CN108350040B

CN108350040B - 用于精细化学品的改进生产的重组微生物

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Publication number: CN108350040B
Application number: CN201680035843.2A
Authority: CN
Inventors: 王庆昭; S·S·拉塔尼; 郭哲源; H·施罗德; H·哈特曼; M·蓬佩尤斯
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2036-06-02
Also published as: MX2017015668A; WO2016193351A2; US20180148748A1; CA2988415A1; RU2017146342A3; PH12017502215A1; CN108350040A; WO2016193351A3; JP7071124B2; JP2018517413A; KR20180011313A; US10519474B2; RU2017146342A; EP3303372A2; BR112017025923A2

Abstract

本发明涉及重组核酸分子、重组微生物和生产丙氨酸的方法以及所述重组核酸分子或重组微生物发酵生产丙氨酸的用途。

Description

用于精细化学品的改进生产的重组微生物

发明领域

本申请涉及重组核酸分子、重组微生物，涉及生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的方法，并且涉及所述重组核酸分子或重组微生物发酵生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的用途。

发明描述

氨基酸是具有羧基和氨基的有机化合物。最重要的氨基酸是α-氨基酸，其中氨基与羧基相邻。蛋白质是基于α-氨基酸。

丙氨酸已经引起了很大兴趣，因为它已经在食品、饲料和制药工业中用作添加剂。此外，丙氨酸是工业生产N,N-二(羧甲基)丙氨酸三钠盐(MGDA，商品名Trilon M)的原料，MGDA是一种强螯合剂，在溶解有机和无机污垢中显示出优秀性能(WO94/29421,WO2012/150155)。M级Trilon根据标准OECD测试是容易生物降解的。由于极好的生态学和毒物学谱，M级Trilon尤其适合用于最终消费者的产品中并且对此类生物可降解的复杂增洁剂的需要不断上升。

丙氨酸可以通过用棒杆菌属细菌(Hermann,2003:Industrial production ofamino acids by Coryneform bacteria,J.of Biotechnol,104,155-172.)或大肠杆菌(WO2007/120198,WO2008/119009)发酵生产。

最近已经描述了ygaW基因的过表达提高了微生物的丙氨酸发酵生产力(WO2012/172822)。

大肠杆菌中的丙氨酸生产更有效并且广泛用于作为化学工业原料的丙氨酸的工业生产。由于对丙氨酸的化学工业的需求增加，需要提高丙氨酸的发酵生产的生产力。

本发明的一个目的是提供可用于以高产率和效率发酵生产丙氨酸的微生物。

发明详述

通过大肠杆菌(Escherichia coli)家族的重组微生物提供了实现上述目的的贡献，与相应的参比微生物相比，所述重组微生物具有i)brnQ基因的减少，抑制或缺失的活性和/或表达和/或ii)argP基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或iii)gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或iv)gcvB基因的减少，抑制或缺失的活性和/或表达和/或v)lpxD基因的改变的活性。

术语“减少的、抑制的或缺失的酶表达和/或活性”意指显著减少、抑制或缺失的表达和/或活性并且也包括各自酶的检测不到的表达和/或活性。

术语“更高”，“增加”或“增强”，例如关于酶的表达和/或活性或产量或生产力而言，是指显著更高的，增加的或增强的表达和/或活性或产量或生产力。

术语“改变的”酶表达和/或活性意指重组微生物中酶的表达和/或活性，其与野生型、非重组微生物中各自酶的表达和/或活性显著不同。

令人惊奇的是，已经发现具有以下至少一种：i)由brnQ基因编码的蛋白质的减少的，抑制或缺失的表达和/或活性和/或ii)argP基因的引入，增加或增强的活性和/或表达和/或iii)gcvA基因的引入，增加或增强的活性和/或表达和/或iv)gcvB基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或v)1pxD基因的改变的活性的微生物与不包含相应brnQ基因的减少的，抑制的或缺失的表达和/或活性，argP基因的增加或增强的活性和/或表达和/或gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或gcvB基因的降低的，抑制或缺失的活性和/或表达和/或lpxD基因的改变的活性的相同微生物相比，在发酵生产中具有更高的丙氨酸产量和/或生产力。

因此，本发明的一个实施方案是重组微生物，其包含与各自参比微生物相比较以下的至少一种：i)编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或ii)编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或iii)编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或iv)编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或v)编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性，并且与相应的参比微生物相比在发酵生产中具有更高的丙氨酸产量和/或生产力。

如本文所用的术语“参比微生物”意指重组微生物与之比较的对照微生物。该参比微生物具有与所述重组微生物基本相同的基因型，待分析的差异除外。优选地，参比微生物是重组微生物所来源的菌株。例如，将基因引入了野生型微生物，从而产生重组微生物，从而野生型将是该重组微生物的合适的参比微生物。还可能的是向重组微生物A中引入另一突变，从而产生重组微生物B。重组微生物A将是重组微生物B的合适的参比微生物。如果将比较重组微生物和各自参比微生物的性能，那么两种微生物生长在基本相同的条件下。

对于本领域技术人员显而易见的是，具有增加的丙氨酸产率和/或生产力的微生物也可以用于生产与丙氨酸密切相关的其他代谢物，例如，为丙氨酸途径中间体的代谢物，与丙氨酸途径有共同中间体的代谢物或为使用丙氨酸作为其途径中中间体的代谢物的代谢物。通过增加或引入某些酶活性或通过敲除或降低某些酶活性，本发明的微生物也可以容易地适应于具有此类相关代谢物的增加的产率和/或生产力。

此类代谢物是例如丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和亮氨酸。

例如，为了使用本发明的重组微生物产生琥珀酸，必须在本发明微生物的基因组中敲除基因ldh,pfl,pta和adhE并且必须引入PEP羧化酶基因和/或丙酮酸羧化酶基因。例如在Zhang et al.(2009),PNAS(106)pp20180-20185中描述了各自途径和必要的突变。

因此，本发明的另一个实施方案是重组微生物，其与各自参比微生物相比较包含以下的至少一种：i)编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或ii)编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或iii)编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或iv)编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或v)编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性，并且与相应的参比微生物相比在发酵生产中具有更高的丙酮酸，琥珀酸，天冬氨酸，苹果酸，乳酸，缬氨酸和/或亮氨酸产量和/或生产力。

在一些实施方案中，所述微生物是原核细胞或酵母细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阳性、革兰氏阴性和革兰氏可变细菌细胞，优选革兰氏阴性细胞。

从而，可用于本发明的微生物包括但不限于，氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)，浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)，带马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae)，粘无色杆菌(Achromobacter viscosus)，乳无色杆菌(Achromobacterlacticum)，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)，肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens)，石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)，Arthrobacter hydrocarboglutamicus，氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)，天牛短小杆菌(Aureobacterium saperdae)，印度固氮菌(Azotobacterindicus)，产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)，Brevibacterium divaricatum，Brevibacterium lactofermentum，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，Brevibacterium globosum，暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)，酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)，Brevibacterium helcolum，Brevibacteriumpusillum，Brevibacterium testaceum，Brevibacterium roseum，Brevibacteriumimmariophilium，扩展短杆菌(Brevibacterium linens)，Brevibacteriumprotopharmiae，嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，美棒杆菌(Corynebacterium callunae)，嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)，醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，解淀粉杆菌(Erwiniaamylovora)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)，菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)，奇异稳杆菌(Flavobacteriumperegrinum)，染色假杆菌(Flavobacterium fucatum)，Flavobacterium aurantinum，莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)，塞沃尼假杆菌(Flavobacterium sewanense)，短黄杆菌(Flavobacterium breve)，脑膜败血金黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum，微球菌属种(Micrococcus sp.)CCM825，摩氏变形菌(Morganella morganii)，红串红球菌(Nocardia opaca)，粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)，Planococcus eucinatus，Proteusrettgeri，谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)，成黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha)，氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)，Pseudomonas jluorescens，卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，Pseudomonasacidovolans，霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)，睾丸酮丛毛单胞菌(Pseudomonastestosteroni)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)，玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，红球菌属种(Rhodococcussp.)ATCC 15592)，红球菌属种ATCC 19070)，脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，Vibrio metschnikovii，Vibrio tyrogenes，马杜拉马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)，Actinomyces violaceochromogenes)，Kitasatosporia parulosa，除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，Streptomyces flavelus，浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus)，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)，橄榄链霉菌(Streptomycesolivaceus)，田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)，Streptomyces virginiae)，抗菌素链霉菌(Streptomyces antibioticus)，可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)，淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)，绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，杀鲑变形菌(Aeromonas salmonicida)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)，弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)，Microbacterium ammoniaphilum，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)，Salmonella schottmulleri，柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)，等。

在一些实施方案中，微生物是真核细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞，例如，酵母属物种，如酿酒酵母，汉逊酵母属，如多形汉逊酵母,裂殖酵母属,如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，耶氏酵母属物种，如解脂耶氏酵母，毕赤酵母属物种，如甲醇毕赤酵母，树干毕赤酵母和巴斯德毕赤酵母，接合酵母属物种，如鲁氏接合酵母和拜耳接合酵母，假丝酵母属物种，如博伊丁假丝酵母，产朊假丝酵母，Candida freyschussii，光滑假丝酵母和Candida sonorensis，许旺酵母属物种，如西方许旺酵母，Arxula属物种，如Arxula adeninivorans，Ogataea属物种如Ogataea minuta，克雷伯菌属物种，如肺炎克雷伯菌。

许多细菌的工业菌株特别适合于在本文公开的方法使用。在一些实施方案中，所述微生物是棒杆菌属物种的，例如嗜乙酰棒杆菌,谷氨酸棒杆菌,美棒杆菌,嗜乙酰乙酸棒杆菌,醋谷棒杆菌。在一些实施方案中，微生物是芽孢杆菌属物种，例如，苏云金芽孢杆菌，炭疽杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌,环状芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,灿烂芽孢杆菌,凝固芽孢杆菌,短芽孢杆菌,坚强芽孢杆菌,B.alkaophius,地衣芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌,耐盐芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施方案中，微生物是欧文氏菌属的种，如,噬夏孢欧文氏菌,胡萝卜软腐欧文氏菌,E.ananas,草生欧文氏菌,E.punctata和E.terreus.在一些实施方案中，微生物是埃希氏菌属的种，例如，大肠杆菌。在其他实施方案中，微生物是泛菌属的种，例如，柠檬泛菌或成团泛菌。在其他实施方案中，微生物是链霉菌属的种，例如，产二素链霉菌,不产色链霉菌,除虫链霉菌,天蓝色链霉菌,生金色链霉菌,金色链霉菌,杀真菌素链霉菌,灰色链霉菌或浅青紫链霉菌。在其他实施方案中，所述微生物是发酵单胞菌属的种，例如，运动发酵单胞菌或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。在其他实施方案中，所述微生物是红球菌属的种，例如，混浊红球菌。

优选所述微生物选自肠杆菌科，优选埃希氏菌属，例如大肠杆菌(E.coli)，优选菌株大肠杆菌W，其对应于DSMZ1116，其对应于ATCC9637。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(a)编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中pflB基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(b)编码双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶)的adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中adhE基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(c)编码依赖NAD的发酵性D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中ldhA基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(d)编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中pta基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可进一步包含(e)编码乙酸激酶的ackA基因的降低的，阻抑的或缺失的活性和/或表达，其中ackA基因的活性和/或表达的降低，阻抑或缺失与各自的参比微生物比较进行确定。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可进一步包含(f)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的降低的，阻抑的或缺失的活性和/或表达，其中所述frdA基因的活性和/或表达的降低，阻抑或缺失与相应的参比微生物相比确定。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可进一步包含(g)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，其中与相应的参比微生物相比较确定alaD基因的活性和/或表达的增加或增强。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物还可以包含(h)编码丙氨酸消旋酶的dadX基因的活性和/或表达降低，抑制或缺失，其中dadX基因的活性和/或表达的降低，抑制或缺失与相应的参比微生物相比确定。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可进一步包含(i)编码丙氨酸转运蛋白的ygaW基因的引入，增加或增强的活性和/或表达，其中与WO2012/172822和PCT/IB2014/064426中所述的相应的参比微生物相比确定ygaW基因的活性和/或表达的增加或增强，PCT/IB2014/064426通过引用并入本文。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可进一步包含(j)编码参与Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入，增加或增强的活性和/或表达，其中与如PCT/IB2014/064426中所述(其通过引用并入本文作为参考)的相应的参比微生物相比确定zipA基因的活性和/或表达的增加或增强。

除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物还可包含(k)编码硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因的导入，增加或增强的活性和/或表达，其中所述lpd基因的活性和/或表达的增加或增强与如PCT/IB2014/064426中所述的相应的参比微生物相比测定。

优选地，包含编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达，编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性的至少一种的本发明的重组微生物额外具有至少两个，优选至少三个，更优选至少四个，甚至更优选至少五个，甚至更优选至少六个，甚至更优选至少七个，甚至更优选八个，最优选全部选自下组的特征

(a)编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(b)编码双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶)的adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(c)编码依赖NAD的发酵性D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(d)编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和

(e)编码乙酸激酶的ackA基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达，

(f)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达，和

(g)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的导入，增加或增强的活性和/或表达，

(h)编码丙氨酸还原酶的dadX基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达，和

(i)编码丙氨酸转运蛋白的ygaW基因的导入，增加或增强的活性和/或表达

(j)编码参与Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的导入，增加或增强的活性和/或表达，和

(k)编码硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因的导入，增加或增强的活性和/或表达，

其中基因的活性和/或表达的减少、抑制、缺失、增加或增强与各自参比微生物比较进行测定。

alaD基因可以来自任何生物并且可以是由人设计的合成基因，例如，具有为在本发明的重组微生物中表达优化的密码子选择或者为酶活性进行优化，例如，具有改善的Vmax或Km。优选地，alaD基因来自芽孢杆菌属(Bacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)之一的微生物。在更优选的实施方案中，alaD基因来自土芽孢杆菌属。在最优选实施方案中，alaD基因来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilu)。

在优选实施方案中，所述alaD基因为在本发明的重组微生物中表达进行密码子优化。

本发明的微生物可以包含其他遗传修饰，如突变、敲除或增强的或引入的酶活性，其进一步改善丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸的产率和/或生产力。

在另一个实施方案中，在本发明的重组微生物中具有减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达的编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因选自

(i)包含SEQ ID NO:1的序列的核酸分子，或

(ii)与SEQ ID NO:1的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(iii)与具有SEQ ID NO:1的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(iv)编码SEQ ID NO:2的多肽的核酸分子,或

(v)编码与SEQ ID NO:2的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中由(ii)，(iii)或(v)编码的多肽具有至少10％，20％，优选至少30％或50％，更优选至少60％或70％，甚至更优选至少75％，80％，85％或90％，最优选至少95％的具有SEQ ID NO:2的多肽的活性，和

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有改善的丙氨酸产量。

在一个实例中，在本发明的重组微生物中编码具有减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达的具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因具有SEQ ID NO:3的序列，编码具有SEQ ID NO:4的蛋白质。

在另一个实施方案中，在本发明的重组微生物中编码具有引入，增加或增强的活性和/或表达的具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因选自

(i)包含SEQ ID NO:45的序列的核酸分子，或

(ii)与SEQ ID NO:45的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(iii)与具有SEQ ID NO:45的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(iv)编码SEQ ID NO:46的多肽的核酸分子,或

(v)编码与SEQ ID NO:46的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(ii),(iii)或(v)编码的多肽具有SEQ ID NO:46的多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％，并且

在一个实例中，在本发明的重组微生物中具有引入，增加或增强的活性和/或表达的编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因具有SEQ ID NO:47的序列，编码具有SEQ ID NO:48的蛋白质。

在另一个实施方案中，在本发明的重组微生物中引入，增加或增强的活性和/或表达的编码DNA结合蛋白的gcvA基因选自

(i)包含SEQ ID NO:53的序列的核酸分子，或者

(ii)与SEQ ID NO:53的核酸分子具有至少80％，优选至少85％，例如至少90％，更优选至少95％，例如至少96％，甚至更优选至少97％，例如至少98％，最优选至少99％的同一性的核酸分子，或

(iii)在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在非常高的严格条件下与具有SEQ ID NO:53的核酸分子杂交的核酸分子，或

(iv)编码SEQ ID NO:54的多肽的核酸分子，或者

(v)编码与SEQ ID NO:54的多肽具有至少60％，优选至少70％，例如至少75％，更优选至少80％，例如至少85％，甚至更优选至少90％，例如至少95％，最优选至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同源性的多肽的核酸分子，

其中(ii)，(iii)或(v)编码的多肽具有如具有SEQ ID NO:54的多肽的活性的至少10％，20％，优选至少30％或50％，更优选至少60％或70％，甚至更优选至少75％，80％，85％或90％，最优选至少95％，和

在另一个实施方案中，编码在本发明的重组微生物中具有降低的，阻抑的或缺失的活性和/或表达的非蛋白质编码RNA的gcvB基因选自

(i)包含SEQ ID NO:58的序列的核酸分子，或

(ii)与SEQ ID NO:58的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(iii)与具有SEQ ID NO:58的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

其中由(ii)，(iii)或(v)编码的非蛋白质编码RNA具有如具有SEQ ID NO:58的非蛋白质编码RNA的至少10％，20％，优选至少30％或50％，更优选至少60％或70％，甚至更优选至少75％，80％，85％或90％，最优选至少95％的活性，和

