DE102004026152A1 - Fermentative Herstellung von Feinchemikalien - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend: DOLLAR A a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst; DOLLAR A b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des (der) Stoffwechselprodukte(s) und DOLLAR A c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe, DOLLAR A wobei man einen das (die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium kultiviert, welches man erhält durch: DOLLAR A a1) Vermahlen der Stärkequelle und DOLLAR A a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von Feinchemikalien durch Vermahlen, Verflüssigen und Verzuckern von Stärkequellen und den Einsatz der dadurch gewonnenen Zuckerlösung als Fermentationsmedium.
  • Fermentative Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien wie z.B. Aminosäuren, Vitaminen und Carotenoiden durch Mikroorganismen sind allgemein bekannt. In Abhängigkeit von den verschiedenen Verfahrensbedingungen werden dabei unterschiedliche Kohlenstoffquellen genutzt. Diese reichen von reiner Saccharose über Rüben- und Zuckerrohrmelasse, sogenannten „high test molasses" (invertierte Zuckerrohrmelasse) bis hin zu Glucose aus Stärkehydrolysaten. Für die biotechnologische Herstellung von L-Lysin werden darüber hinaus Essigsäure und Ethanol als großtechnisch einsetzbare Co-Substrate genannt (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112).
  • Auf Basis der genannten Kohlenstoffquellen sind verschiedene Methoden und Vorgehensweisen zur zuckerbasierten, fermentativen Herstellung von Feinchemikalien etabliert. Am Beispiel des L-Lysins werden diese beispielsweise von Pfefferle et al. (a.a.O.) im Hinblick auf Stammentwicklung, Prozessentwicklung und großtechnische Produktion beschrieben.
  • Eine wichtige Kohlenstoffquelle für die durch Mikroorganismen vermittelte fermentative Herstellung von Feinchemikalien ist Stärke. Diese muss in vorgelagerten Reaktionsschritten zunächst verflüssigt und verzuckert werden, bevor sie als Kohlenstoffquelle in einer Fermentation genutzt werden kann. Hierzu wird die Stärke aus einer natürlichen Stärkequelle wie Kartoffeln, Cassava, Getreide, z.B. Weizen, Mais, Gerste, Roggen oder Reis üblicherweise in vorgereinigter Form gewonnen und anschließend enzymatisch verflüssigt und verzuckert, um dann in der eigentlichen Fermentation zur Produktion der Feinchemikalien eingesetzt zu werden.
  • Neben dem Einsatz derartig vorgereinigter Stärkequellen ist auch die Verwendung nicht-vorbehandelter Stärkequellen zur Herstellung von Kohlenstoffquellen für die fermentative Produktion von Feinchemikalien beschrieben worden. Typischerweise werden die Stärkequellen dabei zunächst durch Mahlen zerkleinert. Das Mahlgut wird dann einer Verflüssigung und Verzuckerung unterworfen. Da dieses Mahlgut naturgemäß neben Stärke noch eine Reihe von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen enthält, die die Fermentation nachteilig beeinflussen, werden diese Bestandteile üblicherweise vor der Fermentation abgetrennt. Die Entfernung kann entweder direkt nach dem Mahlen (WO 02/277252; JP 2001-072701; JP 56-169594; CN 1218111), nach der Verflüssigung (WO 02/277252; CN 1173541) oder im Anschluss an die Verzuckerung (CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotehhnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) erfolgen. In allen Varianten wird jedoch ein weitgehend reines Stärkehydrolysat in der Fermentation eingesetzt.
  • Neuere Techniken befassen sich insbesondere mit verbesserten Methoden, die vor der Fermentation eine Aufreinigung z.B. von verflüssigten und verzuckerten Stärkelösungen ( JP 57159500 ) und von Fermentationsmedien aus erneuerbaren Ressourcen ( EP 1205557 ) ermöglichen sollen.
  • Unaufbereitete Stärkequellen finden hingegen bekanntermaßen in großem Umfang Einsatz bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol. Dabei ist das als „Drymilling" bekannte Verfahren des trockenen Vermahlens, Verflüssigens und Verzuckerns von Stärkequellen technisch in großem Maßstab etabliert. Entsprechende Prozessbeschreibungen finden sich z.B. in „The Alcohol Textbook – A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, und in McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks" ,NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
  • Bei den Dry-milling-Verfahren werden im ersten Schritt ganze Getreidekörner fein vermahlen, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse und Roggen. Im Gegensatz zum sogenannten „Wet-Milling"-Verfahren wird dabei keine zusätzliche Flüssigkeit zugesetzt. Das Zermahlen in feine Bestandteile dient dazu, die in den Körnern enthaltene Stärke in der nachfolgenden Verflüssigung und Verzuckerung der Einwirkung von Wasser und Enzymen zugänglich zu machen.
  • Da bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol das Wertprodukt durch Destillation gewonnen wird, stellt der Einsatz von Stärkequellen aus dem Dry-Milling-Prozess in nicht vorgereinigter Form kein spezielles Problem dar. Bei der Anwendung eines Dry-Milling-Verfahrens zur Produktion von Feinchemikalien ist jedoch der über die Zuckerlösung in die Fermentation eingetragene Feststoffstrom problematisch, da dieser sich sowohl negativ auf die Fermentation auswirken kann als auch die anschließende Aufarbeitung nicht unerheblich erschwert.
  • So ist für viele Fermentationen die Sauerstoffversorgung der eingesetzten Mikroorganismen, insbesondere wenn diese einen hohen Sauerstoffbedarf haben, ein limitierender Faktor. Über den Einfluss hoher Feststoffkonzentrationen auf den Sauerstoffübergang von der Gas- in die Flüssigphase und somit auf die Sauerstofftransferrate ist allgemein wenig bekannt. Es ist andererseits bekannt, dass eine mit zunehmender Feststoffkonzentration ansteigende Viskosität zu einer verminderten Sauerstofftransferrate führt. Werden darüber hinaus oberflächenaktive Substanzen mit den Feststoffen in das Fermentationsmedium eingetragen, so beeinflussen diese die Koalugationsneigung der Gasblasen. Die dadurch resultierende Blasengröße beeinflusst ihrerseits maßgeblich den Sauerstofftransfer (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).
  • Durch den Feststoffeintrag kann in Bezug auf die Viskosität der verwendeten Medien bereits bei der Herstellung der stärkehaltigen Suspension ein kritischer Wert erreicht werden, weil z.B. eine Suspension mit mehr als 30 Gew.-% Maismehl in Wasser nicht mehr homogen mischbar ist (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Dadurch ist bei herkömmlichem Vorgehen die Glucosekonzentration begrenzt. Aus verfahrensökonomischen Gründen ist es in der Regel nachteilig, mit Lösungen geringerer Konzentration zu arbeiten, weil dies zu einer überproportionalen Verdünnung der Fermentationsbrühe führt. Dadurch sinkt die erreichbare Endkonzentration der Zielprodukte, was zusätzliche Kosten bei deren Isolierung verursacht, und die Raum-Zeit-Ausbeute nimmt ab, was bei gleicher Produktionsmenge zu einem größeren Volumenbedarf, d.h. zu höheren Investitionskosten, führt.
  • Bei der Aufarbeitung können sich aus der erhöhten Feststoffkonzentration besondere Schwierigkeiten für den Einsatz spezieller Methoden ergeben. So ist z.B. bei der Aufreinigung der Fermentationsbrühe mittels Ionenaustauschchromatographie die Neigung der eingesetzten Chromatographie-Säule zur Verblockung (d.h. Verstopfung) zu berücksichtigen.
  • Aufgrund dieser Schwierigkeiten eignen sich bisher bekannte Varianten des Dry-Milling-Verfahrens nicht zur Bereitstellung von Stärkequellen für die fermentative Herstellung von Feinchemikalien und sind daher ohne wesentliche wirtschaftliche Bedeutung. Versuche zur Übertragung des Dry-Milling-Konzepts und der mit diesem Verfahren verbundenen prinzipiellen Vorteile auf die großtechnische Herstellung von Feinchemikalien sind bisher lediglich unter Verwendung von Cassava als Stärkequelle beschrieben worden.
  • So beschreibt die JP 2001/275693 zwar ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, bei dem man als Stärkequelle geschälte Cassavaknollen einsetzt, die trocken vermahlen wurden. Zur Durchführung des Verfahrens ist es jedoch erforderlich, eine Teilchengröße des Mahlgutes von ≤ 150 μm einzustellen. Bei der dazu angewendeten Filtration werden mehr als 10 Gew.-% des eingesetzten Mahlguts, einschließlich nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Verflüssigung/Verzuckerung der enthaltenen Stärke und der anschließenden Fermentation abgetrennt. Darüber hinaus stellt sich hier die Problematik des Abtrennens von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen insofern nicht, als da die Fermentationsprodukte, z.B. Lysin, als Futtermittelzusatz bestimmt sind und daher die nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Cassava im Wertprodukt verbleiben können.
  • Ein ähnliches Verfahren wird in der JP 2001/309751 zur Herstellung eines aminosäurehaltigen Futterzusatzes beschrieben. Entsprechend ist hier eine Aufreinigung bzw. Feststoffabtrennung nicht erforderlich.
  • Cassava ist jedoch im Vergleich zu anderen Stärkequellen für das Dry-Milling relativ unproblematisch. Während der Stärkeanteil der Cassavawurzel in trockenem Zustand typischerweise 80 bis 89 Gew.-% beträgt (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Bd. XX, 1978, John Wiley and Sons, Inc., Tabelle 1, Seite 558), liegt der Trockengehalt an Stärke im Vergleich dazu bei Getreide deutlich niedriger, z.B. bei Mais bei etwa 68 Gew.-% und bei Weizen bei etwa 65 Gew.-% (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.). Dementsprechend enthält die nach Verflüssigung und Verzuckerung erhaltene Glucoselösung bei Einsatz von trocken vermahlener Cassava weniger Fremdbestandteile und insbesondere weniger Feststoffe als bei Einsatz einer anderen trocken vermahlenen Stärkequelle.
