白质中预期的非必需氨基酸优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换。

备选地，在另一实施方案中，可以沿着编码序列的全部或部分随机引入突变，如通过饱和诱变，并且可以筛选所得的突变体的本文所述的各自活性以鉴定保留其活性的突变体。在诱变本发明的序列之一后，可以重组表达所编码的蛋白质并且可以使用例如本文所述的测定法测定蛋白质的活性。

为了测定两个或多个氨基酸序列或两个或多个核苷酸序列的百分数同一性，已经开发了一些计算机软件程序。可以用例如软件fasta计算两个或多个序列的同一性，fasta当前以版本fasta 3使用(W.R.Pearson and D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Methods in Enzymology 183,63(1990)；W.R.Pearson and D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))。用于计算不同序列的同一性的另一有用的程序是标准blast程序，其包括在Biomax pedant软件(Biomax,Munich,Federal Republic of Germany)中。这有时不幸地导致次优结果，因为blast不总是包括主题和查询的完整序列。然而，因为该程序非常有效，其可用于比较巨大数目的序列。下面的设置通常用于这种序列的比较：

-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认值＝nr；-i查询文件[File In]；默认值＝stdin；-e期望值(E)[实数]；默认值＝10.0；-m比对视图选项:0＝逐对；1＝查询锚定的显示同一性；2＝查询锚定的无同一性；3＝平面查询锚定的,显示同一性；4＝平面查询锚定的,无同一性；5＝查询锚定的无同一性和平末端；6＝平面查询锚定的,无同一性和平末端；7＝XML Blast输出；8＝表格式；9表格式具有注释行[整数]；默认值＝0；-o BLAST报告输出文件[文件输出]任选的；默认值＝stdout；-F过滤器查询序列(DUST with blastn,SEGwith others)[字符串]；默认值＝T；-G打开空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认值＝0；-E延伸空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认值＝0；-X空位比对的X减少值(比特)(0调用默认行为)；blastn 30,megablast 20,tblastx 0,所有其他的15[整数]；默认值＝0；-I Show GI's in deflines[T/F]；默认值＝F；-q核苷酸错配的惩罚(仅blastn)[整数]；默认值＝-3；-r核苷酸匹配的奖励(仅blastn)[整数]；默认值＝1；-v对(V)显示一行描述的数据库序列的数目[整数]；默认值＝500；-b对(B)显示比对的数据库序列的数目[整数]；默认值＝250；-f延伸命中的阈值,如果0则为默认值；blastp 11,blastn 0,blastx 12,tblastn13；tblastx 13,megablast 0[整数]；默认值＝0；-g进行空位比对(用tblastx无效)[T/F]；默认值＝T；-Q待使用的查询遗传代码[整数]；默认值＝1；-D DB遗传代码(仅对tblast[nx])[整数]；默认值＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认值＝1；-O SeqAlign文件[文件输出]任选的；-J相信查询defline[T/F]；默认值＝F；-M矩阵[字符串]；默认值＝BLOSUM62；-W字长,如果0则为默认值(blastn 11,megablast 28,所有其他的3)[整数]；默认值＝0；-z数据库的有效长度(对于实际大小使用0)[实数]；默认值＝0；-K来自待保持区域的最佳命中的数目(如果推荐使用100的值，那么默认关)[整数]；默认值＝0；-P多次命中为0，单次命中为1[整数]；默认值＝0；-Y搜索空间的有效长度(对于实际大小使用0)[实数]；默认值＝0；-S对数据库搜索的查询链(对blast[nx],和tblastx)；3为两者，1为顶部，2为底部[整数]；默认值＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认值＝F；-l限制数据库的搜索到GI的列表[字符串]任选的；-U使用FASTA序列的小写体过滤[T/F]任选的；默认值＝F；-y无缺口延伸的X减少值比特(0.0调用默认行为)；blastn 20,megablast 10,所有其他的7[实数]；默认值＝0.0；-Z最后空位比对的X减少值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn/megablast50,tblastx 0,所有其他的25[整数]；默认值＝0；-R PSI-TBLASTN限制点文件[文件输入]任选的；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认值＝F；-L查询序列上的位置[字符串]任选的；-A多个命中窗口大小,如果0则为默认值(blastn/megablast 0,所有其他的40[整数]；默认值＝0；-w移码罚分(对于blastx，OOF算法)[整数]；默认值＝0；-t tblastn中用于连接HSP允许的最大内含子的长度(0使得不能连接)[整数]；默认值＝0。

通过使用Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法搜索高质量结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列的比较可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins et al.,CABIOS 5,151(1989))或优选用程序“Gap”和“Needle”(它们均基于Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48；443(1970)),和“BestFit”(其基于Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))进行。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)；Altschul et al.,(Nucleic Acids Res.25,3389(1997)),“Needle”是TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)(Trends in Genetics 16(6),276(2000))的一部分。因此，优选地，用程序“Gap”或“Needle”在序列的整个范围上进行计算以确定序列同一性百分比。下面用于比较核酸序列的标准调整用于“Needle”:矩阵:EDNAFULL,Gap_penalty:10.0,Extend_penalty:0.5。下面用于核酸序列比较的标准调整用于“Gap”:空位权重:50,长度权重:3,平均匹配:10.000,平均错配:0.000。

例如，在核酸水平上与SEQ ID NO:1的序列有80％同一性的序列被理解为指这样的序列，其当通过上面的程序“Needle”用上面的参数设置与SEQ ID NO:1代表的序列比较时，具有80％同一性。优选地，基于查询序列如SEQ ID NO:1.的完整长度计算同一性。

分离的：如本文所用的术语“分离的”意指物质已经通过人手取出并且与其最初的原始环境分开存在并且因此不是自然的产物。分离的物质或分子(如DNA分子或酶)可以以纯化形式存在或者可以存在于非天然环境如转基因宿主细胞中。例如，天然存在的核酸分子或存在于活细胞的多肽不是分离的，但与天然系统中一些或所有共存物质分离的同样的核酸分子或多肽是分离的。这种核酸分子可以是载体的一部分和/或这样的核酸分子或多肽可以是组合物的一部分，并且是分离的，因为这样的载体或组合物不是其原始环境的一部分。优选地，关于核酸分子使用时，如在“分离的核酸序列”中的术语“分离的”指已经鉴定且从至少一种污染性核酸分子分开的核酸序列，它在其天然来源中通常与所述污染性核酸分子结合。分离的核酸分子是这样的核酸分子，其存在的形式或背景与它在自然界中发现的不同。相比，非分离的核酸分子是核酸分子，例如DNA和RNA，其以它们在自然界中存在的状态被发现。例如，一个给定的DNA序列(例如，基因)在宿主细胞染色体上邻近基因附近被发现；RNA序列，如一个编码特定蛋白质的特定mRNA序列，在细胞中作为与许多其它的编码多种蛋白质的mRNA的混合物被发现。然而，包含例如SEQ ID NO：1的分离的核酸序列包括例如，在细胞中的此类核酸序列，所述序列通常包含SEQ ID NO：1，其中所述核酸序列是在不同于天然细胞的基因组或质粒位置，或侧翼是与自然界中发现的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸序列被用于表达蛋白质时，核酸序列将至少包含至少部分有义链或编码链(即，所述核酸序列可以是单链的)。或者，它可以含有有义和反义链(即，所述核酸序列可以是双链的)。

非编码：术语“非编码”指的是不编码表达的蛋白质的部分或全部的核酸分子的序列。非编码序列包括但不限于增强子，启动子区，3'非翻译区，和5'非翻译区。

核酸和核苷酸：术语“核酸”和“核苷酸”是指天然存在的或合成或人造的核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包括单链或双链，有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或任何核苷酸类似物和聚合物或其杂合体。除非另外指出，特定的核酸序列还暗示包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”与“基因”、“cDNA“、”mRNA“、“寡核苷酸“和”核酸分子“在本文可互换使用。核苷酸类似物包括在碱基，糖和/或磷酸酯的化学结构中具有修饰的核苷酸，所述修饰包括但不限于，5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰，胞嘧啶环外胺修饰，5-溴尿嘧啶的取代，等；和2'-位糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH被选自H，OR，R，卤素，SH，SR，NH 2，NHR，NR2或CN的基团取代。短发夹RNA(shRNA)也可以包括非天然的元素，如非天然的碱，例如，ionosin和黄嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然磷酸二酯键，例如，甲基膦酸酯，硫代磷酸酯和肽。

