CZ20031886A3

CZ20031886A3 - Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku a mikroorganizmy používané při tomto způsobu

Info

Publication number: CZ20031886A3
Application number: CZ20031886A
Authority: CZ
Inventors: R. Rogers Yocum; Thomas A. Patterson; Janice G. Pero; Theron Hermann
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-18
Publication date: 2003-10-15
Also published as: WO2002061108A3; KR20030075163A; CN1571837A; IN2003CH01280A; IL156708A0; JP4229700B2; HU227432B1; NO20033240D0; US20080166777A1; IN2003CH01278A; US20040091979A1; EP1390519B1; WO2002061108A2; HUP0501185A2; EP1390519A2; US7244593B2; DE60216581T2; CA2434626A1; JP2004533213A; PL369009A1

Description

Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku a mikroorganizmy používané při tomto způsobu

Související přihlášky vynálezů

Tato přihláška přihláška vynálezu uplatňuje právo před« nosti z přihlášky vynálezu číslo 60/XXX XXX s názvem Mikroΐ organizmy a způsoby usnadněné produkce pantothenátu podané ‘ 11. ledna 2002, která je v řízení, z přihlášky vynálezu číslo

J 60/263 053, podané 19. ledna 2001, která je rovněž v řízení, a z přihlášky vynálezu číslo 60/262 995, podané 19. ledna 2001, která je rovněž v řízení. Tento vynález se týká také vynálezu, popsaného v americké přihlášce vynálezu číslo 09/667 569, podané 21. září 2000, která je v řízení, a navazuje na část americké odvolané přihlášky vynálezu číslo 09/400 494, podané 21. září 1999. Americká přihláška vynálezu číslo 09/667 569 nárokuje právo přednosti ze zaniklé přihlášky vynálezu číslo 60/210 072, podané 7. června 2000, ze zaniklé přihlášky vynálezu číslo 60/221 836 podané 28. července 2000 a ze zaniklé přihlášky vynálezu číslo 60/227 860 podané 24. srpna 2000. Předmětná přihláška vynálezu navazuje vždy na obsah shora uvedených přihlášek vynálezu jako celku.

Oblast techniky

Vynález se týká způsob ořipravý pantothenátu a mikroorganismů používaných při této přípravě.

Dosavadní stav techniky

Pantothenát, známý také jako kyselina pantothenová nebo vitamin B5, je členem B-komplexu vitaminů a je nutnou podmínkou pro výživu savců, včetně dobytka a lidí (například z potravinových zdrojů, jako vodou rozpustný vitaminový doplněk nebo přísada potravy). V buňkách je pentothenát využíván přede2 • · • · • · · · ·· ·· vším k biosyntéze koenzymu A (CoA) a jako acylový nosič proteinu (acyl carrier protein ACP). Tyto koenzymy funguji v metabolizmu acylových podílů, které vytvářejí thioestery se sulfhydry1ovou skupinou 4 -fosfopantethei nového podílu těchto molekul. Tyto koenzymy jsou nezbytné ve všech buňkách, neboť se podílejí na více než 100 různých meziproduktových reakcích v buněčném metabolismu.

f ^A Obvyklým způsobem syntézy pantothenátu (zejména bioaktivJ ního D-izomeru) je chemická syntéza z chemikálií, což je proces, jehož překážkou jsou vysoké náklady na substráty a nutnost optického štěpení racemických meziproduktů. Proto se pracovníci v oboru v poslední době zaměřují na bakteriální nebo mikrobiální systémy, které produkují enzymy užitečné v procesech biosyntézy pantothenátu (jelikož bakterie jako takové jsou schopny syntetizovat pentothenát). Obzvláště se ukázalo, že biokonverzní způsoby jsou cestou podpořené produkce výhodného izomeru kyseliny pantothenové. Kromě toho byly vyzkoušeny způsoby přímé mikrobiální syntézy jako cesty k usnadnění produkce D-pantothenátu.

Existuje však stále významná potřeba zlepšených způsobů přípravy pantothenátu, obzvláště mikrobiálních způsobů, opt i malizovaných k produkci vyšších výtěžků žádaného produktu.

Podstata vynálezu

Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku spočívá podle vynálezu v tom, že se pěstuje mikroorganismus mající deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu za podmínek, při nichž je produkce pantothenátu podpořena

Vynález se týká zlepšených způsobů (například mikrobiální syntézy) pro produkci pantothenátu. Způsoby výroby pantothenátu jsou popsány v souvisejících patentových přihláškách, které • · • · · · • · · · <

► · · · · · <

• · 4 > · · · · · se týkají například mikrobů, zaměřených na nadměrnou expresi klíčových enzymů pro biosyntetickou cestu (pathway” = cesta) přípravy pantothenátu a pro isoleucin-valinovou biosyntetickou cestu (například obr. 1). Kmeny jsou konstruovány tak, ěe jsou schopny produkovat pantothenátu více než 50 g/1 ve standardních fermantačnich procesech (například světový patentový spis číslo WO 01/21772 a americká přihláška vynálezu číslo 60/ _f 262 995). Zejména zvýšení exprese genů panB, panC, panD a * panEl a zvýšení exprese genů ilvBNC a ilvD vede ke kmenům, ) které převádějí glukózu (pyruvát) na obchodně zajímavá množství pantothenátu.

Ke zlepšení produkce například pantothenátu, byla nyní vyvinuta různá zlepšení shora popsaných způsobů. Například americká přihláška vynálezu číslo 09/667 569 popisuje produkci kmenů s modifikovanými (například s deletovaným i nebo se sníženými aktivitami) pantotenátkinázovými enzymy. V takových kmenech jsou hladiny pantothenátu účinně zvýšeny snížením využití pantothenátu pro syntézu koenzymu A (CoA”). Americká přihláška vynálezu číslo 60/262 995 dále popisuje zlepšené kmeny pro produkci pantothenátu, které jsou zaměřeny na minimalizaci využití různých panthotenátových biosyntetických enzymů a/nebo isoleucin- val i nových biosyntetických enzymů a/nebo jejich příslušných substrátů od jejich využití k výrobě alternativního produktu označeného HMBPA.

Vynález se týká způsobů dalšího zvýšení výroby pantothenátu modulací biosyntetické cesty, která zahrnuje substrát pro pantothenátovou biosyntetickou cestu, zvláště methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu. Zejména se zjistilo, že zvyšováním hladiny MTF nodifikací MTF biosyntetické cesty vede ke zvýšenému množství ketopantoátu, klíčového meziproduktu pro panthotenátovou biosyntetickou cestu. Zvýšené množství ketopantoátu pak vede k významně zvýšené výrobě pantothenátu ve vhodně konstruovaných kmenech. Vynález v podstatě i (například například ·· 99 ·· • · · · · · • · 9 9 ·

999·· · • 9 · · •999 99 ·» identifikuje mezní krok v produkci pantosloučenin pantothenátu) kmeny konstruovanými k nadexpresí panB, panC, panD, panEl, ilvBNC a ilvD genů a charakterizuje prostředky k překonání této meze modifikací MTF biosyntetické cesty.

i

Popisují se zde alespoň tři účinné prostředky úpravy biosyntetické cesty MTF. Jednak se zjistilo, že zvyšováním hladí,L ny šeřinu v kultivačním prostředí mikroorganismů, produkují/ cích pantothenát, se zvyšuje produkce pantothenátových derivátů. Zjistilo se také, že zvyšováním syntézy nebo aktivity

3-fosfoglycerátdehydrogenázy (produktu serA genu) nebo syntézy nebo aktivity ser inhydroxymethyltransferázy (produktu glyA genu), tím zvýšením biosyntézy šeřinu a methylentetrahydrofolátu ve vhodně zkonstrtuovaných mikroorganismech, se zvýší produkce pantosloučen i n.

Vynález se týká způsobu zvýšení produkce pantoátu a pantothenátu, při kterém se kultivuje mikroorganisms mající modifikované aktivity pantothenátového biosyntetickébo enzymu a mající modifikované aktivity methy1entetrahydrofolátového (MTF) biosyntetického enzymu za podmínek zvýšení produkce pantothenátu. Vynález se dále týká způsobu zvýšení produkce pantoátu a pantothenátu kultivací mikroorganismů majících modifikované aktivity pantothenátového biosyntetického enzymu pantothenátu, majících modifikované aktivity i soleucin-valinových (ilv) biosyntet i ckých enzymů a majících modifikované aktivity methylentetrahydrofol átového (MTF) biosyntetického enzymu za podmínek zvýšení produkce pantothenátu. Zejména je vynález týká způsobu zvýšení produkce žádaných produktů (například pantoátu a pantothenátu) zvýšením hladiny klíčového meziproduktu, ketopantoátu, enzymy, které přispívají k této syntéze. Výhodné způsoby vedou k produkci pantothenátu ve větším množství než 50, 60, 70 nebo více g/1 po 36 hodinách kultivace mikroorganismů, nebo k produkci alespoň 60, 70, 80, 90 nebo více g/1 pantothenátu • · · · · · • · • · · · · po 36 hodinách kultivace mikroorganismů. Vynález se také tyká rekombinantních mikroorganismů a podmínek jejich kultivace.

Vynález se dále týká sloučenin produkované takovými mikoorgan i smy.

Další význaky a výhody vynálezu objasňuje nálesující podrobný popis s připojenými obrázky.

í t-

Seznam obrázků na výkresech

Na obr. 1 je schematicky znázorněna pantothenátová a isoleucin-valinová (ilv) biosyntetická cesta. Pantothenátové biosyntetické enzymy jsou vyznačeny plně a jejich odpovídající geny jsou vyznačeny kurzivou. Isoleucin-valinové (ilv) biosyntetické enzymy jsou vyznačeny zesílenou kurzivou a odpovídající geny jsou vyznčeny kurzivou.

Na obr. 2 je schematicky vyznačena methylentetrahydrofolátová (MTF) biosyntetická cesta v E. coli (a předpokládaná v B. sub-

ti 1is)
Na	obr
Na	obr
Na	obr
Na	obr
Na	obr

je schematicky vyznačena konstrukce plasmidu pAN665, je schematicky vyznačena konstrukce plasmidu pAN670.

je schematicky vyznačena konstrukce plasmidu pAN004.

je schematicky vyznačena konstrukce plasmidu pAN396.

je schematicky vyznačena konstrukce plasmidu pAN393.

Podrobný popis vynálezu

Vynález se týká zlepšených způsobů výroby pantosloučenin (například ketopantoátu, pantoátu a/nebo pantothenátu) a kmenů konstruovaných k použití v těchto zlepšených způsobech. Kmeny schopné produkovat více než 50 g/1 pantothenátu mohou být konstruovány způsobem podle světového patentového spisu číslo WO 01/21772 a podle americké přihlášky vynálezu číslo 60/262 995. Zvyšováním exprese genů panB, panC, panD a panEl a zvyšováním exprese genů ilvBNC a i 1vD je možno konstruovat kmeny (napřik9 ·· ·♦ • · · · • · · • ··· • · ···· ·· ·· ···· ·· · lad kmeny Bacillus), které přeměňují glukózu (pyruvát) na obchodně atraktivní množství pantothenátu.

Nyní se však zjistilo, že v případě kmenů, konstruovaných k expresi vysokých množství produktu genu panB, ketopantoáthydroxymethy1transferázy (například PA824, popsané v americké přihlášce vynálezu číslo 09/667 569 a PA 668-24, popsané v americké přihlášce vynálezu číslo 60/262 995), je mezním krokem pro další zvyšování produkce pantothenátu stále přeměna ot-keto i sova 1 erátu (oe-KIV) na ketopantoát. Způsoby zvyšování produkce ce-KIV jsou popsány ve světovém patentovém spise číslo WO 01/21772 a v americké přihlášce vynálezu číslo 60/262 995. Podle vynálezu se zjistilo, že je možno dosáhnout ještě dalšího zvýšení produkce pantothenátu konstrukcí zaměřenou na zvýšení množství Í1TF nebo rychlosti její syntézy.

Vynález se týká modulace methylentetrahydrofolátové (MTF) biosyntetické cesty. Zejména zvýšení množství MTF v mikrobech produkujících pantosloučeniny je účinným prostředkem ke zvýšení produkce ketopantoátu a vede v zápětí k podpoře produkce pantoátu a/nebo pantothenátu ve vhodně konstruovaných rekombinantních mikroorganismech.

Ketopantoáthydroxymethylentransferáza katalyzuje produkci ketopantoátu z at - keto i soval erátu (ař-KIV) a MTF (například obr. 1). Enzym zejména katalyzuje přenos hydroxymethylové skupiny z MTF na oř-KIV k získání ketopantoátu. Oba, jak ař-KIV tak MTF, jsou substráty pro tuto reakci a jejich syntézy mohou být zvýšeny ke zlepšení produkce ketopantoátu. Cesta biosyntézy MTF v E. coli (a snad také v Bacillus subtilis) je vyznačena na obr.2. MTF je syntetizován z tetrahydrofolátu a ze šeřinu v reakci katalyzované genem glyA, který kóduje ser inhydroxymethyltransferázu. Ke zlepšení syntézy MTF potřebují buňky zvýšená množství jak substrátu tak produktu genu glyA.

V jednom provedení se vynález týká způsobu zvýšení produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího (i) deregulovanou pantothenátovou cestu biosyntetickou cestu (například mající jeden, dva, tři nebo čtyři deregulované pantothenátové biosyntetické enzymy) a (ii) deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu (mající alespoň jeden nebo dva deregulované MTF biosyntetické enzymy, za podmínek zvyšování produkce pantothenátu. Mezi pantothenátové biosyntetické enzymy patří ketopantoáthydroxymethyltransferáza, ketopantoátreduktáza, pantothenátsyntetáza a aspartát - of-dekarboxyl áza . Příkladně MTF b i osyntet i cké enzymy zahrnují produkt genu serA a produkt genu glyA.

V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího (i) deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu (například mající jeden, dva, tři nebo čtyři deregulované pantothenátové biosyntetické enzymy), (ii) deregulovaou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou cestu (mající například jeden, dva nebo tři deregulované biosyntetické enzymy ilv) a (iii) deregulovanou MTF biosyntetickou cestu (například mající alespoň jeden nebo dva deregulované biosyntetické MTF enzymy), za podmínek zvyšování produkce pantothenátu. Příkladně ilv biosyntetické enzymy zahrnují acetohydroxykyse1 inovou kyselou syntetázu, acetohydroxykyse1 inovou isomeroreduktázu a dihydroxykyse1 i novou dehydratázu.

V jiném provedení se vynález týká způsobu výroby pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu, deregulovanou ilv biosyntetickou cestu a deregulovanou MTF biosyntetickou cestu tak, še se vždy během 36 hodin kultivace mikroorganismu vyrobí alespoň 50 g/1 pantothenátu, s výhodou alespoň 60 g/1 pantothenátu a výhodněji alespoň 70 g/1 pantothenátu.

·· »· ·· «·»<. ·» »·»«

- 8 • ··· *··· * · · « • ··»· ««·« *··♦♦* ·· · · » · ·

V jiném provedení se vynález týká způsobu výroby pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího deregu1 ovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu, deregulovanou ilv biosyntetickou cestu a deregulovanou MTF biosyntetickou cestu tak, že se vždy během 48 hodin kultivace mikroorganismu vyrobí alespoň 60 g/1 pantothenátu, s výhodou alespoň 70 g/1 pantothenátu a výhodněji alespoň 80 g/1 pantothenátu.

Vynález se dále týká shora popsaných způsobů, kde výroba pantothenátu je dále zvyšována regulováním aktivity pantothenátkinázy (například je aktivita pantothenátkinázy snížena). V jednom provedeni je CoaA vypuštěna a CoaX je regulováno směV jiném provedení je CoaX vypuštěna a CoaA je reguV ještě jiném provedení je CoaX a CoaA regulováno směrem dolů. Vynález se dále týká shora popsaných způsobů, přičemž mikroorganismy se kultivují za podmínek ňadrem dolů.

ováno směrem dolů bytku šeřinu. Vynález se dále přičemž mikroorganismy mají týká shora popsaných způsobů, pantothenátovou biosyntetickou cestu deregulovanou tak, že je produkce pantothenátu nezáviská na přísunu β-a lan i nu.