  • Durch eine erhöhte Menge an Fremdbestandteilen wird die Viskosität der Reaktionsmischung wesentlich erhöht. Stärke aus Cassava ist jedoch relativ leicht zu verarbeiten. Zwar weist sie im Vergleich zu Maisstärke eine höhere Viskosität bei der Quellungstemperatur auf, dafür nimmt die Viskosität jedoch bei ansteigender Temperatur bei Cassava schneller ab als bei Maisstärke (Menezes, T.J.B. de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, Seite 24, rechte Spalte). Darüber hinaus sind die Quellungs- und Gelatinierungstemperaturen von Stärke aus Cassava niedriger als die von Stärke aus Getreide wie Mais, weshalb sie leichter für bakterielle α-Amylase zugänglich ist als Getreidestärke (Menezes, T.J.B. de, a.a.O.).
  • Weitere Vorteile von Cassava gegenüber anderen Stärkequellen sind ihr geringer Cellulosegehalt und ihr niedriger Phytatgehalt. Cellulose und Hemicellulose können insbesondere unter sauren Verzuckerungsbedingungen in Furfurale umgewandelt werden (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.; Menezes, T.J.B. de, s.o.), die ihrerseits auf die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen eine inhibierende Wirkung haben können. Phytat inhibiert ebenfalls die für die Fermentation eingesetzten Mikroorganismen.
  • Während es somit technisch möglich ist, Cassava als Stärkequelle in einem dem Drymilling entsprechenden Verfahren zu verarbeiten, so ist ein solches Verfahren auf Basis von Cassava dennoch komplex, nicht optimiert und daher nicht weit verbreitet.
    •
  • Es war somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Verfahren zur fermentativen Herstellung von Feinchemikalien bereitzustellen, das die Verwendung einer Vielzahl stärkehaltiger, weltweit lokal verfügbarer Pflanzen, z.B. Getreide oder Kartoffeln, als Stärkequelle erlaubt. Das Verfahren sollte sich durch eine leichte Handhabbarkeit der verwendeten Medien auszeichnen und insbesondere aufwändige Vor- oder Aufreinigungsschritte, wie etwa die Abtrennung fester nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Fermentation vermeiden. Außerdem sollte es eine leichte Aufarbeitung des Fermentationsgemisches ermöglichen. Im Rahmen der von der Anmelderin durchgeführten Arbeiten wurde überraschend gefunden, dass ein solches Verfahren trotz des inhärent erhöhten Feststoffeintrags effizient durchführbar ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend:
    • a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst;
    • b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und
    • c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe,
    dadurch gekennzeichnet, dass man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium kultiviert, welches man erhält durch:
    • a1) Vermahlen der Stärkequelle; und
    • a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt.
  • Als Stärkequelle kommen vor allem trockene Kornfrüchte oder Samen in Betracht, die in getrocknetem Zustand mindestens 40 Gew.-% und bevorzugt mindestens 50 Gew.-% Stärkeanteil aufweisen. Diese finden sich in vielen der heutzutage in großem Maßstab kultivierten Getreidepflanzen wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, Roggen, Reis und verschiedenen Hirsesorten, z.B. Sorghum und Milo. Bevorzugt ist die Stärkequelle unter Getreidekörnern, besonders bevorzugt unter Mais-, Roggen- und Weizenkörnern ausgewählt. Grundsätzlich lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit anderen Stärkequellen durchführen, wie beispielsweise Kartoffeln, Tapioka oder einer Mischung verschiedener stärkehaltiger Früchte oder Samen.
  • Bei den in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltenen Zuckern handelt es sich vorzugsweise um Monosaccharide wie Hexosen und Pentosen, z.B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Sorbose, Xylose, Arabinose und Ribose, insbesondere um Glucose. Der Anteil an von Glucose verschiedenen Monosacchariden kann abhängig von der verwendeten Stärkequelle und den darin enthaltenen nicht-stärkehaltigen Be standteilen variieren und durch die Verfahrensführung, beispielsweise durch Aufschluss von Cellulosebestandteilen durch Zusatz von Cellulasen, beeinflusst werden. Vorteilhafterweise umfassen die Monosaccharide des zuckerhaltigen Flüssigmediums einen Anteil an Glucose von mindestens 60 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 80 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge. Üblicherweise liegt der Glucoseanteil im Bereich von 75 bis 99 Gew.-%, insbesondere von 80 bis 97 Gew.-% und speziell von 85 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge.
  • Zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums wird im Schritt a1) die jeweilige Stärkequelle mit oder ohne Zusatz von Flüssigkeit, z.B. Wasser, vermahlen, bevorzugt ohne Zusatz von Flüssigkeit. Es kann auch eine Trockenvermahlung mit einer anschließenden Nassvermahlung kombiniert werden. Zur trockenen Vermahlung werden typischerweise Hammermühlen, Rotormühlen oder Walzen-Schrotmühlen eingesetzt; zur Nassvermahlung eignen sich Rührmixer, Rührwerkskugelmühlen, Zirkulationsmühlen, Scheibenmühlen, Ringkammermühlen, Schwingmühlen oder Planetenmühlen. Grundsätzlich kommen auch andere Mühlen in Betracht. Die zur Nassvermahlung erforderliche Flüssigkeitsmenge kann der Fachmann in Routineexperimenten ermitteln. Üblicherweise wird sie so eingestellt, dass der Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 20 Gew.-% liegt.
  • Durch das Mahlen wird eine für die sich anschließenden Verfahrensschritte geeignete Korngröße eingestellt. Hierbei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das beim Vermahlen, insbesondere bei trockener Vermahlung, im Schritt a1) erhaltene Mahlgut Mehlpartikel, d.h. teilchenförmige Bestandteile, mit einer Korngröße im Bereich von 100 bis 630 μm in einem Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% aufweist. Vorzugsweise enthält das erhaltene Mahlgut 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm. In der Regel weisen mindestens 95 Gew.-% der ermahlenen Mehlpartikel eine Korngröße von weniger als 2 mm auf. Die Messung der Korngröße erfolgt dabei mittels Siebanalyse unter Verwendung einer Vibrations-Analysenmaschine. Eine geringe Korngröße ist grundsätzlich zur Erzielung einer hohen Produktausbeute vorteilhaft. Eine zu geringe Teilchengröße kann jedoch zu Problemen, insbesondere durch Klumpenbildung/Agglomeration, beim Anmaischen des Mahlguts während der Verflüssigung bzw. bei der Aufarbeitung, z.B. bei der Trocknung der Feststoffe nach dem Fermentationsschritt, führen.
  • Üblicherweise werden Mehle durch den Ausmahlungsgrad bzw. durch die Mehltype charakterisiert, wobei diese so miteinander korrelieren, dass mit zunehmendem Ausmahlungsgrad auch die Kennzahl der Mehltype zunimmt. Der Ausmahlungsgrad entspricht der Gewichtsmenge des gewonnenen Mehls bezogen auf 100 Gewichtsteile des eingesetzten Mahlguts. Während beim Mahlen zunächst reines, feinstes Mehl, z.B. aus dem Inneren des Getreidekorns, anfällt, nimmt beim weiteren Vermahlen, also mit steigendem Ausmahlungsgrad, der Anteil an Rohfaser- und Schalengehalt im Mehl zu, der Stärkeanteil wird dabei geringer. Der Ausmahlungsgrad spiegelt sich daher auch in der sogenannten Mehltype wider, die als Zahlenangabe zur Klassifizierung von Mehlen, insbesondere von Getreidemehlen, verwendet wird und die auf dem Aschegehalt des Mehles beruht (sogenannte Ascheskala). Die Mehltype bzw. die Typenzahl gibt hierbei die Menge Asche (Mineralstoffe) in mg an, die beim Verbrennen von 100 g Mehltrockensubstanz zurück bleibt. Für Getreidemehle bedeutet eine höhere Typzahl einen höheren Ausmahlungsgrad, da der Kern des Getreidekorns in etwa 0,4 Gew.-%, die Schale hingegen etwa 5 Gew.-% Asche enthält. Bei niederem Ausmahlungsgrad bestehen die Getreidemehle also überwiegend aus dem zerkleinerten Mehlkörper, d.h. dem Stärkebestandteil der Getreidekörner; bei höherem Ausmahlungsgrad enthalten die Getreidemehle auch die zerkleinerte, eiweißhaltige Aleuronschicht der Getreidekörner, bei Schrot auch die Bestandteile des eiweiß- und fetthaltigen Keimlings sowie der rohfaser- und aschehaltigen Samenschalen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind grundsätzlich Mehle mit einem hohen Ausmahlungsgrad bzw. einer hohen Typzahl bevorzugt. Wird Getreide als Stärkequelle eingesetzt, so werden vorzugsweise die ganzen ungeschälten Körner vermahlen und weiter verarbeitet.
  • Gegebenenfalls wird man die Stärkequelle vor dem Vermahlen auf eine für das Vermahlen geeignete Größe zerkleinern, beispielsweise bei Einsatz größerer Früchte wie Kartoffeln oder Cassava. Im Falle von Getreide kann dieser Zerkleinerungsschritt entfallen, und das ganze Korn wird eingesetzt und vermahlen.
  • Zum Verflüssigen des Stärkeanteils im Mahlgut gibt man im Schritt a2) wenigstens eine Teilmenge des Mahlgutes, vorzugsweise wenigstens 40 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 55 Gew.-% im Verlauf der Verflüssigung, jedoch vor der Verzuckerung in den Reaktor. Häufig wird die zugegebene Menge 90 Gew.-%, insbesondere 85 Gew.-% und besonders bevorzugt 80 Gew.-% nicht überschreiten. Vorzugsweise wird die im Verlauf zugegebene Teilmenge an Mahlgut dem Reaktor unter Bedingungen zugeführt, wie sie bei der Verflüssigung vorliegen. Die Zugabe kann diskontinuierlich, d.h. portionsweise in mehreren Teilportionen, die vorzugsweise jeweils nicht mehr als 20 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-%, z.B. 1 bis 20 Gew.-% insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, der Gesamtmenge des zu verflüssigenden Mahlgutes ausmachen, oder kontinuierlich erfolgen. Erfindungswesentlich ist, dass sich zu Beginn der Verflüssigung nur ein Teil des Mahlgutes, vorzugsweise nicht mehr als 60 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 50 Gew.-% und besonders bevorzugt nicht mehr als 45 Gew.-% des Mahlgutes, im Reaktor befindet und die Restmenge des Mahlgutes während des Verflüssigens zugegeben wird. Die Verflüssigung kann auch kontinuierlich, z.B. in einer mehrstufigen Reaktionskaskade, ausgeführt werden.