核酸序列：术语“核酸序列”指从5'-到3'-末端读取的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA，自我复制的质粒，DNA或RNA的感染性的聚合物和执行主要结构性角色的DNA或RNA。“核酸序列”还指缩写，字母，字符或词的连续的列表，它们代表核苷酸。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”,其是一个相对短的核酸，通常在长度上小于100个核苷酸。通常核酸探针是从约50个核苷酸长度到约10个核苷酸长度。核酸的“靶区域”是被识别为所关注的核酸的一部分。核酸的“编码区”是核酸的一部分，它当置于适当调节序列的控制下时，以序列特异性方式转录和翻译以产生特定多肽或蛋白质。编码区编码这样的多肽或蛋白质。

寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物，以及具有相似功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。这种经修饰的或取代的寡核苷酸通常因为期望的性质而优于天然形式，所述性质为例如，增强的细胞吸收，对核酸靶标的增强的亲和力和在核酸酶的存在下增加的稳定性。一个寡核苷酸优选包括通过连接(例如，磷酸二酯)或替代键共价偶联于彼此的两个或多个核单体。

突出端：“突出端“是在双链寡核苷酸分子的5'-或3'-羟基末端上相对短的单链核苷酸序列(也称作“延伸”、“突出端”或“粘性末端”)。

多肽：术语“多肽”，“肽”，“寡肽”，“多肽”，“基因产物”，“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的多聚体和低聚物。

启动子：术语“启动子”或“启动子序列”是等同的并且如本文中所使用，是指DNA序列，其当有效连接到目的核苷酸序列时能够控制目的核苷酸序列转录成RNA。启动子位于5'(即，上游)，邻近目的核苷酸序列的转录起点(启动子控制所述目的核苷酸序列转录成mRNA)，并提供了RNA聚合酶特异性结合和其它转录因子起始转录的位点。该启动子不包括编码区或5'非翻译区。启动子可以例如与各自细胞是异源或同源的。核酸分子序列如果来自外来物种，或者如果来自相同物种，从其原始形式修饰，那么与生物体或第二核酸分子序列是“异源的”。例如，有效连接到异源编码序列的启动子是指编码序列与启动子来自不同物种，或者，如果来自相同物种，编码序列与启动子天然不是结合的(例如，遗传改造的编码序列或来自不同的生态型或品种的等位基因)。合适的启动子可以来自那里应该发生表达的宿主细胞的基因或来自该宿主的病原体。

纯化的：如本文所使用的，术语“纯化的”是指从它们的天然环境中去除(分离的或分开)的分子(无论核酸或氨基酸序列)。“基本上纯化的”分子至少60％，优选至少75％，更优选至少90％没有与它们天然结合的其他成分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。

重组的：术语“重组的”就核酸分子而言是指通过重组DNA技术产生的核酸分子。该术语还包括其本身不存在于自然界中，但被修改，改变，突变或由人以其他方式操纵的核酸分子。优选地，“重组核酸分子”是非天然存在的核酸分子，其有至少一个核苷酸不同于天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”还可以包含“重组构建体”，其包含，优选有效连接，以那个顺序不天然存在的核酸分子的序列。用于产生所述重组核酸分子的优选方法可包括克隆技术，定向或非定向诱变，合成或重组技术。

显著增加：例如，酶的活性、基因表达、某种产品的生产力或产率的增加，该增加比在测量技术的固有误差界限更大，优选比对照酶的活性，表达，生产力，产率或或对照细胞中的表达或对照细胞中的生产力或产率增加约10％或25％，优选50％或75％，更优选2倍或5倍或更大，甚至更优选增加约10倍或更大。

显著减少：例如，酶的活性、基因表达、某种产品的生产力或产率的减少，该减少比在测量技术的固有误差界限更大，优选减少至少约5％或10％，优选至少约20％或25％，更优选至少约50％或75％，甚至更优选至少约80％或85％，最优选至少约90％，95％，97％，98％或99％。

基本上互补：在其最广泛的意义上，术语“基本上互补”，关于相对于参比或目标核苷酸序列的核苷酸序列使用时，是指核苷酸序列具有所述参比或目标核苷酸序列的基本上互补的核苷酸序列和精确互补序列之间的同一性百分数为至少60％，更理想的是至少70％，更理想的是至少80％或85％，优选至少90％，更优选至少93％，还更优选至少95％或96％，还更优选至少97％或98％，还更优选至少99％或最优选100％(在这种情况下后者等同于术语“相同的”)。优选地，同一性在至少19个核苷酸的长度，优选至少50个核苷酸，更优选核酸序列的全长上与所述参比序列评估(如果下面没有另外规定)。序列比较用University of Wisconsin GCG,GAP的SEQWEB应用，以默认GAP分析，基于Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48:443-453；如上述所定义)进行。与参比核苷酸序列“基本上互补”的核苷酸序列在低严格条件下，优选中等严格条件，最优选高严格条件(如上述定义)下与参比核苷酸序列杂交。

转基因：如本文所使用的术语“转基因”是指任何核酸序列，其通过实验操作被引入细胞的基因组中。转基因可以是“内源DNA序列”，或“异源DNA序列”(即，“外源DNA”)。术语“内源DNA序列”指核苷酸序列，其天然存在于它被引入的细胞中，只要它相对于天然存在的序列不含有某种修饰(例如点突变，可选择标记基因的存在等)。

转基因的：提及生物体时术语转基因指用重组DNA分子转化的，优选稳定转化的，所述重组DNA分子优选地包含有效连接到目的DNA序列的合适启动子。

载体：如本文所使用的，术语“载体”指能够转运其已经连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合的载体或“整合载体”，它可以变成整合到宿主细胞的基因组DNA。另一类型的载体是附加型载体，即，能够染色体外复制的质粒或核酸分子。能够指导与它们有效连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，除非从上下文清楚具有不同意思。

野生型：术语“野生型”，“天然的”或“天然来源”关于生物体时指所述生物体不被改变，突变，或由人以其他方式操纵。相对于多肽或核酸序列，该多肽或核酸序列是天然存在的或可在至少一个天然产生的生物体中获得，其没有被改变，突变，或由人以其他方式操纵。

野生型微生物是指一种微生物，其基因组存在的状态与引进某个基因的遗传修饰前一样。所述遗传修饰可以是例如基因或其部分的缺失或点突变或基因的引入。

术语“生产”或“生产力”是本领域公知的，并且包括在给定的时间和给定的发酵体积(例如千克产物每小时每升)内形成的发酵产物(例如，丙氨酸)的浓度。术语“生产效率”包括要完成的特定生产水平(例如，细胞需要多久达到精细化学品的输出的特定比率)所需的时间。

术语“产率”或“产物/碳产率”是本领域公知的并包括碳源转化为产物(即，精细化学品)的效率。这通常写作，例如，kg产物每kg碳源。通过增加化合物的产率或生产，回收的分子或在给定的时间量内给定量的培养物中那种化合物的有用的回收分子的量增加了。

术语“重组微生物”包括微生物,其已被遗传修饰，使得它们与它们所来源的野生型微生物相比表现出改变的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。重组微生物包含至少一个重组DNA分子。

术语“重组的”关于DNA时指使用重组DNA技术通过人所产生的DNA分子。该术语包括其本身不存在于自然界的DNA分子或不存在于所述DNA所来源的生物体，但被修饰，改变，突变或由人以其他方式操纵的DNA分子。优选地，“重组DNA分子”是序列与天然存在核酸分子相差至少一个核苷酸的非天然存在核酸分子。“重组DNA分子”也可包括“重组构建体”，其包括，优选有效连接，以那个顺序不天然存在的核酸分子的序列。用于制备所述的重组DNA分子的优选的方法可包括克隆技术，定向或非定向诱变，基因合成或重组技术。