Vynález se také týká produktů syntetizovaných způsobem podle vynálezu a prostředků, které obsahují pantothenát, vyrobený podle těchto způsobů. Vynález se také týká rekombinantních mikroorganismů používaných při způsobech podle vynálezu. V jednom provedení se vynález týká rekombinantního mikroorganismu pro způsob zvýšené produkce pantothenátu charakterizovaný deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestou a deregulovanou MTF biosyntetickou cestou. V jiném provedení se vynález týká rekombinantního mikroorganismus pro způsob zvýšené produkce pantothenátu charakterizovaný deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestou, deregulovanou MTF biosyntetickou cestou a deregulovanou ilv biosyntetickou cestou. Mikroorganismy mohou mít dále sníženou pantothenátkinázovou aktivitu. Výhodnými mikroorgani srny jsou rodu Bači 11us například Bacillus ·· *«·· ** ···<

• « *· · r * < · • · · • · · ·» · subt i 1 i s .

Jak je popsáno shora, některé procesní význaky vynálezu pro zvýšenou produkci paníosloučenin (například pantoátu a/nebo pantothenátu) zahrnují kultivaci mikroorganismů majících alespoň deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu. Výraz pantothenátová biosyntetická cestu” zahrnuje biosyntetickou cestu zahrnující například pantothenátové biosyntetické enzymy (například polypeptidy kódované geny kódujícími biosyntetický enzym), sloučeniny (například substráty, meziprodukty nebo produkty) a kofaktory používané při vytváření nebo syntéze pantothenátu. Výraz pantothenátová biosyntetická cestu zahrnuje biosyntetickou cestu vedoucí k syntéze pantothenátu v mikroorganismech (například in vivo), stejně jako biosyntetickou cestu vedoucí k syntéze pantothenátu in vitro.

Zde používaný výraz mikroorganismus mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu se vztahuje k mikroorganismu majícímu alespoň jeden pantothenátový biosyntetický enzym deregulovaný (například nadměrně expresovaný) (oba výrazy zde definované) tak, že produkce pantothenátu je zvýšena (například v porovnání s produkcí pantothenátu v takových mikroorganismech před deregulací uvedeného biosyntetického enzymu nebo ve srovnání s mkroorganismy standardního typu). Výraz pantothenát zahrnuje volnou kyselinovou formu pantothenátu označovanou také jako kyselina pantothenová a také jakoukoli její sůl (například odvozenou nahražením kyselinového vodíku pantothenátu nebo kyseliny pantothenové kationtem, například vápníkem, sodíkem, draslíkem, amoniem, hořčíkem), která se označuje jako pantothenátová sůl. Výraz pantothenát zahrnuje také alkoholové deriváty pantothenátu. Výhodnými panthotenátovými solemi jsou panthotenát sodný a pantothenát vápenatý. Výhodným alkoholovým derivátem je pantothenol, Pantothenátové soli a/nebo alkoholy podle vynálezu zahrnují soli a/nebo alkoholy připravené běžnými způsoby z volných kyselin podle • · • · · · • · · · · · • · · · ·· · ·· · • ····· ·· 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 vynálezu. V jiném provedeni se pantothenátová sůl syntetizuje přímo mikroorganismem podle vynálezu. Podobně mohou být pantothenátové soli převáděny na formu volné kyseliny pantothenátu nebo na pantothenovou kyselinu o sobě známými způsoby. Výraz pantothenát se zde zkracuje na pan.

S výhodou zahrnují mikroorganismy mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu mikroorganismus mající deregulováný alespoň jeden pantothenátový biosyntetický enzym (například nadměrně expresovaný) tak, še produkce pantothenátu je alespoň 1 g/1. Výhodněji mikroorganismsy mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu zahrnují mikroorganismus mající deregulovaný alespoň jeden pantothenátový biosyntetický enzym (například nadměrně expresovaný) tak, že produkce pantothenátu je alespoň 2 g/1. Ještě výhodněji zahrnují mikroorganismy mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu” mikroorganismus mající deregulovaný alespoň jeden pantothenátový biosyntetický enzym (například nadměrně expresovaný) tak, že produkce pantothenátu je alespoň 1O g/1, 20 g/ 1, 30 g/ 1 , 40 g/ 1 a 50 g/ 1 .

Výraz pantothenátový biosyntetický enzym znamená jakýkoli enzym použitý k vytvoření sloučeniny (například meziproduktu nebo produktu) pantothenátové biosyntetické cestu. Například syntéza pantoátu z of-ketoisovalerátu (<x-KIV) probíhá přes meziprodukt ketopantoát. Tvoření ketopantoátu je katalyzováno pantothenátovým biosyntetickým enzymem PanB nebo ketopantoáthydroxymethy1entransferázou (produktem genu panB). Tvoření pantoátu je katalyžováno pantothenátovým biosyntetickým enzymem PanEI nebo ketopantoátreduktázou (produktem genu panEI). Syntéz β-alaninu z aspartátu je katalyžována pantothenátovým biosyntet i ckým enzymem PanD nebo aspartát-ot-de karboxy 1ázou (poduktem genu panD). Tvoření pantothenátu z pantoátu a z p-alaninu (například kondenzací) je katalyžováno pantothenátovým biosyntetickým enzymem PanC nebo pantothenátsyntetázou (produktem genu panC). Pantothenátové biosyntetické enzymy mohou také mít alternativní funkci jako enzymy HMBPA zde popsané biosyntetické cesty.

Vynález se týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivací mikroorganismu majícího deregulovaný alepoň jeden pantothenátový biosyntetický enzym (například deregulovaný tak, Se je podpořena produkce pantothenátu), přičemž je enzym volený ze souboru zahrnujícího skupinu sestávající z PanB (nebo ketopantoáthydroxymethy1transferáza), PanC (nebo pantothenátsyntetáza) , PanD (nebo aspartát-oř-dekarboxyláza), Pan El (nebo ketopantoátreduktáza). V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího deregulované alespoň dva pantothenátové biosyntetické enzymy, přičemž jsou enzymy voleny ze souboru zahrnujícího například skupinu PanB (nebo ketopantoáthydroxymethyltransferáza), PanC (nebo pantothenátsyntetáza) , PanD (nebo aspartát - or-dekarboxyl áza) a PanEI (nebo kepantotoátreduktáza). V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího deregulované alespoň tři pantothenátové biosyntetické enzymy, přičemž jsou enzymy voleny ze souboru zahrnujícího PanB (nebo ketopantoáthydroxymethy1transferáza), PanC (nebo pantothenátsyntetáza), PanD (nebo aspartát dekarboxyl áza) , Pan El (nebo ketopantoátreduktáza).

V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivací mikroorganismu majícího deregulované alespoň čtyři pantotenátové biosyntetické enzymy, přičemž jsou enzymy voleny ze souboru zahrnujícího deregulovanou PanB (nebo ketopantoáthydroxymethy1transferáza) , PanC (nebo pantothenátsyntetáza), PanD (nebo aspartát-a-dekarboxyláza) Pan El (nebo ketopantoátreduktáza).

V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu mají12 • 4···· 44 44 4 4 cí deregulovanou isoleucin-vallnovou biosyntetickou cestu. Výraz ”isoleucin-valinovová biosyntetická cesta” znamená biosyntetickou cesta zahrnující například isoleucin-valinové biosyntetické enzymy (například polypeptidy kódované geny kódujícími biosyntetický enzym), sloučeniny (například substráty, meziprodukty nebo produkty) a kofaktory, používané k vytváření nebo k syntéze konverse pyruvátu na valin nebo isoleucin. Výraz ”i soleucin-val inová biosyntetická cesta se týká biosyntetické cesty vedoucí k syntéze val inu nebo i soleucinu v mikroorganismech (in vivo) stejně jako biosyntetické cesty vedoucí k syntéze val inu nebo i soleuci nu in vitro.

Výraz mikroorganismus mající deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) cestu zahrnuje mikroorganismus mající alespoň jeden deregulovaný biosyntetický isoleucin-va1 i nový (ilv) enzym (například nadexpresovaný) (oba výrazy zde definované), takže je zvýšena produkce isoleucinu a/nebo val inu a/nebo valinovéhp prekursoru, ot-keto i soval erátu (α-KIV) (například ve srovnání s produkcí isoleucinu a/nebo val inu a/nebo ot-KIV v uvedeném mikroorganismu před deregulací uvedeného biosyntetického enzymu nebo v porovnání s mikroorganismem standardního Na obr. 1 je schéma i soleucin-va1 i nové biosyntetické Biosystetické i soleucin-va1 i nové enzymy jsou vyznačeny plnou kurzivou a jejich odpovídající geny jsou vyznačeny kurzivou. Výraz “i soleucin-val i nový biosyntetický enzym zahrnuje každý enzym použitý ve vytváření sloučeniny (například meziproduktu nebo produktu) i soleucin-val inové biosyntetické cesty. Podle obr. 1, postupuje syntéza val inu z pyruvátu přes meziprodukty, acetolaktát, at, β-di hydroxy i soval erát («,β-DHIV) a a-ketoisovalerát (ot-KIV). Vytváření acetolaktátu z pyruvátu je katalyzováno isoleucin-valinovým biosyntetickým enzymem acetohydroxykyse1 i nová syntetáza (genový produkt ilvBN, nebo typu). cesty.

alternativně genový produkt alsS). Tvoření at,p-DHIV z acetolaktátu je katalyzováno isoleucin-valinovým biosyntetickým enzymem acetohydroxykyselinová isomeroreduktáza (genový produkt • · 9 99 9

9 ·· 9 9 9··· • 9 9 9 · 9

99999 99 99 9 9 • 9999 9999

999999 9 · 9 99 99 ilvC). Syntéza α-KIV z a,/3-DHIV se katalyzuje isoleucin-val inovým biosyntetickým enzymem dihydroxykyselinová dehydratázou (genový produkt ilvD). Kromě toho mohou být valin a isoleucin vzájemně převedeny se svými příslušnými of-ketosl oučen i nam i aminokyse1 i novým i transaminázami s rozvětveným řetězcem. Isoleucin-val i nové biosyntetické enzymy mohou také mít alternativní funkci jako enzymy ve zde popsané HMBPA biosyntetické cestě.

w

I Podle jednoho provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, při kterém se kultivuje mikroorganismus mající alespoň jeden deregulovaný isoleucin-valinový (ilv) biosyntetický enzym (například deregulovaný tak, že je zvýšena produkce val inu a/nebo iso-leucinu a/nebo «-KIV), přičemž je enzym volen například ze souboru zahrnujícího deregulovanou IlvBN, AlsS (nebo acetohydroxyacidsyntetáza, IlvC (nebo acetohydroxykyselinová isomeroreduktáza) a IlvD (nebo dihydroxykysel inová dehydratáza). V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího alespoň dva deregulované isoleucin-valinové (ilv) biosyntetické enzymy volené ze souboru zahrnujícího například deregulovanou IlvBN, AlsS (nebo acetohydroxykyselinová syntetáza), IlvC (nebo acetohydroxykyseli nová isomeroreduktázu) a IlvD (nebo dihydroxykyselinová dehydratáza). V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu majícího alespoň tři deregulované isoleucin-valinové (ilv) biosyntetické enzymy volené ze souboru zahrnujícího například deregulovanou IlvBN, AlsS (nebo acetohydroxykyse1 inová syntetázu), IlvC (nebo acetohydroxykyseli nová isomeroreduktáza) a IlvD (nebo dihydroxykyselinová dehydratáza).

Jak shora uvedeno, zjistilo se, že enzymy pantothenátové biosyntetické cesty a/nebo i soleucin-val i nové (Ilv) cesty mají alternativní aktivitu v syntéze [R]- 3-( 2-hydroxy-3-methylbuty14 ry1ami no)propionové kyseliny (HMBPA) nebo v biosyntetické cestě [R]- 3-(2-hydroxy-3-methylbutyry1amino)propionové kyseliny (HMBPA). Výra2 biosyntetická cesta [R3-3-(2-hydroxy-3-methylbutyrylamino)propionové kyseliny (HMBPA)” zahrnuje alternativní biosyntetickou cestu zahrnující biosyntetické enzymy a sloučeniny (například substráty) tradičně spojené s pantothenátovou biosyntetickou cestou a/nebo s iso1eucin-valínovou (ilv) biosyntetickou cestou používanou při tvorbě nebo sntéze HMBPA. Výraz HMBPA biosyntetcká cesta znamená biosyntet ickou cestu vedoucí k syntéze HMBPA v mikroorganismech (například in vivo), stejně jako biosyntetickou cestu vedoucí k syntéze HMBPA in vitro.

Výrazem HMBPA biosyntetický enzym se rozumí jakýkoli enzym použitý k vytváření sloučeniny (například meziproduktu

Například syntéza of-ketoisovalerátu nebo produktu) HMBPA biosyntetické cesty, kyseliny 2-hydroxy i sova lerové (ct-HIV) z (cť-KIV) je katalyzována genovým produktem panEl nebo panE2 (PanEl je alternativně nazýván ketopantoátreduktáza), nebo je katalyžován genovým produktem ilvC (nazývaným hydroxyacidisomeroreduktáza). Vytváření HMBPA zde též acetoz β-alan i nu a z «-HIV je katalyzováno genovým produktem panC (nazývaným zde též pantothenátsyntetáza).

Výraz “[R]-3-(2-hydroxy-3-methylbutyry1amino)propionová kyselina (HMBPA) zahrnuje volnou kyselinu z HMBPA nazývanou též [R]-3-( 2-hydroxy-3-methylbutyry1ami no)propionát” stejně jako jeho jakoukoli sul (například odvozenou nahražením kyselinového vodíku kyseliny 3-(2-hydroxy-3-methylbutyrylamino)propionové nebo 3-(2-hydroxy-3-methy1butyrylamino)propionátu kationtem například vápníku, sodíku, draslíku, amonia, hořčíku) a nazývou též sůl kyseliny 3-(2-hydroxy-3-methylbutyrylami no)propionové nebo “sůl HMBPA, Výhodnými solemi HMBPA jsou vápenatá sůl HMBPA, nebo sodná sůl HMBPA. Soli HMBPA podle vynálezu zahrnují soli připravené o sobě známými způsoby z vol15

ΦΦΦΦ φφ φφφφ φ φ φ φ φ · φφφφ φφ φ φφ φ φ φφφφφ φφ ·· φ · φ φφφφ φφφφ φφφφφφ φφ φ φφ φφ ných kyselin podle vynálezu. Sůl HMBPA podle vynálezu může být podobně převedena o sobě známými způsoby na formu volné kyseliny 3-(2-hydroxy-3-methylbutyrylamino)propionové nebo na 3-< 2-hydroxy- 3-methyIbutyry1ami no)propionát.

Ve výhodném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantoderivátů (například pantoátu a/nebo pantothenátu), při kterém se kultivuje mikroorganismu majícíc deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu. Výrazem methy1entetrahydrofolátová (MTF) biosyntetická cesta se rozumí biosyntetická cesta zahrnující například biosyntetické enzymy MTF (například polypeptidy kódované geny kódujícími biosyntetický enzym), sloučeniny (například substráty, meziprodukty nebo produkty) a kofaktory, používané k tvorbě nebo syntéze substrátu PanB, MTF. Výraz methylentetrahydrofolátová (MTF) biosyntetcká cesta se týká biosyntetické cesty vedoucí k syntéze MTF in vivo (například v E. coli, jak je naznačeno na obr. 2), stejně jako biosyntetické cesty vedoucí k syntéze MTF in vitro. Výraz ”methylentetrahydrofolátový (MTF) biosyntet i cký enzym zahrnuje jakýkoli enzym použitý k vytváření sloučeniny (například meziproduktu nebo produktu) methylentetrahydrofo1átové (MTF) biosyntetické cesty.