  • Erfindungsgemäß erfolgt das Verflüssigen in Schritt a2) in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms, das vorzugsweise unter α-Amylasen ausgewählt ist. Andere unter den Reaktionsbedingungen aktive und stabile Stärke verflüssigende Enzyme sind ebenfalls einsetzbar.
  • Die α-Amylase (bzw. das verwendete Stärke verflüssigende Enzym) kann im Reaktionsgefäß vorgelegt oder im Verlauf des Schrittes a2) zugegeben werden. Vorzugsweise gibt man eine Teilmenge der in Schritt a2) benötigten α-Amylase zu Beginn von Schritt a2) zu oder legt diese Teilmenge im Reaktor vor. Die Gesamtmenge an α-Amylase liegt üblicherweise im Bereich von 0,002 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1,5 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
  • Die Verflüssigung kann oberhalb oder unterhalb der Gelatinierungstemperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Verflüssigung in Schritt a2) zumindest zeitweise oberhalb der Gelierungstemperatur der eingesetzten Stärke (sogenannter Cooking Prozess). In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und 165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125 °C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 115 °C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt.
  • Für eine optimale Wirkung der α-Amylase wird Schritt a2) vorzugsweise zumindest zeitweise bei einem pH-Wert im schwach sauren Bereich, vorzugsweise zwischen 4,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,0 bis 6,5 durchgeführt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn von Schritt a2) die pH-Einstellung vorgenommen wird; dieser pH-Wert wird während der Verflüssigung vorzugsweise kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt vorzugsweise mit verdünnten Mineralsäuren wie H2SO4 oder H3PO4 bzw. mit verdünnten Alkalilaugen wie NaOH oder KOH.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform führt man Schritt a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens so durch, dass zunächst eine Teilmenge von höchstens 60 Gew.-%, bevorzugt höchstens 50 Gew.-% und besonders bevorzugt höchstens 45 Gew.-%, z.B. 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 45 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Mahlguts, in einer wässrigen Flüssigkeit, z.B. Frischwasser, rückgeführtes Prozesswasser, z.B. aus der Fermentation oder der Aufarbeitung, oder in einer Mischung dieser Flüssigkeiten suspendiert wird und anschließend die Verflüssigung durchgeführt wird.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die zur Erzeugung der Suspension verwendete Flüssigkeit auf eine leicht erhöhte Temperatur, z.B. im Bereich von 40 bis 60°C, vorzutemperieren. Es ist jedoch bevorzugt, die Flüssigkeiten bei Raumtemperatur einzusetzen.
  • Zu dieser Suspension wird dann das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, gegeben. Wird eine α-Amylase verwendet, so gibt man vorteilhafterweise nur eine Teilmenge der α-Amylase zu, z.B. 10 bis 70 Gew.-% und insbesondere 20 bis 65 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt in Schritt a2) eingesetzte α-Amylase. Die zu diesem Zeitpunkt zugegebene Menge an α-Amylase richtet sich nach der Aktivität der jeweiligen α-Amylase in Bezug auf die verwendete Stärkequelle unter den Reaktionsbedingungen und liegt üblicherweise im Bereich von 0,0004 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 bis 1,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle. Alternativ kann die Teilmenge der α-Amylase vor dem Ansetzen der Suspension mit der verwendeten Flüssigkeit vermengt werden.
  • Hierbei wird vorzugsweise die Teilmenge an α-Amylase vor dem Beginn des Aufheizens auf die zur Verflüssigung angewendete Temperatur, insbesondere bei Raumtemperatur oder nur leicht erhöhter Temperatur, z.B. im Bereich von 20 bis 30 °C, zu der Suspension gegeben.
  • Vorteilhafterweise werden die Mengen an α-Amylase und Mahlgut so ausgewählt sein, dass die Viskosität während des Gelierungsvorgangs ausreichend reduziert ist, um eine effektive Durchmischung der Suspension, z.B. mittels Rühren, zu ermöglichen. Bevorzugt beträgt die Viskosität der Reaktionsmischung während des Gelierens maximal 20 Pas, besonders bevorzugt maximal 10 Pas und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Pas. Die Messung der Viskosität erfolgt in der Regel mit einem Haake Viskosimeter Type Roto Visko RV20 mit Messsystem M5 und Messeinrichtung MVDIN bei einer Temperatur von 50 °C und einer Schergeschwindigkeit von 200 s–1.
  • Die so angesetzte Suspension wird dann vorzugsweise auf eine Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der verwendeten Stärke erhitzt. In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und 165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125 °C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 115 °C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt. Unter Kontrolle der Viskosität werden nach und nach weitere Teilmengen der Stärkequelle, z.B. jeweils 2 bis 20 Gew.-% und insbesondere 5 bis 10 Gew.-% bezogen auf die gesamte eingesetzte Stärkemenge, zu der stärkehaltigen Suspension zugegeben. Es ist bevorzugt, die im Verlauf der Verflüssigung zuzugebende Teilmenge des Mahlgutes in mindestens 2, bevorzugt mindestens 4 und besonders bevorzugt mindestens 6 Teilportionen der Reaktionsmischung zuzugeben. Alternativ kann die Zugabe der beim Ansetzen der Suspension nicht eingesetzten Teilmenge des Mahlgutes kontinuierlich während der Verflüssigung erfolgen. Die Temperatur sollte bei der Zugabe vorteilhafterweise oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke gehalten werden.
  • Nach vollständiger Zugabe des Mehls wird das Reaktionsgemisch üblicherweise noch eine Zeit, z.B. 30 bis 60 Minuten oder länger, sofern erforderlich, bei der oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke eingestellten Temperatur gehalten, d.h. verkocht. Die Reaktionsmischung wird dann in der Regel auf eine etwas geringere Temperatur ober halb der Gelierungstemperatur, z.B. 75 bis 90°C, abgekühlt, bevor eine weitere Teilmenge an α-Amylase, vorzugsweise die Hauptmenge, zugesetzt wird. Je nach Aktivität der verwendeten α-Amylase unter den Reaktionsbedingungen beträgt die Menge an zu diesem Zeitpunkt zugegebener α-Amylase vorzugsweise 0,002 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,01 bis 1,0 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,4 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
  • Bei diesen Temperaturen wird die granuläre Struktur der Stärke zerstört (Gelieren), wodurch deren enzymatischer Abbau ermöglicht wird. Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten oder gegebenenfalls weiter erhitzt, bis der Stärkenachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls können hierbei noch eine oder mehrere weitere Teilmengen α-Amylase, z.B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.
  • Nach abgeschlossener Verflüssigung der Stärke wird eine Verzuckerung der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, d. h. deren Abbau zu Glucose, kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt, bevorzugt kontinuierlich. Die Verzuckerung erfolgt entweder in einem speziellen Verzuckerungstank oder direkt im Fermenter.
  • Im ersteren Fall wird die verflüssigte Stärkelösung üblicherweise auf das Temperaturoptimum des verzuckernden Enzyms oder leicht darunter, z.B. auf 50 bis 70 °C, bevorzugt 60 bis 65 °C abgekühlt bzw. temperiert und anschließend mit Glucoamylase versetzt.
  • Sofern man die Verzuckerung im Fermenter durchführt, wird man die verflüssigte Stärkelösung in der Regel auf Fermentationstemperatur, d. h. 32 bis 37°C, abkühlen, bevor man sie dem Fermenter zuführt. Die Glucoamylase (bzw. das mindestens eine verzuckernde Enzym) zur Verzuckerung wird in diesem Fall der Fermentationsbrühe direkt zugesetzt. Die Verzuckerung der verflüssigten Stärke gemäß Schritt a2) erfolgt hierbei parallel zur Verstoffwechselung des Zuckers durch die Mikroorganismen gemäß Schritt b).
  • Vorteilhafterweise wird vor Zugabe der Glucoamylase der pH-Wert des Flüssigmediums auf einen Wert im optimalen Wirkungsbereich der eingesetzten Glucoamylase, vorzugsweise im Bereich zwischen 3,5 und 6,0; besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,5 und ganz besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,0 eingestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verzuckerung in einem speziellen Verzuckerungstank. Dazu wird die verflüssigte Stärkelösung auf eine für das Enzym optimale Temperatur oder leicht darunter temperiert und der pH-Wert in der oben beschriebenen Weise eingestellt.
  • Die Glucoamylase wird dem dextrinhaltigen Flüssigmedium üblicherweise in einer Menge von 0,001 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,005 bis 3,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,01 bis 1,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zugesetzt. Nach Zugabe der Glucoamylase wird die dextrinhaltige Suspension vorzugsweise für einen Zeitraum von z.B. 2 bis 72 Stunden oder länger, sofern erforderlich, insbesondere von 5 bis 48 Stunden bei der eingestellten Temperatur gehalten, wobei die Dextrine zu Monosacchariden verzuckert werden. Der Fortschritt der Verzuckerung kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, z.B. HPLC, Enzymtests oder Glucose-Teststäbchen, verfolgt werden. Die Verzuckerung ist abgeschlossen, wenn die Konzentration der Monosaccharide nicht mehr wesentlich ansteigt oder wieder fällt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die diskontinuierliche oder kontinuierliche, bevorzugt die diskontinuierliche und insbesondere portionsweise Zugabe des Mahlguts in Gegenwart der mindestens einen α-Amylase sowie der mindestens einen Glucoamylase im Schritt a2) derart, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas, bevorzugt maximal 10 Pas und besonders bevorzugt maximal 5 Pas beträgt. Zur Unterstützung der Viskositätskontrolle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn mindestens 25 Gew.-%, bevorzugt mindestens 35 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 50 Gew.-% der Gesamtmenge des zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelatinierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden. Die Kontrolle der Viskosität kann des Weiteren dadurch beeinflusst werden, dass das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, oder/und das mindestens eine verzuckernde Enzym, vorzugsweise eine Glucoamylase, selbst portionsweise zugegeben werden.