术语“定向进化”与术语“代谢进化”同义使用，并且涉及应用选择压力，其有利于具有目的性状的突变体生长。选择压力可以基于不同的培养条件，ATP和生长偶联的选择和氧化还原相关的选择。选择压力可用具有顺序转移接种的分批发酵或具有相同的压力的连续培养来进行。

这样的重组DNA的一个例子是已经插入异源DNA序列的质粒或与该重组DNA所来源的基因或启动子相比，已被突变的基因或启动子。突变可通过本领域中已知的定向诱变技术或通过随机诱变技术，如化学，紫外线或X射线诱变或定向进化技术来引入。

术语“表达”或“基因表达”是指一个或多个特定的基因或特定的遗传载体构建体的转录。特别是，术语“表达”或“基因表达”尤其指基因或遗传载体构建体转录成mRNA。该过程包括DNA的转录并且可能包括所得的RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括mRNA的翻译和所编码的蛋白质的合成，即，蛋白质表达。

图1

ackA-pta基因失活后的克隆验证。

A：用引物P395-ackA-pta-check2和P395-ackA-pta-check5(338bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRT的基因组DNA中获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-ackA-pta-check2和P395-ackA-pta-check5测序PCR扩增子证实了ackA-pta基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图2

adhE基因的失活之后的克隆验证。

A：用引物P395—adhE-check2和P395-adhE-check5(569bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-adhE-check2和P395-adhE-check5对PCR扩增子的测序证实了adhE基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图3

frdABCD基因的失活之后的克隆验证。

A：用引物P395-frd-check1和P395-frd-check4(797bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-frd-check1和P395-frd-check4对PCR扩增子的测序证实了frd基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图4

pflB基因的失活之后的克隆验证。

A：用引物P395-pflB-check1和P395-pflB-check3(511bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRTΔpflB::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-pflB-check1和P395-pflB-check3对PCR扩增子的测序证实了pflB基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图5

alaD-gstear基因的整合之后的克隆验证。

A：用引物P395-ldhA-check1和P395-ldhA-check2(1833bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRTΔpflB::FRTΔldhA::alaD-gstear的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-ldhA-check1和P395-ldhA-check2对PCR扩增子的测序证实了ldhA基因座的碱基对精确修饰和alaD-gstear的整合。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。alaD-gstear ORF以青色显示，剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图6

在大肠杆菌菌株Ex1(可互换地称为QZ16)中丙氨酸生物合成路线，所述菌株包含如实施例1中描述的所有的突变。

图7

在stem EV3(可互换命名QZ20)的alaD基因的插入位点上新基因座的基因组组织,所述stem EV3包含ydbH编码区的部分缺失和ldhA启动子(其驱动stem QZ16中alaD基因的表达)的缺失。

图8

在LB培养基中在37℃下生长过夜的大肠杆菌W,大肠杆菌QZ16,大肠杆菌QZ20,和大肠杆菌QZ32的可溶性蛋白质级分的SDS-PAGE分析。39.37kDa的丙氨酸脱氢酶(AlaD)带加白色框。裂解细胞前,大肠杆菌培养物归一化成OD600。M：标记物。

图9

体积丙氨酸脱氢酶(alaD)的活性用大肠杆菌粗细胞裂解物在体外测定法中监测。L-丙氨酸向丙酮酸的转化是通过在340nm处NADH的形成以分光光度法监测。

图10

相对于大肠杆菌QZ16 8小时，在分批发酵期间8h,11h和28h时大肠杆菌QZ16和QZ20中alaD的相对基因表达分析。所有的qPCR衍生数据相对于作为参考的rrsA基因归一化。

图11

在具有80克/升葡萄糖的500mL NBS培养基中大肠杆菌QZ16，大肠杆菌QZ32和大肠杆菌QZ63的分批发酵。发酵控制在37℃，400rpm下，用5N NH₄OH调节pH 6.8,无通气。该图描绘了与样品的丙氨酸浓度和NH₄OH的消耗率相关的丙氨酸形成。

图12

体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为在用80克/升葡萄糖作为碳源的500毫升的NBS培养基中分批发酵期间直到完全葡萄糖消耗，大肠杆菌QZ16(超过50小时)和QZ32(ΔydbH-lpdA)和QZ63(ΔlpdA)产生的产物的量除以反应器体积和时间。

图13

在具有80克/升葡萄糖的500mL NBS培养基中大肠杆菌QZ33(ΔydbH-lpdA,ygaWQ5H)和大肠杆菌QZ32(ΔydbH-lpdA)的分批发酵。发酵控制在37℃，400rpm下，用5N NH₄OH调节pH 6.8,无通气。该图描绘了与样品的丙氨酸浓度和NH₄OH的消耗率相关的丙氨酸形成。

图14

体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为在用80克/升葡萄糖作为碳源的500毫升的NBS培养基中分批发酵期间直到完全葡萄糖消耗，大肠杆菌QZ32(ΔydbH-ldhA),QZ60(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5N),QZ61(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5R),QZ62(ΔydbH-ldhA,ygaWQ5Y)和QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H)产生的产物的量除以反应器体积和时间。

图15

在具有80克/升葡萄糖的500mL NBS培养基中大肠杆菌QZ60(ΔydbH-lpdA,ygaWQ5N),大肠杆菌QZ61(ΔydbH-lpdA,ygaW Q5R)和大肠杆菌QZ62(ΔydbH-lpdA,ygaW Q5Y)与大肠杆菌QZ32(ΔydbH-lpdA)和大肠杆菌QZ33(ΔydbH-lpdA,ygaW Q5H)相比的分批发酵。发酵控制在37℃，400rpm下，用5N NH₄OH调节pH 6.8,无通气。(A)描绘了整个发酵期间生物量形成。(B)描绘了与样品的丙氨酸浓度和NH₄OH的消耗率相关的丙氨酸形成。

图16

如通过RT-qPCR测定的，相对于大肠杆菌QZ16 8h,在8h,11h和28h分批发酵时大肠杆菌QZ16和QZ20中ygaW的相对基因表达分析。所有的qPCR衍生数据针对作为参比的rrsA基因归一化。

图17

在具有80克/升葡萄糖的500mL NBS培养基中大肠杆菌QZ41(ΔydbH-ldhA,ygaWQ5H,zipA SNP)和大肠杆菌QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H)的分批发酵。发酵控制在37℃，400rpm下，用5N NH₄OH调节pH 6.8,无通气。该图描绘了与样品的丙氨酸浓度和NH₄OH的消耗率相关的丙氨酸形成。

图18

体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为在用80克/升葡萄糖作为碳源的500毫升的NBS培养基中分批发酵期间直到完全葡萄糖消耗，大肠杆菌QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H)和QZ 41(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H,zipA SNP)产生的产物的量除以反应器体积和时间。

图19

在具有100克/升葡萄糖的500mL NBS培养基中大肠杆菌QZ52(ΔydbH-ldhA,ygaWQ5H,lpd SNP)和大肠杆菌QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H)的分批发酵。发酵控制在37℃，400rpm下，用5N NH₄OH调节pH 6.8,无通气。(A)描绘了整个发酵期间两种菌株的生物量形成。(B)描绘了与样品的丙氨酸浓度和NH₄OH的消耗率相关的丙氨酸形成。

图20

体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为在用100克/升葡萄糖作为碳源的500毫升的NBS培养基中分批发酵41小时后，大肠杆菌QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H)和QZ52(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H,lpd SNP)产生的产物的量除以反应器体积和时间。尽管QZ53 41小时后已经完全消耗所有葡萄糖，但是QZ33直到53小时无法完全消耗测试条件下的葡萄糖。

图21

体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为在用80克/升葡萄糖作为碳源的500毫升的NBS培养基中分批发酵期间直到完全葡萄糖消耗，大肠杆菌QZ32(ΔydbH-ldhA),QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H),QZ41(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H,zipA SNP)和QZ53(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H,zipA SNP,lpd SNP)产生的产物的量除以反应器体积和时间。