Vynález je založen alespoň zčásti na objevu, že deregulace určitých MTF biosyntetických enzymů vede ke zvýšení produkce MTF. Biosyntetický enzym MTF, u něhož je výsledkem deregulace zvýšená produkce MTF, se nazývá “enzym usnadňující biosyntézu MTF. Například jsou enzymem usnadňujícím biosyntézu MTF jsou genový produkt serA (3-fosfoglycerátdehydrogenáza) a genový produkt glyA (ser inhydroxymethyltransferáza) . Mikroorganismus mající deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu je mikroorganismus mající alespoň jeden deregulovaný enzym usnadňující biosyntézu MTF (například nadexpresovaný) tak, že produkce nebo biosyntéza MTF je zvýšena (například v porovnání s produkcí MTF v uvedeném mikroorganis16 • · · · mu před deregulací uvedeného biosyntetickébo enzymu nebo ve srovnání s mikroorganismem standardního typu).

V jednom provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantosloučenin (například pantoátu nebo pantothenátu), při kterém se kultivuje mikroorganismus mající deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu shora definovanou. V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantosloučenin (například pantoátu nebo pantothenátu), při kterém se kultivuje mikroorganismus mající deregulovaný MTF biosyntézu zvyšující enzym. Ve výhodném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantosloučenin (například pantoátu nebo pantothenátu), při kterém se kultivuje mikroorganismus mající deregulovaný glyA genový produkt (serinhydroxymethy1transferáza) a nebo deregulovaný serA genový produkt (3-fosfog1ycerátdehydrogenáza) .

V ještě jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšené produkce pantothenátu, při kterém se kultivuje mikroorganismus za podmínek volených ke zvýšení rodukce pantothenátu, například kultivací mikroorganismu s nadbytkem šeřinu (substrátu glyA) v prostředí. Výraz nadbytek šeřinu znamená množství šeřinu zvýšené nebo vyšší než obvykle používané při kultivaci uvedených mikroorganismů. Například kultivace mikroorganismu Bacillus popsaná v dalších příkladech se rutinně provádí v přítomnosti šeřinu v množství přibližně v rozmezí O až 2,5 g/1. Tak může být množství šeřinu větší než 2,5 g/1, například přibližně 2,5 až 10 g/1 šeřinu. Nadměrnýn množstvím šeřinu může být více než 5 g/1, například šeřinu přibližně 5 až 10 g/1 prostředí.

V ještě jiném provedení se vynález týká popsaného způsobu kultivace mikroorganismu za podmínek dalšího zvýšení produkce pantothenátu, například zvýšením prekursorů a/nebo meziproduktů pantothenátové biosyntetické cesty a/nebo isoleucin-valino17 • 4 4444

9999 ► ••4 44 vé (ilv) biosyntetické cesty, jak zde definováno (například kultivace mikroorganismů v přítomnosti nadbytku β-alaninu, valinu a/nebo αί-KIV) nebo alternativně za podmínek další modifikace mikroorganismů, aby byly schopny produkovat významné množství /3- a lan inu v nepřítomnosti přísunu p-alaninu (například mikroorganismů nezávislých na p-alaninu, jak je popsáno v americké přihlášce vynálezu 09/09/667 569).

enzym katalýzující (například americká

V ještě jiném provedení se vynález týká další regulace aktivity pantothenátkinázy v kmenech produkujících pantothenát ke zvýšení produkce pantothenátu. Pantothenátkináza je klidový vytváření Coenzymu A (CoA) z pantothenátu přihláška vynálezu díslo 09/09/667 569).

Regulace pantothenátkinázy (například snížení aktivity nebo hladiny pantothenátkinázy) snižuje produkci CoA, podporuje akumulaci pantothenátu. V jednom provedení je aktivita pantothenátk i názy snížena delecí CoaA a snížením aktivity CoaX (CoaA a CoaX jsou oba schopné katalyžovat první stupeň v CoA biosyntéze v některých mikroorganismech). V jiném provedení vynálezu je aktivita pantothenátkinázy snížena vypuštěním CoaX a regulováním CoaA směrem dolů. Ještě v jiném provedení je aktivita pantothenátkinázy snížena regulováním směrem dolů aktivit CoaA a CoaX.

Různé aspekty vynálezu jsou dále podrobně popsány v nás1eduj í c í ch pododstavc í ch.

I. Cílové geny kódující různé pantothenátové a/nebo isoleucin-valinové (ilv) a/nebo methylentetrahydrofoátové (MTF) biosyntetické enzymy

V jednom provedení se vynález týká modifikace nebo zvýšení množství různých biosyntetických enzymů pantothenátové a/ nebo isoleucin-valinové (ilv) a/nebo methylentetrahydrofolátové (MTF) biosyntetické cesty. Vynález se zejména týká modifi18 ·· ·· » · · 4 «··« ·· fr··· • · · · · 4 • · 4 ·· ·· > · · · ·· ·· kace různých enzymatických aktivit spojených s uvedenými cestami, modifikací nebo změnou genů kódujících uvedené biosynteti cké enzymy.

Výraz gen zahrnuje molekulu kyseliny nukleové (například molekulu DNA nebo její segment), která může být v organismu oddělena od jiného genu nebo jiných genů intergenickou DNA (tedy zasahující nebo oddělující DNA, která přirozeně lemuje gen a/nebo odděluje geny v chromosomální DNA organismu). Alternativně může gen lehce překrývat jiný gen (například na 3 konci prvního genu překrývajícího 5 konec druhého genu), překrývající geny od ostatních genů oddělené intergenovou DNA. Gen může řídit syntézu enzymu nebo jiné proteinové molekuly (může například obsahovat kódující sekvence, souvislý otevřený čtecí rámec (ORF), který kóduje protein) nebo může být sám funkční v organismu. V organismu může být gen seskupen do operonu, jak zde definováno, přičemž je takový operon oddělen od ostatních genů a/nebo od operonů intergenovou DNA váný výraz izolovaný gen” se týká genu, který je prost sekvencí, které přirozeně lemují gen v chromosomální DNA organismu, od kterého je gen odvozen (je tedy oproštěn od sousedících kódujících skvencí, které kódují druhý nebo určitý protein, například přilehlou strukturální sekvenci) a obsahuje

Zde použ ív podstatě případně regulační sekvence 5 a 3 , sekvence a/nebo term inátorové sekvence hrnuje izolovaný gen převážně kódující například promotorové V jednom provední zasekvence pro protein (například sekvence kódující proteiny Bacillus). V jiném provedení zahrnuje izolovaný gen kódující sekvence pro protein (například pro protein Bacillus) a přilehlé 5 a/nebo 3 regulační sekvence z chromosomální DNA organismu, ze kterého je gen odvozen (například přilehlé 5 a/nebo 3 regulační sekvence Bacillus). Izolovaný gen obsahuje s výhodou méně než přibližně 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,2 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp nebo 10 bp nukleotidových sekvencí, které přirozeně lemují gen v chromosomální DNA organismu, ze kterého je gen od19

9 · · · • 9 99 • •99 9« 9 99 ·

99999 9 9

9 9 9 9

9999 99 9· 9 • · 9 · «9 vožen .

Výraz operon zahrnuje alespoň dva sousedící geny nebo ORF, případně překrývající v sekvenci při buď 5 nebo 3 konci alespoň jeden gen nebo ORF. Výraz operon zahrnuje koordinovanou jednotku genové exprese, která obsahuje promotor a případně regulační element spojený s jedním nebo s několika přilehlými geny nebo ORF (například strukturální geny kódující enzymy, například biosyntetické enzymy). Exprese genu (například strukturálních genů) může být koordinovaně regulována například regulačními proteiny vázanými na regulační element nebo anti - term inací nebo transkripcí. Geny operonu (například strukturální geny) mohou být transkribovány k získání jediné mRNA, která kóduje všechny proteiny.

standardního typu. mutantní gen kóduje

Zde používané označení gen mající mutaci nebo mutantní gen zahrnuje gen mající nukleotidovou sekvenci, která zahrnuje alespoň jednu alteraci (například substituci, inserci, deleci) takovou, že polypeptid nebo protein kódovaný takovým mutantem vykazuje aktivitu, která se liší od polypeptidu nebo proteinu kódovaného molekulou nebo genem nukleové kyseliny V jednom provedení gen mající mutaci nebo polypeptid nebo protein mající zvýšenou aktivitu ve srovnání s polypeptidem nebo proteinem kódovaným genem standardního typu, například při testování za podobných podmínek (například testován v mikroorganismech kultivovaných při stejné teplotě). Zde používané výraz zvýšená aktivita nebo zvýšená enzymatická aktivita znamená aktivitu, která je alespoň o 5 % větší než aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného molekulou nebo genem nukleové kyseliny standardního typu, s výhodou alespoň o 5 až 10 % větší, výhodněji o nejméně 10 až 25 % větší a ještě výhodněji o nejméně 25-50 %, 50-75 %, nebo 75 až 100 % větší než polypeptidu nebo proteinu kódovaného molekulou nebo genem nukleové kyseliny standardního typu. Mezilehlé rozsahy citovaných hodnot, například 75 až 85 %, 85 až 90 %, 90 až 95 % vynález rovněž zahrnuje. Zde používaný výraz zvýšená aktivita nebo zvýšená enzymatická aktivita může také zahrnovat aktivitu, která je alespoň 1,25 krát větší než aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného genem standardního typu, s výhodou alespoň 1,5 krát větší, výhodněji 2 krát větší a ještě výhodněji alespoň 3 krát, 4 krát, 5 krát, 10 krát, 20 krát, 50 krát, 100 krát větší než aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného genem standardního typu.

V jiném provední gen mající mutaci nebo mutantní gen kóduje polypeptid nebo protein mající sníženou aktivitu ve srovnání s polypeptidem nebo proteinem kódovaným genem standardního typu, například je-li testován za podobných podmínek (například testován v mikroorganismu kulivovaném při stejné teplotě) . Mutantní gen nemusí také kódovat žádný polypeptid nebo může mít sníženou úroveň produkce polypeptidu standardního typu. Výrazem snížená aktivita nebo snížená enzymová aktivita se zde míní aktivita alespoň o 5 % menší než aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného molekulou nebo genem nukleové kyseliny standardního typu, s výhodou alespoň 5 až 10 % nižší, výhodněji o 10 až 25 % nižší a ještě výhodněji o alespoň 25-50 %, 50-75 %, nebo 75 až 100 % nižší než aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného molekulou nebo genem nukleové kyseliny standardního typu. Mezilehlé rozsahy citovaných hodnot, například 75 až 85 %, 85 až 90 %, 90 až 95 % vynález rovněž zahrnuje. Výraz snížená aktivita nebo snížená enzymatická aktivita může také zahrnovat aktivitu, která je vypuštěna nebo knokautována (například přibližně o 100 % menší aktivita než polypeptidu nebo proteinu kódovaného molekulou nebo genem nukleové kyseliny stanardního typu).

Aktivita se dá stanovit podle kterékoli dobře zavedené zkoušky k měření aktivity pčislušného sledovaného proteinu. Aktivita se dá měřit přímo, například měřením aktivity proteinu v surovém buněčném extraktu nebo v izolovaném nebo ve vy21 • 9 9·9·

9999 • 99 9 9

9999 99 ► · 9 9

99 čištěném od buněk nebo mikroorganismů. Alternativně se dá aktivita měřit nebo 2koumat uvnitř buněk nebo mikroorganismů nebo v extrabuněčném prostředí. Například zkoumání mutantního genu (tedy mutantu kódujícího sníženou enzymatickou aktivitu), se může uskutečnit expresováním mutovaného genu v mikroorganismu, například mutantového mikroorgnismu, ve kterém je enzym citlivý na teplotu a zkoumáním mutantního genu z hlediska schopnosti doplnit na teplotu citlivý (Ts) rautant z hlediska enzymatické aktivity. Mutantním genem, který kóduje zvýšenou enzymatickou aktivitu může být gen. který doplňuje Ts mutant účinněji než například odpovídající gen standardního typu. Mutantním genem, který aktivitu je gen, který doplňuje mutant Ts méně například odpovídající gen standardního typu.

kóduje sníženou enzymatickou účinně než

Pracovníkům v oboru je jasné, že i jediná substituce v sekvenci nukleových kyselin nebo genů (například substituce, která kóduje změnu aminokyselin v sekvenci aminokyselin) může dramaticky ovlivnit aktivitu kódovaného polypeptidu nebo proteinu ve srovnání s polypeptidem nebo proteinem standardního typu. Mutantní gen (například kódující mutantový polypeptid nebo protein) zde definovaný, je snadno rozlišitelný od nukleové kyseliny nebo genu kódujícího proteinový homolog v tom, že mutantní gen kóduje protein nebo polypeptid mající změněnou případně pozorovatelný jako rozdílný nebo odlišný v mikroorganismu expresujícím uvedený mutantový gen nebo produkující uvedený mutantový protein nebo polypeptid (tedy mutantový mikroorganismus) ve srovnání s odpovídajícím mikroorganismem produkujícím gen standardního typu. Na rozdíl od toho může mít proteinový homolog stejnou nebo podstatně podobnou aktivitu, případně fenotypicky nerozlišitelnou, je-li produkován v mikroorganismu, ve srovnání s odpovídajícím mikroorganismem expresujícím gen stanardního typu. Podle toho neexistuje například stupeň sekvenční identity mezi molekulami nukleové kyseliny, geny, proteiny nebo polypeptidy, které akt i v i tu, fenotyp * 9 9 · 4r · ·· 9999 • · 9«

9 9 9 99 9 99 9

999 9999 999 9 • 9999 9999

9999 99 99 9 99 99 slouží k rozlišení mezi homology a mutanty, spíše je to aktivita kódovaného proteinu nebo polypeptidu, která rozliš! mezi homology a mutanty; homology mající například nízkou sekvenční identitu (například 30-50% sekvenční identitu), avšak mající v podstatě ekvivalentní funkční aktivity, a mutanty, například vykazující 99% sekvenční identity a mající přesto dramaticky odlišné nebo změněné funkční aktivity.

Pracovníkům v oboru je jasné, že molekuly nukleové kyseliny, geny, proteiny nebo polypepidy pro použití podle vynálezu, mohou být odvozeny z jakéhokoli mikroorganismu majícího MTF biosyntetickou cestu a ilv biosyntetickou cestu nebo pantothenátovou biosyntetickou cestu. Takové molekuly nukleové kyseliny, geny, proteiny nebo polypepidy mohou být pracovníky v oboru identifikovány pomocí známých technik, jako je homologový skríning, porovnání sekvencí a podobných technik a pracovník v oboru je může modifikovat takovou cestou, jako je exprese, nebo produkce těchto molekul nukleové kyseliny, genů, proteinů nebo polypepidů vyskytujících se v rekombinantnim mikroorganismu (například použitím vhodných promotorů, ribosomálnich vazebních míst, expresních nebo integračních vektorů, úpravou sekvence genů tak, že se zvýší transkripce (přičemž se bere v úvahu výhodné použití kodonů), zde popsanými způsoby a technikami známými pracovníkům v oboru.