  • Durch Anwendung der Schritte a1) und a2) ist es möglich, die zuckerhaltige Flüssigkeit mit einem Monosaccharidgehalt von vorzugsweise mehr als 30 Gew.-% und besonders bevorzugt mehr als 40 Gew.-% herzustellen.
  • Zur Verflüssigung des Stärkeanteils im Mahlgut können grundsätzlich alle α-Amylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.1) eingesetzt werden, insbesondere α-Amylasen, die aus Bacillus lichenformis oder Bacillus staerothermophilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verflüssigen von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verflüssigen geeigneten α-Amylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozymes unter der Bezeichnung Termamyl 120 L, Typ L; oder von Genencor unter der Bezeichnung Spezyme. Es kann auch eine Kombination verschiedener α-Amylasen zur Verflüssigung eingesetzt werden.
  • Zur Verzuckerung der Dextrine (d.h. Oligosaccharide) in der verflüssigten Stärkelösung können grundsätzlich alle Glucoamylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.3) eingesetzt werden, insbesondere Glucoamylasen, die aus Aspergilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verzuckern von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verzuckern geeigneten Glucoamylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozymes unter der Bezeichnung Dextrozyme GA; oder von Genencor unter der Bezeichnung Optidex. Es kann auch eine Kombination verschiedener Glucoamylasen verwendet werden.
  • Zur Stabilisierung der eingesetzten Enzyme kann gegebenenfalls die Konzentration an Ca2+-Ionen, z.B. mit CaCl2, auf einen enzymspezifischen optimalen Wert eingestellt werden. Geeignete Konzentrationswerte können vom Fachmann in Routineexperimenten bestimmt werden. Wird z.B. Termamyl als α-Amylase eingesetzt, so ist es vorteilhaft, eine Ca2+-Konzentration von z.B. 50 bis 100 ppm, bevorzugt 60 bis 80 ppm und besonders bevorzugt etwa 70 ppm im Flüssigmedium einzustellen.
  • Da zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß a) die ganze Stärkequelle, z.B. im Falle von Getreide das ganze Korn, vermahlen wird, umfasst diese auch die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Dies bedingt oftmals den Eintrag eines nicht zu vernachlässigenden Anteils an Phytat aus der Kornfrucht. Um die daraus resultierende inhibierende Wirkung zu vermeiden, wird vorteilhafterweise in Schritt a2) dem Flüssigmedium mindestens eine Phytase zugesetzt, bevor das zuckerhaltige Flüssigmedium dem Fermentationsschritt b) zugeführt wird.
  • Die Zugabe der Phytase kann vor, während oder nach der Verflüssigung oder der Verzuckerung erfolgen, sofern sie die jeweils erforderliche Hitzestabilität aufweist.
  • Es können beliebige Phytasen eingesetzt werden, soweit deren Aktivität unter den Reaktionsbedingungen jeweils höchstens unwesentlich eingeschränkt ist. Bevorzugt sind Phytasen mit einer Temperaturstabilität (T50) > 50 °C und besonders bevorzugt > 60 °C.
  • Die Menge an Phytase beträgt üblicherweise 1 bis 10000 Units/kg Stärkequelle und insbesondere 10 bis 1000 Units/kg Stärkequelle.
  • Zur Erhöhung der Gesamtzuckerausbeute bzw. zur Gewinnung freier Aminosäuren können dem Reaktionsgemisch während der Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums außerdem weitere Enzyme, zum Beispiel Pullulanasen, Cellulasen, Glucanasen, Xylanasen, Glucosidasen oder Proteasen, zugesetzt werden. Der Zusatz dieser Enzyme kann die Viskosität positiv beeinflussen, d.h. herabsetzen (z.B. durch Spaltung längerkettiger Glucane und/oder von (Arabino-) Xylanen), die Freisetzung metabolisierbarer Glucoside und die Freisetzung von (Rest-) Stärke bewirken. Der Einsatz von Proteasen hat analoge positive Effekte, wobei zusätzlich Aminosäuren als Wachstumsfaktoren für die Fermentation freigesetzt werden können.
  • Das zuckerhaltige Flüssigmedium kann vorteilhaft zur fermentativen Herstellung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom verwendet werden. Dazu wird das in Schritt a) hergestellte zuckerhaltige Flüssigmedium einer Fermentation gemäß b) zugeführt. In der Fermentation werden Feinchemikalien, d. h. Verbindungen mit mindestens 3 C-Atomen und/oder mindestens einem N-Atom und mindestens 2 C-Atomen, von den Mikroorganismen produziert. Die Durchführung des Fermentationsverfahrens kann in der Regel in der dem Fachmann bekannten üblichen Art und Weise erfolgen.
  • Der Begriff Feinchemikalie umfasst im Folgenden insbesondere organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z. B. 1, 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tragenende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen, z.B. Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, 3-Hydroxypropionsäure, Glutarsäure, Lävulinsäure, Milchsäure, Propionsäure, Gluconsäure, Aconitsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäure; proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren, z.B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparaginsäure und Threonin; Purin- und Pyrimidinbasen; Nukleoside und Nukleotide, z.B. Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP); Lipide; gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z.B. γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure; Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z.B. Propandiol und Butandiol; höherwertige Alkohole mit 3 oder mehr, z.B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z.B. Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol und Arabinitol; längerkettige Alkohole mit wenigstens 4 C-Atomen, z.B. mit 4 bis 22 C-Atomen, z.B. Butanol; Kohlenhydrate, z.B. Hyaluronsäure und Trehalose; aromatische Verbindungen, z.B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo; Vitamine und Provitamine, z.B. Ascorbinsäure, Vitamin B6, Vitamin B12 und Riboflavin, Cofaktoren und sogenannte Nutrazeutika; Proteine, z.B. Enzyme; Carotenoide, z.B. Lycopin, β-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin; Ketone mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z.B. Aceton und Acetoin; Lactone, z.B. γ-Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z.B. Polyhydroxyacetat, Polyester, Polysaccharide, Polyisoprenoide, Polyamide, Polyhydroxyalkanoate, z.B. Poly-3-hydroxybuttersäure und Copolyester mit anderen organischen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (Hg.), Biopolymers, 1. Aufl., 2003, Wiley-VCH, Weinheim und der dort zitierten Literatur beschrieben sind; sowie Vorstufen und Derivate der vorgenannten Verbindungen. Weitere als Feinchemikalien in Frage kommende Verbindungen sind von Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086 beschrieben.
  • Der Begriff "Cofaktor" umfasst nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Beispiele solcher Moleküle sind NAD und Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP); die Vorstufe dieser Cofaktoren ist Niacin.
  • Der Begriff "Nutrazeutikum" umfasst Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und bestimmte Lipide, z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt zur Herstellung nicht-flüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte eingesetzt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter nicht-flüchtigen Stoffwechselprodukten Verbindungen verstanden, die sich im Allgemeinen auf destillativem Weg nicht unzersetzt aus der Fermentationsbrühe entfernen lassen. Diese Verbindungen weisen in der Regel einen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser, häufig oberhalb 150 °C und insbesondere oberhalb 200 °C bei Normaldruck auf.
  • Die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen richten sich in an sich bekannter Weise nach den jeweiligen Feinchemikalien, wie unten im einzelnen erläutert. Sie können natürlichen Ursprungs oder genetisch modifiziert sein. Beispiele für geeignete Mikroorganismen und Fermentationsverfahren sind die in der folgenden Tabelle A angegeben: Tabelle A:
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    Figure 00180001
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  • Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen die Herstellung von Aminosäuren, Vitaminen, Vorläufern und Folgeprodukten davon, wie insbesondere Lysin, Methionin, Threonin, Pantothensäure und Riboflavin, sowie die Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten, von den vorgenannten Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, speziell Bernsteinsäure, Milchsäure und Propionsäure, den vorgenanten Diolen, speziell Propandiol, von den vorgenannten längerkettigen Alkanolen, speziell Butanol, von den vorgenannten Ketonen, speziell Aceton und von den vorgenannten Kohlehydraten, speziell Trehalose.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen daher ausgewählt unter natürlichen oder rekombinanten, Aminosäuren, Vitamine, Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon oder Polyhydroxyalkanoate überproduzierenden Mikroorganismen, insbesondere unter Lysin, Methionin, Pantothensäure, Riboflavin, Polyhydroxyalkanoate Bernsteinsäure, Milchsäure, Threonin, Propionsäure, Propandiol, Butanol, Aceton und Trehalose überproduzierenden Mikroorganismen.
  • Insbesondere sind die Mikroorganismen ausgewählt unter den Gattungen Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmanni, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii Clostridium propionicum und Clostridium acetobutlicum.
  • In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Lysin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehenswei sen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in Pfefferle et al., a.a.O. und US 3,708,395 . Prinzipiell kommen sowohl eine kontinuierliche als auch eine diskontinuierliche (Batch oder Fed-Batch) Betriebsweise in Betracht, bevorzugt ist die Fed-Batch Betriebsweise.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 03/087386 und WO 03/100072.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Polyhydroxyalkanoate wie Poly-3-hydroxybutyrat und Copolyester mit anderen organischen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (a.a.O.) beschrieben sind, z.B. auch längerkettige Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3-Hydroxytetradecansäure, sowie Mischungen davon. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 01/011052, DE 19840709 , WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
  • Die Isolierung von Feinchemikalien aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) kann in einem oder mehreren Schritten erfolgen. Ein wesentlicher Schritt dabei ist die Abtrennung der festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe. Diese kann entweder vor oder nach der Isolierung des Wertprodukts durchgeführt werden. Sowohl zur Isolierung von Wertstoffen als auch zur Abtrennung von Feststoffen, d.h. Fest-Flüssig-Phasenseparation, sind im Fachgebiet übliche Methoden bekannt, die auch Schritte zur Grob- und Feinreinigung der Wertstoffe sowie zur Konfektionierung umfassen (z.B. beschrieben in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH).