图22

具有100克/升葡萄糖的500mL NBS培养基中大肠杆菌QZ53(ΔydbH-ldhA,ygaWQ5H,zipA SNP,lpd SNP)和大肠杆菌QZ41(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H,zipA SNP)的分批发酵。发酵控制在37℃，400rpm下，用5N NH₄OH调节pH 6.8,无通气。该图描绘了与样品的丙氨酸浓度和NH₄OH的消耗率相关的丙氨酸形成滴度。

图23

体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为在用80克/升葡萄糖作为碳源的500毫升的NBS培养基中分批发酵期间直到完全葡萄糖消耗，大肠杆菌QZ53(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H,zipA SNP,lpd SNP)和QZ41(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H,zipA SNP)产生的产物的量除以反应器体积和时间。

图24

用80克/升葡萄糖的500mL NBS培养基中具有对照质粒pACYC184的大肠杆菌QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H)和具有质粒pACYC184-lpd与lpd ORF的额外拷贝的大肠杆菌QZ33的分批发酵。发酵控制在37℃，400rpm下，用5N NH₄OH调节pH 6.8,无通气。该图描绘了与样品的丙氨酸浓度和NH₄OH的消耗率相关的丙氨酸形成滴度。

图25

体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为在用80克/升葡萄糖作为碳源的500毫升的NBS培养基中分批发酵期间直到完全葡萄糖消耗，具有对照质粒pACYC184的大肠杆菌QZ33(ΔydbH-ldhA,ygaW Q5H)和具有质粒pACYC184-lpd与lpd ORF的额外拷贝的大肠杆菌QZ33产生的产物的量除以反应器体积和时间。

实施例

化学品和常用方法

除非另有说明，如(Sambrook et al.,1989)中所述进行用于实施本发明的目的的克隆步骤，包括限制性消化，琼脂糖凝胶电泳，核酸纯化，核酸的连接，转化，选择和培养细菌细胞。重组DNA的序列分析用激光荧光DNA测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)使用桑格技术执行(Sanger等人，1977)。除非另有说明，化学品和试剂购自SigmaAldrich公司(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)，购自(Madison,WI,USA),Duchefa(Haarlem,The Netherlands)或Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。限制性内切酶来自New EnglandBiolabs公司(Ipswich,MA,USA)或Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,Germany)。寡核苷酸是由Eurofins MWG Operon(Ebersberg,Germany)合成。

实施例1：

通过失活ackA-pta,adhE,frdABCD和pflB ORFs并通过alaD基因的密码子优化的变体(alaD-gstear)替换ldhA ORF，将大肠杆菌W(LU17032)工程化用于L-丙氨酸生产。

通过插入FRT-侧翼卡那霉素抗性盒，接着通过FLP重组去除抗生素抗性盒，失活ackA-pta,adhE,frdABCD和pflB ORFs。

所述的ldhA基因由alaD-gstear和下游FRT-侧翼zeocin抗性盒替换，其最后通过FLP重组去除。

材料和方法

细菌培养

大肠杆菌W(LU17032)在Luria-Bertani(LB)液体培养基中或Luria-Bertani固体培养基上培养。偶尔，克隆在含有10mM蔗糖的M9基本琼脂上传代培养以确认W菌株身份。将抗生素酌情加入到该液体和固体培养基至15μg/ml(卡那霉素，氯霉素)，25μg/ml(zeocin)或3μg/ml(四环素)的最终浓度。

Red/ET重组

使用Gene Bridges GmbH(www.genebridges.com)的标准协议进行Red/ET重组。简言之，将Red/ET-proficient大肠杆菌W好氧培养在30℃下至～0.3的OD600nm值。通过添加10％的50微升(重量/体积)L-阿拉伯糖，随后温度升高至37℃诱导红色基因的表达。从未诱导的对照培养物省略阿拉伯糖。在37℃下温育35分钟后，用冰冷的10％(体积/体积)甘油洗涤细胞两次，并在1.35千伏，10μF，600Ω用500纳克PCR产物电穿孔细胞。然后细胞再悬浮在1ml冰冷的LB培养基中，并在37℃下需氧生长大约1.5小时。然后培养物平板接种于含15微克/毫升卡那霉素(敲除)的LB琼脂或25微克/毫升的zeocin(敲入)。

FLP重组

侧翼FRT位点允许通过FLP重组接着大肠杆菌染色体的修饰而去除抗生素抗性标记物。FLP重组留下单个FRT位点(34碱基对)以及短的侧翼序列(各约20个碱基)，其被用作在盒的扩增中的引物结合位点。

为了进行FLP重组，将编码FLP重组酶的质粒708-FLPe(表1)通过电穿孔导入红色/ET重组体中。KanR CmR或ZeoR CmR转化体用于接种0.2毫升LB培养物，其在30℃下培养3小时。然后通过温度偏移至37℃，接着是在37℃三个小时的温育，诱导FLP活性。对从这些培养物获得的单个菌落随后筛选了CmS和KanS或ZeoS表型。

DNA制备和分析

大肠杆菌基因组DNA(gDNA)用Gentra Puregene Yeast/Bact.试剂盒B(Qiagen,Hilden,Germany)从过夜培养物中分离。用PRECISOR高保真DNA聚合酶(BioCat，海德堡)从模板质粒扩增含有敲除或敲入盒的PCR产物并用PCR Extender System(5PRIME GmbH,Hamburg,Germany)根据制造商的建议进行分析PCR反应。使用GeneJET PCR纯化试剂盒或GeneJET凝胶提取试剂盒(Fermentas,St.Leon-Rot,Germany)纯化PCR扩增子并通过BATCBioTech(Konstanz,Germany)或BioSpring(Frankfurt am Main,Germany)测序。

表1.质粒和引物

1.1.ackA-pta基因座-ackA-pta的靶定

将大约500纳克ΔackA-pta PCR构建体(1737bp)电穿孔到Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。三个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实ackA-pta基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图1)。

1.2 adhE基因座-adhE的靶定

将大约500纳克ΔadhE PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。两个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕证实adhE基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图2)。

1.3 frd基因座-frdABCD的靶定

将大约500纳克ΔfrdABCD PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT和ΔadhE::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实frd基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图3)。

1.4 pflB基因座-pflB的靶定

将大约500纳克ΔpflB PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT,ΔadhE::FRT和ΔfrdABCD::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特异的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。四个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实pflB基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图4)。

1.5 ldhA基因座-alaD-gstear的敲入

将大约500纳克ΔldhA::alaD-gstear PCR构建体(1783bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT,ΔadhE::FRT,ΔfrdABCD::FRT和ΔpflB::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析四个ZeoR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实alaD-gstear的整合和zeocin抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图5)。

实施例2 丙氨酸的HPLC检测和定量

下列HPLC方法被用于在细胞培养基中丙氨酸的检测：

柱：Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad公司)，300×7.8毫米，内径

粒度9微米

流动相：钙(NO 3)2在0.1mol/L90％，乙腈10％

流速：0.6毫升/分钟

柱温度：60℃

检测：折射率检测器

根据以上的方法，在细胞培养物样品基质中主要估计组分可以从丙氨酸很好地分离，而不干扰丙氨酸的定量。

样品中的丙氨酸的量由外部标准校准方法测定。注射含有0.5～10.0g/L丙氨酸的标准样品并将峰面积用于校准。校准曲线的线性回归系数为0.9995。

样品以20微升注射一次。峰面积用于由Waters LC Millennium软件计算样品中存在的量。

实施例3 葡萄糖，琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸和乙醇的HPLC检测和定量

使用的HPLC方法

柱：Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad公司)，300×7.8毫米，内径

粒度9微米

流动相：H2SO4 4mM

流速：0.4毫升/分钟

柱温度：45℃

检测：折射率检测器

分析物的量通过外标校准法测定。注射含有0.1到38.0克/升葡萄糖，0.05至10.0g/L琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸和乙醇的标准样品并将峰面积用于校准。所有六个校准曲线的线性回归系数均好于0.999。