其中包含如上定义的突变基因的微生物在发酵中具有改善的丙氨酸产量。

在另一个实施方案中，编码在本发明的重组微生物中具有改变的活性和/或表达的UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因选自

(i)包含SEQ ID NO:49的序列的核酸分子，或者

(ii)与SEQ ID NO:49的核酸分子具有至少80％，优选至少85％，例如至少90％，更优选至少95％，例如至少96％，甚至更优选至少97％，例如至少98％，最优选至少99％的同一性的核酸分子，或

(iii)在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在非常高的严格条件下与具有SEQ ID NO:49的核酸分子杂交的核酸分子，或

(iv)编码SEQ ID NO:50的多肽的核酸分子，或者

(v)编码与SEQ ID NO:50的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(i)到(v)项下的基因的对应于SEQ ID NO:49的43-45位的密码子不是编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者(i)到(v)项下的基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:50的15位的氨基酸不是丙氨酸，并且

其中如(1)到(5)中上面定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

在一个实例中，编码在本发明的重组微生物中具有改变的活性和/或表达的UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因具有SEQ ID NO：51的序列，编码具有SEQ ID NO:52的蛋白质。

包含编码支链氨基酸转运蛋白的brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达，和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的，增加或增强的活性和/或表达，编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的，增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白质编码RNA的gcvB基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性的至少一种的本发明的重组微生物额外可进一步包含(a)至(k)中定义的特征中的任何一个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或全部特征，

其中pflB基因选自以下组成的组：

(A)包含SEQ ID NO:5的序列的核酸分子，或

(B)与SEQ ID NO:5的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(C)与具有SEQ ID NO:5的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(D)编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子,或

(E)编码与SEQ ID NO:6的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(B),(C)或(E)编码的多肽具有具SEQ ID NO:6多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中adhE基因选自以下组成的组：

(F)包含SEQ ID NO:7的序列的核酸分子，或

(G)与SEQ ID NO:7的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(H)与具有SEQ ID NO:7的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(I)编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子,或

(J)编码与SEQ ID NO:8的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(G),(H)或(J)编码的多肽具有具SEQ ID NO:8多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中ldhA基因选自以下组成的组：

(K)包含SEQ ID NO:9的序列的核酸分子，或

(L)与SEQ ID NO:9的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(M)与具有SEQ ID NO:9的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(N)编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子,或

(O)编码与SEQ ID NO:10的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(L),(M)或(O)编码的多肽具有具SEQ ID NO:10多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中pta基因选自以下组成的组：

(P)包含SEQ ID NO:11的序列的核酸分子，或

(Q)与SEQ ID NO:11的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(R)与具有SEQ ID NO:11的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(S)编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子,或

(T)编码与SEQ ID NO:12的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(Q),(R)或(T)编码的多肽具有具SEQ ID NO:12多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中ackA基因选自以下组成的组：

(U)包含SEQ ID NO:120的序列的核酸分子，或

(V)与SEQ ID NO:120的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(W)与具有SEQ ID NO:120的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(X)编码SEQ ID NO:121的多肽的核酸分子,或

(Y)编码与SEQ ID NO:121的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(V),(W)或(Y)编码的多肽具有具SEQ ID NO:121多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中frdA基因选自以下组成的组：

(Z)包含SEQ ID NO:13的序列的核酸分子，或

(AA)与SEQ ID NO:13的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(BB)与具有SEQ ID NO:13的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(CC)编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子,或

(DD)编码与SEQ ID NO:14的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(AA),(BB)或(DD)编码的多肽具有具SEQ ID NO:14多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中alaD基因选自由以下组成的组

(EE)包含SEQ ID NO:15的序列的核酸分子，或者

(FF)与SEQ ID NO:15的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(GG)与具有SEQ ID NO:15的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(HH)编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子,或

(II)编码与SEQ ID NO:16的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(FF),(GG)或(II)编码的多肽具有具SEQ ID NO:16多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中dadX基因选自以下组成的组：

(JJ)包含SEQ ID NO:118的序列的核酸分子，或

(KK)与SEQ ID NO:118的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(LL)与具有SEQ ID NO:118的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(MM)编码SEQ ID NO:119的多肽的核酸分子,或

(NN)编码与SEQ ID NO:119的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(KK),(LL)或(NN)编码的多肽具有具SEQ ID NO:119多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中ygaW基因选自以下组成的组：

(OO)包含SEQ ID NO:109的序列的核酸分子，或

(PP)与SEQ ID NO:109的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(QQ)与具有SEQ ID NO:109的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(RR)编码SEQ ID NO:110的多肽的核酸分子,或

(SS)编码与SEQ ID NO:110的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(PP),(QQ)或(SS)编码的多肽具有具SEQ ID NO:110多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中zipA基因选自以下组成的组：

(TT)包含SEQ ID NO:111的序列的核酸分子，或

(UU)与SEQ ID NO:111的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(VV)与具有SEQ ID NO:111的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(WW)编码SEQ ID NO:112的多肽的核酸分子,或

(XX)编码与SEQ ID NO:112的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(UU),(VV)或(XX)编码的多肽具有具SEQ ID NO:112多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且

其中lpd基因选自以下组成的组：

(YY)包含SEQ ID NO:113的序列的核酸分子，或

(ZZ)与SEQ ID NO:113的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(AAA)与具有SEQ ID NO:113的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(BBB)编码SEQ ID NO:114的多肽的核酸分子,或

(CCC)编码与SEQ ID NO:114的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中(ZZ),(AAA)或(CCC)编码的多肽具有具SEQ ID NO:114多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％。

优选地，如(EE)到(II)中定义的核酸分子在微生物中处于作为启动子发挥功能的序列的控制下，所述启动子具有序列：

(1)包含SEQ ID NO:115或116的序列的核酸分子，或

(2)与SEQ ID NO:115或116的核酸分子具有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(3)与具有SEQ ID NO:115或116的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子或

(4)具有SEQ ID NO:115或116的核酸分子的至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸,至少30个核苷酸或至少40个核苷酸的片段，更优选至少50个核苷酸,至少75个核苷酸或至少100个核苷酸,甚至更优选至少150或至少200个核苷酸的片段。优选地，SEQ ID NO:115或116的片段是包含SEQ ID NO:115或116的3’区的片段，因此，该片段在SEQ ID NO:115或116的5’末端包含缺失。

本发明的另一实施方案是包含如上文定义的一种或多种重组微生物的组合物。该组合物可以进一步包含允许本发明的重组微生物生长的培养基。该培养基可以额外包含碳源，如己糖、戊糖或多元醇，如蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、木酮糖、甘油、甘露醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、淀粉、纤维素、木质纤维素或其组合。优选地，碳源是葡萄糖或蔗糖，更优选地，碳源是葡萄糖。

在优选实施方案中，组合物包含本发明的微生物和NBS培养基、AM1培养基或PPM01培养基。更优选地，组合物包含碳源，优选糖。这些培养基的成分是技术人员公知的。

优选NBS培养基每升包含

1-5g,优选3.5g KH₂PO₄和

1-10g,优选5.0g K₂HPO₄和

1-5g,优选3.5g(NH₄)₂HPO₄和

0.1-1g,优选0.25g MgSO₄–7H₂O和

5-25mg,优选15mg CaCL₂-2H₂O和

0.1-1mg,优选0.5mg硫胺素和

0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,

其中所述微量金属贮存液包含0.5-5g,优选1.6g FeCL₃–6H₂O；0.05-0.5g,优选0.2g CoCl₂–6H₂O；0.01-0.5g,优选0.1g CuCl₂-2H₂O；0.1-0.5g,优选0.2g ZnCl₂；0.05-0.5g,优选0.2g NaMoO₄–2H₂O；0.001-0.1g,优选0.05g H₃BO₃每升0.01-1M,优选0.1M HCL。

NBS培养基中优选的碳源是葡萄糖或蔗糖，优选2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。

优选地，AM 1培养基包含每升0.1-10mM,优选1mM甜菜碱溶液

1-10g,优选2.6g(NH4)₂HPO₄和

0.1-5g,优选0.87g NH₄H₂PO₄和

0.05-2.5g,优选0.15g KCl和

0.05-5g,优选0.37g MgSO₄-7H₂O和

0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,

其中微量金属贮存液每升包含0.01-1M,优选0.12M HCL,1-5g,优选2.4g FeCL₃-6H₂O；0.1-1g,优选0.3g CoCl₂-6H₂O；0.1-1g,优选0.21g CuCl₂-2H₂O；0.1-1g,优选0.3gZnCl₂；0.1-1g,优选0.27g NaMoO4–2H₂O；0.01-0.5g,优选0.068g H₃BO₃和0.1-1g,优选0.5gMnCl₂–4H₂O,

和任选地1-30g,优选15g(NH₄)₂SO₄。

NBS培养基中优选的碳源是葡萄糖或蔗糖,优选2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。

优选地，PPM01培养基每升包含

0.05-5g,优选0.37g MgSO₄–7H₂O和

0.1-10g,优选1g(NH₄)₂SO₄和

0.05-5g,优选0.46g甜菜碱和

0.001-0.5g,优选0.05g氰钴胺(B12)和

1-10g,优选3.74g KH₂PO₄和

0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,

其中微量金属贮存液每升包含10-100mM,优选60mM硫酸,1-10g,优选3.48g(NH₄)₂Fe(II)(SO₄)₂-7H₂O；0.1-1g,优选0.35g CoSO₄-7H₂O；0.1-1g,优选0.31g CuSO₄-5H₂O；0.1-5g,优选0.63g ZnSO₄-7H₂O；0.1-1g,优选0.27g MnSO₄-H₂O；0.01-1g,优选0.07g NaMoO₄-2H₂O和0.1-5g,优选0.43g H₃BO₃。

PPM01培养基中优选的碳源是一水合葡萄糖，优选每升培养基10-500g,更优选140g一水合葡萄糖。

本发明的另一实施方案是产生具有增强的丙氨酸，丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸产率或生产力的重组微生物的方法，所述方法包括以下步骤：

(I)i)在微生物中减少，抑制或缺失如上文(i)至(v)定义的brnQ基因的一种或多种活性和/或表达和/或ii)引入，增加，增强如上文(i)至(v)定义的argP基因的一种或多种活性和/或表达和/或iii)引入，增加，增强如上文(i)至(v)定义的gcvA基因的一种或多种活性和/或表达，和/或iv)减少，抑制或缺失如上文(i)至(v)定义的gcvB基因的一种或多种活性和/或表达，和/或v)改变如上文(i)至(v)定义的lpxD基因的活性；和

(II)产生，鉴定和分离与(I)中定义的没有所述修饰的相应微生物相比，具有增强的丙氨酸，丙酮酸，琥珀酸，天冬氨酸，苹果酸，乳酸，缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸产量或生产力的重组微生物。

在优选的实施方案中，具有降低的，阻抑的或缺失的活性和/或表达的brnQ基因具有SEQ ID NO:3的序列和/或编码SEQ ID NO:4的多肽。

在一个优选的实施方案中，具有引入的，增加的或增强的活性和/或表达的argP基因具有SEQ ID NO:47的序列和/或编码SEQ ID NO:48的多肽。

在优选的实施方案中，具有引入的，增加的或增强的活性和/或表达的gcvA基因与具有SEQ ID NO:56或57的序列的启动子功能性连接。

在优选的实施方案中，具有降低的，阻抑的或缺失的活性和/或表达的gcvB基因与具有SEQ ID NO:60或61的序列的启动子功能性连接。

在一个优选的实施方案中，具有改变的活性和/或表达的lpxD基因具有SEQ IDNO:51的序列和/或编码SEQ ID NO:52的多肽。

在用于生产本发明的重组微生物的方法的优选实施方案中，所述方法还包括减少，抑制或缺失例如如(A)至(DD)和(JJ)至(NN)中定义的pflB基因，adhE基因，ldhA基因，pta基因，ackA基因，frdA基因或dadX基因的至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，至少六种或全部的活性和/或表达和/或引入，增加或增强(EE)至(II)和(OO)至(CCC)中定义的alaD基因，ygaW基因，zipA基因或lpd基因的至少一种，至少两种，至少三种或全部的活性和/或表达的步骤。

在产生本发明重组微生物的方法的进一步优选的实施方案中，如(EE)到(II)中定义的核酸分子处于作为启动子发挥功能的序列的控制下，所述启动子具有序列：

(1)包含SEQ ID NO:115或116的序列的核酸分子，或

产生本发明重组微生物的最优选方法包括减少，抑制或缺失所有brnQ基因，gcvB基因，pflB基因，adhE基因，ldhA基因，pta基因，ackA基因，frdA基因和dadX基因的的活性和/或表达的步骤，以及引入，增加或增强所有alaD基因，ygaW基因，zipA基因，lpd基因，argP基因和gcvA基因的活性和/或表达的步骤和改变lpxD基因的活性和/或表达的步骤。

在用于生产本发明的重组微生物的方法的一个实施方案中，微生物选自包含以下的原核微生物：氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacterasaii)，带马瓦无色杆菌(Achromobacter delmarvae)，粘无色杆菌(Achromobacterviscosus)，乳无色杆菌(Achromobacter lacticum)，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)，柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)，肿胀节杆菌(Arthrobactertumescens)，石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)，Arthrobacterhydrocarboglutamicus，氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)，天牛金杆菌(Aureobacterium saperdae)，印度固氮菌(Azotobacter indicus)，产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)，Brevibacterium divaricatum，谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，Brevibacterium globosum，暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)，酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)，Brevibacterium helcolum，Brevibacteriumpusillum，需土金杆菌(Brevibacterium testaceum)，玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)，Brevibacterium immariophilium，扩展短杆菌(Brevibacterium linens)，Brevibacterium protopharmiae，嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，美棒杆菌(Corynebacterium callunae)，嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)，醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)，菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)，奇异稳杆菌(Flavobacteriumperegrinum)，染色假杆菌(Flavobacterium fucatum)，Flavobacterium aurantinum，莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)，Flavobacterium sewanense，Flavobacteriumbreve，脑膜败血金黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)，Micrococcus sp.CCM825，摩氏变形菌(Morganella morganii)，Nocardia opaca，粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)，Planococcus eucinatus，Proteus rettgeri，谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)，成黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)，氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)，液化荧光杆菌(Pseudomonas fluorescens)，卵状假单胞菌(Pseudomonasovalis)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，Pseudomonas acidovolans，霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)，Pseudomonas testosteroni，Pseudomonas aeruginosa，红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)，玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，Rhodococcus sp.ATCC 15592)，Rhodococcus sp.ATCC 19070)，脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，Vibriometschnikovii，Vibrio tyrogenes，马杜拉马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)，Actinomyces violaceochromogenes，Kitasatosporia parulosa，除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，Streptomycesflavelus，浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)，浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)，橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)，田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)，弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)，抗菌素链霉菌(Streptomyces antibioticus)，可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)，淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)，绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，杀鲑变形菌(Aeromonas salmonicida)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)，弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)，嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)，粘质塞氏杆菌(Serratia marcescens)，鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)，Salmonellaschottmulleri，柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)，集胞蓝细菌属的种(Synechocystissp.)，细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus)，Thermosynechococcus elongatus，铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)，念珠蓝细菌属的种(Nostoc sp.)，共同念珠蓝细菌(N.commune)，圆球念珠蓝细菌(N.sphaericum)，点型念珠蓝细菌(Nostocpunctiforme)，盘状螺旋蓝细菌(Spirulina platensis)，巨大鞘丝蓝细菌(Lyngbyamajuscula)，赖氏鞘丝蓝细菌(L.lagerheimii)，纤细席蓝细菌(Phormidium tenue)，鱼腥蓝细菌属的种(Anabaena sp.)，Leptolyngbya sp等。

在一些实施方案中，微生物是真核细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞，如酿酒酵母属物种(Saccharomyces spec)，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，汉逊酵母属物种(Hansenula spec)，如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces spec)，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces spec)，如乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母，耶氏酵母属，如解脂耶氏酵母，毕赤酵母属，如甲醇毕赤酵母，Pichia stipites和巴斯德毕赤酵母，接合酵母属如鲁氏接合酵母和拜氏接合酵母，假丝酵母属如博伊丁氏假丝酵母，产朊假丝酵母，假念珠菌，光滑假丝酵母和Candida sonorensis，许旺酵母属，例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)，Arxula spec，例如Arxula adeninivorans，Ogataeaspecs如Ogataea minuta，克雷伯氏菌属(Klebsiella spec)，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)。

许多细菌工业菌株特别适用于本文公开的方法中。在一些实施方案中，微生物是棒状杆菌属的物种，例如，C.acidophilum，谷氨酸棒状杆菌，C.callucee，嗜乙酰乙酸棒杆菌(C.acetoacidophilum)，醋谷棒杆菌(C，acetoglutamicum)。在一些实施方案中，微生物是芽孢杆菌属的一种，例如苏云金芽孢杆菌，炭疽芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，黄色芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，短芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，克劳氏芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，B.halodurans，枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施方案中，微生物是欧文氏菌属的一个种，例如E.eredovora，胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)，菠萝欧文氏菌(E.ananas)，草生欧文氏菌(E.herbicola)，E.punctata和E.terreus。在一些实施方案中，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)的物种，例如大肠杆菌(E.coli)。在其他实施方案中，微生物是泛菌属的一个种，例如柠檬泛菌或成团泛菌。在其他实施方案中，微生物是链霉菌属的一个种，例如产二素链霉菌(S.ambofaciens)，不产色链霉菌(S.achromogenes)，除虫链霉菌(S.avermitilis)，天蓝色链霉菌(S.coelicolor)，金霉素链霉菌(S.aureofaciens)，金色链霉菌(S.aureus),杀真菌素链霉菌(S.fungicidicus),灰色链霉菌(S.griseus)或变铅青链霉菌(S.lividans)。在进一步的实施方案中，微生物是发酵单胞菌属的种，例如运动发酵单胞菌或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。在进一步的实施方案中，微生物是红球菌属的一个种，例如，混浊红球菌(R opacus)。