  • Zur Isolierung des Wertprodukts kann man vorteilhafterweise so vorgehen, dass man zunächst die festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe entfernt, z.B. mittels Zentrifugation oder Filtration, und anschließend das Wertprodukt aus der flüssigen Phase isoliert, z.B. durch Kristallisation, Fällung, Adsorption oder Destillation. Alternativ kann das Wertprodukt auch direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert werden, z.B. durch Einsatz chromatographischer Verfahren oder von Extraktions-Verfahren. Als chromatographisches Verfahren ist insbesondere die Ionenaustauschchromatographie zu nennen, bei der das Wertprodukt selektiv auf der Chromatographiesäule isoliert werden kann. In diesem Fall erfolgt die Abtrennung der Feststoffe aus der verbleibenden Fermentationsbrühe vorteilhafterweise z.B. durch Dekantieren, Eindampfen oder/und Trocknung.
  • Übliche Filtrations-Verfahren sind z.B. die Kuchen- und Tiefenfiltration (z.B. beschrieben in A. Rushton, A. S. Ward, R. G. Holdich: Solid – Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp. 177ff., K. J. Ives, in A. Rushton (Hg.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series E Nr. 88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp. 90ff.) und Cross-flow-Filtrationen, insbesondere die Mikrofiltration zur Abtrennung von Feststoffen > 0,1 μm (z.B. beschrieben in J. Altmann, S. Ripperger, J. Membrane Sci. 124 (1997) 119 – 128.).
  • Übliche Zentrifugations-Verfahren sind z.B. in G. Hultsch, H. Wilkesmann, "Filtering Centrifuges," in D.B. Purchas, Solid – Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp. 493 – 559; und H. Trawinski, Die äquivalente Klärfläche von Zentrifugen, Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612 beschrieben. Verschiedene Bauformen wie Röhren- und Korbzentrifugen sowie im speziellen Schub-, Stülpfilterzentrifugen und Tellerseparatoren können eingesetzt werden.
  • Übliche Extraktions-Verfahren umfassen batch-weise bzw. stufenweise und differentielle kontinuierliche Verfahren im Gleich- oder Gegenstrom. Dabei kann mit zwei oder einer beweglichen Phasen gearbeitet werden. Die Löslichkeit der Wertstoffe und der abzutrennenden Nebenkomponenten in beiden Phasen kann unter Anderem durch die Wahl des Lösungsmittels, durch Variation der Gegenionen und durch Variation des pH-Wertes beeinflusst werden (Treybal, R.E., Mass Transfer Operations, 3. Aufl., New York, Mc Graw-Hill, 1979; Kula, M., Kroner, K.H., Hustedt, H. und Schutee, H., Technical aspects of extractive enzyme purification, Ann. N.Y. Acad. Sci., 341 (1981); Robinson, R.G., and Cha, D.Y., Controlled pH extraction in the separation of weak acids and bases, Biotech. Progress, 1(1), 18 (1985)).
  • Übliche Adsorptions-Verfahren sind z.B. in D. M. Ruthven: Principles of Adsorption and Adsorption Processes, J. Wiley & Sons, New York 1984.; G. Wedler: Adsorption, Verlag Chemie, Weinheim 1970.) beschrieben. Festbett-, Moving-bed- und Fluidizedbed-Adsorber können zur Anwendung kommen. Die Adsorption kann batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden (K. Hauffe, S. R. Morrison: De Gruyter Studienbuch "Adsorption," De Gruyter, Berlin 1974.; W. Kast: Adsorptionstechnik, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988.). Neben vielen anderen Adsorbentien können aktivierte Kohlen, Ionenaustauscherharze, natürliche oder synthetische Zeolithe und aktivierte Aluminiumoxide eingesetzt werden. Daneben können auch Verfahren zur Affinitätsadsorption zur Anwendung kommen (z.B. beschrieben in Arnold, F.H., Blanch, H.W., and Wilke, C.R., Analysis of Affinity separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985)).
  • Insbesondere zur Reinigung der Feinchemikalien können z.B. Chromatographie, Fällung, Ultra-, Mikro- und Nanofiltration, Reversosmose, Elektrophorese, Elektrodialyse und isoelektrische Fokussierung eingesetzt werden.
  • Chromatographische Verfahren können batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Zur kontinuierlichen Chromatographie zählen z.B. ein Continuous Rotating Annular Chromatograph (CRAC) (z.B. beschrieben in A. J. P. Martin, Discuss. Farraday Soc. 7 (1949)), ein True Moving Bed Chromatograph (TMBC) (z.B. beschrieben in K. Takeuchi, T. Miyauchi, Y. Uraguchi, J. Chem. Eng. Japan 11 (1978) 216-220.) und ein Simulated Moving Bed Chromatograph (SMB) (z.B. beschrieben in D. B. Broughton, Universal Oil Products Co., US 2,985,589, 1961 ). Als Festphase werden z.B. aktivierte Aluminiumoxide, Silikagele, glykolimprägnierte Diatomerenerden, Dextrane, Polymere sulfonierter Stryene, Polyacrylamide sowie polymergebundene Proteine eingesetzt (Arnold, F.H., Blanch, H.W., und Wilke, C.R., Analysis of Affinity separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985); Gibbs, S.J., und Lightfoot, E.N., Scaling up gradient elution chromatography, IEC Fund., 25, 490 (1986); King, C.J., Separation Processes, 2. Aufl., New York, McGraw-Hill (1979); Yau, W. W., Kirlland, J.J., und Bly, D.D., Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography, Wiley, New York (1979)).
  • Bei einer Fällung können entweder die Wertstoffe oder die Nebenkomponenten ausgefällt werden (J. W. Mullin: Crystallization, 3rd ed., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993). Die Fällung kann z.B. eingeleitet werden durch Zugabe eines weiteren Lösungsmittels, Zugabe von Salzen und die Variation der Temperatur. Der entstehende Niederschlag kann durch die oben beschriebenen üblichen Verfahren zur Abtrennung von Feststoffen von der Brühe separiert werden.
  • Bei der Mikro-, Ultra-, Nanofiltration und der Reversosmose können z.B. mikroporöse (A. S. Michaels: "Ultrafiltration," in E. S. Perry (ed.): Progress in Separation and Purification, vol. 1, Interscience Publ., New York 1968.), homogene (J. Crank, G. S. Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968; S. A. Stern: "The Separation of Gases by Selective Permeation," in P. Meares (ed.): Membrane Separation Processes, Elsevier, Amsterdam 1976.), asymetrische (R. E. Kesting: Synthetic Polymeric Membranes, A Structural Perspective, Wiley-Interscience, New York 1985.) und elektrisch geladene (F. Helfferich: Ion-Exchange, McGraw-Hill, London 1962.) Membranen eingesetzt werden, die nach verschiedenen Verfahren erzeugt werden (R. Zsigmondy, US 1 421 341, 1922 ; D. B. Pall, US 4 340 479, 1982 ; S. Loeb, S. Sourirajan, US 3 133 132, 1964 .). Typische Werkstoffe sind Celluloseester, Nylon, Polyvinylchlorid, Acrylnitril, Polypropylen, Polycarbonat und Keramik. Der Einsatz dieser Membranen erfolgt als Plattenmodul (R. F. Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems, Elsevier, Amsterdam 1977), Spiralmodul ( US 3 417 870, 1968 (D. T. Bray)), Rohrbündel bzw. Hohlfasermodul (H. Strathmann: "Synthetic Membranes and their Preparation," in M. C. Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp. 1 – 60). Daneben ist die Verwendung flüssiger Membranen möglich (N. N. Li: "Permeation Through Liquid Surfactant Membranes," AIChE J. 17 (1971) 459; S. G. Kimura, S. L. Matson, W. J. Ward III: "Industrial Applications of Facilitated Transport," in N. N. Li (ed.): Recent Developments in Separation Science, Bd. V, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1979, pp. 11-25). Der gewünschte Wertstoff kann sowohl feedseitig angereichert und über den Retentatstrom abgeführt als auch feedseitig abgereichert und über den Filtrat-/Permeatstrom abgeführt werden.
  • Elektrophoretische Verfahren sind z.B. in Rudge, S.R., Ladisch, M.R., Process considerations for scale-up of liquid chromatography and electrophoresis, in Separation Recovery and Purification in Biotechnology, J. Asenjo und J. Hong, Hg., ACS Symposium Series, 314, 122 (1986) beschrieben. Zahlreiche Varianten wie z.B. isoelektrische Fokussierung in granulierten Gelschichten. kontinuierliche isoelektrische Fokussierung mit Recycling, die „Rotofor-„Zelle, die Freifluss-Fokussierung mit Recycling und die multi-kompartimentierte Elektrolyse mit isoelektrischen Membranen finden Anwendung. Als Matrixmaterialien kommen u.a. Celluloseacetat, Agarosegele und Polyacrylamidgele zum Einsatz.