样品以20微升注射一次。峰面积用于由Waters LC Millenium软件计算样品中存在的量。

实施例4 来自实施例1的用于改进丙氨酸产率的大肠杆菌W主干(stem)的代谢进化

包含如在实施例1中所述的所有突变的大肠杆菌主干(命名为大肠杆菌Ex1或QZ16)用于代谢进化过程，以提高大肠杆菌Ex1主干的丙氨酸产率。

如下进行代谢进化：在第一和第二进化轮中，在NBS培养基5％葡萄糖中进行连续进化500小时和750小时。

NBS培养基:

3.5g KH2PO4

5.0g K2HPO4

3.5g(NH4)2HPO4

0.25g MgSO4-7H2O

15mg CaCL2-2H2O

0.5mg硫胺素

1ml微量金属贮存液

以0.1M HCL,1.6g FeCL₃-6H₂O；0.2g CoCl₂-6H₂O；0.1g CuCl₂-2H₂O；0.2g ZnCl₂；0.2g NaMoO4-2H₂O；0.05g H₃BO₃制备微量金属贮存液。

细胞在LB平板上划线并测试丙氨酸产率。最好的大肠杆菌主干(大肠杆菌Ev1或QZ17)导致用包含5％葡萄糖的NBS培养基在37℃24及48小时发酵的丙氨酸产率在84％-86％之间，相比，起始主干大肠杆菌Ex1的丙氨酸产率为80％-83％。

大肠杆菌Ev1用于进一步的进化步骤，其以批次进化进行20天。5％的细胞每24h，48h，72h等再次接种在新鲜培养基中，和包含14％葡萄糖的AM1培养基中37℃。

AM1培养基:

15g/L硫酸铵在最后一步加入

1mm甜菜碱

1ml微量金属贮存液”

为了制备1L微量金属贮存液:

以0.12M HCL,2.4g FeCL₃-6H₂O；0.3g CoCl₂-6H₂O；0.21g CuCl₂-2H₂O；0.3gZnCl₂；0.27g NaMoO4-2H₂O；0.068g H₃BO₃；0.5g MnCl2-4H₂O制备微量金属贮存液

从该进化，分离主干大肠杆菌Ev2，又称QZ18。用发酵测试此主干，该发酵在具有14％葡萄糖的AM1培养基的发酵罐中进行。主干大肠杆菌Ev2具有92％-94％的丙氨酸产率，相比，在相同条件下，大肠杆菌Ev1的丙氨酸产率是91％-92％。

另一分批进化步骤在包含12％葡萄糖的AM1培养基中进行300小时，随后在包含12％葡萄糖的AM1中进行10个分批进化步骤，分离主干大肠杆菌Ev3，也命名QZ20。

丙氨酸产率测试揭示主干大肠杆菌Ev3在包含12％葡萄糖的AM1培养基中具有94％-96％的丙氨酸产率，相比，在相同条件下大肠杆菌Ev2的丙氨酸产率是92％-93％。

实施例5 测定与大肠杆菌Ex1相比，在大肠杆菌Ev3中的突变

对大肠杆菌主干Ex1和大肠杆菌Ev3的基因组测序并比较结果以确定导致主干大肠杆菌Ev3的增加的丙氨酸产率的突变。

鉴定了在lpd基因中的突变，其将在主干大肠杆菌Ex1中lpd基因的序列从编码具有SEQ ID NO50的蛋白质的SEQ ID NO 49改变为主干大肠杆菌Ev3中编码具有SEQ ID NO52的蛋白质的SEQ ID NO 51。

此外，鉴定了在zipA基因中的突变，其将在主干大肠杆菌Ex1中zipA基因的序列从编码具有SEQ ID NO 46的蛋白质的SEQ ID NO 45改变为主干大肠杆菌Ev3中编码具有SEQID NO 48的蛋白质的SEQ ID NO 47。

也鉴定了在ygaW基因中的突变，其将在主干大肠杆菌Ex1中ygaW基因的序列从编码具有SEQ ID NO 2的蛋白质的SEQ ID NO 1改变为主干大肠杆菌Ev3中编码具有SEQ IDNO 4的蛋白质的SEQ ID NO 3。

此外，鉴定了ydbH编码区的部分缺失和驱动alaD基因表达的ldhA启动子的缺失和alaD基因前ydbH基因的5'编码区的部分缺失，其使得alaD基因处于具有SEQ ID NO:55的启动子的控制下。关于新基因座的基因组组织见图7。

实施例6 确认alaD基因的突变启动子对丙氨酸产率的效力

为了确认在大肠杆菌EV3/QZ20已检测到的alaD基因上游的缺失对丙氨酸产率和生产力的影响，在大肠杆菌Ex1(QZ16)的基因组中引入缺失以产生大肠杆菌QZ32。

大肠杆菌QZ32的菌株构建

使用引物Rec1_1_F和Rec1_1_R用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo)从模板载体pQZ11(Genescript)扩增具有可选择氯霉素抗性标记和负选择sacB标记(赋予蔗糖敏感性)的ydbH-ldhA-cat-sacB盒(3091bp)。该PCR产物用DpnI(NEB)在37℃下消化1小时，以减少质粒模板背景并用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从1％琼脂糖凝胶中进行凝胶提取。用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo)从一组自退火引物Rec1_2_F and Rec 1_2_R扩增ydbH-ldhA缺失盒(116bp)并用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen)纯化。

对于Red/ET重组，根据制造商的方案使用Genebridges Red/ET重组试剂盒。将约200ng ydbH-ldhA-cat-sacB PCR产物电穿孔到Red/ET-proficient大肠杆菌Ex1细胞。电穿孔后，将培养物平板接种在具有10微克/毫升氯霉素的LB琼脂平板上进行阳性转化体的选择。用基因组特异的引物Rec1_seq_F和Rec1_seq_R通过PCR筛选一些菌落的标记物盒的整合。PCR证实的克隆用于与ydbH-ldhA缺失盒的第二次Red/ET重组以替换cat-sacB标记盒。电穿孔后，培养物在具有6％蔗糖没有NaCl的LB琼脂平板上平板接种用于选择阳性转化体。用基因组特异性引物Rec1_seq_F和Rec1_seq_R检测一些克隆的cat-sacB标记盒的丧失。产生正确大小的PCR产物的至少一个克隆也通过测序(Genewiz)证实。菌株在生物反应器中测试前，热敏感性重组质粒pRedET(amp)从菌株在42C过夜成熟(cure)。向菌株大肠杆菌Ex1(QZ16)中引入ydbH-ldhA缺失。所得的具有ydbH-ldhA启动子缺失的菌株QZ16被指定为QZ32。

ydbH缺失和新的alaD启动子角色的测定

为了进一步表征由于529bp的ydbH-ldhA启动子缺失实现alaD的过表达的机理和确定部分ydbH基因的缺失在其中是否具有作用，构建了基于大肠杆菌QZ16的两个菌株。在大肠杆菌QZ63中，仅缺失了50bp ldhA启动子序列，并且加入了经预测互补新的alaD启动子序列的额外的碱基对TATTG以形成新的启动子(SEQ ID NO:55)。在大肠杆菌QZ64中，缺失了完整ydbH基因，而原始ldhA启动子保持原状。

大肠杆菌QZ63和大肠杆菌QZ64的菌株构建

如前述进行大肠杆菌QZ63和大肠杆菌QZ64的菌株构建。用引物Rec1B_1_F和Rec1B_1_R扩增ΔPldhA-cat-sacB盒(3091bp)并且用引物Rec1C_1_F和Rec1C_1_R扩增ΔydbH-cat-sacB盒(3091bp)。所产生的PCR扩增子用作大肠杆菌QZ16中Red/ET重组的底物。分别使用自身退火引物Rec1B_2_F和Rec1B_2_R和Rec1C_2_F和Rec1C_2_R扩增PldhA-缺失盒(125bp)和ydbH-缺失盒(108bp)。PCR扩增子用于替换cat-sacB标记盒和产生大肠杆菌QZ63和大肠杆菌QZ64的希望的基因型。通过PCR用基因组特异性引物Rec1B_seq_F和Rec1B_seq_R测试了大肠杆菌QZ63的菌落并且通过测序证实了至少一个阳性克隆。通过PCR用基因组特异性引物Rec1C_seq_F和Rec1C_seq_R测试了大肠杆菌QZ64的菌落并且通过测序证实了至少一个阳性克隆。