微生物优选选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae),优选埃希氏菌属(Escherichia),例如大肠杆菌(E.coli),优选菌株大肠杆菌W,其对应于DSMZ 1116,其对应于ATCC9637。

本发明的另一实施方案是产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的方法，包括在允许产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的条件下培养如上文定义的一种或多种重组微生物。

在一些实施方案中，本发明包括的重组微生物在分批或连续发酵条件下生长。典型的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不受到人工改变。分批系统的变型是补料分批发酵。在该变型中，随着发酵进行，底物作为增量加入。当分解代谢抑制可能抑制细胞的代谢和希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是也有用的。分批发酵和补料分批发酵在本领域是常见和公知的。在本发明中也可使用的连续发酵是这样的系统，其中向生物反应器连续加入确定的发酵培养基并且通常取出等量的条件培养基(例如，含有希望的终产物)用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要在生长期，其中终产物的产生被增强。连续发酵系统努力保持稳态生长条件。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术是工业微生物领域公知的。

在一些实施方案中，在约10℃到约60℃,约15℃到约50℃,约20℃到约45℃,约25℃到约45℃,约30℃到约45℃和约25℃到约40℃范围内的温度下进行发酵。在优选实施方案中，温度是约34℃,35℃或36℃。在最优选实施方案中，温度是约37℃或38℃。

在一些其他实施方案中，发酵进行约8小时到240小时，约8小时到240小时,约8小时到约168小时,约10小时到约144小时,约15小时到约120小时,或约20小时到约72小时的时间。优选地，发酵进行约20小时到约40小时。

在一些其他实施方案中，发酵在约4到约9的范围内、约4.5到约8.5的范围内、约5到约8的范围内、约5.5到约7.5的范围内的pH下进行。发酵将优选在7的pH下进行。

在产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的方法的一个实施方案中，微生物培养在包含1％和30％(w/v)之间的糖,5％和25％(w/v)之间的糖,10％和20％(w/v)之间的糖,14％和18％(w/v)之间的糖的培养基中。优选地，微生物在包含12％至16％(w/v)糖的培养基中培养。更优选地，微生物在包含13％至15％(w/v)糖的培养基中培养，最优选地，微生物在包含14％(w/v)糖的培养基中培养。

在产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的方法的另一实施方案中，丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸的产率是至少80％例如至少81％,至少82％,至少83％,至少84％或至少85％。产率优选是至少86％,至少87％,至少88％,至少89％或至少90％。产率更优选是至少90.5％,至少91％,至少91.5％,至少92％,至少92.5％,至少93％,至少93.5％,至少94％或至少94.5％。在甚至更优选的实施方案中，产率是至少95％或至少95.5％。在最优选的实施方案中，产率是至少96％。产率百分数计算为从培养基中葡萄糖克数产生的产物克数。所以，当培养基含有100g葡萄糖并且发酵产生98g丙氨酸时，产率将是98％。

在产生丙氨酸的方法的另一实施方案中，优选产生L-丙氨酸，其中L-丙氨酸的手性纯度是至少90％,至少91％,至少92％,至少93％或至少94％。在优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少95％或至少95.5％。在更优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少96％或至少96.5％或至少97％。在甚至更优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少97.5％,至少98％或至少98.5％例如至少99％。甚至更优选地，L-丙氨酸的手性纯度是至少99.5％或至少99.6％例如至少99.7％,至少99.8％,或至少99.9％。在最优选实施方案中，产生手性纯的L-丙氨酸。

本发明的另一实施方案是培养或生长如上文定义的遗传修饰的微生物的方法，该方法包括用一种或多种遗传修饰的微生物接种培养基并在如上文定义的条件下在培养基中培养或生长所述遗传修饰的微生物。

如上文定义的重组微生物或如上文定义的组合物用于发酵生产丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的用途是本发明的额外实施方案。

根据本发明的重组微生物的特征在于，与相应的参比微生物例如野生型相比，由brnQ基因编码的酶和/或由gcvB基因编码的RNA的表达和/或活性降低和/或由argP基因和/或gcvA基因编码的酶的表达和/或活性增加和/或由lpxD基因编码的酶的活性改变了。

术语“减少的表达和/或活性”还包括不具有brnQ和/或gcvB的可检测表达和/或活性的野生型微生物。

在一个实施方案中，通过失活、突变或敲除基因实现该基因的表达和/或活性的减少。这可以如下进行：通过缺失该基因的编码区和/或启动子的部分或全部，通过突变该基因，如插入或缺失许多核苷酸，例如，一个或两个核苷酸，导致该基因编码区的移码，在编码区中引入终止密码子，通过例如缺失或突变启动子框，如核糖体进入位点，TATA框等失活该基因的启动子。减少也可以通过例如通过引入核酶、dsRNA、反义RNA或反义寡核苷酸降解基因的转录物来实现。基因活性的减少可以通过在细胞中表达特异结合靶标酶的抗体或适体来实现。减少基因的表达和/或活性的其他方法是技术人员已知的。

在一个优选的实施方案中，brnQ基因的表达和/或活性的降低通过向基因中引入突变，优选缺失来实现。在另一个优选的实施方案中，在SEQ ID NO:1的第667位和第764位之间引入缺失，从而从brnQ基因中缺失97个核苷酸。所得到的截短的核酸具有如SEQ IDNO:3中所描绘的序列并且编码如SEQ ID NO:4中所描绘的截短的蛋白质。

在一个优选的实施方案中，argP基因的表达和/或活性的增加通过向基因中引入突变，优选点突变来实现。更优选地，其通过突变SEQ ID NO:45的argP基因的286位至288位密码子或功能同源基因的相应密码子来实现。甚至更优选地，密码子被突变以使其编码氨基酸谷氨酸或另一种酸性氨基酸或其酰胺或与谷氨酸但不是丙氨酸相似的氨基酸。在一个最优选的实施方案中，相应的密码子被突变，从而其编码氨基酸谷氨酸。

优选地，通过在argP基因中引入突变实现argP基因的表达和/或活性的增加，其中所示突变的argP基因具有编码SEQ ID NO:48的蛋白质的SEQ ID NO:47的序列。

优选地，gcvA基因的表达和/或活性的增加通过在gcvA基因的启动子中引入突变来实现，其中突变的启动子优选具有SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57的序列。

在优选的实施方案中，gcvB基因的表达和/或活性的降低通过将突变引入启动子中来实现。例如，可以通过缺失SEQ ID NO:59的62至68位中的任何一个或多个碱基T或通过在SEQ ID NO:59的60位引入点突变使该启动子突变，使此处位置的A突变为G，C或T中的任一个。优选地，突变的启动子具有SEQ ID NO:60或61的序列。

优选地，gcvB基因的表达和/或活性的降低通过在gcvB基因的启动子中引入突变来实现。具有SEQ ID NO:59的野生型启动子优选被突变为具有SEQ ID NO:60或61的序列。

优选地，1pxD基因的改变的表达和/或活性通过在1pxD基因中引入突变来实现，其中突变的1pxD基因具有编码SEQ ID NO:52的蛋白质的SEQ ID NO:51的序列。

本文公开的RNA或酶的减少的表达和/或活性，尤其乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)、双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶(adhE)、磷酸乙酰基转移酶(pta)、延胡索酸还原酶(frdA)，gcvB和/或brnQ编码的RNA或酶的减少的表达和/或减少的活性可以是与各自参比微生物，如野生型微生物中所述RNA或酶的表达和/或活性相比，表达和/或活性减少至少50％，或表达和/或活性减少至少90％，或更优选表达和/或活性减少至少95％，或更优选表达和/或活性减少至少98％，或甚至更优选表达和/或活性减少至少99％，或甚至更优选表达和/或活性减少至少99.9％。在最优选的实施方案中，在本发明的微生物中检测不到RNA或酶的表达和/或活性。

gcvB基因和/或brnQ基因的表达和/或活性的丧失以及argP基因和/或gvcA基因的导入或增加的表达和/或活性以及1pxD基因的改变的活性和/或表达导致与各自参比微生物相比，本发明的重组微生物中的丙氨酸，丙酮酸，琥珀酸，天冬氨酸，苹果酸，乳酸，缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸的提高的产量和/生产力。因此，brnQ基因或gcvB基因的表达和/或活性的丧失以及argP基因或gcvA基因的表达和/或活性的引入或增加以及lpxD基因的活性和/或表达的改变可通过测量与各自参比微生物相比，本发明的重组微生物中的丙氨酸，丙酮酸，琥珀酸，天冬氨酸，苹果酸，乳酸，缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸的产量和/生产力来确定。用于发酵产生代谢物例如丙氨酸的方法是本领域技术人员已知的并且也在本文中描述。例如与相应的参比微生物在发酵中丙氨酸的产量相比，本发明的微生物发酵中的丙氨酸的提高的产量是各自基因的表达和/或活性的丢失，减少，引入或增加或改变的量度。

测定乳酸脱氢酶(ldhA)表达或活性的方法例如由Bunch et al.在“The ldhAgene encoding the fermentative lactate de hydrogenase of Escherichia Coli”,Microbiology(1997),Vol.143,pages 187-155；or Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer J.andGrassl,M.(1983-1986)在“Methods of Enzymatic Analysis”,3rd Edition,Volume III,pages 126-133,Verlag Chemie,Weinheim；或Enzymes in Industry:Production andApplications,Second Edition(2004),Wolfgang Aehle,page 23中公开。优选最后一种方法。

测定丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)表达或活性的方法例如公开于Knappe J,Blaschkowski HP,Grobner P,Schmitt T(1974)."Pyruvate formate-lyase ofEscherichia coli:the acetyl-enzyme intermediate."Eur J Biochem 1974；50(1)；253-63.PMID:4615902；KNAPPE,Joachim,et al."Pyruvate Formate‐Lyase ofEscherichia coli:the Acetyl‐Enzyme Intermediate."European Journal ofBiochemistry 50.1(1974):253-263；in Wong,Kenny K.,et al."Molecular propertiesof pyruvate formate-lyase activating enzyme."Biochemistry 32.51(1993):14102-14110和Nnyepi,Mbako R.,Yi Peng,and Joan B.Broderick."Inactivation of E.colipyruvate formate-lyase:Role of AdhE and small molecules."Archives ofbiochemistry and biophysics 459.1(2007):1-9。

测定双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶(adhE)表达或活性的方法例如公开于Membrillo-Hernández,Jorge,et al."Evolution ofthe adhE Gene Product of Escherichia coli from a Functional Reductase to aDehydrogenase GENETIC AND BIOCHEMICAL STUDIES OF THE MUTANT PROTEINS."Journalof Biological Chemistry 275.43(2000):33869-33875和Mbako R.Nnyepi,Yi Peng,JoanB.Broderick,Inactivation of E.coli pyruvate formate-lyase:Role of AdhE andsmall molecules,Archives of Biochemistry and Biophysics,Volume 459,Issue 1,1March 2007,Pages 1-9。

测定磷酸乙酰基转移酶(pta)表达或活性的方法例如公开于Dittrich,CherylR.,George N.Bennett,and Ka‐Yiu San."Characterization of the Acetate‐ProducingPathways in Escherichia coli."Biotechnology progress 21.4(2005):1062-1067和Brown,T.D.K.,M.C.Jones-Mortimer,and H.L.Kornberg."The enzymic interconversionof acetate and acetyl-coenzyme A in Escherichia coli."Journal of generalmicrobiology102.2(1977):327-336。

测定延胡索酸还原酶(frdA)表达或活性的方法例如公开于Dickie,Peter,andJoel H.Weiner."Purification and characterization of membrane-bound fumaratereductase from anaerobically grown Escherichia coli."Canadian journal ofbiochemistry 57.6(1979):813-821；Cecchini,Gary,et al."Reconstitution ofquinone reduction and characterization of Escherichia coli fumarate reductaseactivity."Journal of Biological Chemistry 261.4(1986):1808-1814或

I.,et al."Identification of active site residues of Escherichia coli fumaratereductase by site-directed mutagenesis."Journal of Biological Chemistry266.21(1991):13572-13579。

确定丙氨酸消旋酶(dadX)表达或活性的方法例如公开在J.Wild,J.Hennig,M.Lobocka,W.Walczak,T.Klopotowski“Identification of the dadX gene coding forthe predominant isozyme of alanine racemase in Escherichia coli K12”Mol GenGenet(1985)198:315-322和M.Pulliam Lambert and F.C.Neuhaus“Factors Affectingthe Level of Alanine Racemase in Escherichia coli”Journal of Bacteriology,Mar.1972,p.1156-1161。

测定丙氨酸脱氢酶(alaD)表达或活性的方法例如公开于Sakamoto,Y.,Nagata,S.,Esaki,N.,Tanaka,H.,Soda,K."Gene cloning,purification and characterizationof thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus"JFermen.Bioeng.69(1990):154-158。

术语“酶的减少的表达”包括例如所述遗传操作的(例如，基因工程化的)微生物对所述酶的表达处于比各自参比微生物例如所述微生物的野生型表达的水平更低的水平。用于酶的减少表达的遗传操作可以包括但不限于，缺失编码所述酶的基因或其部分，改变或修饰与编码所述酶的基因相关的调节序列或位点(例如，通过去除强启动子或抑制性启动子)，修饰涉及编码所述酶的基因的转录的蛋白质(例如，调节蛋白，抑制基因，增强子，转录激活子等)和/或基因产物的翻译，或本领域常规的减少特定基因表达的任何其他常规手段(包括但不限于，使用反义核酸分子或其他方法敲除或阻断靶蛋白的表达)。此外，可以在mRNA中引入去稳定元件或引入遗传修饰，导致RNA的核糖体结合位点(RBS)的恶化。还可能以降低翻译效率和速度的方式改变基因的密码子选择。

通过引入导致酶的减少的活性的一个或多个有害的基因突变也可以获得酶的减少的活性。此外，酶活性的减少也可以包括活化酶的失活(或减少的表达)，所述活化酶是活化待减少其活性的酶必要的。通过后一方法，待减少其活性的酶优选保持在失活状态。

根据本申请的有害突变是包含启动子和编码区的基因内的任何突变，所述突变导致该基因的编码区编码的蛋白质的减少的或缺失的蛋白质活性。此类有害突变包括例如，移码，编码区中终止密码子的引入，启动子元件如TATA框的阻止转录的突变，等。

具有由brnQ基因编码的酶或gcvB基因编码的RNA的降低的表达和/或活性，或由argP基因或gcvA基因编码的蛋白质的增强或增强的表达和/或活性或由lpxD基因编码的蛋白质的改变的活性和/或表达的微生物可以天然发生，即由于自发突变发生。通过各种技术如化学处理或辐射，微生物可被修饰成缺乏或具有由一个或多个所述基因编码的酶或RNA的显著降低，增强或改变的活性。为此，微生物将通过例如诱变化学试剂，X射线或紫外线来处理。在随后的步骤中，将选择那些由一个或多个所述基因编码的酶或RNA的表达和/或活性降低，增强或改变的微生物。重组微生物还可通过同源重组技术获得，所述同源重组技术旨在突变，破坏或切除微生物基因组中的一个或多个所述基因，或用相应的编码酶或RNA的基因取代一个或多个所述基因,所述酶或RNA与由野生型基因编码的酶或RNA相比，具有降低，增强或改变的表达和/或活性。

根据本发明的重组微生物的一个实施方案，brnQ基因或gcvB基因编码的酶或RNA的表达和/或活性的降低通过修饰brnQ基因来实现，其中这个/这些基因修饰优选通过缺失一个或多个所述基因或其至少一部分，缺失一个或多个所述基因或其部分的调节元件，例如启动子序列，或者通过将至少一种有害突变引入到一个或多个所述基因中来实现。

根据本发明的重组微生物的一个实施方案，可以通过argP-基因和/或gcvA基因的修饰而实现由argP-基因和/或gcvA基因编码的酶的表达和/或活性的增加，其中这个/这些基因修饰是优选通过在微生物基因组中的argP基因和/或gcvA基因的拷贝数的增加，通过将自我复制的表达载体上的基因导入微生物，通过将argP基因和/或gcvA-基因的启动子与更强的启动子交换或通过该基因的内源性启动子转换成更强的启动子，例如通过在启动子序列中引入点突变实现的。

所述argP基因和/或gcvA基因和/或lpxD基因的进一步的活性可以通过突变该基因被增强或改变以达到蛋白质中氨基酸交换，其改善或改变所述基因的活性。这样的方法是本领域技术人员已知的。

向上面基因的突变可以如下引入，例如通过定向或随机诱变，接着通过重组将经修饰的基因引入微生物的基因组中。通过PCR突变基因序列可以产生基因的变体。“Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit”(Stratagene)可以用于实施定向诱变。在整个编码序列或仅仅其部分上的随机诱变可以借助“GeneMorph II RandomMutagenesis Kit”(Stratagene)实施。通过使用的模板DNA的量将诱变率设置成所希望的突变量。通过各个突变的靶向组合或者通过几个诱变循环的顺序实施产生多个突变。