  • Übliche Kristallisations-Verfahren sind z.B. in Janeic, S.J., Grootscholten, P.A., Industrial Crystallization, New York, Academic, 1984; A. W. Bamforth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965; G. Matz: Kristallisation, 2. Aufl., Springer Verlag, Berlin 1969; J. Nývlt: Industrial Crystallization -State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982; S. J. Jancic', P. A. M. Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984; O. Söhnel, J. Garside: Precipitation, Butterworth-Heinemann, Oxford, 1992; A. S. Myerson (Hg.): Handbook of Industrial Crystallization, Butterworth-Heineman, Boston 1993; J. W. Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993; A. Mersmann (Hg.): Crystallization Technology Handbook, Marcel Dekker, New York 1995 beschrieben. Eine Kristallisation kann z.B. durch Kühlung, Verdampfung, Vakuumkristallisation (adiabate Kühlung), Reaktionskristallisation oder Aussalzen initiiert werden. Die Kristallisation kann z.B. in gerührten und ungerührten Kesseln, im Direkt-Kontakt-Verfahren, in Verdampfungskristallisatoren (R. K. Multer, Chem Eng. (N.Y.) 89 (1982) March, 87-89), in Vakuumkristallisatoren absatzweise oder kontinuierlich, z.B. in Zwangsumlauf-Kristallisatoren (Swenson forced-circulation crystaller) oder Wirbel schicht-Kristallisatoren (Oslo-type) (A. D. Randolph, M. A. Larson: Theory of Particulate Processes, 2. Aufl. Academic Press, New York 1988; J. Robinson, J. E. Roberts, Can. J. Chem. Eng. 35 (1957) 105-112; J. Nývlt: Design of Crystallizers, CRC Press, Boca Raton, 1992) durchgeführt werden. Auch fraktionierte Kristallisation ist möglich (L. Gordon, M. L. Salutsky, H. H. Willard: Precipitation from Homogeneous Solution, Wiley-Interscience, New York 1959). Ebenso können Enantiomere und Racemate getrennt werden (J. Jacques, A. Collet, S. H. Willen: Enantiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York 1981; R. A. Sheldon: Chirotechnology, Marcel Dekker, New York 1993; A. N. Collins, G. N. Sheldrake, J. Crosby (Hg.): Chirality in Industry, Wiley, New York 1985).
  • Übliche Verfahren zur Trocknung sind z.B. in O. Krischer, W. Kast: Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik, 3. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; R. B. Keey: Drying: Principles and Practice, Pergamon Press, Oxford 1972; K. Kröll: Trockner und Trocknungsverfahren, 2. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; Williams-Gardener, A.: Industrial Drying, Houston, Gulf, 1977; K. Kröll, W. Kast: Trocknen und Trockner in der Produktion, Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1989 beschrieben. Es existieren Verfahren zur Konvektionstrocknung, z.B. Trockenöfen, Tunneltrockner, Bandtrockner, Scheibentrockner, Jettrockner, Wirbelschichttrockner, belüftete sowie rotierende Trommeltrockner, Sprühtrockner. Weitere Verfahren nutzen die Kontakttrocknung, z.B. Schaufeltrockner; Vakuum- bzw. Gefriertrocknung; oder Wärmestrahlung (Infrarot) oder dielektrische Energie (Mikrowellen) zur Trocknung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Isolierung der Feinchemikalien aus der Fermentationsbrühe gemäß c) mittels Ionenaustausch-Chromatographie. Die allgemeinen Bedingungen und Vorgehensweisen dabei sind dem Fachmann bekannt und z.B. in Römpp Lexikon der Chemie, 10. Auflage, 1997, Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Weis, Handbuch der Ionenchromatographie, 1991, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, beschrieben. Im Allgemeinen wird man so vorgehen, dass die durch die Mikroorganismen produzierte Verbindung selektiv auf dem Ionenaustauscher gebunden wird und der Ionenaustauscher vor der Elution der durch die Mikroorganismen produzierten Verbindung gewaschen wird, z.B. mit Wasser.
  • Vor Aufgabe der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe auf die Ionenaustauschchromatographiesäule können die Feststoffe gegebenenfalls mittels dem Fachmann bekannter üblicher Verfahren, z.B. Filtration und Zentrifugation, abgetrennt werden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt keine Abtrennung der Feststoffe vor der Aufgabe der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe auf die Ionenaustauchchromatographiesäule. In diesem Fall wird der Ionenaustauscher vorteilhafterweise entgegen der Schwerkraft mit der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe angeströmt, so dass die enthaltenen Feststoffe nicht zu einer Verblockung (d.h. Verstopfung) der Ionenaustauschersäule führen.
  • Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine basische Aminosäure, so kann diese vorteilhaft durch Ionenaustauschchromatographie aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, indem eine saure Kationenaustauschersäule eingesetzt wird. In diesem Fall wird die basische Aminosäure, z.B. Lysin, auf der Ionenaustauschersäule selektiv gebunden. Vor der Elution ist eine Aufreinigung durch Waschen, insbesondere mit Wasser, möglich. Die Elution der basischen Aminosäure erfolgt dann mit einem geeigneten Elutionsmittel, z.B. Ammoniakwasser, bevorzugt mit 5 Vol.-%igem Ammoniakwasser.
  • Die Anwendung der Ionenaustauschchromatographie zur Abtrennung oder Aufreinigung basischer Aminosäuren wie Lysin ist z.B. in der WO 01/072689 und Lee et al., The use of ion exclusion chromatography as approved to the normal ion exchange chromatography to achieve a more efficient lysine recovery from fermentation broth, Enzyme and Microbial Technology 30 (2002), 798-303 beschrieben.
  • Die nach Abtrennung des Wertprodukts, z.B. einer basischen Aminosäure wie Lysin, verbleibende Fermentationsbrühe enthält im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung, wie z.B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Puffer- und Nährsalze. Aus dieser verbleibenden Fermentationsbrühe kann das Nebenprodukt in analoger Weise wie bei der Herstellung von Bioethanol gewonnen werden. Das so gewonnene, sogenannte „Distillers Dried Grains with Solubles" (DDGS) kann als Viehfutter vermarktet werden.
  • Üblicherweise wird die gesamte Brühe dazu in einer in der Regel mehrstufigen Verdampfung teilweise eingedampft und die enthaltenen Feststoffe anschließend z.B. mit einem Dekanter abgetrennt. Die hierbei abgetrennten Feststoffe weisen in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 80 Gew.-%, bevorzugt 15 bis 60 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 50 Gew.-% auf. Die abgetrennte flüssige Phase kann teilweise als Prozesswasser zurückgeführt werden. Dieser rückgeführte Teil der flüssigen Phase kann vorteilhaft z.B. ganz oder teilweise bei der Herstellung der zuckerhaltigen Flüssigkeit nach Schritt a) eingesetzt werden oder zum Ansetzen von Puffer- bzw. Nährsalzlösungen für den Einsatz in der Fermentation verwendet werden. Bei der Zumischung von rückgeführtem Prozesswasser in Schritt a) ist zu berücksichtigen, dass ein zu hoher Anteil die Fermentation durch ein Überangebot an bestimmten Mineralstoffen und Ionen, z.B. Natrium- und Lactationen, negativ beeinflussen kann. Vorzugsweise ist der Anteil an rückgeführtem Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension zur Stärkeverflüssigung erfindungsgemäß daher auf maximal 75 Gew.-%, bevorzugt maximal 60 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 50 Gew.-% beschränkt. Vorteilhafterweise liegt der Anteil an Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension in der bevorzugten Ausgestaltung von Schritt a2) im Bereich von 5 bis 60 Gew.-% und bevorzugt von 10 bis 50 Gew.-%.
  • Der Anteil der nicht in den Prozess zurückgeführten flüssigen Phase wird in einer mehrstufigen Eindampfung zu einem Sirup aufkonzentriert. Der so erhaltene Sirup weist in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 20 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 80 Gew.-% und besonders bevorzugt 40 bis 70 Gew.-% auf. Dieser Sirup wird mit den beim Dekantieren abgetrennten Feststoffen vermischt und anschließend getrocknet. Die Trocknung kann z.B. mittels Trommeltrockner, Sprühtrockner oder Schaufeltrockner erfolgen, bevorzugt wird ein Trommeltrockner eingesetzt. Die Trocknung wird bevorzugt so durchgeführt, dass der erhaltene Feststoff einen Gehalt an Restfeuchte von maximal 30 Gew.-%, bevorzugt maximal 20 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% aufweist.
  • Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin, so erfolgt die Isolierung des Wertprodukts vorteilhafterweise durch Zentrifugation oder Filtration. Dabei können analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen z.B. in der früheren Anmeldung DE 10359668.2 beschrieben wurden. Nach Ende der Fermentation wird die erzeugte Fermentationsbrühe aufgeheizt, um das gesamte Methionin in Lösung zu bringen. Anschließend werden die Feststoffe durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise durch teilweises oder vollständiges Eindampfen aufkonzentriert, wobei das Methionin auskristallisiert. Abschließend erfolgt eine Trocknung des Methionins, gegebenenfalls nach einem vorherigen weiteren Filtrationsschritt.
  • Die durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennten Feststoffe enthalten im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse und die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung, z.B. Fasern. Dieser verbleibende Fermentationsrückstand kann in analoger Weise, wie oben bei der Abtrennung basischer Aminosäuren beschrieben, behandelt werden, so dass DDGS als Nebenprodukt erhalten wird.
  • Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pantothensäure, so erfolgt die Isolierung des Wertprodukts vorteilhafterweise gleichfalls durch Zentrifugation oder Filtration. Dabei können analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Im Übrigen kann die Aufarbeitung in entsprechender Weise, wie zuvor für Methionin beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise führt man im Falle der Pantothensäure zusätzlich eine Pasteurisierung der gesamten Fermentationsbrühe vor der Abtrennung der Feststoffe durch. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, bevorzugt sprühgetrocknet.
  • Der verbleibende Fermentationsrückstand, d.h. insbesondere die abgetrennten Feststoffe, kann in analoger Weise, wie oben bei der Abtrennung basischer Aminosäuren beschrieben, behandelt werden, so dass DDGS als Nebenprodukt erhalten wird.
  • Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Polyhydroxyalkanoate, so erfolgt die Isolierung des Wertproduktes vorteilhafterweise durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie z. B in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben. Die übrigen Feststoffe können in üblicher Weise, z. B. durch Filtration oder Zentrifugation, abgetrennt werden. Im Übrigen kann die Aufarbeitung der Feststoffe in entsprechender Weise, wie zuvor für Methionin beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise führt man im Falle der Polyhydroxyalkanoate zusätzlich eine Pasteurisierung der gesamten Fermentationsbrühe vor der Abtrennung der Feststoffe durch. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, bevorzugt sprühgetrocknet. Dle weitere Aufreinigung der Polyhydroxyalkanoate erfolgt in an sich bekannter Weise, wie z.B. in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben.