SDS-PAGE分析

为了测试ydbH-ldhA启动子缺失对alaD的表达水平的影响，与大肠杆菌W，大肠杆菌QZ16和大肠杆菌QZ20比较进行了所产生的大肠杆菌QZ32的SDS-PAGE分析。将来自LB培养基中37C,200rpm下的过夜培养物的细胞归一化到OD600，收获并裂解。可溶性蛋白质级分上样到SDS-PAGE上进行比较。

如在大肠杆菌QZ20发现的具有529bp的ydbH-ldhA启动子缺失(QZ32)的菌株中表达的alaD的量(39.37kDa)在QZ16显著更高并且与QZ20中AlaD表达水平相当(图8)。这一结果表明，在大肠杆菌QZ20发现的alaD上游的529bp缺失引起alaD基因的显著过表达。

AlaD酶促体外测定

在体外测试与大肠杆菌W，大肠杆菌QZ16和大肠杆菌QZ20细胞裂解物相比，细胞粗裂解物中大肠杆菌QZ32的AlaD活性。

粗裂解物从在LB培养基中于37℃生长过夜培养物制备。细胞通过离心沉淀并根据制造商建议的方案使用BugBuster(Novagen)去污剂裂解。使用Bradford测定法(Amresco公司)和牛血清白蛋白(BSA)标准曲线测定粗裂解物的总蛋白浓度。由alaD

催化的反应是可逆的，L-丙氨酸向丙酮酸的逆转化是通过NADH的形成用分光光度计在λ＝340nm处间接监测的。

体外测定反应物含有125mM甘氨酸/KOH(pH值10.2)，125mM甘氨酸/KOH(pH 10.2)中的100mM L-丙氨酸，10mM Tris-HCl(pH 7.0)中1.25mM NAD⁺和10微升粗制细胞裂解物，归一化到甘氨酸/KOH(总分析体积为300μL)中OD600。测定组分组装在冰上，加入NAD使反应开始。在37℃×15分钟(每30秒)进行动力学读数(λ＝340纳米)。

不包含alaD基因的大肠杆菌W的粗裂解物产生了与无粗细胞裂解物(图9)的阴性对照相似的结果。如从SDS-PAGE分析(图8)预期，大肠杆菌QZ16(其中所述ldhA基因用alaD基因替换，与大肠杆菌W相比显示出很少的alaD酶活性。具有ydbH-alaD启动子缺失的QZ20与大肠杆菌QZ16相比显示出显著更高的体积alaD酶活性，如从AlaD表达所观察到的增加预期的。大肠杆菌QZ32的体积alaD酶活性接近大肠杆菌QZ20酶活性。

alaD基因转录水平的RT-qPCR分析

除了进行SDS-PAGE分析以监测alaD蛋白表达外，还通过定量逆转录PCR(RT-qPCR的)测定alaD转录水平。来自Biorad公司的iTaq Universal One-Step Kit用于基于SYBRGreen的一步法逆转录(RT)-qPCR反应。从如先前所述进行的大肠杆菌QZ16和大肠杆菌QZ20的平行分批发酵，在8，11，22，28和48小时取培养物样品。样品立即用RNAprotect细菌试剂(Qiagen)处理以稳定RNA。根据制造商的手册用AurumTotal RNA Mini Kit(Biorad)从样品提取RNA。分离的RNA用DNA-free DNA Removal Kit(lifetechnologies)进一步处理以除去污染性基因组DNA和在qPCR期间降低背景。将RNA在λ＝260nm处用分光光度计定量。

用特异于alaD基因的RT-qPCR引物(表1)alaD_RT_F和alaD_RT_R和特异于核糖体16S RNA编码rrsA基因的rrsA_RT_F和rrsA_RT_R，测试100纳克大肠杆菌QZ16RNA的7步骤10倍稀释系列，所述rrsA基因在qPCR试验中用作参比基因。对每个RT-qPCR引物组，测定导致信号放大效率90％<E<110％和R²>0.985的线性回归系数的RNA稀释液的合适的线性动态范围。测试rrsA作为归一化的内部参考基因的合适性并且发现在所有试验样品之间稳定表达(数据未显示)。根据制造商的方案用Touch Real-Time PCR Detection System(Biorad)进行RT-qPCR反应。用大肠杆菌QZ16 8h RNA作为内部校准物根据ΔΔCt方法计算基因表达的相对定量。

alaD显示在8h与大肠杆菌QZ16相比在大肠杆菌QZ20中11倍更高表达(图10)。这是ydbH-ldhA启动子缺失对alaD基因表达的影响的另一个验证。

相比大肠杆菌QZ16，大肠杆菌QZ32的发酵试验

在实验室规模的生物反应器中测试大肠杆菌菌株QZ32的性能。监测与大肠杆菌菌株QZ16和QZ20相比丙氨酸形成。预培养物在具有LB培养基，20％填充体积的摇瓶中，在37℃和200rpm下生长过夜。发酵是在DASGIP1.5升平行生物反应器系统(Eppendorf)中在500毫升的NBS培养基(3.50g/L KH₂PO₄,5.00g/L K₂HPO₄,0.25g/L MgSO₄·7H₂O,3.50g/L(NH₄)2HPO₄,0.5mg/L硫胺素,15.00mg/L CaCl₂·2H₂O,15.00g/L(NH₄)₂SO₄,153.61mg/L甜菜碱,1ml/L微量金属贮存液)中进行。微量金属贮存液包含1.6g/L FeCL₃·6H₂O；0.2g/L CoCl₂·6H₂O；0.1g/L CuCl₂·2H₂O；0.2g/L ZnCl₂；0.2g/L NaMoO₄·2H₂O；0.05g/L H₃BO₃,0.1M HCL。80g/L葡萄糖被用作在发酵培养基中的碳源。

通过离心收集等同于7的OD600·mL的大肠杆菌细胞并重新悬浮于5毫升的NBS培养基。#OD600·mL＝(未稀释的培养物的OD600)×(以mL计的培养物体积)。5毫升重悬浮细胞用于接种在1.5升DASGIP生物反应器中的500mL发酵培养基。每个菌株以一式两份在37℃和400rpm搅拌速度下运行。5N NH4OH被用来控制pH值至6.8，并提供培养物，以铵作为在整个发酵中的丙氨酸前体。没有空气在发酵过程中被喷射并且未加压容器，使得在培养基中由细胞初步消耗溶解的氧后,发酵在微需氧条件下运行。整个发酵过程中采集样品并通过HPLC分析丙氨酸和葡萄糖浓度。

很明显，ydbH-ldhA启动子缺失和所导致的关键酶alaD在QZ32中更高的表达水平对丙氨酸形成有强烈的影响(图11)。相比大肠杆菌QZ16，大肠杆菌QZ32达到了2.00±0.07g/(Lh)的显著更高的最大体积丙氨酸形成速率，大肠杆菌QZ16显示出约0.74±0.02g/(Lh)的最大体积丙氨酸形成速率。大肠杆菌QZ16甚至在>50h延长的发酵时间后也无法完全消耗发酵培养基中的80克/升葡萄糖。50h后QZ16的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)为0.58±0.04g/(Lh)，体积丙氨酸生产力定义为产生的产物的量除以反应器体积和时间。大肠杆菌QZ32在葡萄糖耗尽时显示出1.47±0.04g/(Lh)的总体积丙氨酸生产力(图12)。