V jednom provedení jsou geny podle vynálezu odvozeny z Gram pozitivního mikroorganismového organismu (například mikroorganismu, který zadržuje zásadité barvivo, například krystalovou violeť v důsledku přítomností Gram pozitivní stěny obklopující mikroorganismus). Výrazen odvozený z (například odvozený z Gram pozitivního mikroorganismu) se míní gen, který se přírodně nachází v mikroorganismu (například se přírodně nachází v Gram positivním mikroorganismu). Ve výhodném provedení jsou geny podle vynálezu odvozeny z mikroorganismu patřícího do rodu voleného ze souboru zahrnujícího Bacillus, Cornebacteri um *· «·*· ···· (například Cornebacterium glutamicum), Lacbobaci1lus, Laktoceocci a Streptomyces. Ve výhodnějším provedení jsou geny podle vynálezu odvozeny z mikroorganismu rodu Bacillus. V jiném provedení jsou geny podle vynálezu odvozeny z mikroorganismu voleného ze souboru zahrnujícího Bacillus subtilis, Bacillus Lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bac i 11us amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacilluš circulans, Bacillus coagulans, Bacillus 1icheniformis, Bacil lus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus halodurans a jiné skupiny 1 Bacillus species, například charakterizovaného typem íóSrRNA. V jiném výhodném provedení je gen odvozen od Bacillus brevis nebo Bacillus stearothermophilus. V jiném výhodném provední jeou geny podle vynálezu odvozeny z mikroorganismu voleného ze souboru zahrnujícího Bacillus 1 icheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis a Bacillus pum ilus. V jiném výhodném provední jsou geny podle vynálezu odvozeny z mikroorganismu Bacillus subtilis (například je Bacillus subti 1is-odvozený) . Výraz Bacillus subtilis nebo Bacillus subti 1 is-odvozený zahrnuje gen, který se přírodně nachází v mikroorganismu Bacillus subtilis. Do rozsahu vynálezu jsou pojaty geny odvozené od Bacillus (například Bacillus subti 1is-odvozené geny), například Bacillus nebo geny Bacillus subtilis coaX, geny serA, geny glyA, geny coaA, pan geny a/nebo i Iv geny.

V jiném provední jsou geny podle vynálezu odvozeny z Gram negativního mikroorganismu (s vyloučením zásaditých barviv). Ve výhodném provední jsou geny podle vynálezu odvozeny z mi kro organismu patřícího do rodu voleného ze souboru zahrnujicícho Salmonella (například Salmonella typhirauri um), Escheríchia, Klebsiella, Serratia a Próteus. Ve výhodnějí cm provedení jsou geny podle vynálezu odvozeny z mikroorganismu rodu Escheríchia. V ještě výhodnějším provedení jsou geny podle vynálezu odvozeny z Escheríchia coli. V jiném provedení jsou geny podle vynálezu odvozeny ze Saccharomyces (například Saccharomyces cere24

0· «Μ« • » *0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 «

C 0000« · 0

0 0 0 0

0000 0« 00 0 *

«

00*0 visi ae) .

II. Molekuly rekombinantní nukleové kyseliny a vektory

Vynález se také týká molekul nukleové kyseliny (například molekul rekombinantní DNA ), které zahrnují zde popsamé geny (například izolované geny), s výhodou geny Bacillus, výhodněji geny Bacillus subtilis a ještě výhodněji Bacillus subtilis pantothenátové biosyntetické geny a nebo isoleucín-valinové (ilv) biosyntetické geny a/nebo methylentetrahydrofolátové (MTF) biosyntetické geny. Výraz molekuly rekombinantní nukleové kyseliny zahrnuje molekulu nukleové kyseliny (například molekulu DNA), která byla změněna, modifikována nebo konstruována tak, že se liší v nukleotidové sekvenci od nativní nebo přírodní molekuly nukleové kyseliny, ze které byla rekombinantní molekula nukleové kyseliny odvozena (například adicí, delecí nebo substitucí jednoho nebo několika nukleotidů). S výhodou zahrnuje molekula rekombinantní nukleové kyseliny (například molekula rekombinantní DNA) isolovaný gen podle vynálezu operativně navázaný na regulační sekvence. Výraz “operativně navázaný na regulační sekvence znamená, že nukleotidová sekvence sledovaného genu je navázána na regulační sekvenci (sekvence) takovým způsobem, že umožňuje expresi (například zvětšenou, zvýšenou, konstitutivní, bazální, zeslabenou, sníženou nebo potlačenou expresi) genu, s výhodou expresi genového produktu kódovaného genem (například když je molekula rekombinantní nukleové kyseliny začleněna v rekombinantním vektoru, jak je zde definováno a je zavedena do mikroorganismu).

Výraz regulační sekvence zahrnuje sekvence nukleové kyseliny, které ovlivňuji (například modulují nebo reguluji) expresi jiných sekvencí nukleové kyseliny (například genů). V jednom provedení je regulační sekvence zahrnuta v molekule rekombinantní nukleové kyseliny v podobné nebo identické poloze a/nebo orientaci vůči konkrétnímu sledovanému genu, jak je ·· ·· · * 1 • « « ·» <»··* ·· ·«,· « · · s · t « * * * * • · · · · · • · » · > · ·· · ·· ·· »· ·· patrno pro regulační sekvenci a sledovaný gen, jak se vyskytuje v přírodě, například v nativní poloze a/nebo orientaci. Například muže být sledovaný gen zahrnut v molekule rekombinantní nukleové kyseliny operativně vázaný na regulační sekvenci, která doprovází nebo je přilehlá ke sledovanému genu v přírodním organismu (například operativně vázaný na nativní regulační sekvence, například nativní promotor). Alternativně může být sledovaný gen zahrnut v molekule rekombinantní nukleové kyseliny, která doprovází nebo přiléhá k jinému (například odlišnému) genu v přírodním organismu. Alternativně může být sledovaný gen zahrnut do molekuly rekombinantní nukleové kyseliny operativně vázaný na regulační sekvenci z jiného organismu. Například regulační sekvence jiných mikrobů (například jiné bakteriální regulační sekvence, bakteriofágové regulační sekvence a podobné) mohou být operativně vázány na příslušný sledovaný gen.

V jednom provedení je regulační sekvence nenativní nebo přírodně se nevyskytujicí sekvence (například sekvence, která byla modifikována, mutována, substituována, derivována, deletována, včetně sekvencí, které jsou chemicky syntetizovány). K výhodným regulačním sekvencím patří promotory, zesilovače transkripce, terminační signály, anti termínační signály a ostatní expresi řídicí elementy (například sekvence, na které se vážou represory nebo induktory a/nebo vazební místa pro transkr i pčn í a/nebo translační regulační proteiny, například v transkribované mRNA). Takové regulační sekvence jsou popsány například v příručce Sambrook J., Fritsh E.F. a Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. vydání vydavatel Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989. K regulačním sekvencím patří sekvence, které přímo konstitutivně expreují nukleotidovou sekvenci v mikroorganismu (například konstitutivní promotory a silné konstitutivní promotory), které zaměřují indukční expresi u nukleotidové sekvence v mikroorganismu (například ·· ·· • · · · • · · • ··· • * ···· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • * · ·· * ·· »·ο • · · • · · • · · · ·· ·« indukční promotory, například xylózové indukční promotory) a které zeslabuji a potlačují expresi nukleotidové sekvence v mikroorganismu (například atenuační signály nebo represorové sekvence). Do rozsahu vynálezu spadá také regulace exprese sledovaného genu odstraněním nebo delecí regulačních sekvencí. Například sekvence, podílející se na negativní regulaci transkripce, mohou být odstraněny tak, že se zesílí exprese sledovaného genu.

V jednom provedení zahrnuje molekula rekombinantní nukleové kyseliny podle vynálezu sekvenci nukleové kyseliny nebo genu, který kóduje alespoň jeden produkt bakteriálního genu (například pentothenátový biošyntetický enzym, isoleucin-val inový biosyntetický enzym a/nebo methy1entetrahydrofo1átový (NTF) biosyntetický enzym) operativně vázaný na promotor nebo promotorovou sekvenci. K výhodným promotorům podle vynálezu patří promotory Bacillus a/nebo bakteriofágové promotory (například bakteriofág, který infikuje Bacillus). V jednom provedení je promotorem Bacillus s výhodou silný promotor Bacillus (například promotor spojený s provozním genem v Bacillus, nebo gen spojený s g1ykolytickým genem v Bacillus). V jiném provedení je promotorem bakteriofágový promotor. Ve výhodném provedení pochází promotor od bakteríofágu SP01 . V obzvlášť výhodném provedení je promotor volen ze souboru zahrnujícího Pis, Pzď nebo Pveg mající například následující případné sekvence^:

GCT.ATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCA.AAACTGTGCTCAGT ACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGAT CCACGCTGTGTAAAAATnrTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGT GTA.ATAATTTAATTACAGGCGGGGGCA.ACCCCGCCTGTťSEQ ID NO:1). GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGAT GTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCA AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGC AGGACGC (SEQ ID N0:2), a.

GAGG.AATCATAGAATTTTGTCAA.AATAATTTTATTGAC.A.ACGTCTTATTAAC

GTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATA

AATGTAGTGAGGTGGATGCAATG (SEQ ID NOG).

• · · ·

·· · ·

K dalším výhodným promotorům patří tef (translační elongační faktor (TEF) promotor) a pyc (pyruvátkarboxy1ázový (PYC) promotor), který promotuje expresi vysoké úrovně v Bacillus (například Bacillus subtilis). Dalšími výhodnými promotory, například k použití v Gram-positivních mikroorganismech jsou bez záměru na jakémkoliv omezení promotory amy a SP02. Dalšími výhodnými promotory, například k použití v Gram-negativních mikroorganismech jsou bez záměru na jakémkoliv omezení cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, lpp-lac, lacIQ, T7, T5, T3, gal , trc, ara, SP6, lambda-PR, nebo lambda-PL.

V jiném provedení zahrnuje molekula rekombinantní nukleové kyseliny podle vynálezu term inátorovou sekvenci nebo terminátorové sekvence (například transkripční terminátorové sekvence) . Výraz term inátorové sekvence” zahrnuje regulační sekvence, které slouží k term i naci mRNA. Term inátorové sekvence (nebo tandem transkripční terminátory) mohou dále sloužit ke stabilizaci mRNA (například přidáním struktury k mRNA), například proti nukleázám.

V ještě jiném provedení zahrnuje molekula rekombinantní nukleové kyseliny podle vynálezu sekvence, které umožňují detekci vektoru obsahujícího tyto sekvence (například zjistitelné nebo volitelné markéry), například geny, které kódují antibiotické resistanční sekvence nebo které čelí auxotrofním mutacím, například drogové markéry trpC, fluorescenční markéry a/nebo kolorimetrické markéry (například galaktosidáza lacZ//3) . V ještě jiném provedení zahrnuje molekula rekombinantní nukleové kyseliny podle vynálezu umělé ribosomové vazební místo (RBS) nebo sekvenci, která se transkribuje do umělé RBS. Označení umělé ribosomové vazební místo (RBS) zahrnuje místo v molekule mRNA (například kódované DNA), ke kterému se ribosom váže (například počáteční translací), které se liší od nativního RBS (například RBS nacházející se v přírodně se vyskytujícím genu) alespoň jedním nukleotidem. Výhodná umělá RBS zahrnují přibližně 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16,

- 18, 19-20, 21-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30 nebo více nukleotidů, z nichž přibližně 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12,

13-15 nebo více se liší od nativního RBS (například nativní RBS sledovaného genu například nativního panB

RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO:4) nebo nativní panD

RBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG (SEQ ID NO:5)).

S výhodou jsou odlišné nukleotidy substituovány tak, že jsou identické s jedním nebo s několika nukleotidy ideálního RBS když je optimálně seřazen k porovnání. K ideálním RBS patří bez záměru na jakémkoliv omezení

AGAAAGGAGGTGA (SEQ ID N0:6).

TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG (SEQ ID N0:7).

TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG (SEQ ID N0:8).

AG.AAAGGAGGTGANNNTNNNNATG (SEQ ID N0:9), a

AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG (SEQ ID NO:10).

Umělých RBS může být použito k náhradě přírodně se vyskytujících nebo nativních RBS spojených s příslušným genem. Umělé RBS zvyšují s výhodou translaci příslušného genu. Mezi výhodné umělé RBS (například RBS pro zvýšení translace panB, například B-subtilis panB) patří

CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID N0:I1) a

CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 12).

Výhodnými umělými RBS (například RBS pro zvýšení translace panD, například B-subtilis panD) patří TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG (SEQ ID NO: 13). TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG (SEQ ID NO: 14). TTAG.AAAGGAGGTGATTTAAATG (SEQ ID NO: 15). TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG (SEQ IDN0.16),

ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG (SEQ ID N0:17), ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG (SEQ ID N0:l8), a ATTCGTAGA.A.AGGAGGTG.AATTA.ATATG (SEQ ID NO.19).

·· AA

AAA A A • · · A A • · A · A A • A A

AAA A A

Vynález se dále týká vektorů (například rekombinantních vektorů) které zahrnují molekuly nukleové kyseliny (například geny nebo molekuly rekombinantní nukleové kyseliny obsahující uvedené geny) jak je zde popsáno. Výraz rekombinantní vektor znamená vektor (plasmidový, fágový, phasmidový, virový, kosmidový nebo jiný vektor vyčištěné nukleové kyseliny), který byl změněn, modifikován nebo zkonstruován tak, že obsahuje větší, menší nebo odlišné sekvence aminokyselin, než jaké jsou zahrnuty v nativní nebo přírodní molekule nukleové kyseliny, ze které byl rekombinantní vektor odvozen. S výhodou zahrnuje rekombinantní vektor biosyntetický enzym-kódující gen nebo molekulu rekombinantní nukleové kyseliny obsahující uvedený gen, operativně vázaný na regulační sekvence, například promotorové sekvence, terminátorové sekvence a/nebo umělá ribosom vázající místa (RBS) jak zde definováno. V jiném provedení zahrnuje rekombinantní vektor podle vynálezu sekvence, které zvýší replikaci v bakterii (například replikaci zvyšující sekvence). V jednom provedení fungují replikaci zvyšující sekvence v E.coli. V jiném provedení jsou replikaci zvyšující sekvence odvozeny od pRB322.

V ještě jiném provedení obsahuje rekombinantní vektor podle vynálezu antibiotické resistantní sekvence. Výraz ”antibiotické resistantní sekvence zahrnuje sekvence, které podporují nebo udílejí odolnost proti antibiotikům na organismu hostitele (například Bacillus). V jednom provedení jsou antibiotikům resistantní sekvence voleny ze souboru zahrnujícího cat (chloramfenikolu resistantní) sekvence, tet (tetracyklinu resistantní) sekvence, erm (erythromyci nu resistantní) sekvence, neo (neomycinu resistantní) sekvence, kan (kanamycinu resistantní) sekvence, a spec (spektinomycinu resistantní) sekvence. Rekombinantní vektory podle vynálezu mohou dále zahrnovat homologové rekombinantní sekvence (například sekvence konstruované umožňující rekombinaci sledovaného genu v chromosomu hostitelského organismu). Například se může použít sekvencí bpr, vpr, nebo amyE jako homologových cílů pro rekombinaci v hostitelském chromosomu. Pracovníkům v oboru je jasné, že konstrukce vektoru může být volena v závislosti na takových faktorech, jako jsou například volba mikroorgnismu ke genetické konstrukci a množství exprese žádaného genového produktu.

IV. Rekombinantní mikroorganismy

Vynález se týká dále mikroorganismů, tedy rekombinantních mikroorganismů, které obsahují vektory nebo geny (například geny standardn í ho typu nebo mutované geny) zde popsané. Výraz rekombinantní mikroorganismus zahrnuje mikroorganismus (například bakterii, kvasnicovou buňku, houbovou buňku), který je geneticky změněn, modifikován nebo konstruován (například geneticky konstruován) tak, že vykazuje změněný, modifikovaný nebo odlišný genotyp a/nebo fenotyp (například když genetická modifikace ovlivní kódovací sekvence nukleové kyseliny mikroorganismu) v porovnání s přírodně se vyskytujícím mikroorganismem, ze kterého byl odvozen.

V jednom provedení je rekombinantní mikroorganismus podle vynálezu Gram positivní organismus (například mikroorganismus, který zadržuje zásadité barvivo, například krystalovou violeť v důsledku Gram-positivní stěny obklopující mikroorganismus). Ve výhodném provedení je rekombinantním mikroorganismem mikroorganismus patřící k rodu voleném ze souboru zahrnujícího Bacillus, Cornebacteri um (například Cornebacteri um glutamicum) , Lactobaci 11us, Lactococci a Streptomyces. Ve výhodnějším provedení je rekombinantní mikroorganismus

V jiném výhodném provedení je rekombinantní volen se souboru zahrnujícího Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantotbenticus, Bacillus amy1oliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus 1icheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, rodu Bac i 11us. m i kroorgan i smus • · • · · 9

9 9 • 9 9 9 · ·

»999 9· ·· ·9·9

Bací 11us halodurans a dalši skupiny 1 Bacillus species, například charakterizovaného typem 16SrRNA. V jiném výhodném provedení je rekombinantní mikroorganismus Bacillus brevis nebo Bacillus stearothermophi 1us. V jiném výhodném provedení je rekombinantni mikroorganismus volen ze souboru zahrnujícího skupinu, kterou tvoří Bacillus 1icheniformis, Bacillus amyloliquefaceins, Bacillus subtilis a Bacillus pumilus.