  • Der verbleibende Fermentationsrückstand, d.h. insbesondere die abgetrennten Feststoffe, kann in analoger Weise, wie oben bei der Abtrennung basischer Aminosäuren beschrieben, behandelt werden, so dass DDGS als Nebenprodukt erhalten wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass man
    • (i) dem in Schritt a) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A) durchführt; und
    • (ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durchführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils des zuckerhaltigen Flüssigmediums maximal 50 Gew.-%, bevorzugt maximal 30 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-% beträgt.
  • Diese Vorgehensweise ermöglicht es, in der separaten Fermentation gemäß (iii) Mikroorganismen einzusetzen, für die bestimmte Mindestanforderungen erfüllt sein müssen, z.B. bezüglich der Sauerstofftransferrate. Für solche in der separaten Fermentation gemäß (iii) eingesetzten Mikroorganismen kommen z.B. Bacillus species, bevorzugt Bacillus subtilis in Betracht. Die durch derartige Mikroorganismen in der separaten Fermentation produzierten Verbindungen sind insbesondere unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden und Nukleotiden, Lipi den, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, aromatischen Verbindungen, Proteinen, Carotenoiden, speziell unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Proteinen und Carotenoiden und ganz speziell unter Riboflavin und Calciumpantothenat ausgewählt.
  • Insbesondere ermöglicht diese Vorgehensweise, das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft auch dann einzusetzen, wenn die produzierte Feinchemikalie bei der Fermentation als Feststoff anfällt.
  • Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Vorgehensweise betrifft die parallel betriebene Herstellung gleicher Stoffwechselprodukte (A) und (B) in zwei separaten Fermentationen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn für verschiedene Anwendungen des gleichen Stoffwechselprodukts unterschiedliche Anforderungen an die Reinheit zu stellen sind. Demnach wird das erste Stoffwechselprodukt (A), z.B. eine als Futtermitteladditiv zu verwendende Aminosäure, z.B. Lysin, unter Einsatz der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe und das gleiche zweite Stoffwechselprodukt (B), z.B. die gleiche als Nahrungsmitteladditiv zu verwendende Aminosäure, hier z.B. Lysin, unter Einsatz der gemäß (ii) feststoffabgereicherten Fermentationsbrühe hergestellt. Durch die vollständige oder teilweise Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile kann der Reinigungsaufwand bei der Aufarbeitung des Stoffwechselprodukts, dessen Anwendungsbereich eine höhere Reinheit erfordert, z.B. als Nahrungsmitteladditiv, reduziert werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/011052, DE 19840709 , WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
  • Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie folgt vorgegangen werden. Man implementiert eine vorzugsweise großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z.B. von Feinchemikalien wie Lysin, entsprechend den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten a) bis c). Gemäß (i) wird ein Teil des nach Schritt a) erhaltenen, zuckerhaltigen Flüssigmediums entnommen und gemäß (ii) durch übliche Verfahren, z.B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit. Das daraus gewonnene, im Wesentlichen vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird gemäß (ii) einer Fermentation zur Produktion eines Stoffwechselprodukts B, z.B. Riboflavin, zugeführt. Der gemäß (ii) abgetrennte Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.
  • Die auf diese Art und Weise gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in DE 4037441 , EP 464582 , EP 438767 und DE 3819745 . Nach Lyse der Zellmasse erfolgt die Abtrennung des kristallin vorliegenden Riboflavins vorzugsweise durch Dekantieren. Andere Arten der Feststoffabtrennung, z.B. Filtration, sind ebenfalls möglich. Anschließend wird das Riboflavin getrocknet, bevorzugt mittels Sprüh- und Wirbelschichttrocknern. Alternativ dazu kann das gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsgemisch nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie z.B. in der EP 1048668 und EP 730034 beschrieben. Nach Pasteurisierung wird die Fermentationsbrühe hier zentrifugiert und die zurückbleibende feststoffhaltige Fraktion mit einer mineralischen Säure behandelt. Das gebildete Riboflavin wird aus dem wässrigsauren Medium filtriert, gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.
  • Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fermentation gemäß (ii) zur Produktion von Pantothensäure zugeführt. Dabei ist die im Vergleich zum feststoffhaltigen Flüssigmedium verringerte Viskosität besonders vorteilhaft. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.
  • Die gemäß (ii) erzeugte, Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet.
  • Die abgetrennten Feststoffe werden im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens zu DDGS verarbeitet.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Polyhydroxyalkanoate. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.
  • Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fermentation gemäß (ii) zur Produktion von Polyhydroxyalkanoaten zugeführt. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.
  • Die gemäß (ii) erzeugte, Polyhydroxyalkanoat-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der US 4310684 und EP 355307 . Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet. Dle weitere Aufreinigung der Polyhydroxyalkanoate erfolgt in an sich bekannter Weise, wie z.B. in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben.
  • Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung einzelner Aspekte der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen.
    •
  • I. Vermahlen der Stärkequelle
  • Die im folgenden eingesetzten Mahlgüter wurden wie folgt hergestellt. Ganze Maiskörner wurden unter Verwendung einer Rotormühle vollständig vermahlen. Unter Einsatz unterschiedlicher Schlägerwerke, Mahlbahnen bzw. Siebeinbauten wurden dabei drei verschiedene Feinheiten erzielt. Eine Siebanalyse des Mahlgutes mittels Labor-Vibrationssieb (Vibrations-Analysenmaschine: Retsch Vibrotronic Typ VE1; Siebzeit 5 min; Amplitude: 1,5 mm) ergab die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse.
  • Tabelle 1
    Figure 00310001
  • II. Enzymatische Stärkeverflüssigung und -verzuckerung
  • II.1. Ohne Phytase im Verzuckerungsschritt
  • II.1a) Enzymatische Stärkeverflüssigung
  • Aus 320 g trocken vermahlenem Maismehl (T71/03) wurde unter stetem Rühren eine Suspension in 480 g Wasser angesetzt und mit 310 mg Calciumchlorid versetzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 6,5 und Erhitzen auf 35 °C wurden 2,4 g Termamyl L zugegeben. Über 40 min wurde das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von 86,5 °C erhitzt, wobei der pH gegebenenfalls mit NaOH auf den zuvor eingestellten Wert nachjustiert wurde. Innerhalb von 30 min wurden weitere 400 g des trocken vermahlenen Maismehls (T71/03) zugegeben, wobei die Temperatur auf 91 °C erhöht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ca. 100 min bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wurden weitere 2,4 g Termamyl L zugegeben und die Temperatur ca. 100 min gehalten. Der Fortschritt der Verflüssigung wurde während der Durchführungsdauer mit der Jod-Stärke-Reaktion verfolgt. Die Temperatur wurde abschließend auf 100 °C erhöht und das Reaktionsgemisch weitere 20 min gekocht. Zu diesem Zeitpunkt war keine Stärke mehr nachzuweisen. Der Reaktor wurde auf 35 °C abgekühlt.
  • II.1 b) Verzuckerung
  • Die aus II.1a) erhaltene Reaktionsmischung wurde unter stetem Rühren auf 61 °C erhitzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 wurden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozyme GA zugegeben. Die Temperatur wurde ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wurde. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 aufgeführt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Es wurden ca. 1180 g Produkt mit einer Dichte von ca. 1,2 kg/l und einem mittels Infrarottrockner bestimmten Gehalt an Trockenmasse von etwa 53,7 Gew.-% erhalten. Nach Waschen mit Wasser wurde ein Gehalt an Trockenmasse (ohne wasserlösliche Inhaltsstoffe) von etwa 14 Gew.-% erhalten. Der durch HPLC bestimmte Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch betrug 380 g/l (vgl. Tab. 2, Probe Nr. 7).
  • Tabelle 2
    Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • II.2. Mit Phytase im Verzuckerungsschritt
  • II.2a) Stärkeverflüssigung
  • Eine trocken vermahlene Maismehlprobe wird entsprechend II.1a) verflüssigt.
  • II.2b) Verzuckerung
  • Die aus II.2a) erhaltene Reaktionsmischung wird unter stetem Rühren auf 61 °C erhitzt. Das Rühren wird während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 werden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozyme GA und 70 μl Phytase (700 Units Phytase, Natuphyt Liquid 10000L von der BASF Aktiengesellschaft) zugegeben. Die Temperatur wird ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wird. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Das erhaltene Produkt wird mittels Infrarottrockner getrocknet und mit Wasser gewaschen. Der Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch wird durch HPLC bestimmt.
  • III. Konstruktion eines Lysin überproduzierenden C. glutamicum Stamms ATCC13032 lysCfbr
  • III.1 Konstruktion des Plasmids pCIS lysC
  • Im ersten Schritt der Stammkonstruktion wurde ein allelischer Austausch des für das Enzym Aspartatkinase kodierenden Wildtypgens (lysC) in C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Dabei wurde im lysC Gen ein Nukleotidaustausch vorgenommen, so dass im resultierenden Protein die Aminosäure Thr an der Position 311 durch ein Ile ausgetauscht wurde. Ausgehend von der chromosomalen DNA aus ATCC13032 als Template für eine PCR Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern
    5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3' (SEQ ID NO:1)
    und
    5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3' (SEQ ID NO:2)
    lysC mit Hilfe des Pfu-Turbo PCR Systems (Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 oder Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828 präpariert. Das amplifizierte Fragment wird an seinem 5'-Ende von einem SalI Restriktionsschnitt und an seinem 3'-Ende von einem MluI Restriktionsschnitt flankiert. Vor der Klonierung wurde das amplifizierte Fragment durch diese beiden Restriktionsenzyme verdaut und mit GFXTMPCR, DNA and Gel Band Furification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) aufgereinigt.