大肠杆菌QZ63和大肠杆菌QZ64的发酵试验

发酵如先前进行。大肠杆菌QZ63，大肠杆菌QZ64，大肠杆菌QZ16和大肠杆菌QZ32以一式两份并行运行。

在QZ64中ydbH基因的缺失没有导致相比QZ16丙氨酸生产力的增加(未示出数据)。然而，用TATTG nts(预期其互补新的alaD启动子)替换野生型ldhA启动子中50bp导致QZ63的丙氨酸形成相比QZ16显著上升(图11)。QZ63的丙氨酸形成比得上QZ32，其携带延长的529bp的ydbH-ldhA启动子缺失。QZ63还显示与QZ32(1.47±0.05g/(Lh))相似的体积丙氨酸生产力(1.36±0.08g/(Lh))(图12)。

这表明，只有alaD上游的新启动子负责增加的alaD表达，从而更好的丙氨酸生产力。

实施例7 确认ygaW基因中SNP对丙氨酸产率的影响

在大肠杆菌QZ20基因组序列中鉴定了ygaW基因中导致Q5H氨基酸交换的G15T。YgaW，也称为alaE，先前被确定为丙氨酸输出子。已表明ygaW从质粒的过表达导致丙氨酸排出(WO2012/172822)。为了测试ygaW基因中SNP对丙氨酸产率的影响，向相比QZ16具有增强的alaD表达的大肠杆菌QZ32遗传背景中引入各自突变。进一步突变引入相同的密码子，以便测试其他氨基酸交换是否对丙氨酸产率具有有益效果。

大肠杆菌QZ33，QZ60，QZ61，QZ62的菌株构建

如先前所述进行菌株构建。该ygaW-cat-sacB盒(3091bp)用引物Rec2_1_F和Rec2_1_R扩增。所述ygaW-SNP盒(130碱基对)用自退火的引物Rec2_2_F和Rec2_2_R扩增。对照PCR用基因组特异的引物Rec2_seq_F和Rec2_seq_R进行。所产生的具有ydbH-ldhA启动子缺失和YgaW Q5H SNP的菌株称为QZ33。

同样，在大肠杆菌QZ32中引入备选的氨基酸取代。含有目的突变的双链DNA(gBlocks)从IDT Technologies订购并用于在Red/ET重组中替换cat-sacB标记盒。大肠杆菌QZ60含有一个YgaW Q5N突变，大肠杆菌QZ61含有YgaW Q5R突变并且大肠杆菌QZ62含有YgaW Q5Y突变。

大肠杆菌QZ32，QZ60，QZ61和QZ62，QZ33的发酵试验

测试与大肠杆菌QZ32相比，菌株QZ33(ygaW Q5H，ydhB-ldha缺失突变体)在发酵过程的性能。分批发酵如前述进行。

所述ygaW Q5H突变导致大肠杆菌QZ33相比大肠杆菌QZ32丙氨酸形成的进一步增加(图13)。用大肠杆菌QZ33达到1.82±0.03g/(Lh)的进一步提高的体积丙氨酸生产力，相比，大肠杆菌QZ32达到1.47±0.05g/(Lh)(图14)。

分批发酵过程中在相同的条件下测试了具有备选Q5突变的菌株。所有三种备选突变相比具有野生型YgaW的大肠杆菌QZ32显示出更高的最大丙氨酸形成速率(图15)。大肠杆菌QZ60(YgaW Q5N)显示出1.56±0.004g/(Lh)的体积丙氨酸生产力，大肠杆菌QZ61(YgaWQ5R)为1.68±0.02g/(Lh)并且QZ62(YgaW Q5Y)为1.61±0.04g/(Lh)，相比，QZ32为1.47±0.04g/(Lh)(图14)。因此，精氨酸取代具有最强的有益效果，其次是酪氨酸取代和天冬酰胺取代。然而，适应性进化过程中发现的具有YgaW Q5H突变的大肠杆菌QZ33超过每种合理设计的突变体，具有1.82±0.03g/(Lh)的体积丙氨酸生产力。

ygaW基因转录水平的RT-qPCR分析

在该YgaW的N末端区域中单个SNP赋予增强的丙氨酸输出子活性的确切机制是未知的。我们已经用基因特异性引物ygaW_RT_F和ygaW_RT_R如先前所述通过RT-qPCR测试了QZ16和QZ20的RNA样品中ygaW的基因表达水平(表1)。基因表达数据以rrsA作为参考基因归一化，并相对于在大肠杆菌中QZ16 8h中的基因表达水平作为校准物计算。

观察到从8小时和11小时发酵的菌株样品中ygaW基因表达无显著上调或下调(图16)。这些结果证实，YgaW Q5H突变的效果与较高ygaW表达水平是不相关的，但必须直接影响YgaW活性或稳定性。

实施例8 确认zipA基因中SNP对丙氨酸产率的影响

为了确定zipA SNP对于丙氨酸生产力的作用，将zipA SNP引入大肠杆菌菌株QZ33(ydbH-ldhA启动子缺失，YgaW Q5H)。

菌株构建

由于zipA是一个重要的基因，设计zipA cat-sacB整合盒以不中断zipA但整合到它的下游。该盒从载体pQZ11(Genescript)用引物Rec4B_1_F/R扩增(表1)。所述zipA SNP盒(197bp)从菌株QZ20的基因组DNA用引物Rec4B_2_F/R扩增。如前述进行Red/ET。克隆通过菌落PCR用Rec4_seq_F/R测序引物进行测试。该zipA SNP被导入具有ldhA启动子缺失和ygaWSNP的大肠杆菌QZ33。所产生的菌株被命名为QZ41。

QZ33和QZ41的发酵试验

如前所述测试菌株QZ41(zipA SNP，ygaW Q5H，Δldha突变体)在发酵过程中的性能。监测相比于菌株QZ33的丙氨酸形成。

所述zipA SNP导致与祖先菌株QZ33相比丙氨酸形成的进一步增加(图17)。相比1.82±0.03g/(Lh)，QZ41的体积丙氨酸生产力为2.06±0.06g/(Lh)(图18)。

实施例9 确认lpd基因中SNP对丙氨酸产率的影响

为了测试lpd SNP对丙氨酸产率的影响，将其引入到大肠杆菌WZ33((ydbH-ldhAdel,ygaW Q5H)以产生大肠杆菌QZ52和引入到大肠杆菌QZ41(ydbH-ldhA del,ygaW Q5H,zipA SNP)以产生大肠杆菌菌株QZ53。

菌株构建

设计zipA cat-sacB整合盒(3087bp)以不中断lpd但整合到它的上游。该盒从载体pQZ11(Genescript)用引物Rec3B_1_F/R扩增(表1)并用于整合到携带lpd SNP的菌株QZ20。所述lpd_SNP-cat-sacB盒(3527bp)从具有整合的cat-sacB盒的菌株QZ20的基因组DNA用引物Rec3B_2_F/R扩增并用于分别整合到大肠杆菌QZ33和大肠杆菌QZ41。该cat-sacB替换盒从QZ20的基因组用引物Rec3B_F/R引物扩增并用于去除QZ33和QZ41中的cat-sacB标记盒。如前述进行Red/ET。克隆通过菌落PCR用Rec3_seq_F和Rec_3B_FR测序引物进行测试。

发酵试验QZ33对QZ52

如前述使用10克/升葡萄糖作为碳源，测试菌株QZ52(ΔydbH-ldha启动子,ygaWQ5H,lpd SNP)在发酵期间的性能。相比于菌株QZ33监测丙氨酸形成。

相比QZ33，lpd SNP对丙氨酸形成具有显著积极影响(图19)。在52小时监测时间内，QZ33无法完全消耗发酵培养基中的100g/L葡萄糖。QZ52在41小时内完全消耗可利用的葡萄糖，达到1.79±0.160g/(Lh)体积丙氨酸生产力，相比，在相同的时间内QZ33达到1.45±0.007g/(Lh)(图20)。

发酵试验QZ41对QZ53

如前所述测试菌株QZ53(ΔydbH-ldha启动子,ygaW Q5H,zipA SNP,lpd SNP)发酵期间的性能，该菌株通过lpd SNP引入大肠杆菌QZ41得到。监测相比于菌株QZ41的丙氨酸形成。