在下文中，描述了用于重组，尤其用于引入突变或缺失序列的合适技术。

该技术在本文有时也被称作“坎贝尔重组”(“Campbell recombination”)(Leenhouts et al.,Appl Env Microbiol.(1989),Vol.55,pages 394-400)。如本文所用的“坎贝尔进”(“Campbell in”)指原始宿主细胞的转化体，其中整个环状双链DNA分子(例如，质粒)已经通过单次同源重组事件(事件中一次杂交)整合到染色体中，并且有效导致所述环状DNA分子的线性化形式插入到染色体的第一个DNA序列中，所述第一个DNA序列与所述环状DNA分子的第一个DNA序列同源。“被坎贝尔进”(“Campbelled in”)指线性化DNA序列，其已经整合到“坎贝尔进”转化体的染色体中。“坎贝尔进”含有第一个同源DNA连续的副本，其每个拷贝包括并且围绕同源重组交换点的一个拷贝。

如本文所用的“坎贝尔出”(“Campbell out”)指“坎贝尔进”转化体的后代细胞，其中已经在“被坎贝尔进”DNA的线性化插入的DNA上含有的第二个DNA序列和与所述线性化插入序列的第二个DNA序列同源的染色体来源的第二个DNA序列之间发生了第二次同源重组事件(交换出事件)，所述第二次重组事件导致缺失(抛弃)一部分整合的DNA序列，但是重要的是也导致一部分(这可以小至单个碱基)整合的“被坎贝尔进”的DNA保留在染色体中，使得与最初的宿主细胞相比，“坎贝尔出”细胞在染色体中含有一个或多个有意的改变(例如，单碱基替代、多个碱基替代、插入异源基因或DNA序列、插入额外的一个或多个拷贝的同源基因或经修饰的同源基因，或者插入包含一个以上的上面列出的这些前述实例的DNA序列)。“坎贝尔出”细胞优选通过对一部分(希望被抛弃的部分)“被坎贝尔进”的DNA序列中所含的基因进行反选择得到，所述基因如枯草芽孢杆菌sacB基因，其当在约5％到10％蔗糖存在下生长的细胞中表达时是致死性的。使用或不使用反选择，可以通过使用任一种可筛选的表型，通过筛选希望的细胞得到或鉴定所希望的“坎贝尔出”细胞，所述表型为诸如但不限于，菌落形态、菌落颜色、抗生素抗性的存在或缺失、通过聚合酶链式反应检测的给定DNA序列的存在或缺失、辅源营养的存在或缺失、酶的存在或缺失、菌落核酸杂交、抗体筛选等等。术语“坎贝尔进”和“坎贝尔出”也可以在多种时态中用作动词指上述方法或过程。

可以理解导致“坎贝尔进”或“坎贝尔出”的同源重组事件可以在同源DNA序列的DNA碱基范围内发生，并且因为同源序列将对于该范围的至少部分是彼此相同的，所以通常不可能精确地指出交换事件发生的地方。换句话说，不可能精确地指出哪个序列最初来自所插入的DNA，哪个最初来自染色体DNA。此外，第一个同源DNA序列和第二个同源DNA序列通常通过部分非同源区域分隔，并且该非同源区域保留在“坎贝尔出”细胞的染色体中。

优选地，第一个和第二个同源DNA序列通常长为至少约200个碱基对，并且可以长达几千个碱基对。然而，该程序可以改变以用于更短或更长的序列。例如，第一个和第二个同源序列的长度可以为约500到2000个碱基，并且通过将第一个和第二个同源序列以大约相同的长度排列，优选具有小于200个碱基对的不同，最优选两个序列较短者为较长者长度(碱基对)的至少70％，方便从“坎贝尔进”得到“坎贝尔出”。

在一个实施方案中，brnQ和/或gcvB基因的表达和/或活性的降低通过失活分别编码支链氨基酸转运蛋白的或编码非蛋白质的RNA的brnQ基因和/或gcvB基因实现的。

在一个实施方案中，所述基因的失活优选通过缺失所述基因或其至少部分，通过缺失所述基因的调控元件或其至少一部分或通过将至少一个有害突变引入基因来实现。

在一个实施方案中，argP的表达和/或活性的诱导通过激活编码具有DNA结合/转录激活活性的蛋白质的argP基因来实现。

在一个实施方案中，gcvA的表达和/或活性的诱导通过激活编码DNA结合蛋白的gcvA基因来实现。

如在本发明上下文中使用的术语“丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸”必须以它们最广的意义上理解并且也包括其盐，例如丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的碱金属盐，像Na⁺和K⁺-盐，或碱土金属盐，像Mg²⁺和Ca²⁺-盐，或者铵盐或酐类。

优选地，丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸在微好氧条件下产生。也可以使用好氧或缺氧条件。

微好氧指氧气的浓度小于空气中氧气的浓度。根据一个实施方案，微好氧指5到27mm Hg，优选10到20Hg的氧张力(Megan Falsetta et al.(2011),The composition andmetabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms,Frontiers inMicrobiology,Vol 2,page 1to 11)。优选地，用0.1到1vvm通气量建立微好氧条件。

缺氧条件可以通过常规技术建立，例如通过对反应培养基中的成分脱气并通过例如以0.1到1或0.2到0.5vvm的流速导入二氧化碳或氮气或其混合物和任选地氢气维持缺氧条件。好氧条件可以通过常规技术建立，例如，通过以0.1到1或0.2到0.5vvm的流速导入空气或氧气。如果合适，可以在该过程中应用0.1到1.5巴的轻度超压。

根据本发明的方法的一个实施方案，可同化的碳源可以是葡萄糖、甘油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、棉子糖和其组合。

在优选实施方案中，可同化的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘油或其组合。优选的碳源是葡萄糖、蔗糖、葡萄糖和蔗糖、葡萄糖和木糖和/或葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。根据本发明的方法的一个实施方案，可同化的碳源可以是蔗糖、甘油和/或葡萄糖。

可同化的碳源的初始浓度，优选初始浓度优选被调节到5到250g/l,优选50到200g/l并且更优选125到150g/l的范围，最优选约140g/l的值并且可以在培养期间保持在所述范围内。反应培养基的pH可以通过加入合适的碱来控制，例如气体氨，NH₄OH,NH₄HCO₃,(NH₄)₂CO₃,NaOH,Na₂CO₃,NaHCO₃,KOH,K₂CO₃,KHCO₃,Mg(OH)₂,MgCO₃,Mg(HCO₃)₂,Ca(OH)₂,CaCO₃,Ca(HCO₃)₂,CaO,CH₆N₂O₂,C₂H₇N，和/或其混合物。

本发明的另一实施方案是发酵产生丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸的方法，包括步骤

I)在发酵罐中培养如上文定义的根据本发明的微生物和

II)从I)中含有的培养液回收丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸。

根据本发明的发酵步骤I)可以例如在搅拌发酵罐、鼓泡塔和环式反应器中进行。可能的方法类型包括搅拌器类型和几何设计的广泛综述可以见Chmiel:“Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,Volume 1。在本发明的方法中，可用的典型的变型是本领域技术人员已知的或在例如Chmiel,Hammes andBailey:“Biochemical Engineering”中解释的以下变型，如分批、补料分批、重复补料分批或其他连续发酵，使用和不用生物量的回收。取决于生产菌株，可以实现用空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或合适的其他混合物进行喷射以便实现良好的产率(YP/S)。

方法步骤I)中用于产生丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸的尤其优选的条件是：

可同化的碳源：葡萄糖

温度: 30到45℃

pH: 6.0到7.0

微好氧条件

在方法步骤II)中，从方法步骤I)中获得的发酵液回收产物。

通常，回收方法包括从发酵液分离重组微生物如所谓的“生物量”的步骤。去除生物量的方法是本领域技术人员已知的，并且包括过滤、沉降、浮选或其组合。因此，例如用离心机、分离器、倾板器、过滤器或在浮选装置中去除生物量。为了最大回收价值产物，通常建议例如，以渗滤的形式洗涤生物量。方法的选择取决于发酵液中的生物量含量和生物量的性质，以及生物量与有机化合物(即价值产物)的相互作用。在一个实施方案中，可以对发酵液灭菌或巴氏消毒。在另一实施方案中，浓缩发酵液。取决于需要，该浓缩可以分批进行或连续进行。应该选择压力和温度范围使得首先不发生产物损坏，其次装置和能量的最小使用是必要的。多级蒸发的压力和温度水平的有技巧的选择尤其使得能够节省能量。

回收方法可以进一步包含额外的纯化步骤，其中进一步纯化发酵产物。然而，发酵产物通过化学反应转化为次级有机产物，那么取决于反应类型和反应条件，发酵产物的进一步纯化不是必需的。对于纯化方法步骤II)中获得的发酵产物，可以使用本领域技术人员已知的方法，例如结晶、过滤、电渗析和层析。可以通过离子交换层析进一步纯化所得溶液以便去除不想要的残留离子。

在一个实施方案中，通过将缺失引入野生型基因来实现brnQ基因的减少的，阻抑的或缺失的表达和/或活性。优选其通过在具有SEQ ID NO:1的野生型基因或其功能变体的位置667和764之间引入特定突变来实现。

因此，本发明的另一实施方案是重组核酸分子，其具有选自下组的序列

(6)包含SEQ ID NO:3的序列的核酸分子，或

(7)与SEQ ID NO:3的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(8)与具有SEQ ID NO:3的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(9)编码SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子,或

(10)编码与SEQ ID NO:4的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中包含所定义的突变基因和/或蛋白质但不包含野生型基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有改善的丙氨酸产量。

在一个实施方案中，argP基因的增强或增加的表达和/或活性通过向野生型基因中引入突变来实现。优选其通过在具有SEQ ID NO:45的野生型基因或其功能变体的位置286-288处引入特定突变来实现。

(1)包含SEQ ID NO:45的序列的核酸分子，或

(2)与SEQ ID NO:45的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(3)与具有SEQ ID NO:45的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(4)编码SEQ ID NO:46的多肽的核酸分子,或

(5)编码与SEQ ID NO:46的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，并且

其中在(1)到(5)项下基因的对应于SEQ ID NO:45的286-288位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者在(1)到(5)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:46的96位的氨基酸不是丙氨酸，并且

其中在上面(1)到(5)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:46的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且

其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。

优选地，重组核酸分子具有选自下组的序列

(6)包含SEQ ID NO:47的序列的核酸分子，或

(7)与SEQ ID NO:47的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(8)与具有SEQ ID NO:47的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(9)编码SEQ ID NO:48的多肽的核酸分子,或

(10)编码与SEQ ID NO:48的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中在(7)到(10)项下基因的对应于SEQ ID NO:47的286-288位的密码子编码氨基酸谷氨酸或相关氨基酸或者在(7)到(10)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:48的96位的氨基酸是谷氨酸或相关氨基酸，并且

其中在上面(7)到(10)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:48的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且

在一个实施方案中，gcvA基因的增强的或增加的表达和/或活性通过将突变引入野生型基因的启动子中来实现。优选通过引入具有SEQ ID NO:53的野生型基因或其功能变体的启动子的特定突变来实现，其中该突变对应于SEQ ID NO:55中引入的突变，导致SEQID NO：56或SEQ ID NO:57。

因此，本发明的另一个实施方案是包含选自以下的序列的重组核酸分子：

(11)包含SEQ ID NO:53的序列的核酸分子，或者

(12)与SEQ ID NO:53的核酸分子具有至少80％，优选至少85％，例如至少90％，更优选至少95％，例如至少96％，甚至更优选至少97％，例如至少98％,最优选至少99％的同一性的核酸分子，

(13)在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在非常高的严格条件下与具有SEQ ID NO:53的核酸分子杂交的核酸分子，或

(14)编码SEQ ID NO:54的多肽的核酸分子，或者

(15)编码与SEQ ID NO:54的多肽具有至少60％，优选至少70％，例如至少75％，更优选至少80％，例如至少85％，甚至更优选至少90％,例如至少95％，最优选至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

功能性连接于突变启动子或与所述核酸分子异源的在微生物中具有活性的启动子，

其中包含如上定义的过表达的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有改善的丙氨酸产量。

在另一实施方案中，通过在lpxD野生型基因中引入突变实现丙氨酸或相关化合物的增强的或增加的产率和/或生产力。

因此，本发明的一个实施方案是重组核酸分子，其具有选自下组的序列

(16)包含SEQ ID NO:49的序列的核酸分子，或

(17)与SEQ ID NO:49的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(18)与具有SEQ ID NO:49的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(19)编码SEQ ID NO:50的多肽的核酸分子,或

(20)编码与SEQ ID NO:50的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，并且

其中在(16)到(20)项下基因的对应于SEQ ID NO:49的43-45位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者在(6)到(10)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:50的15位的氨基酸不是丙氨酸，并且

其中在上面(16)到(20)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

优选地，重组核酸分子具有选自下组的序列

(21)包含SEQ ID NO:51的序列的核酸分子，或

(22)与SEQ ID NO:51的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或

(23)与具有SEQ ID NO:51的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或

(24)编码SEQ ID NO:52的多肽的核酸分子,或

(25)编码与SEQ ID NO:52的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，

其中对应于SEQ ID NO:51的位置43至45的(21)至(25)中的基因的密码子编码氨基酸苏氨酸或相关氨基酸或对应于SEQ ID NO:52的位置15的由(21)至(25)中的基因编码的蛋白质的氨基酸是苏氨酸或相关氨基酸，

其中在上面(21)到(25)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

术语“相关氨基酸”或“保守氨基酸取代”指氨基酸被具有相似侧链的氨基酸替代。相关氨基酸列表在下面的表2中给出。保守取代表是本领域公知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds)和下面的表2)。

表2:保守氨基酸取代的实例

在优选实施方案中，重组核酸分子具有SEQ ID NO:3,47，51并且编码具有SEQ IDNO:4,48，52的蛋白质。

本发明的另一实施方案是具有选自下组的序列的重组氨基酸分子

(26)包含SEQ ID NO:4的序列的氨基酸分子，或

(27)与SEQ ID NO:4的多肽有60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，

其中包含所定义的突变蛋白但不包含野生型蛋白的微生物在发酵中具有改善的丙氨酸产量。

优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:4。

本发明的另一个实施方案是具有选自下组的序列的重组氨基酸分子

(28)包含SEQ ID NO:48的序列的氨基酸分子，或者

(29)与SEQ ID NO:48的多肽具有60％，优选至少70％，例如至少75％，更优选至少80％，例如至少85％，甚至更优选至少90％，例如至少95％，最优选至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同源性的氨基酸分子，

其中对应于SEQ ID NO:48的位置96的(29)中的蛋白质的氨基酸是谷氨酸或相关氨基酸，并且

其中如上文(29)中所定义的蛋白质与具有SEQ ID NO:46的蛋白质相比具有增强的或增加的活性,

优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:48。

(30)包含SEQ ID NO:52的序列的氨基酸分子，或

(31)与SEQ ID NO:52的多肽有60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，

其中(31)下蛋白质的对应于SEQ ID NO:52的15位的氨基酸是苏氨酸或相关氨基酸，并且

其中上面在(31)下定义的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且

优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:52。

定义

将理解本发明不限于具体的方法学或方案。还将理解本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意在限制本发明的范围，所述范围将仅受到所附权利要求的限定。必须指出如本文和所附权利要求书所用的，单数形式“一个”和“这个”包括其复数指代，除非上下文清楚地指出相反意思。从而，例如，对“一个载体”的指代是对一个或多个载体的指代并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。术语“约”在本文中用于指大约、大概、大抵或在区域中。当术语“约”与数字范围连用时，其通过将所给出的数字值上面和下面的边界延伸而修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于将所述值上面和下面的数值修饰20％上下，优选10％上下的变化(更高或更低)。如本文所用的术语“或”指具体列表的任一成员并且也包括该列表中成员的任一组合。术语“包含”和“包括”当用于说明书中和下面的权利要求时，意在说明存在一个或多个所述特征、整数、成分或步骤，但是它们不排除存在或加入一个或多个其他特征，整数、成分、步骤或其组。为了清楚起见，说明书中使用的某些术语在下文中定义和使用：

编码区：如本文所用的术语“编码区”当参考结构基因使用时，指核苷酸序列，其编码由于mRNA分子翻译的结果在新生多肽中发现的氨基酸。编码区在真核生物中结合在编码起始氨基酸甲硫氨酸的核苷酸三联体"ATG"的5’侧，原核生物也使用三联体“GTG”和“TTG”作为起始密码子。在3’侧，其被指定终止密码子(即,TAA,TAG,TGA)的三个三联体之一结合。此外，基因可以包括存在于RNA转录物上的序列的5’和3’末端两者上的序列。这些序列被称作“侧翼”序列或区域(这些测序序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可以含有调节序列，如启动子和增强子，其控制或影响基因的转录。3’侧翼区可以含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。

互补的：“互补的”或“互补性”指包含反向平行核苷酸序列的两个核苷酸序列，当反向平行核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键时，所述反向平行核苷酸序列能够彼此配对(通过碱基配对原则)。例如，序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'互补。互补性可以是“部分的”或“完全的”。“部分”互补性是其中根据碱基配对原则，一个或多个核酸碱基不匹配。核酸分子之间的“完全”或“全部”互补性是其中根据碱基配对原则，每个核酸碱基与另一个碱基匹配。核酸分子之间的互补性程度对核酸分子链之间杂交的有效性和强度有重要影响。如本文所用的核酸序列的“互补序列”指核苷酸序列，其核酸分子显示出与该核酸序列的核酸分子的完全互补性。