V jiném provedení je rekombinantní mikroorganismus Gram negativní organismus (s vyloučením zásaditého barviva). Ve výhodném provedení je rekombinantní mikroorganismus mikroorganismus patřící do rodu voleného ze souboru zahrnujícího Salmonella (například Salmonella typhimuri um), Escherichia, Klebsiella, Serratia a Próteus. Ve výhodnějším provedení je rekombinantní mikroorganismus rodu Escherichia. V ještě výhodnějším provedení je rekombinantní mikroorganismus Esterichi a coli. V jiném výhodném provedení je rekombinantní mikroorganismus Saccharomyces (například Saccharomyces cerevisiae).

Výhodný ''rekombinantní mikroorganismus podle vynálezu je mikroorganismus mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu nebo enzym, deregulovanou isoleucino-valinovou (ilv) biosyntetickou cestu nebo enzym a/nebo modifikovanou nebo deregulovanou methylentetrahydrofolátovu (MTF) biosyntetickou cestu nebo enzym. Výraz deregulováný nebo deregulace znamená alteraci nebo modifikaci alespoň jednoho genu v mikroorganismu, který kóduje enzym v biosyntetické cestě takovou, že hladina nebo aktivita biosyntetického enzymu v mikroorganismu je měněn nebo modifikován. S výhodou alespoň jeden gen, který kóduje enzym v biosyntetické cestě, je měněn nebo modifikován tak, ěe genový produkt je zvýšen nebo zvětšen. Výraz *’deregul ováná cesta můěe také zahrnovat biosyntetickou cestu ve které je jeden gen, který kóduje enzym, v biosyntetické cestě měněn nebo modifikován. Schopnost deregulovat cestu (například současně deregulovát více než jeden gen

• 4 · ·· ··· · • 4 v dané b i osyntet i cké cestě) v m i kroorgn i sinu v některých případech pochází ze zvláštního jevu mikroorganismu, ve kterém jsou více než jeden enzym (například dva nebo tři biosyntetické enzymy) kódovány geny vyskytujícími se vedle sebe na souvislém kusu genetického materiálu nazývaném “operon definovaný výše), Vzhledem ke koordinované regulaci genů, obsažených v operonu, může být výsledkem alterace nebo modifikace jediného promotoru a/nebo regulačního elementu alterace nebo modifikace exprese každého genového produktu kódovaného operonem. Alterace nebo modifikace regulačního elementu může zahrnovat bez záměru na jakémkoliv omezení odstranění endogenního promotoru a/nebo regulačního elementu (elementů) přidáním silných promotorů, indukčních promotorů nebo násobných promotorů nebo odstranění regulačních sekvencí takových, že exprese genových produktů je modifikována modifikováním chromosomální polohy opberonu, alteraci sekvenci nukleových kyselin, sousedících s operonem nebo uvnitř operonu tak jako ribosomové vazební místo, zvětšení počtu kopií operonu, modifikací proteinů (například regulačních proteinů, supresorů, zesilovačů a trankripčních aktivátorů) zahrnutých v transkripci operonu a/nebo translaci genového produktu operonu nebo kterýchkoli jiný konvenční prostředek deregulující expresi genů rutinně v oboru (včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení k použití antimediátorových molekul nukleové kyseliny, například k blokování exprese represorových proteinů). Deregulace může také vyvolat alteraci kódovací oblasti jednoho nebo několika genů k poskytnutí například jednoho enzymu, který je zpětně resistantní nebo má vyšší nebo nižší specifickou aktivitu.

V jiném vhodném provedení je rekombinantní mikroorganismus konstruován tak, že nadměrně expresuje alespoň jeden pantothenátový biosyntetický enzym, alespoň jeden isoleucin-valinový biosyntetický enzym a/nebo alespoň jeden MTF biosyntetický enzym. Výraz nadměrně expresuje nebo nadměrná exprese zahrnuje expresi genového produktu (například biosyntetíckého en33 •4 44 » 4 4 4

4 4

444 •· 4444 zymu) při ve větším množství, než je expresované množství před manipulaci mikroorganismu nebo v porovnatelném mikroorganismu, se kterým nebylo manipulováno. V jednom provedení může být mikroorganismus geneticky konstruován k nadměrné expresi genového produktu ve srovnání s expresí v porovnatelném mikroorganismu, který nebyl konstruován.

Genové inženýrství může zahrnovat, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, alterování nebo modifikování regulačních sekvencí nebo míst souvisejících s expresí příslušného genu (například přidáním silných promotorů, indukovatelných promotorů nebo násobných promotorů nebo odstraněním regulačních sekvencí tak, že exprese je konstitutivní), modifikování chromosomálního umístění příslušného genu, měněním sekvencí aminokyselin přiléhajících k příslušnému genu jako je ribosomové vazební místo, zvětšováním počtu kopií příslušného genu, modifikováním proteinů (například regulačních proteinů, supresorů, zesilovačů, transkripdních aktivátorů) podílejících se na transkripci příslušného genu a/nebo translaci příslušného genového produktu, nebo mohou jiné konvenční prostředky deregulace exprese příslušného genu rutinně v oboru (včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení použití antimédiátorové molekuly nukleové kyeliny, například k blokováni exprese represorových proteinů). Genové inženýrství může také zahrnovat deleči genu, například k blokování cesty nebo k odstranění represoru.

V jiném provední se může s mikroorganismem fyzicky nebo vlivem prostřdi manipulovat k nadměrné expresi množství genového produktu většího než expresované množství před manipulací mikroorganismem nebo v porovnatelném mikroorgnismu, se kterým se nemanipulovalo. Například může být mikroorganismus zpracován nebo kultivován v přítomnosti známého činidla nebo podezřelého, že zvyšuje transkripci příslušného genu a/nebo translaci příslušného genového produktu tak, že transkripce a/nebo • 4 444 ·

99 · • · ·

·· translace jsou usnadněny nebo zvětšeny. Alternativně se může mikroorganismus kultivovat při teplotě volené ke zvýšení transkripce příslušného genu a/nebo translace příslušného genového produktu tak, ěe transkripce a/nebo translace jsou zvýšeny nebo zvětšeny.

V. Kultivace a fermentování rekombinantních mikroorganismů

Výraz kultivace znamená udržování a/nebo růst živého mikroorganismu podle vynálezu (například udržování a/nebo růst kultury nebo kmene). V jednom provedení se mikroorganismus podle vynálezu kultivuje v kapalném prostředí. V jiném provedení se mikroorganismus podle vynálezu kultivuje v pevném prostředí nebo v polopevném prostředí. Ve výhodném provedení se mikroorganismus podle vynálezu kultivuje v prostředí (například sterilní, kapalné prostředí) obsahujícím živiny potřebné nebo vhodné k udržení a/nebo k růstu mikroorganismu (například zdroje uhlíku nebo uhlíkového substrátu, například uhlohydráty, uhlovodíky, oleje, tuky, mastné kyseliny, organické kyseliny a alkoholy; zdroje dusíku, například pepton, kvasnicový extrakt, masný extrakt, sladový extrakt, sohjová živná půda, sojová mouky, sojová drť, močovina, síran amonný, chlorid amonný, amoniumnitrát, a fosforečnanu amonný; zdroje fosforu, například kyselina fosforečná, její sodné nebo draselné soli; stopové prvky například sole hořčíku, železa, manganu, vápníku, mědi, zinku, bóru, molybdenu a/nebo kobaltu; stejně jako růstové faktory jako jsou například aminokyse1 iny, vitaminy, podporovače růstu).

S výhodou se mikroorganismy podle vynálezu kultivují při řízené hodnotě pH. Výraz řízená hodnota pH“ zahrnuje jakoukoli hodnotu pH, která vede k produkci žádaného produktu (například pantoát a/nebo pantothenát). V jednom provedení se mikroorganismus kultivuje při hodnotě pH 7. V jiném provedení se mikroorganismus kultivuje při hodnotě pH v rozmezí 6,0 až 8,5.

99 • 9 9 9

9 9

999

9 •999 99 ··»·

99 9

I 9 9 ( • 9 99

Požadovaná hodnota pH se může udržovat řadou způsobů známých pracovníkům v oboru.

S výhodou se mikroorganismy podle vynálezu kultivují při řízené aeraci. Výraz řízená aerace” zahrnuje dostatečné provzdušnění (například kyslíkem) které vede k produkci žádaného produktu (například pantoát a/nebo pantothenát). V jednom provedení je aerace řízena regulací obsahu kyslíku v kultuře, například regulováním množství kyslíku rozpuštěného v kultivačním prostředí. S výhodou se aerace kultury řídí mícháním kultury. Míchání může zajišťovat vrtulka nebo podobné mechanické míchadlo, otáčení nebo protřepávání kultivační nádoby (zkumavky nebo baňky) nebo různá čerpací zařízení. Provzdušnění se může také řídit probubláváním sterilního vzduchu nebo kyslíku prostředím (například fermentační směsí). Také se s výhodou mikroorganismy podle vynálezu kultivují bez nadbytečného pěnění (například přísadou proti pěn i cích činidel).

Kromě toho se mikroorganismy podle vynálezu kultivují za řízených teplot. Označení řízená teplota vyjadřuje jakoukoli teplotu, která vede k produkci žádaného produktu (například pantoátu a/nebo pantothenátu). V jednom provedení zahrnuje řío c zená teplota teploty v rozmezí 15 C až 95 C. V jiném proveB O dění jde o teploty v rozmezí 15 C až 70 C. Výhodné teploty

Β B jsou v rozmezí 20 až 55 C, výhodněji v rozmezí 30 až 50 C.

Mikroorganismy se mohou kultivovat (tedy udržovat nebo růst) v kapalném prostředí a s výhodou se kultivují spojitě nebo přerušovaně běžnými kultivačními způsoby, jako je kultivace stáním, ve zkumavce, za protřepávání (například rotační protřepávání, kulura v třepačce) kultivace za provzdušňování otáčením nebo fermentace. Ve výhodném provedení se mikroorganismy kultivují v třepačce. V jiném výhodném provedení se mikroorganismy kultivují ve fermentoru (například fermentační proces). K fermentačním způsobům podle vynálezu patří, bez zá·· •9 ·9«9

• · • · 9 • · 9

99 měru na jakémkoliv omezení, procesy po dávkách, batch, fed-batch” nebo batch fermentati on . Označení batch process nebo batch fermentation znamená systém, ve kterém sestava například prostředí, živin a doplňujících aditivů je dodána na začátku fermentace a během fermentace se nemění), mohou však existovat pokusy řídit některé faktory, jako je hodnota pH a koncentrace kyslíku, aby se zabránilo nadměrnému okyselení prostředí a/nebo umrtvení mikroorgnisrnu. Výraz fed-batch process nebo “fed-batch fermentace znamená fermentaci po dávkách s tou výjimkou, že se přidává jeden nebo několik substrátů nebo doplňků (například přidávaných po dávkách nebo průběžně) během průběhu fermentace. Označení continous process nebo continous fermentation popisuje systém, ve kterém se do fermentoru přivádí definované fermentační prostředí průběžně a stejné množství použitého nebo kondiciováného prostředí se současně odebírá s výhodou k získání žádaného produktu (například pantoátu a/nebo pantothenátu). Byly vyvinuty různé způsoby takových procesů a jsou v oboru dobře známy.

Výraz kultivace za takových podmínek, kterými se vyrobí žádaná sloučenina znamená udržování a/nebo růst mikroorganismu za podmínek (například teploty, tlaku, pH, trvání) vhodných nebo postačujících k získání produkce žádané sloučeniny nebo k získání žádaných výtěžků příslušné vyráběné sloučeniny. Například kultivace probíhá po dobu postačující k vyrobení žádaného množství sloučeniny (například pantoátu a/nebo pantothenátu) . S výhodou kultivace pokračuje po dobu postačující k podstatnému dosažení vhodné produkce sloučeniny (například po dobu postačující k dosažení vhodné koncentrace pantoátu a/ nebo pantothenátu nebo vhodného poměru pantoátu k pantothenátu HMBPA). V jednom provedení probíhá kultivace přibližně 12 až 24 hodin. Podle jiného provedení 24 až 36 hodin, 36 až 48 hodin, 48 až 72 hodin, 72 až 96 hodin, 96 až 120 hodin, 120 až 144 hodin nebo déle než 144 hodin. Ještě v jiném provedení se mikroorganismy kultivují za podmínek, že se vyrobí sloučeniny ·· «« • · » · • · « • ·«♦ • * • ·«* «« ·« ··»» ·* ·»»· • · « · • · • · · alespoň přibližně 5 až 10 g/1 za přibližně 36 hodin, alespoň přibližně 1O až 20 g/1 za přibližně 48 hodin nebo alespoň přibližně 20 až 30 g/1 za přibližně 72 hodin. Ještě v jiném provedení se mikroorganismy kultivují za podmínek, že se vyrobí sloučeniny alespoň přibližně 5 až 20 g/1 za přibližně 36 hodin, alespoň přibližně 20 až 30 g/1 za přibližně 48 hodin nebo alespoň přibližně 30 až 50 nebo 60 g/1 za přibližně 72 hodin. Ještě v jiném provedení se mikroorganismy kultivují za podmínek, že se vyrobí sloučeniny alespoň přibližně 40 až 60 g/1 za přibližně 36 hodin nebo alespoň přibližně 60 až 90 g/1 za přibližně 48 hodin. Pracovníkům v oboru je jasné, že uvedené hodnoty jsou horními mezemi dosažitelnými popisovanými způsoby, například v parciální fermentaci probíhající se zvlášť konstruovaným kmenem.

Způsob výroby podle vynálezu vede s výhodou k produkci množství pantothenátu, které je zvýšené ve srovnání s přiměřeným řízením. Výraz přiměřené řízení (appropriate control) zahrnuje jakékoli řízení pracovníkem v oboru považované jako vhodné pro určení usnadněné, podpořené nebo zvýšené výroby žádaného produktu. Například v případě kultivace mikroorganismu majícího deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu a dále deregulovanopu MTF biosyntetickou cestu (tedy konstruovaného tak, že alespoň jeden MTF biosyntetický enzym je deregulován, například nadměrně expresován) zahrnuje přiměřené řízení kultivaci mikroorganismu před manipulací nebo bez manipulace MTF enzymu nebo cesty (tedy mající pouze deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu). Podobně v případě kultivace mikroorganismu majícího deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu a deregulovanou ilv biosyntetickou cestu (je mikroorganismus konstruován tak, že alespoň jeden MTF biosyntet ický enzym je deregulován, například nadměrně expresován) a přiměřené řízení zahrnuje kultivaci mikroorganismu před manipulací nebo bez manipulace MTF enzymu nebo cesty (tedy mající deregulovanou pouze pantothenátovou biosyntetickou cestu • 0*0 • 00

000 0

0« • 0

0

0 0

0 • 00 0 •

0 0 0 a ilv biosyntetickou cestu). Porovnání není nutné provádět v každém procesu podle vynálezu. Například pracovník v oboru může stanovit přiměřené řízení empiricky z provádění řady reakcí (například kultivace ve zkumavce, kultivace v třepačce, fermentace), například za stejných nebo podobných podmínek.

, Tím, že určí rutinní úroveň produkce, například příslušného kmene, je pracovník v oboru schopen rozeznat úrovně, které _u jsou usnadněné, zesílené nebo zvýšené oproti takovým úrovním.

