CN1420931A - 制备泛化合物的方法和微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明特别描述了应用微生物制备泛化合物(如泛酸)的方法，所述微生物的泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸－缬氨酸生物合成途径和/或辅酶A生物合成途径业已经过处理。本发明还提供了特征在于过量表达酮泛解酸还原酶的微生物和过量表达天门冬氨酸－α－脱羧酶的微生物的方法。本发明披露了以非依赖前体形式高产量制备泛化合物的方法。本发明还提供了将上述方法付诸实践所需的重组微生物、载体、分离核酸分子、基因和基因产物。本发明还特别关注了以前尚未鉴定的微生物泛酸激酶基因coaX，以及应用泛酸激酶活性改良型微生物生产泛化合物的方法。本发明对重组微生物、载体、分离coaX核酸分子和纯化CoaX蛋白也给予了特别描述。本发明还特别关注的是应用本发明重组微生物和/或纯化CoaX蛋白鉴定泛酸激酶调节子的方法。
Description
发明背景
泛酸，也称为泛酸或维生素B5，是B族维生素之一，也是包括家畜和人在内的哺乳动物的必需营养元素(例如，来自食物，作为水溶性维生素补充剂或食品添加剂)。在细胞中，泛酸主要用于生物合成辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)。这些辅酶在酰基的代谢过程中发挥作用，所述酰基与这些分子的4’-磷酸泛酰巯基乙胺部分的巯基形成硫酯。这些辅酶在所有细胞中都是必不可少的，参与细胞代谢过程中100多种不同的中间反应。
泛酸(特别是具有生物活性的D异构体)合成的传统方法是通过化学合成，该方法需要大量化学物质，并受到底物价格昂贵和需要光学离析外消旋中间产物(如，离析DL型内酯，获得D型内酯，用于与β丙氨酸聚合)的限制。因此，研究人员最近着眼于能够产生用于泛酸生物合成过程的酶的细菌或微生物系统(例如本身能够合成泛酸的细菌)。特别是最近评价的有益于制备泛酸D异构体的生物转化过程，例如，应用以下微生物，包括能够将DL型泛酸酯选择性水解为D型泛酸的微生物；能够选择性分解L型泛内酯，只形成D型泛内酯的微生物；以及能够将DL型泛内酯选择性水解为D型泛酸的微生物。
但是，仍有需要进一步改良泛酸生产方法，特别是底物需求量较少和/或底物比较便宜的方法。为了这一目标，最近评价了直接微生物合成法，认为该方法能够改善D型泛酸的合成。在微生物中，泛酸的生物合成是多步骤途径，导致泛解酸(衍生自α酮异戊酸)与β丙氨酸聚合形成D型泛酸。异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径生物合成酶乙酰羟酸合成酶(ilvBN或alsS基因产物)、乙酰羟酸异构还原酶(ilvC基因产物)、以及双羟酸脱水酶(ilvD基因产物)可以催化丙酮酸向α酮异戊酸的转化。该反应还可以由泛酸(pan)途径生物合成酶酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)、酮泛解酸还原酶(panE基因产物)、天门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)和泛酸合成酶(panC基因产物)进一步催化。
最近业已鉴定并表征了在鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌中涉及泛酸生物合成的酶的编码基因(Frodyma and Downs(1998)J.Biol.Chem.273：5572-5576 and Jackowski(1996)pp.687-694，InNeidhardt et al(ed.)Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology，2nd ed.Am.Soc.Microbiol.Wash，D.C)。例如，在大肠杆菌中，泛酸的生物合成包括四个关键步骤。第一个反应由panB基因产物酮泛解酸羟甲基转移酶催化，利用L型缬氨酸中间产物α酮异戊酸生成酮泛解酸，然后通过panE基因产物酮泛解酸还原酶将酮泛解酸还原成泛解酸。panD基因产物天门冬氨酸-α-脱羧酶可以利用天门冬氨酸产生β丙氨酸。panC基因产物泛酸合成酶随后连接β丙氨酸与泛解酸，形成D型泛酸。
作者Dusch et al.描述了谷氨酸棒状杆菌panD基因的鉴定，并指出，在大肠杆菌中表达谷氨酸棒状杆菌panD基因，产生的菌株可以制备泛酸，其特异性生产率为每mg(干重)每小时140ng泛酸(Duschet al.(1999)Appl.Environ.Microbiol.65：1530-1539)。