  • Das erhaltene Polynukleotid wurde über die SalI und MluI Restriktionsschnitte in pCLIK5 MCS integrativ SacB, im folgenden pCIS genannt, (SEQ ID NO: 3) kloniert und in E.coli XL-1 blue transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20μg/ml) haltigem LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) erreicht. Das Plasmid wurde isoliert und durch Sequenzierung die erwartete Nukleotidsequenz bestätigt. Die Präparation der Plasmid DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Firma Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet. Das erhaltene Plasmid wurde als pCIS lysC (SEQ ID NO:4) bezeichnet. Es umfasst folgende wesentliche Teilbereiche:
    Figure 00340001
  • III.2 Mutagenese des lysC Gens aus C. glutamicum
  • Die gerichtete Mutagenese des lysC Gens aus C. glutamicum wurde mit dem Quick-Change Kit (Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Mutagenese wurde im Plasmid pCIS lysC (SEQ ID NO:4) durchgeführt. Für den Austausch von thr 311 nach 311 ile mit Hilfe der Quickchange Methode (Stratagene) wurden folgende Oligonukleotidprimer synthetisiert:
    5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3' (SEQ ID NO:5)
    5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3' (SEQ ID NO:6)
  • Der Einsatz dieser Oligonukleotidprimer in der Quickchange Reaktion führt in dem lysC Gen (SEQ ID NO:7) zu einem Austausch des Nukleotids in Position 932 (von C nach T). Der resultierende Aminosäureaustausch Thr311 Ile im lysC Gen wurde nach Trans formation in E.coli XL1-blue und Plasmidpräparation durch eine Sequenzierungsreaktion bestätigt. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pCIS lysC thr311ile (SEQ ID NO:8). Es umfasst folgende wesentliche Teilbereiche:
    Figure 00350001
  • III.3 Transformation von pCIS lysC thr311 ile in C. glutamicum (Stamm ATCC13032)
  • Das Plasmid pCIS lysC thr311 ile wurde in C. glutamicum ATCC13032 mittels Elektroporation, wie bei Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 53:299-303 (1989) beschrieben, transformiert. Modifikationen des Protokolls sind in der DE 10046870 beschrieben. Die chromosomale Anordnung des lysC-Lokus einzelner Transformanten wurde mit Standardmethoden durch Southernblot und Hybridisierung, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989), beschrieben, überprüft. Dadurch wurde sichergestellt, dass es sich bei den Transformanten um solche handelt, die das transformierte Plasmid durch homologe Rekombination am lysC-Lokus integriert haben. Nach Wachstum solcher Kolonien über Nacht in Medien, die kein Antibiotikum enthalten, werden die Zellen auf ein Saccharose-CM-Agarmedium (10% Saccharose) ausplattiert und 24 Stunden bei 30°C inkubiert.
  • Da das im Vektor pCIS lysC thr311 ile enthaltende sacB Gen Saccharose in ein toxisches Produkt umwandelt, können nur solche Kolonien anwachsen, die das sacB Gen durch einen zweiten homologen Rekombinationsschritt zwischen dem Wildtypgen lysC und dem mutierten Gen lysC thr311 ile deletiert haben. Während der homologen Rekombination kann entweder das Wildtypgen oder das mutierte Gen zusammen mit dem sacB Gen deletiert werden. Wenn das sacB Gen zusammen mit dem Wildtypgen entfernt wird, resultiert eine mutierte Transformante.
  • Anwachsende Kolonien wurden gepickt und auf einen Kanamycin-sensitiven Phänotyp hin untersucht. Klone mit deletiertem SacB Gen müssen gleichzeitg Kanamycinsensitives Wachstumsverhalten zeigen. Solche Kanamycin-sensitiven Klone wurden in einem Schüttelkolben auf ihre Lysin-Produktivität hin untersucht. Zum Vergleich wurde der nicht behandelte C. glutamicum ATCC13032 angezogen. Klone mit einer gegenüber der Kontrolle erhöhten Lysin-Produktion wurden selektiert, chromosomale DNA gewonnen und der entsprechende Bereich des lysC Gens durch eine PCR-Reaktion (Pfu-Turbo PCR Systems; Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert und sequenziert (nach Sanger et al., a.a.O.). Ein solcher Klon mit der Eigenschaft erhöhter Lysin-Synthese und nachgewiesener Mutation in lysC an Position 932 wurde mit ATCC13032 lysCfbr bezeichnet.
  • Beispiel 1
  • a) Enzymatische Stärkeverflüssigung und -verzuckerung
  • 500 g trocken vermahlenes Maismehl wurden in 750 ml Wasser suspendiert und in einem Rührmixer erneut fein vermahlen. Die Suspension wurde in 4 Proben Nr. 1 bis 4 geteilt, die jeweils mit ca. 3 g hitzestabiler α-Amylase (Proben Nr. 1 und 2: Termamyl L; Proben Nr. 3 und 4: Spezyme) behandelt wurden. Die Proben Nr. 2 und 4 wurden nachfolgend mit ca. 7 g/l Glucoamylase (Probe Nr. 2: Dextrozyme GA; Probe Nr. 4: Optidex) behandelt. Es wurden gelbliche, viskose Proben erhalten, deren Feststoffanteil jeweils durch Zentrifugation abgetrennt wurde, wobei über der klaren Flüssigphase eine Schicht hydrophober Feststoffe aufschwamm.
  • Von den so erhaltenen Proben wurde unter Vernachlässigung bzw. unter Einbeziehung des abzentrifugierten Pellets jeweils der klare Überstand in konzentrierter Form und in 10-facher Verdünnung mittels HPLC analysiert. Bei Berücksichtigung des Pellets wurde ein Gehalt an Trockenmasse für das Pellet von 50 Gew.-% angenommen. Die Ergebnisse, bezogen auf die Ausgangsprobe, sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt.
  • Tabelle 3
    Figure 00360001
  • b) Fermentation
  • Zwei gemäß Beispiel II.1 erhaltene Maismehlhydrolysate wurden in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt (Kolben 4-9). Außerdem wurde parallel ein analog Beispiel II.1 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 1-3) verwendet.
  • 1b.1) Herstellung des Inokulums
  • Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 4; 20 min bei 121 °C) 48 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD600 = 1 bei 600 nm erreicht.
  • Tabelle 4: Zusammensetzung des CM-Agar
    Figure 00370001
  • 1b.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
  • Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 5 aufgeführt.
  • Tabelle 5: Kolbenmedien
    Figure 00370002
  • Figure 00380001
  • Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Zuckern und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC wurde mit einem 1100 Series LC System von Agilent durchgeführt. Eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäure, die Auftrennung des Produktgemischs erfolgt mit einer Hypersil AA-Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.
  • Tabelle 6
    Figure 00380002
  • In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 30 bis 40 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.
  • Beispiel 2: Fermentation
  • Unter Verwendung eines gemäß Beispiel II.1 erhaltenen Maismehlhydrolysats wird eine Fermentation analog Beispiel 1b) durchgeführt, wobei der unter III. beschriebene Stamm ATCC13032 lysCfbr verwendet wurde. Die Zellen werden auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung Tabelle 4; 20 min bei 121 °C) 48 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums 1 bzw. 2 (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 1 bei 610 nm erreicht. Die Proben werden dann bei 200 Upm und 30 °C in einem befeuchteten Schüttelschrank (85% rel. Luftfeuchte) 48 h inkubiert. Die Konzentration des Lysins in den Medien wird mittels HPLC bestimmt. In allen Fällen wurden annähernd gleiche Mengen an Lysin produziert.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001

Claims (22)

  1. Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend: a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst; b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium kultiviert, welches man erhält durch: a1) Vermahlen der Stärkequelle; und a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym unter α-Amylasen und das mindestens eine verzuckernde Enzym unter Glucoamylasen ausgewählt ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stärkequelle Getreidekörner verwendet.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Getreide ausgewählt ist unter Mais-, Roggen- und Weizenkörnern.
  5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das beim Vermahlen im Schritt a1) erhaltene Mahlgut mindestens 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm.
  6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verflüssigen und Verzuckern des Mahlguts im Schritt a2) derart erfolgt, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas beträgt.
  7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 25 Gew.-% der Gesamtmenge des während der Verflüssigung zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a2) eine Teilmenge der mindestens einen α-Amylase während des Verflüssigens zu der wässrigen Flüssigkeit zugegeben wird.
  9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zuckerhaltiges Flüssigmedium mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 40 Gew.-% erhält.
  10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vor dem Fermentationsschritt b) mindestens eine Phytase zusetzt.
  11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte unter nicht-flüchtigen Stoffen ausgewählt sind.
  12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte unter organischen, gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen; Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden; gesättigten und ungesättigten Fettsäuren; Diolen mit 3 bis 8 C-Atomen, höherwertigen Alkohole mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, längerkettigen Alkoholen mit wenigstesn 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofaktoren, Nutrazeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lactonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt sind.
  13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte ausgewählt sind unter Aminosäuren und Vitaminen sowie Vorläufern und Folgeprodukten davon, wie insbesondere Lysin, Methionin, Pantothensäure und Riboflavin, sowie Polyhydroxyalkanoaten, Bernsteinsäure, Milchsäure, Threonin, Propionsäure, Propandiol, Butanol, Aceton und Trehalose.
  14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter natürlichen oder rekombinanten, Aminosäuren, Vitamine, Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon oder Polyhydroxyalkanoate überproduzierenden Mikroorganismen, insbesondere unter Lysin, Methionin, Pantothensäure, Riboflavin, Polyhydroxyalkanoate Bernsteinsäure, Milchsäure, Threonin, Propionsäure, Propandiol, Butanol, Aceton und Trehalose überproduzierenden Mikroorganismen.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmanni, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii Clostridium propionicum und Clostridium acetobutlicum.
  16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abreicherung oder Isolierung der Stoffwechselprodukte aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) mittels Ionenaustauschchromatographie durchführt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffwechselprodukt selektiv auf dem Ionenaustauscher gebunden wird und gegebenenfalls der Ionenaustauscher vor der Elution des Produkts gewaschen wird.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher entgegen der Schwerkraft mit der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe angeströmt wird.
  19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man (i) dem in Schritt a) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A) durchführt; und (ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durchführt.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so erfolgt, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils der zuckerhaltigen Flüssigkeit maximal 50 Gew.-% beträgt.
  21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffwechselprodukt (B) unter Riboflavin, Pantothensäure und Polyhydroxyalkanoaten ausgewählt ist.
  22. Verwendung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 21 zur fermentativen Herstellung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom.
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