Jinými slovy, porovnání přiměřeného řízení zahrnuje porovnání s předem určenými hodnotami (například předem určené řízení).

Tudíž v provedení, kde vhodně konstruovaný kmen produkuje pantothenátu 40 g/l za 36 hodin (před manipulací takovou, že je produkce pantothenátu zvýšena), produkce pantothenátu 50, 60, 70 nebo více g/l (po manipulaci, například manipulaci takové, že alespoň jeden biosyntetický enzym MTF je nadměrně expresován) je příkladem zesílené produkce. Podobně v provedení, kde vhodně konstruovaný kmen produkuje pantothenátu 50 g/l za 48 hodin (před manipulací takovou, že produkce pantothenátu je zesílena) je produkce pantothenátu 60, 70, 80, 90 nebo více g/l (po manipulaci, například takové, že alespoň jeden biosyntet ický enzym MTF je nadměrně expresován) je příkladem zesílené produkce.

Metodika vynálezu může dále zahrnovat stupeň vytěžení žádané sloučeniny (například pantoátu nebo pantothenátu). Výraz vytěžení (recovering) žádané sloučeniny zahrnuje extrakci, sklizeň, izolaci nebo vyčištění sloučeniny od kultivačního prostředí. Vytěžení sloučeniny lze provádět jakýmkoliv způsobem izolace nebo čištění o sobě známým v oboru, včetně, avšak bezáměru na jakémkoliv omezení, zpracováním vhodnou pryskyřicí (například anexovou nebo katexovou pryskyřicí, neiontovou adsorpční prysykřicí) zpracováním běžným adsorbentem (například aktivním uhlím, kyselinou křemičitou, silikagelem, celulózou, oxidem hlinitým), měněním hodnoty pH, extrakcí rozpouštědlem ·♦ ··#· ··*« • Φ « 9

9

Φ· • 9 9

Φ •

• ΦΦ Φ • Φ • Φ ♦ 9

999

Φ

Φ Φ 9

9 9

9 9 «

(například běžným rozpouštědlem jako je alkohol, ethylacetát a hexan), dialýzou, filtrací, koncentrací, krysta1 izací, rekrystalizací, nastavením hodnoty pH, lyofi 1izací) . Například může být sloučenina vytěžena z kultivačního prostředí napřed odstraněním mikroorganismu z kultivačního prostředí. Prostředí se pak vede přes katexovou pryskyřici nebo nad ní k odstranění kat iontů a pak přes anexovou prysykyřici nebo nad ní k odstraněni anorganických aniontů a organických kyselin majících silnější kyselost než sledované sloučenina. Výsledná sloučenina pak může být převedena na sůl (například vápenatou sůl). jak zde popsáno.

S výhodou je žádaná sloučenina podle vynálezu extrahována, izolována a čištěna tak, že výsledný produkt je v podstatě prostý ostatních složek prostedí (například prostý od sloučenin prostředí a/nebo produktů fermentace). Výraz v podstatě prosté od ostatních složek prostředí” zahrnuje přípravu sloučeniny, ve které je sloučenina oddělena od složek prostředí nebo od vedlejších produktů fermentace kultury, ze které se vyrábí. V jednom provedení má přípravek více než přibližně 80 % (suché hmotnosti) žádané sloučeniny (například méně než přibližně 20 % ostatních složek prostředí nebo fermentačních vedlejších prouduktů), výhodněji více než přibližně 90 % žádané sloučeniny (například méně než přibližně 10 % ostatních složek prostředí nebo fermentačních vedlejších prouduktů), ještě výhodněji více než přibližně 95 % žádané sloučeniny (například méně než přibližně 5 % ostatních složek prostředí nebo fermentačních vedlejších prouduktů) a nejvýhodněji více než přibližně 98 až 99 % žádané sloučeniny (například méně než přibližně 1 až 2 % ostatních složek prostředí nebo fermentačních vedlejších prouduktů). Pokud se má žádaná sloučenina převedět na sůl, je sloučenina s výhodou dále zbavena chemických nečistot spojených s vytvářením soli. Byla-li sloučenina der i vat izována na alkohol, je sloučenina s výhodou dále zbavena chemických nečistot spojených s vytvářením alkoholu.

»· *··« ·· «···

*

V alternativním provedení není žádaná sloučenina čištěna od mikroorganismů, například když mikroorganismus není biologicky nebezpečný (a je tedy bezpečný). Například může být celá kultura (nebo její supernatant) použita jako zdroj produktu (například jako surový produkt). V jednom provedení je kultury nebo jejího supernatantu použito bez modifikace. V jiném provedení jsou kultura nebo její supernatant koncentrovány. Ještě v jiném provedení jsou kultura nebo její supernatant sušeny a 1yof i 1 i zovány.

V jiném provedení je žádaná sloučenina částečně čištěna. Výraz částečně čištěna zahrnuje prostředí, které mělo být alespoň částečně zpracováno, například zpracováním (například po dávkách) komerční pryskyřicí. Ve výhodném provedení má prostředek částečně vyčištěný více než přibližně 30 % (suché hmotnosti) žádané sloučeniny, s výhodou více než přibližně 40 % žádané sloučeniny, výhodněji více než přibližně 50 % žádané sloučeniny, ještě výhodněji více než přibližně 60 % žádané sloučeniny, a nejvýhodněji více než přibližně 70 % žádané sloučeniny. Částečně vyčištěné prostředky mají také s výhodou 80 % nebo méně (suché hmotnosti) žádané sloučeniny (jsou tedy méně čisté než extrahované”, isolované” nebo vyčištěné prostředky jak shora definováno.).

V závislosti na biosyntetickém enzymu nebo kombinaci biosyntet i ckých manipulovaných enzymů, může být žádoucí nebo nutné poskytnout (například zavést) mikroorganismus podle vynálezu s alespoň jedním biosyntetickým prekurzorem jako je žádaná sloučenina nebo vyráběná sloučenina. Výraz biosyntetický prekursor nebo prekursor zahrnuje činidlo nebo sloučeninu, která, je-li tak opatřena, se zavádí do styku nebo je začleněna do kultivačního prostředí mikroorganismu, slouží k usnadnění nebo zvýšení biosyntézy žádaného produktu. V jednom provedení je biosyntetickým prekursorem nebo prekursorem aspartát. V jiném provedení je biosyntetickým prekursorem nebo prekurso41 •· ·· • ·« « • · · • ··· • · ···· ·» ·« « · • · • · • · ·· ···« ·· ·· ···· • · • * • * • » · • a rem β-alanin. Množství přidaného aspartátu nebo p-alaninu je množství vycházející z koncenrace v kultivačním prostředí postačující ke zvýšení produktivity mikroorganismu (například koncentrace postačující ke zvýšení produkce pantoátu nebo pantothenátu) . Biosyntetické prekursory podle vynálezu se mohou přidávat ve formě koncentrovaného roztoku nebo suspense (například ve vhodném rozpouštědle, jeko je voda nebo pufr) nebo v pevné formě (například ve formě prášku). Kromě toho se mohou biosyntetické prekursory podle vynálezu přidávat jako jediný podíl, průběžně nebo přerušovaně v daném časovém období. Výraz nadměrný /3-alanin znamená obsah β-alaninu zvýšený nebo vyšší, než se rutinně používá ke kultivací příslušného mikroorganismu. Například kultivace mikroorganismů Bací 11us popsaná v dalších příkladech se rutinně provádí v přítomnosti £3-alaninu přibližně 0-0,01 g/1. Podle toho může nadbytek β-alaninu dosahovat přibližně 0,01 až 1, s výhodou 1 až 20 g/1.

V ještě jiném provedení je biosyntetickým prekursorem valin. Ještě v jiném provedení je biosyntetickým prekursorem cť-keto i sova 1 erát. Valin nebo ot-ketoisovalerát se přidává v množství, které vede ke koncentraci v prostředí postačující k produkci žádaného produktu (například pantoátu nebo pantothenátu. Výraz nadbytek ot-KIV zahrnuje zvýšené množství ot-KIV nebo vyšší, než se obvykle používá ke kultivaci příslušného mikroorganismu. Například při kultivaci mikroorganismu Bacillus, popsané v příkladech, je s výhodou koncentrace ot-KIV 0 až 0,01 g/1. Podle toho může nadbytkem ot-KIV být přibližně 0,01 až 1 , s výhodou přibližně 1 až 20 g/1. Výraz nadměrný valin” se týká zvýšených možství val inu nebo vyššího množství než se obvykle používá ke kultivaci příslušného mikroorganismu. Například při kultivaci mikroorganismu Bacillus v dalších příkladech se rutinně používá val inu přibližně 0-0,5 g/1. Nadbytkem val inu se proto míní množství val inu přibližně 0,05 až 5 g/1, s výhodou přibližně 5 až 20 g/1.

• ·· · • ····« · · · · · 9 ···· · · 9 · ······ ·· · · · 99

V ještě jiném provedení je biosyntetickým prekursorem serin. Serin se přidává v množtví, které vede ke koncntraci v prostředí postačující k výrobě žádaného produktu (například pantoátu a/nebo pantothenátu). Definovaný nadbytek šeřinu se také může přidávat při způsobu podle vynálezu například ke zvýšení produkce pantothenátu. Pracovníkům v oboru je jasné, še extremní nadbytek biosyntetického prekursoru může vést k toxicitě mikroorganismu. Biosyntetické prekursory se zde uvádějí jako doplňující biosyntetické substráty.

Vynález se dále týká biotransformačních procesů, při kterých se používá »iikroorganisibus podle vynálezu. Výraz biotransformační proces je zde označován také jako biokonversní proces a zahrnuje biologické procesy, které vedou k produkci (například transformaci nebo konversi) příslušných substrátů a/nebo meziproduktů na žádaný produkt.

Mikroorganismy a/nebo enzymy používané k biotransformační reakci jsou ve formě, která jim umožňuje provádět jejich záměrnou funkcí (například produkovat žádanou sloučeninu). Mikroorganismy mohou tvořit úplné buňky, nebo to mohou být části buněk potřebné k získání konečného výsledku. Mikroorganismus může být suspendován (například ve vhodném roztoku jako je pufrový roztok nebo prostředí), vyplachován (například vyplachován z kultivace mikroorganismu), sušen acetonem, imobilizován (například polyakry1amidovým gelem nebo karageenanem nebo na syntetických nosičích, například na perlách, na matricích) fixován, zesítěn nebo permeabi1izován (například mající permeabilizované membrány a/nebo stěny, takže sloučeniny, například substráty, meziprodukty nebo produkty mohou snadněji procházet membránou nebo stěnou).

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

····

9 9 99 9 • 9 9 9 9 9 ·· · · 9 9 • · · · · ····

999··· 9 9 9 99 99

Příklady provedeni__vynálezu

Příklad 1

Pantosloučeninové produkční kmeny

Při vývoji kmenu Bací 11us k výrobě pantothenátu se provádějí různé genetické manipulace s geny a s enzymy účastnícími se v pantothenátové biosyntetické cestě a i soleucin-va1 i nové (ilv) cestě (obr. 1), jak je to popsáno v americké přihlášce vynálezu číslo 09/400 494 a 09/667 569. Například kmeny, mající deregulovaný panBCD operon a/nebo mající deregulovaný panEl, vykazují zlepšenou produkci pantothenátu (jsou-li kultivovány v přítomnosti β-alaninu a a-ketoisovalerátu («-KIV)), Kmeny dále deregulováné pro ilvBNC a ilvD vykazují zvýšenou produkci pantothenátu v přítomnosti pouze β-alaninu. Kromě toho je možno získat β-alaninovou nezávislost další deregulací panD).

Příkladem pantothenátového produkčního kmenu je PA824, tryptophan prototroph, Spec a Tet resistantní, deregulovaný pro panBCD a panBCD lokus, deregulovaný pro panEl a panEl lokus (dva geny v genomu B subtilis jsou homologové vůči E,coli panE, panEl a panE2, přičemž první z nich kóduje hlavní ketopantoátovou reduktázu, zahrnutou v produkci pantothenátu, zatímco panE2 k syntézi pantothenátu nepřispívá (americká přihláška vynálezu číslo 09/400 494), deregulovaný pro ilvD a ilvD lokus, nadměrně expresující kazetu ilvBNC a amyE lokus, a nadměrně expresující panD a bpr lokus. PA824 rutinně poskytuje pantothenátu přibližně 40 až 50 g/1 při kultivaci 48 hodin ve 14 1 fermentační nádrži podle standardního fermentačního postupu (například americká přihláška vynálezu 60/263 053 nebo americká přihláška vynálezu 60/262 995. Dávka prostředí (4,5 1), obsahující stopové prvky se naočkuje kulturami PA824 ze o

třepačky. Fermentace se řídí teplotou (například 43 C), roz44

44··

4444

44444 44 44 4 4

4444 4444

444444 44 4 44 44 puštěnmým kyslíkem a hodnotou pH a probíhá jako proces po dávkách s omezeným přívodem glukózy. Po počátečním spotřebování glukózy je koncentrace glukózy udržována v rozmezí 0 až 1 g/1 za trvalého přívodu čerstvého prostředí FEED. Hodnota pH se nastaví na 7,2, sleduje se a udržuje přívodem roztoku amoniaku nebo kyseliny fosforečné. Koncentrace rozpuštěného kyslíku [pOa1 se udržuje na přibližně 10 až 30 % regulací míchání a , provzdušnění. Pěnění se řídí přísadou vhodného proti pěnicího činidla. Pantothenátový titr ve fermentační půdě se stanoví (analýzou HPLC) po odstranění buněk odstředěním.

Druhým příkladným kmenem je PA668. PA668 je derivátem PA824, který obsahuje kopie P2epatnB zesílený v místě vpr a/nebo panB. PA668 je konstruován za použití panB expresního vektoru (pAN636), který umožňuje selekci vícenásobných kopií za pomoci chloramfeni kolu. Restrikční fragment pAN636 Notl (s vyloučením vektorových sekvencí) je vázán a pak použit k transformaci PA824 selekcí na destičkách obsahujících 5 pg/ml chloramfenikolu. Produkty transformace odolné chloranfenikolu 30 Mg/ml se izolují a skrínují se pro produkci pantothenátu ve 48-hodinových zkumavkových kulturách. Isoláty produkují přibližně o 10 % více pantothenátu než PA824. V 10-1 fermentacích produkuje první kmen PA668-2A pantothenát v množství porovnatelném s PA824 kultivovaným za podobných podmínek (například přibližně 45-50 g/1 při 36 hodinách). Po 36 hodinách se produkce pan« tothenátu začíná zpomalovat s PA824, PA668-2A pokračuje v produkci významného množství pantothenátu (například pantothenátu přibližně 60 až 65 g/1 za 48 hodin). Druhý kmen, PA668-24 produkuje pantothenát ještě rychleji a dosahuje pantothenátu 60 až 70 g/1 po 48 hodinách.