内源的：“内源”核苷酸序列指核苷酸序列，其存在于野生型微生物的基因组中。

增强的表达：“增强”或“增加”微生物中核酸分子的表达在本文等同使用并且意指与参比微生物，如野生型相比，在微生物中核酸分子的表达水平更高。如本文所用的术语“增强的”或“增加的”指待表达的核酸分子的更高，优选显著更高的表达。如本文所用的，试剂，如蛋白质、mRNA或RNA的水平的“增强”或“增加”指相对于在基本相同的条件下生长的基本相同的微生物，水平增加了。如本文所用的，试剂，如靶基因表达的preRNA,mRNA,rRNA,tRNA和/或其编码的蛋白质产物水平的“增强”或“增加”意指相对于合适的参比微生物，水平增加50％或以上，例如，100％或以上，优选200％或以上，更优选5倍或以上，甚至更优选10倍或以上，最优选20倍或以上，例如50倍。通过技术人员熟悉的方法可以确定增强或增加。从而，核酸或蛋白质量的增强或增加可以例如通过蛋白质的免疫学检测来测定。此外，诸如蛋白质测定法、荧光、Northern杂交、核酸酶保护测定法、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、蛋白质印迹、放射免疫测定法(RIA)或其他免疫测定法和荧光激活的细胞分析(FACS)的技术可以用于测量微生物中的特定蛋白质或RNA。取决于所诱导的蛋白质产物的类型，也可以测定其活性或对微生物表型的影响。测定蛋白质的量的方法是技术人员已知的。可以提及的实例是micro-Biuret方法(Goa J(1953)Scand J Clin LabInvest 5:218-222),Folin-Ciocalteau方法(Lowry OH et al.(1951)J Biol Chem 193:265-275)或测量CBB G-250的吸收(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。

表达：“表达”指基因产物的生物合成，优选指核苷酸序列，例如内源基因或异源基因在细胞中的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mRNA，并且任选地，mRNA随后翻译成一种或多种多肽。在其他情况下，表达可以仅仅指含有RNA分子的DNA的转录。

外来的：术语“外来的”指通过实验操作导入细胞的任何核酸分子(例如，基因序列)并且可以包括在细胞中发现的序列，只要所引入的序列含有一些修饰(例如，点突变、存在选择标记基因等)并且因此相对于天然存在的序列是不同的。

功能连接：术语“功能连接”或“功能连接的”等同于术语“有效连接”或“有效连接的”并且将被理解为指例如调节元件(例如，启动子)与待表达的核酸序列和如果合适，其他调节元件(例如，终止子)以这样的方式顺序排列，使得每个调节元件都可以完成其预期的功能以允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达。可以使用“有效连接”或“有效连接的”作为同义词。该表述可取决于核酸序列关于有义或反义RNA的排列。为此，化学意义上的直接连接不是必需的。遗传控制序列，如增强子序列，也可以从远处或实际上从其他DNA分子对靶序列发挥功能。优选的排列是这样的排列，其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列的后面，从而两个序列彼此共价连接。在优选实施方案中，待转录的核酸序列以这样的方式位于启动子后面，使得转录起始与本发明的嵌合RNA的期望起始相同。功能连接和表达构建体可以通过如所述的惯用重组和克隆技术产生(例如，在Maniatis T,Fritsch EF and Sambrook J(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy et al.(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor(NY)；Ausubel et al.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience；Gelvin et al.(Eds)(1990)PlantMolecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlands中)。然而，例如，作为具有限制酶的特定切割位点的接头或作为信号肽的其他序列也可以位于两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调节区如启动子与待表达的核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在或者可以例如通过转化插入基因组中。

基因：术语“基因”指有效连接合适的调节序列的区域，所述调节序列能够以某种方式调节基因产物(例如，多肽或功能RNA)的表达。基因包括编码区(可读框，ORF)前面(上游)和后面(下游)的DNA的非翻译调节区(例如，启动子、增强子、抑制子，等)。如本文所用的术语“结构基因”意指这样的DNA序列，其被转录成mRNA，mRNA然后被翻译成特定多肽特征性的氨基酸序列。

基因组和基因组DNA：术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包括拟核的DNA以及自主复制质粒的DNA。

异源的：关于核酸分子或DNA的术语“异源的”指核酸分子，其有效连接或被操作而变得有效连接到第二个核酸分子，该第二个核酸分子天然不有效连接所述核酸分子，或者第二个核酸分子与所述核酸分子天然有效连接在不同的位置。包含核酸分子和与其连接的一个或多个调节核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是通过实验操作产生的构建体，其中a)所述核酸分子，或b)所述调节核酸分子或c)两者(即(a)和(b))不位于其天然(自然)遗传环境或已经通过实验操作进行修饰，修饰的例子是一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境指来源生物中天然的遗产基因座或者指在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，优选保留，至少部分保留核酸分子序列的天然遗传环境。所述环境在所述核酸分子的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1,000bp,非常特别优选至少5,000bp长度的序列。天然发生的表达构建体，例如启动子与对应基因的天然发生的组合当被非天然、合成的“人工”方法如诱变修饰时，变成转基因表达构建体。已经描述了此类方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，认为有效连接启动子(其不是该核酸分子的天然启动子)的编码蛋白质的核酸分子与该启动子是异源的。优选地，异源DNA与其所引入的细胞不是内源的或不天然结合，但是已经从另一细胞获得或已经合成。异源DNA也包括含有某种修饰的内源DNA序列，内源DNA序列的非天然发生的多拷贝，或与物理上与其连接的另一DNA序列不天然结合的DNA序列。通常，尽管不是必要的，异源DNA编码这样的RNA或蛋白质，所述RNA或蛋白质通常不是由所述异源DNA在其中表达的细胞产生的。

杂交：如本文所用的术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基配对与互补链结合的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,NewYork)。杂交和杂交的强度(即，核酸分子之间结合的强度)受到诸如核酸分子之间互补性程度，所涉及的条件的严格性，所形成的杂合体的Tm和核酸分子内G:C比例的因素的影响。如本文所用，术语“Tm”参考“解链温度”使用。解链温度是双链核酸分子群体变得半解离为单链时的温度。计算核酸分子的Tm的方程是本领域公知的。如标准参考书所指出，当核酸分子在1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计可以通过以下方程计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)[见例如，Anderson and Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic AcidHybridization(1985)]。其他参考文献包括更复杂的计算，其对于Tm的计算考虑结构以及序列特征。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以见Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。合适的杂交条件是在这样的条件下与包含序列的互补序列的至少50个，优选至少100个，更优选至少150个，甚至更优选至少200个，最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交，所述条件等同于在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4,1mM EDTA，50℃下在2X SSC,0.1％SDS,50℃(低严格性)下洗涤。其他合适的杂交条件是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4,1mM EDTA，50℃下与包含序列的互补序列的至少50个，优选至少100个，更优选至少150个，甚至更优选至少200个，最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交，在1X SSC,0.1％SDS 50℃(中等严格性)或65℃(高严格性)下洗涤。

同一性：当关于两个或多个核酸或氨基酸分子比较使用时，“同一性”指所述分子的序列共有某种程度的序列相似性，所述序列是部分相同的。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸分子的百分数同一性(如果提及核酸序列，同源性在本文可互换使用)，将序列一个写在另一个的下方用于最佳比较(例如，可以在蛋白质或核酸的序列中插入空位以便产生与另一蛋白质或另一核酸的最佳比对)。

然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上氨基酸残基或核酸分子。如果一条序列中的位置与另一条序列中相应位置被相同的氨基酸残基或相同的核酸分子占据，那么所述分子在该位置上是相同的。两条序列之间的百分数同一性是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数x 100)。当提及核酸序列时，术语“同源性”和“同一性”从而被认为是同义词。当提及氨基酸序列时，术语同一性指序列中特定位置上相同氨基酸，术语同源性指序列中特定位置上的同源氨基酸。同源氨基酸是具有相似侧链的氨基酸。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。

编码与本发明的蛋白质同源的蛋白质的核酸分子可以如下来产生：在核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，从而在所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术，如位点定向诱变或PCR介导的诱变向本发明的序列中引入突变。优选地，在一个或多个预期的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β－分支侧链氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。从而，本发明蛋白质中预期的非必需氨基酸优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换。

备选地，在另一实施方案中，可以沿着编码序列的全部或部分随机引入突变，如通过饱和诱变，并且可以筛选所得的突变体的本文所述的各自活性以鉴定保留其活性的突变体。在诱变本发明的序列之一后，可以重组表达所编码的蛋白质并且可以使用例如本文所述的测定法测定蛋白质的活性。

为了测定两个或多个氨基酸序列或两个或多个核苷酸序列的百分数同一性，已经开发了一些计算机软件程序。可以用例如软件fasta计算两个或多个序列的同一性，fasta当前以版本fasta 3使用(W.R.Pearson and D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Methods in Enzymology 183,63(1990)；W.R.Pearson and D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))。用于计算不同序列的同一性的另一有用的程序是标准blast程序，其包括在Biomax pedant软件(Biomax,Munich,Federal Republic of Germany)中。这有时不幸地导致次优结果，因为blast不总是包括主题和查询的完整序列。然而，因为该程序非常有效，其可用于比较巨大数目的序列。下面的设置通常用于这种序列的比较：

-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认值＝nr；-i查询文件[File In]；默认值＝stdin；-e期望值(E)[实数]；默认值＝10.0；-m比对视图选项:0＝逐对；1＝查询锚定的显示同一性；2＝查询锚定的无同一性；3＝平面查询锚定的,显示同一性；4＝平面查询锚定的,无同一性；5＝查询锚定的无同一性和平末端；6＝平面查询锚定的,无同一性和平末端；7＝XML Blast输出；8＝表格式；9表格式具有注释行[整数]；默认值＝0；-o BLAST报告输出文件[文件输出]任选的；默认值＝stdout；-F过滤器查询序列(DUST with blastn,SEGwith others)[字符串]；默认值＝T；-G打开空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认值＝0；-E延伸空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认值＝0；-X空位比对的X减少值(比特)(0调用默认行为)；blastn 30,megablast 20,tblastx 0,所有其他的15[整数]；默认值＝0；-I Show GI's in deflines[T/F]；默认值＝F；-q核苷酸错配的惩罚(仅blastn)[整数]；默认值＝-3；-r核苷酸匹配的奖励(仅blastn)[整数]；默认值＝1；-v对(V)显示一行描述的数据库序列的数目[整数]；默认值＝500；-b对(B)显示比对的数据库序列的数目[整数]；默认值＝250；-f延伸命中的阈值,如果0则为默认值；blastp 11,blastn 0,blastx 12,tblastn13；tblastx 13,megablast 0[整数]；默认值＝0；-g进行空位比对(用tblastx无效)[T/F]；默认值＝T；-Q待使用的查询遗传代码[整数]；默认值＝1；-D DB遗传代码(仅对tblast[nx])[整数]；默认值＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认值＝1；-O SeqAlign文件[文件输出]任选的；-J相信查询defline[T/F]；默认值＝F；-M矩阵[字符串]；默认值＝BLOSUM62；-W字长,如果0则为默认值(blastn 11,megablast 28,所有其他的3)[整数]；默认值＝0；-z数据库的有效长度(对于实际大小使用0)[实数]；默认值＝0；-K来自待保持区域的最佳命中的数目(如果推荐使用100的值，那么默认关)[整数]；默认值＝0；-P多次命中为0，单次命中为1[整数]；默认值＝0；-Y搜索空间的有效长度(对于实际大小使用0)[实数]；默认值＝0；-S对数据库搜索的查询链(对blast[nx],和tblastx)；3为两者，1为顶部，2为底部[整数]；默认值＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认值＝F；-l限制数据库的搜索到GI的列表[字符串]任选的；-U使用FASTA序列的小写体过滤[T/F]任选的；默认值＝F；-y无缺口延伸的X减少值比特(0.0调用默认行为)；blastn 20,megablast 10,所有其他的7[实数]；默认值＝0.0；-Z最后空位比对的X减少值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn/megablast50,tblastx 0,所有其他的25[整数]；默认值＝0；-R PSI-TBLASTN限制点文件[文件输入]任选的；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认值＝F；-L查询序列上的位置[字符串]任选的；-A多个命中窗口大小,如果0则为默认值(blastn/megablast 0,所有其他的40[整数]；默认值＝0；-w移码罚分(对于blastx，OOF算法)[整数]；默认值＝0；-t tblastn中用于连接HSP允许的最大内含子的长度(0使得不能连接)[整数]；默认值＝0。

通过使用Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法搜索高质量结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列的比较可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins et al.,CABIOS 5,151(1989))或优选用程序“Gap”和“Needle”(它们均基于Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48；443(1970)),和“BestFit”(其基于Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))进行。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)；Altschul et al.,(Nucleic Acids Res.25,3389(1997)),“Needle”是TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)(Trends in Genetics 16(6),276(2000))的一部分。因此，优选地，用程序“Gap”或“Needle”在序列的整个范围上进行计算以确定序列同一性百分比。下面用于比较核酸序列的标准调整用于“Needle”:矩阵:EDNAFULL,Gap_penalty:10.0,Extend_penalty:0.5。下面用于核酸序列比较的标准调整用于“Gap”:空位权重:50,长度权重:3,平均匹配:10.000,平均错配:0.000。

例如，在核酸水平上与SEQ ID NO:1的序列有80％同一性的序列被理解为指这样的序列，其当通过上面的程序“Needle”用上面的参数设置与SEQ ID NO:1代表的序列比较时，具有80％同一性。优选地，基于查询序列如SEQ ID NO:1.的完整长度计算同一性。

分离的：如本文所用的术语“分离的”意指物质已经通过人手取出并且与其最初的原始环境分开存在并且因此不是自然的产物。分离的物质或分子(如DNA分子或酶)可以以纯化形式存在或者可以存在于非天然环境如转基因宿主细胞中。例如，天然存在的核酸分子或存在于活细胞的多肽不是分离的，但与天然系统中一些或所有共存物质分离的同样的核酸分子或多肽是分离的。这种核酸分子可以是载体的一部分和/或这样的核酸分子或多肽可以是组合物的一部分，并且是分离的，因为这样的载体或组合物不是其原始环境的一部分。优选地，关于核酸分子使用时，如在“分离的核酸序列”中的术语“分离的”指已经鉴定且从至少一种污染性核酸分子分开的核酸序列，它在其天然来源中通常与所述污染性核酸分子结合。分离的核酸分子是这样的核酸分子，其存在的形式或背景与它在自然界中发现的不同。相比，非分离的核酸分子是核酸分子，例如DNA和RNA，其以它们在自然界中存在的状态被发现。例如，一个给定的DNA序列(例如，基因)在宿主细胞染色体上邻近基因附近被发现；RNA序列，如一个编码特定蛋白质的特定mRNA序列，在细胞中作为与许多其它的编码多种蛋白质的mRNA的混合物被发现。然而，包含例如SEQ ID NO:1的分离的核酸序列包括例如，在细胞中的此类核酸序列，所述序列通常包含SEQ ID NO:1，其中所述核酸序列是在不同于天然细胞的基因组或质粒位置，或侧翼是与自然界中发现的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸序列被用于表达蛋白质时，核酸序列将至少包含至少部分有义链或编码链(即，所述核酸序列可以是单链的)。或者，它可以含有有义和反义链(即，所述核酸序列可以是双链的)。

非编码：术语“非编码”指的是不编码表达的蛋白质的部分或全部的核酸分子的序列。非编码序列包括但不限于增强子，启动子区，3'非翻译区，和5'非翻译区。

核酸和核苷酸：术语“核酸”和“核苷酸”是指天然存在的或合成或人造的核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包括单链或双链，有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或任何核苷酸类似物和聚合物或其杂合体。除非另外指出，特定的核酸序列还暗示包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”与“基因”、“cDNA“、”mRNA“、“寡核苷酸“和”核酸分子“在本文可互换使用。核苷酸类似物包括在碱基，糖和/或磷酸酯的化学结构中具有修饰的核苷酸，所述修饰包括但不限于，5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰，胞嘧啶环外胺修饰，5-溴尿嘧啶的取代，等；和2'-位糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH被选自H，OR，R，卤素，SH，SR，NH 2，NHR，NR2或CN的基团取代。短发夹RNA(shRNA)也可以包括非天然的元素，如非天然的碱，例如，ionosin和黄嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然磷酸二酯键，例如，甲基膦酸酯，硫代磷酸酯和肽。

核酸序列：术语“核酸序列”指从5'-到3'-末端读取的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA，自我复制的质粒，DNA或RNA的感染性的聚合物和执行主要结构性角色的DNA或RNA。“核酸序列”还指缩写，字母，字符或词的连续的列表，它们代表核苷酸。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”,其是一个相对短的核酸，通常在长度上小于100个核苷酸。通常核酸探针是从约50个核苷酸长度到约10个核苷酸长度。核酸的“靶区域”是被识别为所关注的核酸的一部分。核酸的“编码区”是核酸的一部分，它当置于适当调节序列的控制下时，以序列特异性方式转录和翻译以产生特定多肽或蛋白质。编码区编码这样的多肽或蛋白质。

寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物，以及具有相似功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。这种经修饰的或取代的寡核苷酸通常因为期望的性质而优于天然形式，所述性质为例如，增强的细胞吸收，对核酸靶标的增强的亲和力和在核酸酶的存在下增加的稳定性。一个寡核苷酸优选包括通过连接(例如，磷酸二酯)或替代键共价偶联于彼此的两个或多个核单体。

突出端：“突出端“是在双链寡核苷酸分子的5'-或3'-羟基末端上相对短的单链核苷酸序列(也称作“延伸”、“突出端”或“粘性末端”)。

多肽：术语“多肽”，“肽”，“寡肽”，“多肽”，“基因产物”，“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的多聚体和低聚物。

启动子：术语“启动子”或“启动子序列”是等同的并且如本文中所使用，是指DNA序列，其当有效连接到目的核苷酸序列时能够控制目的核苷酸序列转录成RNA。启动子位于5'(即，上游)，邻近目的核苷酸序列的转录起点(启动子控制所述目的核苷酸序列转录成mRNA)，并提供了RNA聚合酶特异性结合和其它转录因子起始转录的位点。该启动子不包括编码区或5'非翻译区。启动子可以例如与各自细胞是异源或同源的。核酸分子序列如果来自外来物种，或者如果来自相同物种，从其原始形式修饰，那么与生物体或第二核酸分子序列是“异源的”。例如，有效连接到异源编码序列的启动子是指编码序列与启动子来自不同物种，或者，如果来自相同物种，编码序列与启动子天然不是结合的(例如，遗传改造的编码序列或来自不同的生态型或品种的等位基因)。合适的启动子可以来自那里应该发生表达的宿主细胞的基因或来自该宿主的病原体。

纯化的：如本文所使用的，术语“纯化的”是指从它们的天然环境中去除(分离的或分开)的分子(无论核酸或氨基酸序列)。“基本上纯化的”分子至少60％，优选至少75％，更优选至少90％没有与它们天然结合的其他成分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。

重组的：术语“重组的”就核酸分子而言是指通过重组DNA技术产生的核酸分子。该术语还包括其本身不存在于自然界中，但被修改，改变，突变或由人以其他方式操纵的核酸分子。优选地，“重组核酸分子”是非天然存在的核酸分子，其有至少一个核苷酸不同于天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”还可以包含“重组构建体”，其包含，优选有效连接，以那个顺序不天然存在的核酸分子的序列。用于产生所述重组核酸分子的优选方法可包括克隆技术，定向或非定向诱变，合成或重组技术。

显著增加：例如，酶的活性、基因表达、某种产品的生产力或产率的增加，该增加比在测量技术的固有误差界限更大，优选比对照酶的活性，表达，生产力，产率或或对照细胞中的表达或对照细胞中的生产力或产率增加约10％或25％，优选50％或75％，更优选2倍或5倍或更大，甚至更优选增加约10倍或更大。

显著减少：例如，酶的活性、基因表达、某种产品的生产力或产率的减少，该减少比在测量技术的固有误差界限更大，优选减少至少约5％或10％，优选至少约20％或25％，更优选至少约50％或75％，甚至更优选至少约80％或85％，最优选至少约90％，95％，97％，98％或99％。

基本上互补：在其最广泛的意义上，术语“基本上互补”，关于相对于参比或目标核苷酸序列的核苷酸序列使用时，是指核苷酸序列具有所述参比或目标核苷酸序列的基本上互补的核苷酸序列和精确互补序列之间的同一性百分数为至少60％，更理想的是至少70％，更理想的是至少80％或85％，优选至少90％，更优选至少93％，还更优选至少95％或96％，还更优选至少97％或98％，还更优选至少99％或最优选100％(在这种情况下后者等同于术语“相同的”)。优选地，同一性在至少19个核苷酸的长度，优选至少50个核苷酸，更优选核酸序列的全长上与所述参比序列评估(如果下面没有另外规定)。序列比较用University of Wisconsin GCG,GAP的SEQWEB应用，以默认GAP分析，基于Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48:443-453；如上述所定义)进行。与参比核苷酸序列“基本上互补”的核苷酸序列在低严格条件下，优选中等严格条件，最优选高严格条件(如上述定义)下与参比核苷酸序列杂交。

转基因：如本文所使用的术语“转基因”是指任何核酸序列，其通过实验操作被引入细胞的基因组中。转基因可以是“内源DNA序列”，或“异源DNA序列”(即，“外源DNA”)。术语“内源DNA序列”指核苷酸序列，其天然存在于它被引入的细胞中，只要它相对于天然存在的序列不含有某种修饰(例如点突变，可选择标记基因的存在等)。

转基因的：提及生物体时术语转基因指用重组DNA分子转化的，优选稳定转化的，所述重组DNA分子优选地包含有效连接到目的DNA序列的合适启动子。

载体：如本文所使用的，术语“载体”指能够转运其已经连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合的载体或“整合载体”，它可以变成整合到宿主细胞的基因组DNA。另一类型的载体是附加型载体，即，能够染色体外复制的质粒或核酸分子。能够指导与它们有效连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，除非从上下文清楚具有不同意思。

野生型：术语“野生型”，“天然的”或“天然来源”关于生物体时指所述生物体不被改变，突变，或由人以其他方式操纵。相对于多肽或核酸序列，该多肽或核酸序列是天然存在的或可在至少一个天然产生的生物体中获得，其没有被改变，突变，或由人以其他方式操纵。

野生型微生物是指一种微生物，其基因组存在的状态与引进某个基因的遗传修饰前一样。所述遗传修饰可以是例如基因或其部分的缺失或点突变或基因的引入。

术语“生产”或“生产力”是本领域公知的，并且包括在给定的时间和给定的发酵体积(例如千克产物每小时每升)内形成的发酵产物(例如，丙氨酸)的浓度。术语“生产效率”包括要完成的特定生产水平(例如，细胞需要多久达到精细化学品的输出的特定比率)所需的时间。生产力也可能意味着时空产量，这个产量被定义为产生的产品量除以反应器的体积和时间。

术语“产率”或“产物/碳产率”是本领域公知的并包括碳源转化为产物(即，精细化学品)的效率。这通常写作，例如，kg产物每kg碳源。通过增加化合物的产率或生产，回收的分子或在给定的时间量内给定量的培养物中那种化合物的有用的回收分子的量增加了。

术语“重组微生物”包括微生物,其已被遗传修饰，使得它们与它们所来源的野生型微生物相比表现出改变的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。重组微生物包含至少一个重组DNA分子。

术语“重组的”关于DNA时指使用重组DNA技术通过人所产生的DNA分子。该术语包括其本身不存在于自然界的DNA分子或不存在于所述DNA所来源的生物体，但被修饰，改变，突变或由人以其他方式操纵的DNA分子。优选地，“重组DNA分子”是序列与天然存在核酸分子相差至少一个核苷酸的非天然存在核酸分子。“重组DNA分子”也可包括“重组构建体”，其包括，优选有效连接，以那个顺序不天然存在的核酸分子的序列。用于制备所述的重组DNA分子的优选的方法可包括克隆技术，定向或非定向诱变，基因合成或重组技术。

这样的重组DNA的一个例子是插入了异源DNA序列的质粒或与重组DNA衍生的基因或启动子相比突变的基因或启动子。可通过本领域已知的定向诱变技术或通过随机诱变技术如化学，紫外线或X射线诱变或定向进化技术来引入突变。

术语“定向进化”与术语“代谢进化”同义使用，并且涉及应用选择压力，其有利于具有目的性状的突变体生长。选择压力可以基于不同的培养条件，ATP和生长偶联的选择和氧化还原相关的选择。选择压力可用具有顺序转移接种的分批发酵或具有相同的压力的连续培养来进行。

术语“表达”或“基因表达”是指一个或多个特定的基因或特定的遗传载体构建体的转录。特别是，术语“表达”或“基因表达”尤其指基因或遗传载体构建体转录成mRNA。该过程包括DNA的转录并且可能包括所得的RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括mRNA的翻译和所编码的蛋白质的合成，即，蛋白质表达。

图1

ackA-pta基因失活后的克隆验证。

A：用引物P395-ackA-pta-check2和P395-ackA-pta-check5(338bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRT的基因组DNA中获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-ackA-pta-check2和P395-ackA-pta-check5测序PCR扩增子证实了ackA-pta基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图2

adhE基因的失活之后的克隆验证。

A：用引物P395-adhE-check2和P395-adhE-check5(569bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-adhE-check2和P395-adhE-check5对PCR扩增子的测序证实了adhE基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图3

frdABCD基因的失活之后的克隆验证。

A：用引物P395-frd-check1和P395-frd-check4(797bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-frd-check1和P395-frd-check4对PCR扩增子的测序证实了frd基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图4

pflB基因的失活之后的克隆验证。

A：用引物P395-pflB-check1和P395-pflB-check3(511bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRTΔpflB::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-pflB-check1和P395-pflB-check3对PCR扩增子的测序证实了pflB基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图5

alaD-gstear基因的整合之后的克隆验证。

A：用引物P395-ldhA-check1和P395-ldhA-check2(1833bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRTΔpflB::FRTΔldhA::alaD-gstear的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-ldhA-check1和P395-ldhA-check2对PCR扩增子的测序证实了ldhA基因座的碱基对精确修饰和alaD-gstear的整合。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。alaD-gstear ORF以青色显示，剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。

图6

本发明微生物中丙氨酸合成的代谢图谱。

红色的星形描绘了酶活性的敲除。

绿色箭头表示引入的酶活性。

J7代表ldh-乳酸脱氢酶，KO降低乳酸产量。

J6代表frdABCD-延胡索酸还原酶，KO降低了琥珀酸的产量。

J8代表pfl-丙酮酸甲酸裂解酶，KO减少乙酸和乙醇的产生。

J10代表ack-pta-磷酸转乙酰酶-乙酸激酶，KO减少乙酸的产生。

J11代表adhE-醇脱氢酶，KO减少乙醇的产生。

图7

大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ48(ArgP A96E)在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵期间丙氨酸的形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图8

用140g/L葡萄糖作为碳源,在500mL AM1培养基中分批发酵46h后，大肠杆菌QZ20和QZ48(ArgP A96E)的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图9

大肠杆菌QZ20/pACYC184质粒对照和大肠杆菌QZ20/pACYC184-argP在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵期间的丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图10

用140g/L葡萄糖作为碳源,在500mL AM1培养基中分批发酵20h后，大肠杆菌QZ20/pACYC184质粒对照和大肠杆菌QZ20/pACYC184-argP的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图11

在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ58(gcvA/B启动子SNP)期间丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH6.8，不通气。

图12

用140g/L葡萄糖作为碳源,在500mL AM1培养基中分批发酵46h后，大肠杆菌QZ20和QZ58(gcvA/B启动子SNP)的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图13

在含有140g/L的500mL AM1培养基中分批发酵大肠杆菌QZ48(ArgP A96E)和大肠杆菌QZ66(Arg A96E，gcvA/B启动子SNP)期间丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图14

用140g/L葡萄糖作为碳源,在500mL AM1培养基中分批发酵46h后，大肠杆菌QZ48(ArgP A96E)和大肠杆菌QZ66(ArgP A96E，gcvA/B启动子SNP)的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图15

(A)gcvA和(B)gcvB在大肠杆菌QZ20和QZ23中分批发酵8小时，11小时和28小时相对于大肠杆菌QZ20 8小时的相对基因转录分析。将所有qPCR衍生的数据相对于作为参照的rrsA基因进行归一化。

图16

在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵大肠杆菌QZ20/pACYC184质粒对照，大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvA和大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvB期间的丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图17

在含有140g/L葡萄糖作为碳源的500mL AM1培养基中分批发酵46h后，具有质粒对照pACYC184，pACYC184-gcvA和pACYC184-gcvB对大肠杆菌QZ20的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图18

在含有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ71(gcvB敲除)期间丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图19

在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵46h后大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ71(gcvB敲除)的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图20

在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵大肠杆菌QZ20，大肠杆菌QZ57(brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ69(brnQ KO)期间丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图21

在含有140g/L葡萄糖作为碳源的500mL AM1培养基中分批发酵46h后大肠杆菌QZ20，大肠杆菌QZ57(brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ69(brnQ KO)的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图22

在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ56(LpxD A15T)期间丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图23

在含有140g/L葡萄糖作为碳源的500mL AM1培养基中分批发酵46h后大肠杆菌QZ20和QZ56(LpxD A15T)的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图24

在具有140g/L葡萄糖的500mL AM1培养基中分批发酵大肠杆菌QZ68(argP A96E，gcvA/B启动子SNP，brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ70(argP A96E，gcvA/B启动子SNP，brnQΔ667-764,1pxDA15T)的丙氨酸形成。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

图25

在含有140g/L葡萄糖作为碳源的500mL AM1培养基中分批发酵46h后大肠杆菌QZ68(argP A96E，gcvA/B启动子SNP，brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ70(argP A96E，gcvA/B启动子SNP，brnQΔ667-764,1pxDA15T)的体积丙氨酸生产力(时空产率)，定义为产生的产物量除以反应器体积和时间。

图26

在含有140g/L葡萄糖作为碳源的500mL AM1培养基中分批发酵期间的各个时间点从大肠杆菌菌株QZ30和大肠杆菌菌株QZ23获取的丙氨酸样品的对映体过量。使用5N NH4OH将发酵控制在37℃，400rpm，pH 6.8，不通气。

实施例

化学品和常用方法

除非另有说明，如(Sambrook et al.,1989)中所述进行用于实施本发明的目的的克隆步骤，包括限制性消化，琼脂糖凝胶电泳，核酸纯化，核酸的连接，转化，选择和培养细菌细胞。重组DNA的序列分析用激光荧光DNA测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)使用桑格技术执行(Sanger等人，1977)。除非另有说明，化学品和试剂购自SigmaAldrich公司(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)，购自(Madison,WI,USA),Duchefa(Haarlem,The Netherlands)或Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。限制性内切酶来自New EnglandBiolabs公司(Ipswich,MA,USA)或Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,Germany)。寡核苷酸是由Eurofins MWG Operon(Ebersberg,Germany)合成。

实施例1：

通过失活ackA-pta,adhE,frdABCD和pflB ORFs并通过alaD基因的密码子优化的变体(alaD-gstear)替换ldhA ORF，将大肠杆菌W(LU17032)工程化用于L-丙氨酸生产。

通过插入FRT-侧翼卡那霉素抗性盒，接着通过FLP重组去除抗生素抗性盒，失活ackA-pta,adhE,frdABCD和pflB ORFs。

所述的ldhA基因由alaD-gstear和下游FRT-侧翼zeocin抗性盒替换，其最后通过FLP重组去除。

材料和方法

细菌培养

大肠杆菌W(LU17032)在Luria-Bertani(LB)液体培养基中或Luria-Bertani固体培养基上培养。偶尔，克隆在含有10mM蔗糖的M9基本琼脂上传代培养以确认W菌株身份。将抗生素酌情加入到该液体和固体培养基至15μg/ml(卡那霉素，氯霉素)，25μg/ml(zeocin)或3μg/ml(四环素)的最终浓度。

Red/ET重组

使用Gene Bridges GmbH(www.genebridges.com)的标准协议进行Red/ET重组。简言之，将Red/ET-proficient大肠杆菌W好氧培养在30℃下至

的OD600nm值。通过添加10％的50微升(重量/体积)L-阿拉伯糖，随后温度升高至37℃诱导红色基因的表达。从未诱导的对照培养物省略阿拉伯糖。在37℃下温育35分钟后，用冰冷的10％(体积/体积)甘油洗涤细胞两次，并在1.35千伏，10μF，600Ω用500纳克PCR产物电穿孔细胞。然后细胞再悬浮在1ml冰冷的LB培养基中，并在37℃下需氧生长大约1.5小时。然后培养物平板接种于含15微克/毫升卡那霉素(敲除)的LB琼脂或25微克/毫升的zeocin(敲入)。

FLP重组

侧翼FRT位点允许通过FLP重组接着大肠杆菌染色体的修饰而去除抗生素抗性标记物。FLP重组留下单个FRT位点(34碱基对)以及短的侧翼序列(各约20个碱基)，其被用作在盒的扩增中的引物结合位点。

为了进行FLP重组，将编码FLP重组酶的质粒708-FLPe(表1)通过电穿孔导入红色/ET重组体中。KanR CmR或ZeoR CmR转化体用于接种0.2毫升LB培养物，其在30℃下培养3小时。然后通过温度偏移至37℃，接着是在37℃三个小时的温育，诱导FLP活性。对从这些培养物获得的单个菌落随后筛选了CmS和KanS或ZeoS表型。

DNA制备和分析

大肠杆菌基因组DNA(gDNA)用Gentra Puregene Yeast/Bact.试剂盒B(Qiagen,Hilden,Germany)从过夜培养物中分离。用PRECISOR高保真DNA聚合酶(BioCat，海德堡)从模板质粒扩增含有敲除或敲入盒的PCR产物并用PCR Extender System(5PRIME GmbH,Hamburg,Germany)根据制造商的建议进行分析PCR反应。使用GeneJET PCR纯化试剂盒或GeneJET凝胶提取试剂盒(Fermentas,St.Leon-Rot,Germany)纯化PCR扩增子并通过BATCBioTech(Konstanz,Germany)或BioSpring(Frankfurt am Main,Germany)测序。

表1.质粒和引物

1.1.ackA-pta基因座-ackA-pta的靶定

将大约500纳克ΔackA-pta PCR构建体(1737bp)电穿孔到Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。三个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实ackA-pta基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图1)。