相比QZ41，在QZ53中lpd SNP也对丙氨酸形成显示积极效果(图22)。QZ53的体积丙氨酸生产力为2.21±0.004g/(Lh)，相比，QZ41的为2.06±0.06g/(Lh)(图23)。

作为ydbH-ldhA启动子缺失,ygaW Q5H SNP,zipA SNP和lpd SNP的结果的体积丙氨酸生产力的总体改善在图21中给出。

lpd基因的过表达

将处于天然启动子的控制下的lpd的一个额外拷贝引入pACYC184质粒。通过商业的InFusion克隆技术(Clontech,Mountain View,CA,USA)构建pACYC184-Lpd(p15ori,Chl^R,每个细胞～15个拷贝)。首先，通过NEB(Ipswich,MA,USA)获得载体pACYC184(p15ori,chl^R,tet^R)并用也来自NEB的HindIII和SalI限制性内切核酸酶线性化。这种消化去除大部分的四环素抗性基因。另外，用Phusion聚合酶从野生型大肠杆菌W DNA用以下引物(lpd-pACYC_F SEQ ID NO:114和lpd-pACYC_R SEQ ID NO:115)PCR扩增lpd ORF。

所述引物包含与线性化载体同源的附加的15碱基对突出端，以促进无缝克隆。然后根据制造商的方案，用经纯化的线性化载体骨架和lpd插入片段进行注入(InFusion)反应。所得的注入产物然后用于通过电穿孔转化QZ33(ydbH-ldhA启动子缺失,YgaW Q5H)并在LB氯霉素平板上选择。通过PCR鉴定阳性克隆，通过DNA测序验证并用于发酵中用于过表达研究。

QZ33/pACYC184和QZ33/pACYC184-lpd的发酵比较

将包含lpd表达载体(QZ33/pACYC184-lpd)的菌株的丙氨酸生产力与包含空对照载体(QZ33/pACYC184)的菌株比较。预培养物在具有LB培养基，20％的填充体积的摇瓶中，在37℃和200rpm下生长过夜。发酵是在DASGIP1.5升平行生物反应器系统中用NBS培养基的8％葡萄糖进行的。其它条件与以前相同。

在33小时时间点，相比QZ33/pACYC184的57.1g/L，QZ33/pACYC184-lpd产生了58.4g/L丙氨酸(图24)。

与QZ33/pACYC184相比，QZ33/pACYC184-lpd的空时收率(生产力)也从1.63增加到1.77g/h/l(图25)。

Claims (37)

1.重组核酸分子，其是编码SEQ ID NO:2的且SEQ ID NO:2的5位的氨基酸是组氨酸、天冬酰胺、精氨酸或酪氨酸的多肽的核酸分子。

2.权利要求1的重组核酸分子，其是SEQ ID NO:1的序列的且SEQ ID NO:1的13－15位的密码子编码组氨酸、天冬酰胺、精氨酸或酪氨酸的核酸分子。

3.重组氨基酸分子，其是SEQ ID NO:2的序列的且SEQ ID NO:2的5位的氨基酸是组氨酸、天冬酰胺、精氨酸或酪氨酸的氨基酸分子。

4.重组表达构建体，其包含与权利要求1中定义的核酸分子有效连接的在微生物中有功能的至少一个启动子。

5.重组载体，其包含权利要求1中定义的核酸分子或如权利要求4中定义的重组表达构建体。

6.重组微生物，其包含至少一种如权利要求1定义的重组核酸分子或权利要求4的重组表达构建体或权利要求5的重组载体。

7.权利要求6的重组微生物，其进一步包含alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。

8.权利要求6或7的重组微生物，其进一步包含pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。

9.权利要求6到8任一项的重组微生物，其进一步包含adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。

10.权利要求6到9任一项的重组微生物，其进一步包含ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。

11.权利要求6到10任一项的重组微生物，其进一步包含pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。

12.权利要求6到11任一项的重组微生物，其进一步包含frdA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。

13.权利要求7到12中任一项的重组微生物，其中所述alaD基因是编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子。

14.权利要求13的重组微生物，其中所述alaD基因是SEQ ID NO:15的序列的核酸分子。

15.权利要求7到14任一项的重组微生物，其中所述alaD基因有效连接到SEQ ID NO 54或55的启动子或(I)与SEQ ID NO:54或55的核酸分子在中等严格条件下杂交的核酸分子。

16.权利要求8到15任一项的重组微生物，其中所述pflB基因是编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子。

17.权利要求8到15任一项的重组微生物，其中所述pflB基因选自(A)SEQ ID NO:5的序列的核酸分子，或

(B)与SEQ ID NO:5的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子。

18.权利要求9到17任一项的重组微生物，其中所述adhE基因是编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子。

19.权利要求9到17任一项的重组微生物，其中所述adhE基因是(F)SEQ ID NO:7的序列的核酸分子，或(H)与具有SEQ ID NO:7的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子。

20.权利要求10到19任一项的重组微生物，其中所述ldhA基因是编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子。

21.权利要求10到19任一项的重组微生物，其中所述ldhA基因选自以下组成的组

(K)SEQ ID NO:9的序列的核酸分子，或

(M)与SEQ ID NO:9的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子。

22.权利要求11到21任一项的重组微生物，其中所述pta基因是编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子。

23.权利要求11到21任一项的重组微生物，其中所述pta基因选自以下组成的组

(P)SEQ ID NO:11的序列的核酸分子，或

(R)与具有SEQ ID NO:11的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子。

24.权利要求12到23任一项的重组微生物，其中所述frdA基因是编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子。

25.权利要求12到23任一项的重组微生物，其中所述frdA基因选自以下组成的组

(U)SEQ ID NO:13的序列的核酸分子，或

(W)与具有SEQ ID NO:13的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子。

26.权利要求6至25中任一项的重组微生物，其中所述微生物选自棒杆菌属，芽孢杆菌属，欧文氏菌属，埃希氏菌属，泛菌属，链霉菌属，发酵单胞菌属和红球菌属。

27.组合物，其包含根据权利要求6至26中任一项的一种或多种重组微生物。

28.权利要求27的组合物，其进一步包含培养基和碳源。

29.一种产生具有增强的丙氨酸产率的重组微生物的方法，该方法包括以下步骤：

(I)将至少一种如在权利要求1中定义的核酸分子或至少一种如在权利要求3中定义的氨基酸分子或权利要求4的表达构建体或权利要求5的载体引入到微生物；和

(II)生成与不包含至少一种如在权利要求1中定义的核酸分子或至少一种如在权利要求3中定义的氨基酸分子或权利要求4的表达构建体或权利要求5的载体的相应微生物相比，具有增强的丙氨酸产率的重组微生物。

30.权利要求29的方法，其中所述微生物选自棒杆菌属，芽孢杆菌属，欧文氏菌属，埃希氏菌属，泛菌属，链霉菌属，发酵单胞菌属和红球菌属组成的组的属。

31.生产丙氨酸的方法,包括在允许生产丙氨酸的条件下，培养根据权利要求6至26中任一项的一种或多种重组微生物。

32.根据权利要求31的方法，其中所述微生物培养在包含0.5％到30％(w/v)的糖的培养基中。

33.根据权利要求31的方法，其中丙氨酸的产率是至少80％。

34.根据权利要求31至33任一项的方法，其中L-丙氨酸的手性纯度是至少98％。

35.培养或生长遗传修饰的微生物的方法，其包括用根据权利要求6至26中任一项的一种或多种遗传修饰的微生物接种培养基并在所述培养基中培养或生长所述遗传修饰的微生物。

36.权利要求1的重组核酸分子或权利要求3的重组氨基酸分子，权利要求4的重组表达构建体，权利要求5的重组载体，权利要求6至26中任一项的重组微生物或权利要求27或28任一项的组合物用于发酵生产丙氨酸的用途。

37.发酵生产丙氨酸的方法，其包括步骤

I)在发酵罐中生长权利要求6至26中任一项的微生物和

II)从在I)中获得的发酵液回收丙氨酸。

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