Třetí produkční kmen PA721B-39 je konstruován k dalšímu obsahu zesi 1ovate1 né kazety PzepanBpanD takto: Napřed se zkonstruuje samotná expresní kaseta, která je schopná integrovat jak panB tak panD v místě bpr. Kombinování obou genů do jedné ·· φ φ · · φφφ φ φ expresní kazety zjednodušuje výsledný kmen vyloučením markéru antibiotické resistance. Expresní kazeta PzepanBpanD je konstruována tak, že obsahuje obě dvě různá vazební místa panD ribosomu (RBS byl dříve syntetizován a testován způsobem popsaným ve světovém patentovém spise číslo WO 01/21772 a v americké přihlášce vynálezu číslo 60/262 995). Kazeta dále obsahuje ribosomové vazební místo syntetického panB genu (RBS1), ale konstrukce umožňuje další obměnu pan RBS jednoduchou oligonuk1eotidovou kasetovou substituci. V prvním stupni konstrukce se panB gen připojí ke dvěma kazetám genu panD, jak je to znázorněno na obr. 3 pro konstrukci pAN665. Nato se výsledné kazety panBpanD převedou na B. subtilis expresní vektor pOTP61, jak je znázorněno na obr. 4. Souhrn podstatných význaků každého zkonstruovaného plasmidu den v tabulce I (pAN670 a pAN674) je uve

Tabulka I

Plasmidy obsahující různé genové expresní kazety B.subtilis panBpanD

Plasm i d	panDRBS	Vektor	Hostitelský kmen
PAN665	standardni	pASK-1BA3	E.coli
PAN670	·	pOTPól	B.subt i 1 i s
PAN669	ND-C2	pASK-1BA3	E.coli
PAN674		pOTP61	B.subt i 1 i s

Tyto nové plasmidy kombinují produkci oddělených PanB a PanD z jediného vektoru a byly určeny k produkci zvýšených množství PanB se zřetelem na expresní vektor panB (pAN636) obsažený v PA668. Strategie sestavení vektorů P26 panBpanD v kmenech produkce pantothenátu využívá přednosti genetické vazby mezi bpr a panEl. Napřed se zkonstruoval derivát PA824, • · · · · 4 který je vytvrzením residentní expresní kazety panD transformaci kmene s chromosomál n i DNA izolované z PA930 (panEbcat) a selekcí pro odolnost vůči chlorarafeni kolu. Výsledné produkty transformace se zkoumají z hlediska citlivosti na tetracyklin a obnovily se dva Tet-sensitivni isoláty nazvané PA715. Tento kmen je hostitelským kmenem pro testování vektorů P26panBpanD (viz dále). K obnovení kazety P26panEl v PA715 je každý vektor napřed transformován do kmene (PA328), který obsahuje P26panEl, ale neobsahuje kazetu integrovanou v místě bpr. PA328 obsahuje P26panBCD lokus, ačkoli není konstruován pro nadprodukci or-KIV. Produkty transformace PA328 odolné tetracyklinu se získají použitím vhodných restrikčních fragmentů Notl ze dvou vektorů a výsledné kmeny získaly označení PA710 a PA714.

Následujícím stupněm je převod kazet do PA715 takže mohou být vyhodnocena pozadí kmene PA824. To se provede izolováním chromosomální DNA z kmenů PA710 a PA714 a použitím obou DNA zvlášť k transformaci PA715 se selekcí na odolnost vůči tetracyklinu, Tetracyklinu odolávající produkty transformace se zkoumají z hlediska citlivosti na chloramfenikol; to identifikuje žádoucí produkty transformace, které mají také získaný gen P26panEl z donoru DNA vazbou s kazetou P26panBpanD v místě bpr. Získají se izoláty citlivé na chloramfenikol odvozené z transformací, ve kterých PA710 nebo PA714 chromosomální DNA byla použita jako donor. Zachovají se izoláty které vytvářejí nejvyšší titr pantothenátu ve zkumavkovém testu kultivace. Tyto kmeny mají označení PA717 a PA721. Duplikáty zkumavkových kultur nových kmenů, stejně jako PA824 a PA715 se kultivují v SVY + 10 g/1 aspartátu při teplotě 43 C po dobu 48 hodin a pak se zkoumají na pantothenát, HMBPA a β-alanin. Kromě toho probíhají extrakty z každého kmene na gelu SDS-PAGE. Výsledky zkoumání zkumavkových kultur jsou uvedeny v tabulce II.

• · 9 9 9 9 «9 · · 9999 • 999 99 9 99 9

99999 99 99 9 9

9999 9999

99999« 99 9 99 99

Tabulka II

Produkce pantothenátu kmeny v SVY + 10 g/1 aspartátu	PA717 a PA721	kult i vovaným i
kmen	panDB	[ pan]	[HMBPA]	[β-ala]
	kazeta	(g/1)	( g/ 1)	( g/ 1)
PA824	-	4, 9	0, 94	2, 5
··		4, 6	0, 79	2, 3
PA715	žádná	1,7	<0, 1	0, 5
··	·	1,7	<0, 1	0, 4
PA717-24	PAN670	4, 8	0, 34	1,3
·	··	4,9	0, 40	1,3
PA721-35	PAN674	5, 7	0, 50	1,4
··		5, 3	O, 40	1,3
PA721-39	PAN674	4, 1	0, 38	2, 0
*·	··	4, 6	0, 40	2, 2

Podle očekávání produkuje každý z nových kmenů více pantothenátu a β-alaninu než PA715. Dva kmeny (PA717-24 a PA721-39) produkují přibližně stejně pantothenátu jako PA824, zatímco PA721-35 produkuje více pantothenátu než PA824. Všechny tři nové kmeny produkuj í méně HMBPA než PA824. Analýza proteinového gelu ukazuje, že nové kmeny produkují více PanB než kterýkoli z kontrolních kmenů.

Kmeny PA717-24, PA721-35 a PA721-39 se hodnotily také v třepáčkových kulturách v prostředí na bázi sojové mouky. Jak vyplývá z tabulky III, produkují tyto kmeny se zesilitelnou kazetou P2epanBpanD pantothenát a HMBPA v množstvích podobných jako u PA668-2 a PA668-24, které oba obsahují oddělené zesílite 1 né kazety P2&panB a P2epanD.

• · 0 00 0 • · 0 · • · · 0 · · · · 0 0 0 0 0 · *> 0 0 0 0 • 0 0 0 0 » 0 0 · · · · • »000 0···

000000 00 · 00 00

Tabulka III

48-hodi nový pokus se třepačkaovou kulturou

Prostřed í	Kmen	HMBPA (g/l)	PAN (g/l)
Sojová mouka	PA668-2	1.2	6, 8
+ glukóza	PA668-24	1,6	5, 2
	PA717-24	2, 0	5, 9
	PA721-35	2, 6	7, 0
	PA721-39	2, 5	8,6
Sojová mouka	PA668- 2	0,0	9, 0
+ maltóza	PA668-24	0, 4	10, 4
	PA717-24	0,7	8,6
	PA721-35	1,0	9, 2
	PA721-39	0, 4	9, 1

Podmínky: 40 ml prostřed1/200 ml přepážková třepačka, 4x

Bioštítové kryty, otoček 300/rain, 2,5 % inokula (1,0 ml).

Prostředí: 20 g/l Cargill 200/20 sojová mouka, 8 g/1 NH4)2S04, 5g/l glutamátu, 1 x PSTE, 0,1 M fosfátu, pH 7,2 a 0, 3M MOPS, pH 7,2, 60 g/l glukózy nebo maltózy v/10 mM Mg a 1,4 mM Ca. Průměr ze dvou třepačkaů.

Vedle produkce pantothenátu (stejně jako ostatních pantosloučenin, vyznačených na obr. 1, a zde popsaných) se ukázalo, že některé kmeny konstruované k produkci komerčních množství žádaných pantosloučenin vyrábějí vedlejší produkt identifikovaný jako kyselina 3-(2-hydroxy-3-methylbutyrylamino)propionová (HMBPA) (zde také označovaná jako “/3-al an i n - 2-( R) - hydroxy i sova 1 erát , ‘p-alanin-2-hydroxyisovalerát , /3-alanyl -<x-hydroxyi sovalerát a nebo fantothenát) . Označení fantothe49

•A AAAA

A

AAAA A·

A A A· A nát je zde také zkracováno na fan”.

HMBPA je kondenzační produkt [R3 - ot-hydroxy i so valero vé kyseliny (cf-HIV) a β-alaninu, katalyzovaný enzymem PanC. ot-HIV je generována redukcí oi-K.IV, reakcí která je katalyzována ct-ketoreduktázami PanE (například PanEI a/nebo PanE2) a/nebo IlvC. Dospělo se proto k poznatku, že existují nejméně dvě cesty v mikroorganismu, které soutěží o ot-KIV, substrát pro biosyntetický enzym PanB, jmenovitě pantothenátové biosyntetická cesta a HMBPA biosyntetické cesta. (Třetí a čtvrtá cesta soutěží o ot-KIV vede k produkci val inu nebo leucinu z ot-KIV, (například obr. 1). Alespoň pantothenátové biosyntetické cesta a HMBPA biosyntetické cesta vytvářejí dále kompetitivní substráty pro enzymy PanC, jmenovitě a-HIV a pantoát. Produkce HMBPA muže mít významný vliv na produkci pantothenátu. Například cesta HMBPA může soutěžit s pantothenátovou cestou pro prekurzory ( otKIV a β-alanin) a pro některé enzymy (PanC, PanD, Pan El a/nebo IlvC). Kromě toho, jelikož struktura HMBPA je podobnmá struktuře pantothenátu, může mít nežádoucí vlastnost negativně ovlivňovat jeden nebo několik stupňů pantothenátové cesty. Na základě identifikace HMBPA uvádí americká přihláška vynálezu číslo 60/262 995, že produkce pantothenátu může být zlepšena nebo optimalizována jakýmkoli způsobem, který podpoří použiti substrátů (ot-KIV a β-alaninu) a/nebo enzymů (PanC, PanD, Pan El a/nebo IlvC) v biosyntetickýcb pantothenátových procesech ve srovnání s biosyntetickými procesy HMBPA.

Příklad 2

Zvýšení produkce pantothenátu zvýšením dostupnosti šeřinu

Alespoň jeden způsob optimalizce produkce pantothenátu se týká regulace dostupnosti šeřinu v mikroorganismových kulturách. Lze zejména předvést, že zvýšení dostupnosti šeřinu vede ke zvýšené produkci pantothenátu (například v srovnání s pro9 9 9 9

9999

99999 9

9 9 9

9999 99 99 dukcí HMBPA), zatímco sníženi dostupnosti šeřinu vede ke snížené produkci pantothenátu ve srovnání s produkcí HMBPA. Tento způsob je založen na poznatku, že sloučenina methy1entetrahydrofolát (MTF), která je odvozena ze šeřinu, dodává hydroxylovou skupinu do of-KIV během pantothenátové b i osyntet i cké reakce k poskytnutí ketopantoátu (obr. 1 a 2). Regulování množství šeřinu je tudíž jedním prostředkem účinné regulace množství ketopantoátu a tak regulování produkce pantoátu a/nebo pantothenátu ve vhodných konstruovaných mikroorganismech. K důkazu této regulace se nechá růst PA824 ve zkumavkových kulturách SVY glukózy plus 5 g/1 p-alaninu a ± 5 g/1 šeřinu 48 hodin při teplotě 43 °C.

Tabulka IV

Produkce pantothenátu a HMBPA pomocí PA824 s přidáním ser i nu a bez něho

přidaný serin pří 5 g/1	OD&oo	[pan g/11	[HMBPA] g/1
-	16, 3	4, 9	0, 84
-	14, 0	4, 5	0, 80
+	13, 1	6, 4	0, 56
+	12,9	6,0	0,62

Jak vyplývá z tabulky IV, zvšuje přísada šeřinu produkované množství pantothenátu (zatímco naopak snižuje produkci HMBPA.

Příklad 3

Konstrukce bakteriálních buněk se zvýšeným množstvím šeřinu, hydroxylmethyltransferázy, produktu gly/A genu

Jako alternativa dodávání šeřinu je jiný způsob zvyšování fr* ··· · • · · · • · · · · fr • · · · · · • · · * · fr • · · · · · fr· fr · · · · ···· fr· frfr · • · « • · fr fr · fr · » · · · fr« frfr úrovně šeřinu a/nebo využití množství šeřinu (a podobně množství methy1entetrahydrofolátu) k řízení produkce pantothenátu, zvyšování syntézy nebo aktivity 3-fosfog1ycerátové dehydrogenázy nebo ser i nové hydroxymethyltransferázy (včetně genových produktů serA a glyA) a tím zvyšování ser i nové a methylentetrahydrof o 1 átové biosyntézy ve vhodně konstruovaných mikroorgan i snech.

Exprese genu glyA se zvýší transformací buněk B. subtilis y s expresní kazetou obsahující gen B. subtilis glyA klonovaný směrem ve směru silného konstitutivního promotoru. Ke konstrukci expresní kazety se použije primerů RY417 a RY418 z tabulky V k zesílení genu glyA za použití PCR z chromosomální

DNA izolované z B.subti 1 is PY79.

Tabulka V a ser A

Primery použité k zesílení B.subtilis glyA

RY405	CCCTCTAGAGGAGGAGA.AAACATGTTTCG AGTATTGGTC TCAGACAAAATG	SEQ ID NO:20
RY406	CCCGGATCCAATTATGGCAGATCAATGAGCTTCACAGAC ACAA	SEQIDNO:21
RY417	GGATCTAGAGGAGGTGTAAACATGAAA.CATTTACCTGCG CAAGACGAA	SEQ ID NO:22
RY418	CGGGGATCCCCCATCAACAATTACACACTTCTATTGATT CTAC	SEQ IDNO.23

Ry417 obsahuje syntetické ribosomové vazební místo RB32 těsně za místem Xba11. Zesílená DNA se pak přeruší Xbal a BamHI a klonuje se mezi místy XbaII a BanHI na vektor pAN004 (obr. 5) k získání plasmidu pAN396 (obr.6: SEQ ID NO 24). Vektor pAN004 obsahuje fág SP01 Pz<b promotor těsně za klonovacím místem Xbal k popohnání exprese klonovaného genu glyA. Těsně za expresní kazetou obsahuje pAN396 cat gen, který působí v B.

♦ 444 ····

4 4·«· ·· ·· · ·

4444 4 4 4 4 • 444 4· 4 4 4 4« »4 subtilis. K transformaci B.subtilis se fragment NotIDNA obsahující kazetu Pg2e>lyA a cat gen se izoluje od pAN396, samoligující a transformovaný do kompetentních buněk B. subtilis PY79. Selekcí se oddělí několik produktu transformace odolávajících cbloramfenikolu označovaných PA1007 a PA1008. Chromosomální DNA se izoluje od každého z těchto kmenů a použije se k transformaci kompetentních buněk PA721B-39 a PA824, k získání kmenů PA1011 a PA1014. Elektroforéza polyamidového gelu SDS buněčných extraktů vybraných izolátů PA1011 a PA1014 potrvrzuje, že tyto kmeny obsahují zvýšená množství genového produktu glyA v porovnání s podobnými kmeny PA721B-39 (popsanými v příkladu 1) a PA824 (popsaným ve světovém patentovém spise číslo WO 01/21772). K vyzkoušení účinku zvýšené exprese glyA na produkci pantothenátu se pěstují PA1011 a PA1014 ve zkumavkových kulturách SVY glukózy plus 5 g/1 p-alaninu 48 hodin při teploo tě 43 C. Jak vyplývá z údajů na tabulce VI, produkuje PA1014 více pantothenátu (4,5 g/1 než jeho mateřský kmen PA824 (3,2 g/1). Podobně PA1011 produkuje v průměru více pantothenátu (4,35 g/1) než jeho mateřský kmen PA721B-39 (4,05 g/1).