作者Sahm and Eggeling进一步鉴定了谷氨酸棒状杆菌的panB和panC基因，并描述了一种过量表达panBC基因的基因工程学谷氨酸棒状杆菌菌株(Sahm and Eggeling(1999)Appl.Environ.Microbiol.65：1973-1979)。该工程学菌株可以产生泛酸，但为了检测生成的泛酸，必须在宿主中过量表达决定α酮异戊酸生成的基因。并且，如果不添加β丙氨酸，在构建的菌株中就没有泛酸的明显积累。
同样，业已描述的一种制备D泛酸的方法指出，可以利用耐水杨酸钠大肠杆菌突变株的优势，该菌株在β丙氨酸存在的情况下培养，可以产生D型泛酸(美国专利号5,518,906)。制备除了耐水杨酸，还耐α酮异戊酸和/或α酮丁酸，和/或α氨基丁酸，和/或β羟天门冬氨酸和/或氧甲基苏氨酸的大肠杆菌菌株，可以进一步增加泛酸的产量。而且，应用携带panB，panC和panD基因的质粒DNA转化耐水杨酸突变株，可以导致泛酸产量的增加，但是，在给出的实施例中，需要添加高达≥20g/L的β丙氨酸。panB-panC-panD基因在大肠杆菌染色体上成串排列。
最后，一种制备D型泛酸的方法应用抗水杨酸、α酮异戊酸、α酮丁酸、β羟天门冬氨酸、氧甲基苏氨酸的大肠杆菌菌株，在β丙氨酸存在的情况下培养，所述菌株转化了含有泛酸生物合成基因的DNA片段和/或含有支链氨基酸生物合成基因的DNA片段(美国专利号5,932,457)。
细菌中泛酸的合成是由泛解酸与β丙氨酸聚合而成的，涉及多种泛酸生物合成酶，包括酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)，酮泛解酸还原酶(panE基因产物)，天门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)，以及泛酸合成酶(panC基因产物)。尽管泛酸作为一种维生素发挥生物功能，它在所有细胞中还进一步代谢成为辅酶A(CoA)，辅酶A作为酰基载体参与三羧酸(TCA)循环，脂肪酸代谢和多种其他代谢中间反应。泛酸转化成辅酶A(CoA)的第一步(可能进行速率调控)是由泛酸激酶介导的泛酸磷酸化。泛酸激酶活性最先在鼠伤寒沙门氏杆菌中通过筛检温度敏感突变株鉴定，所述菌株在许可的温度下合成CoA，在不许可的温度下分泌泛酸。突变在沙门氏菌染色体上作图，该基因位点被命名为coaA。该基因编码的酶催化由泛酸生物合成辅酶A的第一步(Dunn and Snell(1979)J.Bacteriol.140：805-808)。大肠杆菌的温度敏感突变株业已分离，并了解其特性(Vallari andRock(1987)J.Bacteriol.169：5795-5800)。这些突变株(被命名为coaA15(Ts))在泛酸向CoA聚合方面具有缺陷，并表现为温度敏感性生长表型，提示泛酸激酶活性对于生长是必不可少的。而且，应该指出，突变株中CoA抑制泛酸激酶活性的程度与抑制野生型酶一致。
业已分离耐反馈大肠杆菌突变株(被命名为coaA16(Fr))，该菌株具有的泛酸激酶活性不受CoA反馈抑制的影响(Vallari andJackowski(1988)J.Bacteriol.170：3961-3966)。出人意料的是，通过转导导致的回复突变与coaA没有基因联系。那里描述的其他资料支持这样一个观点，细胞内CoA的总含量通过两种调节机制控制，一种是泛酸激酶步骤的生物合成调节，另一种可能是将CoA降解为4’-磷酸泛酰巯基乙胺。
通过对大肠杆菌温度敏感突变株进行功能互补，克隆了野生型大肠杆菌coaA基因。野生型基因的序列也得到确定(Song and Jackowski(1992)J.Bacteriol.174：6411-6417 and Flamm et al.(1988)Gene(Amst.)74：555-558)。含有多拷贝coaA基因的菌株，泛酸激酶比活性提高76倍，但稳定状态的CoA水平只增加2.7倍(Song andJackowski，supra)。进一步报导指出，原核酶(在大肠杆菌和多种其他微生物中由coaA编码)无论体内、体外，均受CoA的反馈抑制，而且CoA抑制酶活性的能力较乙酰CoA强约5倍(Song and Jackowski，supra and Vallari et al.，supra)。而且，业已报导，大肠杆菌中的panB基因产物也受CoA抑制(Powers and Snell(1976)J.Biol.Chem.251：3786-3793)。这些数据进一步支持这样一个观点，泛酸激酶活性的反馈抑制是控制细胞内CoA浓度的关键因素。