1.2adhE基因座-adhE的靶定

将大约500纳克ΔadhE PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。两个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕证实adhE基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图2)。

1.3frd基因座-frdABCD的靶定

将大约500纳克ΔfrdABCD PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT和ΔadhE::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实frd基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图3)。

1.4pflB基因座-pflB的靶定

将大约500纳克ΔpflB PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT,ΔadhE::FRT和ΔfrdABCD::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特异的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。四个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实pflB基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图4)。

1.5ldhA基因座-alaD-gstear的敲入

将大约500纳克ΔldhA::alaD-gstear PCR构建体(1783bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT,ΔadhE::FRT,ΔfrdABCD::FRT和ΔpflB::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析四个ZeoR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。

克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实alaD-gstear的整合和zeocin抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图5)。

实施例2丙氨酸的HPLC检测和定量

下列HPLC方法被用于在细胞培养基中丙氨酸的检测：

柱：Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad公司)，300×7.8毫米，内径

粒度9微米

流动相：钙(NO 3)2在0.1mol/L90％，乙腈10％

流速：0.6毫升/分钟

柱温度：60℃

检测：折射率检测器

根据以上的方法，在细胞培养物样品基质中主要估计组分可以从丙氨酸很好地分离，而不干扰丙氨酸的定量。

样品中的丙氨酸的量由外部标准校准方法测定。注射含有0.5～10.0g/L丙氨酸的标准样品并将峰面积用于校准。校准曲线的线性回归系数为0.9995。

样品以20微升注射一次。峰面积用于由Waters LC Millennium软件计算样品中存在的量。

实施例3葡萄糖，琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸和乙醇的HPLC检测和定量

使用的HPLC方法

柱：Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad公司)，300×7.8毫米，内径

粒度9微米

流动相：H2SO4 4mM

流速：0.4毫升/分钟

柱温度：45℃

检测：折射率检测器

分析物的量通过外标校准法测定。注射含有0.1到38.0克/升葡萄糖，0.05至10.0g/L琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸和乙醇的标准样品并将峰面积用于校准。所有六个校准曲线的线性回归系数均好于0.999。

样品以20微升注射一次。峰面积用于由Waters LC Millenium软件计算样品中存在的量。

实施例4来自实施例1的用于改进丙氨酸产率的大肠杆菌W主干(stem)的代谢进化

包含如在实施例1中所述的所有突变的大肠杆菌主干(命名为大肠杆菌Ex1或QZ16)用于代谢进化过程，以提高大肠杆菌Ex1主干的丙氨酸产率。

如下进行代谢进化：在第一和第二进化轮中，在NBS培养基5％葡萄糖中进行连续进化500小时和750小时。

NBS培养基:

3.5g KH2PO4

5.0g K2HPO4

3.5g(NH4)2HPO4

0.25g MgSO4-7H2O

15mg CaCL2-2H2O

0.5mg硫胺素

1ml微量金属贮存液

以0.1M HCL,1.6g FeCL₃-6H₂O；0.2g CoCl₂-6H₂O；0.1g CuCl₂-2H₂O；0.2g ZnCl₂；0.2g NaMoO4-2H₂O；0.05g H₃BO₃制备微量金属贮存液。

细胞在LB平板上划线并测试丙氨酸产率。最好的大肠杆菌主干(大肠杆菌Ev1或QZ17)导致用包含5％葡萄糖的NBS培养基在37℃24及48小时发酵的丙氨酸产率在84％-86％之间，相比，起始主干大肠杆菌Ex1的丙氨酸产率为80％-83％。

大肠杆菌Ev1用于进一步的进化步骤，其以批次进化进行20天。5％的细胞每24h，48h，72h等再次接种在新鲜培养基中，和包含14％葡萄糖的AM1培养基中37℃。

AM1培养基:

15g/L硫酸铵在最后一步加入

1mm甜菜碱

1ml微量金属贮存液”

为了制备1L微量金属贮存液:

以0.12M HCL,2.4g FeCL₃-6H₂O；0.3g CoCl₂-6H₂O；0.21g CuCl₂-2H₂O；0.3gZnCl₂；0.27g NaMoO4-2H₂O；0.068g H₃BO₃；0.5g MnCl2-4H₂O制备微量金属贮存液

从该进化，分离主干大肠杆菌Ev2，又称QZ18。用发酵测试此主干，该发酵在具有14％葡萄糖的AM1培养基的发酵罐中进行。主干大肠杆菌Ev2具有92％-94％的丙氨酸产率，相比，在相同条件下，大肠杆菌Ev1的丙氨酸产率是91％-92％。

另一分批进化步骤在包含12％葡萄糖的AM1培养基中进行300小时，随后在包含12％葡萄糖的AM1中进行10个分批进化步骤，分离主干大肠杆菌Ev3，也命名QZ20。

丙氨酸产率测试揭示主干大肠杆菌Ev3在包含12％葡萄糖的AM1培养基中具有94％-96％的丙氨酸产率，相比，在相同条件下大肠杆菌Ev2的丙氨酸产率是92％-93％。

用大肠杆菌Ev3进行如前所述的在含有14％葡萄糖的AM1培养基中1000小时期间的进一步的连续分批进化，并分离出干菌大肠杆菌Ev4(也称为QZ23)。在具有14％葡萄糖的AM1培养基中，将大肠杆菌Ev4与大肠杆菌Ev3进行比较测试。干菌大肠杆菌Ev4显示丙氨酸生产力(时空产率)(定义为产生的产物量除以反应器体积和时间)增加，为2.0-2.4g/(Lh)，相比发酵46小时后的干菌大肠杆菌Ev3的丙氨酸生产力为1.0-1.3g(/Lh)。

实施例5确定与大肠杆菌Ev3相比较的干菌大肠杆菌Ev4中的突变

对大肠杆菌干菌大肠杆菌Ev4和大肠杆菌Ev3的基因组进行测序，并比较结果，以确定导致干菌大肠杆菌Ev4的丙氨酸生产力增加的突变。

鉴定了brnQ基因中的突变，其将在干菌大肠杆菌Ev3中编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质的brnQ基因的序列从SEQ ID NO:1改变为干菌大肠杆菌Ev4中编码具有SEQ ID NO:4的蛋白质的SEQ ID NO:3。

此外，鉴定了argP基因中的突变，其将在干菌大肠杆菌Ev3中编码具有SEQ ID NO:46的蛋白质的argP基因的序列从SEQ ID NO:45改变为干菌大肠杆菌Ev4中编码具有SEQ IDNO:48的蛋白质的SEQ ID NO:47。

此外，鉴定了gcvA基因的启动子中的突变，其将gcvA基因的启动子的序列从干菌大肠杆菌Ev3中的SEQ ID NO:55改变为干菌大肠杆菌Ev4中的SEQ ID NO:56。在也表现出提高的丙氨酸产量的独立菌株中，鉴定了将gcvA基因的启动子序列从SEQ ID NO:55改变为SEQ ID NO:57的另一个突变。

此外，鉴定了gcvB基因的启动子中的突变，其将gcvB基因的启动子的序列从干菌大肠杆菌Ex1中的SEQ ID NO:59改变为干菌大肠杆菌Ev1中的SEQ ID NO:60。在显示丙氨酸产量增加的另一个独立菌株中，鉴定了gcvB基因的启动子中的另一个突变，将启动子序列从SEQ ID NO:59改变为SEQ ID NO:61。

此外，鉴定了1pxD基因中的突变，其将在干菌大肠杆菌Ev3中编码具有SEQ ID NO:50的蛋白质的lpxD基因的序列从SEQ ID NO:49改变为干菌大肠杆菌Ev4中编码具有SEQ IDNO:52的蛋白质的SEQ ID NO:51。

为了确定所鉴定的突变对于丙氨酸产量和生产力的重要性，将突变顺序地引入大肠杆菌菌株,所述菌株包含如实施例1中所述的突变以及在PCT/IB2014/064426中所描述的突变，包括ygaW基因，zipA基因，lpd基因中的突变和控制alaD基因表达的启动子中的突变，也如上所述。评估这些突变对丙氨酸生产力的影响。通过qPCR监测突变启动子区控制下的突变基因或基因的表达水平。

实施例6确认argP(iciA)基因中SNP的作用

ArgP(或iciA)是一种转录调节子。它控制参与精氨酸转运系统的基因和参与DNA复制的基因。在大肠杆菌QZ23中鉴定了导致ArgP蛋白中A96E突变的SNP，并评估了其对丙氨酸生产力的影响。

大肠杆菌QZ48的菌株构建

使用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo)用引物PargP_1_F和PargP_1_R(参见表1)从模板载体pQZ11(Genescript)扩增具有可选择的氯霉素抗性标记和反向选择性sacB标记(赋予蔗糖敏感性)的argP-cat-sacB盒。PCR产物用DpnI(NEB)在37℃下消化1小时以减少质粒模板背景，并用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从1％琼脂糖凝胶中凝胶提取。使用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo)，用引物PargP_2_F和PargP_2_R(参见表1)从QZ23基因组DNA扩增argP SNP盒(543bp)，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。

对于Red/ET重组，根据制造商的方案使用Genebridges Red/ET重组试剂盒。将大约200ng的argP-cat-sacB盒电穿孔到Red/ET-proficient大肠杆菌QZ20细胞中。将培养物铺在含有10μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，以在电穿孔后选择阳性转化体。通过PCR用基因组特异性引物PargP_seq_F和PargP_seq_R(参见表1)筛选几个菌落用于标记盒的整合。用PCR验证的克隆进行与argP SNP盒的第二次Red/ET重组以取代cat-sacB标记盒。将培养物平板接种在含有6％蔗糖但不含NaCl的LB琼脂平板上，以在电穿孔后选择阳性转化体。用基因组特异性引物PargP_seq_F和PargP_seq_R(参见表1)测试几个克隆的cat-sacB标记盒的丢失。产生大小正确的PCR产物的至少一个克隆也通过测序确证(Genewiz)。在菌株在生物反应器中进行测试之前，热敏重组工程质粒pRedET(amp)在42℃下从LB平板上从菌株熟化过夜。导致ArgP A96E突变的SNP被导入菌株大肠杆菌QZ20中。产生的菌株被命名为QZ48。

大肠杆菌QZ20与大肠杆菌QZ48相比的发酵试验

在实验室规模的生物反应器中测试大肠杆菌菌株QZ48在发酵过程中的性能。监测与大肠杆菌菌株QZ20相比的细胞生长和丙氨酸形成。

将预培养物在具有LB培养基的摇瓶中生长，在37℃和200rpm下20％填充体积过夜。在DASGIP 1.5L平行生物反应器系统(Eppendorf)中，在500mL AM1培养基(2.6g/L(NH4)2HPO4,0.87g/L NH4H2PO4,0.15g/L Kill,0.37g/L MgSO4·7H2O,15g/L(NH4)2SO4，1mM甜菜碱，1ml/L痕量金属母液)中进行发酵。微量金属母液包含1.6g/L FeCL3·6H2O；0.2g/LCoCl2·6H2O；0.1g/L CuCl2·2H2O；0.2g/L ZnCl2；0.2g/L NaMoO4·2H2O；0.05g/LH3BO3,0.1M HCL。使用140g/L葡萄糖作为发酵培养基中的碳源。通过离心收集等同于7的OD600·mL的大肠杆菌细胞并重新悬浮于5毫升的AM 1培养基。#OD600·mL＝(未稀释的培养物的OD600)×(以mL计的培养物体积)。5毫升重悬浮细胞用于接种在1.5升DASGIP生物反应器中的500mL发酵培养基。每个菌株以一式两份在37℃和400rpm搅拌速度下运行。5NNH4OH被用来控制pH值至6.8，并提供培养物，以铵作为在整个发酵中的丙氨酸前体。没有空气在发酵过程中被喷射并且未加压容器，使得在培养基中由细胞初步消耗溶解的氧后,发酵在微需氧条件下运行。整个发酵过程中采集样品并通过HPLC分析丙氨酸和葡萄糖浓度。

QZ48中的ArgP A96E突变对丙氨酸形成有强烈的影响(图7)。QZ20在46小时后的体积丙氨酸生产力(时空产率)(定义为产生的产物量除以反应器体积和时间)为1.15±0.06g/(Lh)。大肠杆菌QZ48在46小时后显示增加的体积丙氨酸生产力：1.51±0.01g/(Lh)(图8)。

构建pACYC184-argP质粒

为了测试argP过表达的影响，通过商业InFusion克隆技术(Clontech，MountainView，CA，USA)构建质粒pACYC184-argP(p15ori，CmR，每个细胞

个拷贝)。首先通过NEB(Ipswich，MA，USA)获得载体pACYC184(表1)，并用来自NEB的HindIII和SalI限制性内切核酸酶线性化。该消化去除了大部分四环素抗性基因。单独地，用引物PargP-pACYC_F和PargP-pACYC_R(表1)用Phusion聚合酶(Thermo Scientific，Waltham，MA)从野生型大肠杆菌W DNA中PCR扩增argP ORF。

引物含有额外的与线性化载体末端同源的15bp突出端以促进无缝克隆。然后根据制造商的方案使用纯化的线性化载体骨架和argP插入片段进行InFusion反应。然后将得到的InFusion产物用于通过电穿孔转化QZ20并在LB氯霉素板上进行选择。PCR鉴定阳性克隆，通过DNA测序证实，并用于过表达研究的发酵。

QZ20/pACYC184和QZ20/pACYC184-argP之间的发酵比较

将预培养物在具有LB培养基的摇瓶中生长，20％填充体积在37℃和200rpm过夜。在具有14％葡萄糖的AM1培养基中的DASGIP 1.5L平行生物反应器系统中进行发酵。所有的发酵条件如前所述。

argP过表达导致发酵20小时后丙氨酸形成速率加快和丙氨酸滴度升高(图9)。QZ20/pACYC-argP在20小时后的体积丙氨酸生产力(时空产率)(定义为产生的产物量除以反应器体积和时间)为0.69±0.04g/(Lh)，相比之下具有pACYC184质粒对照的菌株的为0.61±0.02g/(Lh)(图10)。

实施例7确认gcvA/gcvB启动子区域中SNP的作用

QZ58和QZ66的菌株构建

使用引物PgcvA_1_F/R(表1)从载体pQZ11(Genescript)扩增gcvA-cat-sacB盒。使用引物PgcvA_2_F/R从菌株QZ23的基因组DNA扩增gcvA/B SNP盒(320bp)(表1)。如前所述进行Red/ET重组工作。使用PgcvA_seq_F/R测序引物通过菌落PCR测试克隆。将gcvA/B启动子区中的SNP引入大肠杆菌QZ20中，并将所得菌株命名为QZ58。还将SNP引入QZ48(argP SNP)中，并将所得菌株命名为QZ66。

QZ58和QZ66的发酵试验

如前所述在发酵期间测试菌株QZ58(gcvA/B启动子SNP)的性能。监测与菌株QZ20相比的丙氨酸形成。

gcvA/B启动子SNP对丙氨酸形成具有显著影响，导致丙氨酸形成速率更高，在46h后为约76g/L的丙氨酸滴度，相比46小时后QZ20产生约54g/L(图11)。在46h后QZ58的体积丙氨酸生产力为1.66±0.02g/(Lh)，而QZ20为1.15±0.06g/(Lh)(图12)。

还将gcvA/B启动子SNP添加到QZ48中的argP SNP的上面，并且在丙氨酸发酵期间测试与QZ48相比所得的菌株QZ66。在QZ66中，argP突变顶端的额外gcvA/B启动子突变导致与QZ48相比更快的丙氨酸形成速率，46h后约76g/L的较高丙氨酸产率，相比QZ48中为约70g/L(图13)。46小时后QZ66的体积丙氨酸生产力为1.65±0.08g/(Lh)，相比QZ48的为1.51±0.01g/(Lh)(图14)。

gcvA和gcvB转录水平的RT-qPCR分析

通过定量逆转录PCR(RT-qPCR的)测定gcvA和gcvB的转录水平。来自Biorad公司的iTaq Universal One-Step Kit用于基于SYBR Green的一步法逆转录(RT)-qPCR反应。从如先前所述进行的大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ23的平行分批发酵，在8h，11h，和28h取培养物样品。样品立即用RNAprotect细菌试剂(Qiagen)处理以稳定RNA。根据制造商的手册用AurumTotal RNA Mini Kit(Biorad)从样品提取RNA。分离的RNA用DNA-free DNA RemovalKit(lifetechnologies)进一步处理以除去污染性基因组DNA和在qPCR期间降低背景。将RNA在λ＝260nm处用分光光度计定量。

用RT-qPCR引物(表1)：gcvA基因的PgcvA_RT_F/R，gcvB调控RNA的PgcvB_RT_F/R和特异于编码PrrsA基因的核糖体16S RNA的rrsA_RT_F和PrrsA_RT_R测试100ng大肠杆菌QZ20RNA的7步10倍稀释系列，所述PrrsA基因作为qPCR试验期间的参照基因。对每个RT-qPCR引物组，测定导致信号放大效率90％<E<110％和R²>0.985的线性回归系数的RNA稀释液的合适的线性动态范围。测试rrsA作为归一化的内部参考基因的合适性并且发现在所有试验样品之间稳定表达(数据未显示)。根据制造商的方案用Touch Real-Time PCRDetection System(Biorad)进行RT-qPCR反应。根据ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen2001)，用大肠杆菌QZ20 8h RNA作为内部校准物计算基因表达的相对定量。

qPCR结果证实发酵8h和11h后指数期期间，与QZ20相比较，QZ23中gcvA的过表达。当细胞密度下降时，在28小时的样品中观察到gcvA的下调(图15A)。在发酵8h和11h之后，QZ23中的gcvB调节蛋白在指数期与QZ20相比下调。当细胞密度下降时，在28小时样品中观察到gcvB转录的整体下调(图15B)。