Tabulka VI

Produkce pantothenátu a HMBPA pomocí PA1011 a PA1014 ve srov-

nán í s	PA721B-39	a PA824
Kmen		ODpoo	Pantothenát	HMBPA
			( g/ 1 )	( g/ 1)
PA1014	»1	14	4, 5	O, 27
PA1014	«2	15	4,5	0, 31
PA824		16	3, 1	0, 31
PA824		15	3, 3	0, 28
PA1011	#1	17	4, 5	0, 24
PA1011	«2	12	4, 2	O, 27
PA721B	-39	18	4, 0	O, 22
PA721B	-39	16	4, 1	0, 25

·· ·«· · ·♦ ··*· ·· * · · · » * · • ·♦· · • · ··** 99

9 ♦ • · *

9 9

9

9 * • · · · · · • · · · ·« ··

Příklad 4

Konstrukce bakteriálních buněk se zvýšeným množstvím 3-fosfoglycerátdehydrogenázy, produkt genu serA

Produkt genu serA 3-fosfoglycerátdehydrogenáza, je prvním angažovaným enzymem v cestě biosyntézy šeřinu ( obr. 2). Jelikož serin je jedním ze substrátů pro syntézu MTF, vykonstruovala se nadměrná exprese genu serA ke zvýšení hladiny šeřinu v buňce. Způsobem podobným jako shora popsáno pro gen glyA v příkladu 3, se exprese genu serA zvýší transformací buněk B.subti lis expresní kazetou obsahující B.subtilis gen serA klonovaný ve směru silného konstitutivního promotoru. Ke konstrukci je použito expresní kazety primerů RY405 a RY406 vyznačených v tabulce V k zesílení genu serA pomocí PCR z chromosomální DNA izolované z B. subtilis PY79. Zesílená DNA byla pak přerušena Xabal a BamHI a klonována mezi místy Xbal a BamHI ve vektoru pAN004 (obr. 5) k získání plasmidu pAN393 (obr.7, SEQ ID N0;25). K transformování B. subtilis byl izolován pragment NotlDNA obsahující kazetu P2e>serA a cat gen byl izolován z pAN393, samoligován a transformován do kompetentních buněk B.subtilis PY79. Bylo izolováno několik produktů transformace resistentních k chloramfeni kolu s označením PA1004 a PAÍ005. Chromosomální DNA se izoluje ze všech těchto kmenů a použije se k transformaci kompetentních buněk PA721B-39 a PA824 k získání kmenů PA1010 a PA1013. Elektroforéza SDS polyamidového gelu buněčných extraktů vybraných izolátů PA1O1O a ΡΆ1013 potvrzuje, že tyto kmeny obsahují zvýšené množství genového produktu serA ve srovnání s jejich mateřskými kmeny PA721B-39 a PA824.

K vyzkoušení účinku zvýšené exprese serA na produkci pantothenátu se pěstují PA1010 a PA1013 ve zkumavkových kulturách SVY glukózy plus 5 g/1 p-alaninu 48 hodin při teplotě 43 C, Jak vyplývá z údajů na tabulce VII, produkuje PA10Í0 více pan54 ·< *·*» ·· ···· ·· *· ···· ♦ · · · » · »«·»»* ··· * ·«· · · « « « · · v • t 1 · t «··· ···« ·· ♦ · · ·« t« tothenátu (4,7 g/1 ) neš jeho mateřský kmen PA721B-39 (4,1 g/1). Podobně PA1013 produkuje v průměru více pantothenátu (4,1 g/1) než jeho mateřský kmen PA824 (3,1 g/1).

Tabulka VII

Produkce pantothenátu a HMBPA za použití kmenů PA1010 a PA1013 ve srovnání s PA721B-39 a PA824

Kmen		ODeoo	Pantothenát	HMBPA
			g/i	g/ 1
PA1010	«3	16	4, 8	0, 23
PA1O10	«5	15	4,5	0, 26
PA1O1O	M6	22	4,7	0, 24
PA721B-	39	18	4,0	0, 22
PA721B-	39	16	4, 1	0, 25

PA1013	»2	14	3, 3	0, 25
PA1013	H4	14	4, 2	0, 28
PA1013	»5	16	5, 5	0, 37
PA1013	«8	13	3, 6	O, 24
PA824		17	3, 0	O, 27
PA824		16	3, 1	0, 29

Příklad 5

Třepáčkové a fermentorové pokusy s kmeny se zvýšenou expresí serA a glyA

Na základě výkonnosti ve zkumavkách se zvolí dva kmeny se zesílíte lnou kazetou serA a dva kmeny se zesil i telnou kazetou glyA pokaždé ze dvou mateřských PA824 a PA721B-39. Čtyři kmeny * ♦ » 9 » ·

9999

9 9 9

9 9 9 · ·

999 • · »99« 9«

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 «9 9 99 9« se nechají růst vedle mateřských PA824 a PA721B-39 v třepáčkových zkumavkách (obr. 8). V prostředí sojové mouky MOPS glukózy (SMG) produkují všechny čtyři kmeny více pantothenátu než mateřské kmeny. V prostředí sojové mouky a maltózy (SMM) se jeví jeden ze čtyř kmenů nadřazený mateřským kmenům.

Nadměrně expresující kmen serA a nadměrně expresující kmen kmen glyA od každého mateřského kmene byl pěstován simultánně v 10-litrovém fermentoru Chemap bench. Nadměrně expresující kmen glyA, odvozený z PA824, PA1014-3, který dával nejvyšší titr pantothenátu v SMM, se choval nejlépe také ve fermentorech (tabulka IX). Kmen PA1014-3 produkoval 71 g/1 pantothenátu za 36 hodin v kultuře supernatantu a 86 g/1 pantothenátu po 48 hodinách v kultuře supernatantu ve srovnání s mateřským PA824, který produkoval 41 g/1 a 46 g/1 pantothenátu. Kmen serA, PA1012-4 také produkoval významně více pantothenátu než kontrolní PA824 v kultuře supernatantu, 52 g/1, 60 g/1 při 36 a 48 hodinách. Tyto výsledky zřetelně dokazují účinnost nárůstu jak glyA, tak serA.

Nadměrně expresující serA a glyA nadměrně expresující deriváty PA721B-39 byly také zřetelně zlepšeny oproti svým mateřským kmenům. Oba produkovaly přibližně 80 g/1 pantothenátu (82 a 79 g/1) v supernatantech kultury za 48 hodin. Účinek zvýšeného množství PanB v derivátech PA721B-39 oproti derivátům PA824 se projevuje v redukci HNBPA. PA721B-39 a jeho deriváty produkují méně HNBPA za 48 hodin než PA824 nebo dokonce PA668-24. Zvyšování GlyA se jeví také, že snižuje tok uhlíku do HMBPA.

»♦ ·»·· φφ φφφφ

Vyhodnocení z třepaček pantothenátových produkčních kmenu nadměrně expresujících serA nebo glyA φφ φφ » * φ · · φ • · φ · φ φ φ φφφφφ φφ • φφφφ φφφφφφ φφ φ φ φ • φ φ φ φ φ φφ φφ

Tabulka VIII

Zdroj uhlíku	Kmen	Přidaná kazeta	HMBPA (g/1)	Pantothenát (g/1)
Glukóza	PA824		3, 5	4, 0
	PA1012-4	ser A	3, 0	4,6
	PA1014-3	glyA	2, 5	4, 7
	PA721B-39		0, 9	5, 0
	PA1010-6	ser A	1.9	9, 6
	PA1011-2	glyA	1.7	10, 0
Maltóza	PA824		1,2	10, 4
	PA1012-4	ser A	0, 8	9,8
	PA1014-3	glyA	1,1	16, 1
	PA721B-39		O, 6	11,6
	PA1010-6	serA	0, 5	10, 2
	PAtOl1-2	glyA	0,0	10, 3

Všechny hodnoty jsou průměrem ze dvou třepaček po 48 hodinách. Podmínky: 40 ml prostředí/200 ml, přepážková třepačka, 4x

Bioštítové kryty, otoček 300/min, 2,5% inokula při teplotě 43 o

c.

Prostředí: 20 g 200/20 Cargi 11 sojová mouka, 1 x PSTE, 8g/1 NH4)2S04, 5g/1 glutamátu.

Pufr: 0,lM fosfát pH 7,2 a 0, 3M MOPS pH 7,2.

Zdroj uhlíku (sterilizovaný odděleně jako 20x zásoba): 60 g/1 glukózy nebo maltózy w/10 mM Mg a 1,4 mM Ca, •4« 4 4 4-4

4 4444 • 444 «· 4 4« 4 • 4444· 4 4

4 4 4 4

444 44 44 4

Tabulka IX

Vyhodnocení z 10-1 fermentoru pantothenátových produkčních kmenů nadměrně expresu)ících serA nebo glyA

HMBPA Pantothenát (g/1) (g/1)

Pokus	Kmen Mateřský	Př i daná kazeta	36 hoc	48 ii n	36 hoc	48 i i n
P285	PA824			18	25	41	46
P284	PA1012-4	PA824	serA	20	21	52	60
P286	PA1014-3	PA824	glyA	14	16	71	86
P259	PA721B-39			4	5	34	42
P287	PA1010-6	PA721B-39	serA	4	5	65	82
P289	PA1011-2	PA721B-39	glyA	2	3	56	79
P275	PA668-24	PAS24		3	9	55	72

Použitým prostředím je PFM-222. Je to totéž prostředí jako PFM-155 popsané v americké přihlášce vynálezu číslo 60/262 995 (podané 19. ledna 2001) až na tyto změny: (i) v základním materiálu není Amberex 1003. Cargil 200/20 (sojová mouka) 40 g/1 je nahrazena Cargilem 20-80 (sojová drť) 50 g/1. MgS0₄.7H₂0 je nahrazen MgCl2.7H₂0, 1,0 g/1 a SM-1000X je nahrazen PSTE-1000X (PSTE-lOOOX = MnCl₂4H20 2,0 g/1; ZnS0₄.7H₂0 1,5 g/1; C0CI2.6H2O 2,0 g/1: CuS0₄.5H20 0,25 g/1, Na₂Mo0₄.2H2O, 0,75 g/1). V přiváděném materiálu: SM-1000X je nahražen PSTE-lOOOX.

Zvýšení produkce pantothenátu lze dosáhnout také kombinací nadměrné exprese serA a glyA v jediném kmeni a/nebo zavedením mutace, která vede k odolným serA a/nebo glyA.

·*♦«

9 9 99 9

9

Ekvivalenty. Pracovníkům v oboru je jasné, nebo jsou schopni určit za použití rutinních pokusných způsobů mnohé ekvivalenty zde popsaného specifického provedení. Takové ekvivalenty jsou však zahrnuty do následujících patentových návrhů.

Průmyslová využitelnost

Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku s použitím mikroorganismů majících modifikované biosyntetické aktivity pantothenátového enzymu a majících modifikované biosyntetické aktivity methylentetrahydrofolátového (MTF) enzymu. Způsob zej-

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku, v y zna čující se tím, že se kultivuje mikroorganismus mající deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu za podmínek, při nichž je produkce pantothenátu zvýšena.
2. Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku, v y čující se tím, že se kultivuje mikroorganismus mající (i) deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu a (ii) deregulovanou methy1entetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu, za podmínek, při nichž je produkce pantothenátu zvýšena.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t í m, že mikroorganismus má alespoň dva patothenátové biosyntet ické enzymy deregulované.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismus má alespoň tři patothenátové biosyntet ické enzymy deregulované.
5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t í m, že mikroorganismus má alespoň čtyři patothenátové biosyn tetické enzymy deregulované.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že mikroorganismus má deregulovanou ketopantoáthydroxymethyltransferázu, deregulovanou ketopantoátreduktázu, deregulovanou pantothenátsyntetázu a deregulovanou aspartát-oe-dekarboxylázu.
7. Způsob podle nároku 1 až 6, vyznačující se t í m, že mikroorganismus má dále deregulovanou isoleucin-va60 • 9 99 ·99· 99 9 » 9 9 9 9 9 • «999« 9 9

9 9 « 9 9

99*9 9· »· » • 9 ·9 9·

9« línovou (ilv) biosyntetickou cestu.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismus má deregulované alespoň dva isoleucin-valinové (ilv) biosyntetické enzymy.
9. Způsob podle nároku 7, vyznačuj ící se tím, Se mikroorganismus má deregulované alespoň tři ísoleucin-valinové (ilv) biosyntetické enzymy.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismus má deregulovanou acetohydroxykyselinovou kyselou syntetázu, dregulovanou acetohydroxykyselinovou isomeroreduktázu a deregulovanou dihydroxykyselinovou dehydratázu.
11. Způsob podle nároku 1 až 10, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismus má deregulovaný alespoň jeden MTF biosyntetický enzym.

12. Způsob podle nároku 11, vyznač u j í c í s e t í m, že mikroorganismus má deregulovaný glyA gen. 13. Způsob podle nároku 11, vyznač u j í c í s e t í m, že mikroorganismus má deregulovaný serA gen. 14. Způsob podle nároku 11, vyznač u j í c í s e t í m, že mikroorganismus má deregulovaný glyA gen a serA gen.
15. Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetřekou cestu, deregulovanou isoleucin-val i novou (ilv) biosyntetickou cestu a deregulovanou methy1entetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu, tak, že produkce pangothenátu je zvýšená.

***« »·»» ·« « ♦ · 9

9 9 « · · » ·

9 9

9999 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99 9 99 99
16. Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu, deregu1 ovanou i soleucin-va1 i novou (ilv) biosyntetickou cestu a deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu, tak, že se produkuje alespoň 50 g/1 pantothenátu za 36 hodin kultivace mikroorganismu.
17.

t í m, še kult i vace
18 .

tím, že kult i vace

Způsob podle nároku 16, vyznačuj se produkuje pantothenátu alespoň 60 g/1 m i kroorgan i srnu.

ící se za 36 hodin

Způsob podle nároku 16, vyznačuj í c í se produkuje pantothenátu alespoň 70 g/1 za 36 m i kroorgan i smu.

s e hod i n
19. Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku, v y čující se tím, že se kultivuje mikroorganismus mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu, deregulovanou i soleucin-va1 i novou (ilv) biosyntetickou cestu a deregulovanou methylentetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu, tak, že se produkuje alespoň 60 g/1 pantothenátu za 48 hodin kultivace mikroorganismu.
20. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se tím, že se produkuje pantothenátu alespoň 70 g/1 za 48 hodin kultivace mikroorganismu.
21. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že se produkuje pantothenátu alespoň 80 g/1 za 48 hodin kultivace mikroorganismu.
22. Způsob podle nároku 1 až 21, vyznačující se t í m , že produkce pantothenátu je dále zvýšena řízením aktivity pantothenátkinázy.

«· • * » 9 «9 » • «99 • 9 •99« 99 ·♦ ···· • · · • « · «β ·«·«

9 « C

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

99 99
23. Způsob podle nároku 22, vyznačuj ící tím, že aktivita pantothenátkinázy je snížena.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že CoaA je vypuštěn a CoaX je snížen.
25. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící t í m, že CoaX je vypuštěn a CoaA je snížen.
26, Způsob podle nároku 23, vyznačuj í c í tím, že CoaX a CoaA jsou sníženy.
27. Způsob podle nároku 1 až 26, vyznačující se t i m, že mikroorganismus je kultivován v podmínkách nadbytku ser i nu.
28. Způsob produkce pantothenátu vyznačuj ící se t í m, že se kultivuje mikroorganismu mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu za podmínky nadbytku šeřinu, takže se produkuje pantogthenát.
29. Způsob produkce pantothenátu vyznačuj ící se tím, že se kultivuje mikroorganismu mající deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu za podmínky, že produkce pantothenátu je nezávislá na přísunu β-alaninu.
30. Způsob podle nároku 1 až 29, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismem je Gram-positivní mikroorganismus.
31. Způsob podle nároku 1 až 30, vyznačuj ící se t í m, že mikroorganismus patří do kmene Bacillus.
32. Způsob podle nároku 1 až 31, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismem je Bacillus subtilis.
33. Produkt, vyznačující se tím, že je syntetizován způsobem podle předchozích nároků.

*· ·· • » » « • · · • «·· * · ···· ·» ·» ·««· • · « • · * • · · · • · · · ·· »·
34. Prostředek vyznačující se tím, sáhuje pantothenát synetizovaný způsobem podle nároku 1 že ob až 33.
35. Rekombinantni mikroorganismus pro způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku .vyznačující se tím, že má deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu a deregulovanou methy1entetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu.
36. Rekombinantni mikroorganismus pro způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku .vyznačující se tím, že má deregulovanou pantothenátovou biosyntetickou cestu, deregulovanou methy1entetrahydrofolátovou (MTF) biosyntetickou cestu a deregulovanou ísoleucin-val i novou (ilv) cestu.
37. Mikroorganismus podle nároku 35 nebo 36 mající dále sníženou aktivitu pantothenátkinázy.
38. Mikroorganismus podle nároku 35 až 37, který je Gram- pos i t i vn i .
39. Mikroorganismus podle nároku 35 až 37, který je z rodu Bači 11us.
40. Mikroorganismus podle nároku 35 až 37, kterým je

Bac i 11us subt i 1 i s.