构建pACYC184-gcvA和pACYC184-gcvB质粒

由于gcvA/B启动子SNP导致gcvA的过表达，因此需要证实实际上gcvA过表达导致丙氨酸生产力增加。因此，通过商业InFusion克隆技术(Clontech，Mountain View，CA，USA)构建质粒pACYC184-gcvA。首先通过NEB(Ipswich，MA，USA)获得载体pACYC184(表1)，并用也来自NEB的HindIII和SalI限制性内切核酸酶线性化。该消化去除了大部分四环素抗性基因。单独地，用引物PgcvA-pACYC_F和PgcvA-pACYC_R(表1)用Phusion聚合酶(ThermoScientific，Waltham，MA)从野生型大肠杆菌W DNA中PCR扩增gcvA ORF。同样为了测试gcvB过表达的效果，构建了质粒pACYC184-gcvB。用引物PgcvB-pACYC_F和PgcvB-pACYC_R(表1)PCR扩增gcvB转录单位。

引物含有额外的与线性化载体末端同源的15bp突出端以促进无缝克隆。然后按照制造商的方案，分别用纯化的线性化载体骨架和gcvA和gcvB插入片段进行InFusion反应。然后将得到的InFusion产物用于通过电穿孔转化QZ20并在LB氯霉素平板上进行选择。PCR鉴定阳性克隆，通过DNA测序证实，并用于发酵用于过表达研究。

QZ20/pACYC184，QZ20/pACYC184-gcvA和QZ20/pACYC-gcvB之间的发酵比较

将预培养物在具有LB培养基,20％填充体积的摇瓶中，在37℃和200rpm过夜生长。使用具有14％葡萄糖的AM1培养基在DASGIP1.5L平行生物反应器系统中进行发酵。所有的发酵条件如前所述。

发酵试验证实，与空质粒对照相比，来自质粒pACYC184-gcvA的gcvA的过表达导致更高的丙氨酸形成速率和滴度(图16)。相反，来自质粒pACYC184-gcvB的gcvB小调控RNA的过表达导致丙氨酸形成速率和滴度的显著降低。大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvA显示体积丙氨酸生产力为1.50±0.09g/(Lh)，而具有质粒对照的QZ20的体积丙氨酸生产力为1.18±0.08g/(Lh)。与质粒对照相比，大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvB显示降低的体积丙氨酸生产力0.89±0.01g/(Lh)(图17)。

QZ20gcvB敲除QZ71的菌株构建

由于来自质粒pACYC184-gcvB的调节RNA gcvB的过表达导致丙氨酸生产力的显著降低，因此在QZ20中敲除gcvB并测试其性能。使用引物PgcvB_1_F/R(表1)从载体pQZ11(Genescript)扩增gcvB-cat-sacB盒。gcvB缺失盒(400bp)被预定为来自IDT的dsDNAgBlock(SEQ ID NO:98)。如前所述进行Red/ET重组工作。使用PgcvB_seq_F/R测序引物通过菌落PCR测试克隆。将gcvB缺失导入大肠杆菌QZ20中，并将所得菌株命名为QZ71。

QZ71的发酵试验

如前所述在发酵期间测试菌株QZ71(gcvB敲除)的性能。监测与菌株QZ20相比的丙氨酸形成。

与QZ20相比，从QZ20缺失gcvB调控RNA导致丙氨酸滴度增加(图18)。QZ71的体积丙氨酸生产力为1.28±0.05g/(Lh)，相比，46h后QZ20的体积丙氨酸生产率力为1.15±0.06g/(Lh)(图19)。

实施例8确认brnQ基因中缺失的效果(Δ667-764)

BrnQ是推定的439AA支链氨基酸转运蛋白，其将亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸作为钠/支链氨基酸同向转运蛋白转运入细胞。在QZ23中鉴定了97bp的缺失(Δ667-764)，其导致阅读框移位。尽管439AA蛋白质的前222个氨基酸没有改变，但是由于移码而改变了31个氨基酸，并且由于出现了终止密码子，残留的C末端链被截短。由于假定QZ23中的brnQ基因中发现的97bp部分缺失导致BrnQ活性的消除，除了部分brnQ缺失以外，还测试了brnQ基因的完全缺失(敲除)。

QZ57和QZ69的菌株构建

用引物PbrnQ_1_F/R(表1)从载体pQZ11(Genescript)扩增brnQ-cat-sacB盒。用引物PbrnQ_2_F/R(表1)从菌株QZ23的基因组DNA扩增brnQ部分缺失盒(462bp)。brnQ KO盒(500bp)被预定为来自IDT的dsDNA gBlock(SEQ ID NO:117)。如前所述进行Red/ET重组工作。使用PbrnQ_seq_F/R测序引物通过菌落PCR测试克隆。将brnQ部分缺失引入大肠杆菌QZ20中，并将所得菌株命名为QZ57。将brnQ完全缺失导入大肠杆菌QZ20中，并将得到的菌株命名为QZ69。

QZ57和QZ69的发酵试验

如前所述在发酵期间测试菌株QZ57(brnQΔ667-764)和QZ69(brnQ KO)的性能。监测与菌株QZ20相比的丙氨酸形成。

QZ57中的97bp的brnQ缺失和完整的brnQ敲除表现相当。两者均导致比QZ20更高的丙氨酸形成和丙氨酸滴度(图20)。在46h后QZ57的体积丙氨酸生产力为1.30±0.04g/(Lh)，QZ69的生产力为1.28g/(Lh)，而QZ20的生产力为1.15±0.06g/(Lh)(图21)。

实施例9确认lpxD基因中的SNP的作用

在QZ23中，在lpxD基因中检测到SNP，导致编码的酶的A15T突变。由LpxD编码的UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)葡糖胺-N-乙酰转移酶是参与脂质A生物合成的必需酶。脂质A是大肠杆菌外膜脂多糖(LPS)的组成部分。

QZ56和QZ70菌株构建

用引物P1pxD_1C_F/R(表1)从载体pQZ11(Genescript)扩增lpxD-cat-sacB盒。使用引物lpxD_fix_F/R(表1)从菌株QZ23的基因组DNA扩增lpxD SNP盒(2588bp)。如前所述进行Red/ET重组工作。用PlpxD_flank_F/R测序引物通过菌落PCR测试克隆。将lpxD SNP导入大肠杆菌QZ20中，并将得到的菌株命名为QZ56。还将lpxD SNP引入QZ68(argP SNP，gcvA/B启动子SNP，brnQΔ667-764)中，并将所得菌株命名为QZ70。

QZ56和QZ70的发酵试验

如前所述，在发酵期间测试菌株QZ56(lpxD SNP)的性能。监测与菌株QZ20相比的丙氨酸形成。与QZ20相比，QZ56中的LpxD A15T突变导致丙氨酸滴度增加(图22)。在46h后QZ56的体积丙氨酸生产力为1.34±0.06g/(Lh)，而QZ20的体积丙氨酸生产力为1.15±0.06g/(Lh)(图23)。

在QZ68(argP SNP，gcvA/B启动子SNP，brnQΔ667-764)中也引入lpxD SNP，并且在丙氨酸发酵期间与QZ68相比测试所得菌株QZ70。LpxD A15T突变对丙氨酸形成有很强的影响。QZ68和QZ70之间的丙氨酸形成速率是相当的，然而QZ68的丙氨酸滴度在75g/L左右稳定，而在QZ70中丙氨酸形成继续，直到培养基中的所有葡萄糖被消耗，并且约37小时后丙氨酸滴度达到102g/L(图24)。QZ70的体积丙氨酸生产力为2.24±0.002g/(Lh)，46h后QZ68的为1.64±0.03g/(Lh)QZ68(图25)。

实施例10具有缺失的dadX基因的大肠杆菌菌株的构建导致L-丙氨酸的更高的对映体过量

通过从大肠杆菌菌株QZ23的基因组中缺失丙氨酸消旋酶dadX基因(SEQ ID NO:118)构建大肠杆菌菌株QZ30。通过插入FRT侧翼的卡那霉素抗性盒使dadX ORF失活，然后如前所述通过FLP重组除去抗生素抗性盒。根据制造商的方案使用Genebridges Red/ET重组试剂盒。使用引物PdadX_KO_F(SEQ ID NO:122)和PdadX_KO_R(SEQ ID NO:123)从pRED/ET质粒(Gene Bridges)扩增FRT侧翼卡那霉素盒，所述引物各自含有针对dadX ORF的50bp同源区用于插入卡那霉素抗性盒。用引物PdadX_seq_F(SEQ ID NO:124)和PdadX_seq_F(SEQID NO:125)通过PCR检查dadX ORF的成功缺失，并通过对基因组区测序确认。

在实验室规模的生物反应器中，与具有完整dadX的大肠杆菌菌株QZ23相比，培养具有失活的dadX基因的大肠杆菌菌株QZ30，并测试形成的丙氨酸的手性。

将预培养物在具有LB培养基的摇瓶中，在37℃和200rpm下20％填充体积生长过夜。在DASGIP 1.5L平行生物反应器系统(Eppendorf)中，在500mL AM1培养基(2.6g/L(NH₄)₂HPO₄,0.87g/L NH₄H₂PO₄,0.15g/L Kill,0.37g/L MgSO₄·7H₂O,15g/L(NH₄)₂SO₄,1mM甜菜碱，1ml/L痕量金属母液)中进行发酵。微量金属母液包含1.6g/L FeCL₃·6H₂O；0.2g/LCoCl₂·6H₂O；0.1g/L CuCl₂·2H₂O；0.2g/L ZnCl₂；0.2g/L NaMoO₄·2H₂O；0.05g/L H₃BO₃,0.1M HCL。使用140g/L葡萄糖作为发酵培养基中的碳源。

通过离心收获相当于OD600·mL 7的大肠杆菌细胞，并重悬于5mL AM1培养基中。#OD600·mL＝(未稀释培养物的OD600)x(培养物体积，以mL计)。用5mL重悬细胞接种1.5LDASGIP生物反应器中的500mL发酵培养基。每种菌株在37℃和400rpm搅拌速度下一式两份运行。使用5N NH₄OH来控制pH至6.8，并在整个发酵过程中为培养物提供铵作为丙氨酸前体。在发酵期间没有空气鼓泡，并且容器没有加压，从而在细胞对在培养基中溶解氧的初始消耗之后，发酵在微氧条件下进行。在整个发酵过程中取样并通过HPLC分析丙氨酸浓度和手性。

发现与具有完整dadX的大肠杆菌QZ23(图26)相比，具有灭活的dadX基因的大肠杆菌菌株QZ30始终产生具有更高对映体过量(ee)的L-丙氨酸>95％的丙氨酸。培养20小时后，QZ30产生对映体过量98.09％的L-丙氨酸，相比，QZ23产生82.5％的L-丙氨酸。培养34h后，QZ30产生的L-丙氨酸的ee为97.27％，相比，QZ23为81.65％，培养42h后，QZ30产生的L-丙氨酸的ee为97.49％，而QZ23产生的L-丙氨酸的ee为82.2％。

Claims

1.与相应的参比微生物相比在发酵生产中具有更高的丙氨酸产量和/或生产力的重组微生物，该重组微生物包含：

(A)dadX基因的减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达，其中所述dadX基因选自由以下组成的组:

(i)序列如SEQ ID NO:118所示的核酸分子，或者

(ii)编码如SEQ ID NO:119所示多肽的核酸分子，和

(B)以下至少一种：

a)brnQ基因的降低，抑制或缺失的活性和/或表达，

b)argP基因的引入的，增加，增强的活性和/或表达，其中所述argP基因选自：

(I)序列如SEQ ID NO:45所示的核酸分子，其中编码SEQ ID NO:45第286-288位氨基酸丙氨酸的密码子被编码氨基酸谷氨酸的密码子置换，或

(II)编码如SEQ ID NO:46所示多肽的核酸分子，其中SEQ ID NO:46第96位的氨基酸是谷氨酸，

c)gcvA基因的引入的，增加，增强的活性和/或表达，

d)改变的lpxD基因，其中所述改变的lpxD基因选自：

(I)序列如SEQ ID NO:49所示的核酸分子，其中SEQ ID NO:49第43至45位的密码子编码氨基酸苏氨酸，或

(II)编码如SEQ ID NO:50所示多肽的核酸分子，其中SEQ ID NO:50第15位的氨基酸是苏氨酸。

2.权利要求1的重组微生物，其中所述brnQ基因选自以下组成的组

(i)序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子，或

(ii)编码SEQ ID NO:2的多肽的核酸分子。

3.权利要求1的重组微生物，其中所述gcvA基因选自

(i)序列如SEQ ID NO:53所示的核酸分子，或

(ii)编码SEQ ID NO:54的多肽的核酸分子。

4.权利要求1的重组微生物，其还包含降低，抑制或缺失活性和/或表达的gcvB基因，其中所述gcvB基因是序列如SEQ ID NO:58所示的的核酸分子。

5.权利要求1的重组微生物，其进一步包含引入的、增加的或增强的活性和/或表达的alaD基因。

6.权利要求1的重组微生物，其还包含减少的，抑制的或缺失的活性和/或表达的pflB基因。

7.权利要求1的重组微生物，其进一步包含减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的adhE基因。

8.权利要求1的重组微生物，其进一步包含减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的ldhA基因。

9.权利要求1的重组微生物，其进一步包含减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的pta基因。

10.权利要求1的重组微生物，其进一步包含减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的ackA基因。

11.权利要求1的重组微生物，其进一步包含减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的frdA基因。

12.权利要求1的重组微生物，其进一步包含引入的，增加的或增强的活性和/或表达的ygaW基因。

13.权利要求1的重组微生物，其进一步包含引入的，增加的或增强的活性和/或表达的zipA基因。

14.权利要求1的重组微生物，其进一步包含引入的，增加的或增强的活性和/或表达的lpd基因。

15.权利要求5的重组微生物，其中所述alaD基因选自以下组成的组

(EE)序列如SEQ ID NO:15所示的核酸分子，或

(FF)编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子。

16.权利要求5的重组微生物，其中所述alaD基因有效连接到如SEQ ID NO:115或116所示的启动子。

17.权利要求6的重组微生物，其中所述pflB基因选自以下组成的组

(A)序列如SEQ ID NO:5所示的核酸分子，或

(B)编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子。

18.权利要求7的重组微生物，其中所述adhE基因选自以下组成的组

(F)序列如SEQ ID NO:7所示的核酸分子，或

(G)编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子。

19.权利要求8的重组微生物，其中所述ldhA基因选自以下组成的组

(K)序列如SEQ ID NO:9所示的核酸分子，或

(L)编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子。

20.权利要求9的重组微生物，其中所述pta基因选自以下组成的组

(P)序列如SEQ ID NO:11所示的核酸分子，或

(Q)编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子。

21.权利要求10的重组微生物，其中所述ackA基因选自以下组成的组

(U)序列如SEQ ID NO:120所示的核酸分子，或

(V)编码SEQ ID NO:121的多肽的核酸分子。

22.权利要求11的重组微生物，其中所述frdA基因选自由以下组成的组

(Z)序列如SEQ ID NO:13所示的核酸分子，或者

(AA)编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子。

23.权利要求12的重组微生物，其中所述ygaW基因选自由以下组成的组

(OO)序列如SEQ ID NO:109所示的核酸分子，或者

(PP)编码SEQ ID NO:110的多肽的核酸分子。

24.权利要求13的重组微生物，其中所述zipA基因选自由以下组成的组

(TT)序列如SEQ ID NO:111所示的核酸分子，或者

(UU)编码SEQ ID NO:112的多肽的核酸分子。

25.权利要求14的重组微生物，其中所述lpd基因选自由以下组成的组

(YY)序列如SEQ ID NO:113所示的核酸分子，或者

(ZZ)编码SEQ ID NO:114的多肽的核酸分子。

26.权利要求1的重组微生物，其中所述微生物选自棒杆菌属，芽孢杆菌属，欧文氏菌属，埃希氏菌属，泛菌属，链霉菌属，发酵单胞菌属，红球菌属和酵母属。

27.组合物，其包含根据权利要求1至26中任一项的一种或多种重组微生物。

28.权利要求27的组合物，其进一步包含培养基和碳源。

29.生产丙氨酸的方法，包括在允许生产丙氨酸的条件下，培养根据权利要求1至26中任一项的一种或多种重组微生物。

30.根据权利要求29的方法，其中所述微生物培养在包含0.5％到30％(w/v)的糖的培养基中。

31.根据权利要求29或30的方法，其中丙氨酸的产率是至少80％。

32.根据权利要求29或30的方法，其中L-丙氨酸的手性纯度是至少95％。

33.培养或生长遗传修饰的微生物的方法，其包括用根据权利要求1至26中任一项的一种或多种遗传修饰的微生物接种培养基并在所述培养基中培养或生长所述遗传修饰的微生物。

34.发酵生产丙氨酸的方法，其包括步骤

I)在发酵罐中生长权利要求1至26中任一项的微生物和

II)从在I)中获得的发酵液回收丙氨酸。