应用标准搜索排列工具，在流感嗜血杆菌、结核分支杆菌、霍乱弧菌、酿脓链球菌和枯草芽孢杆菌中业已鉴定了coaA的类似物。相反，具有显著同一性的蛋白质却无法在真核细胞或表达tag(EST)序列的哺乳动物数据库中鉴定，所述真核细胞包括酿酒酵母。应用基因筛选策略，最近在构巢曲霉中鉴定了编码泛酸激酶活性的cDNA(Calder et al.(1999)J.Biol.Chem.274：2014-2020)。真核泛酸激酶基因(panK)具有其独特的一级结构和调节特性，与原核泛酸激酶基因截然不同。业已分离了哺乳动物泛酸激酶基因(mpanKla)，其编码的蛋白质不仅与构巢曲霉PanK蛋白同源，而且与在酿酒酵母基因组中鉴定的GenBankTM Accession Number 927798的预期基因产物同源(Rock etal.(2000)J.Biol.Chem.275：1377-1383)。发明简述
本发明至少部分基于在枯草芽孢杆菌中发现的泛酸生物合成途径关键酶编码基因。特别是，本发明的发明者业已鉴定了枯草芽孢杆菌的panE基因。在枯草芽孢杆菌中过量表达或去调节panE基因可以导致panE基因产物酮泛解酸还原酶的产量增加，进而导致泛酸产量的增加。同样，该基因突变可以导致枯草芽孢杆菌泛酸产量下降＞90％。本发明的发明者还在枯草芽孢杆菌中鉴定了假定的panBCD操纵子，该操纵子的过量表达或去调节可以导致泛酸产量的增加。本发明的发明者还发现，枯草芽孢杆菌panD基因的过量表达或去调节(导致panD基因产物天门冬氨酸-α-脱羧酶的产量增加)可以导致泛酸产量的增加，在联合了异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径关键酶编码基因去调节后，更加明显。
因此，本发明特别描述了利用微生物制备泛酸以及泛酸生物合成途径其他化合物(例如，酮泛解酸，泛解酸和β丙氨酸)的方法，这些化合物在本文又称为“泛化合物”，所述微生物的泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径业已经过处理，可以生产泛酸或其他所需泛化合物。在一个实施方案中，本发明特别描述了一种制备泛化合物(如泛酸或泛解酸)的方法，包括在可以生成泛化合物(如泛酸或泛解酸)的条件下培养微生物，所述微生物过量表达panE基因产物酮泛解酸还原酶，在本文又被称为酮泛解酸还原酶过量表达或“KPAR-O”微生物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种制备泛化合物(如泛酸或泛解酸)的方法，包括在可以生成泛化合物(如泛酸或泛解酸)的条件下培养微生物，所述微生物过量表达至少一种泛酸生物合成酶(例如panB，panC或panD基因产物中的至少一种)，优选在KPAR-O微生物中。
本发明的另一方面特别描述了在不依赖添加前体物质(例如β丙氨酸或天门冬氨酸和/或α酮异戊酸或缬氨酸)的情况下，制备泛化合物的方法。在一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖添加前体物质的形式制备泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物，所述微生物的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖添加前体物质的形式制备泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养泛酸(pan)途径和异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径均去调节的AαD-O微生物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖添加天门冬氨酸或β丙氨酸的形式制备泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养AαD-O微生物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖添加缬氨酸或α酮异戊酸的形式制备泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径去调节的微生物。在另一个实施方案中，本发明还特别描述了一种高产量制备泛酸的方法，包括在可以显著提高泛酸产量的条件下(如＞10g/L，20g/L，30g/L或40g/L)，培养经过处理的微生物。
本发明方法还特别关注了过量表达乙酰羟酸合成酶或乙酰羟酸异构还原酶的微生物(例如，应用包括ilvBNC核酸序列的载体转化微生物)，过量表达双羟酸脱水酶的微生物(例如，应用包括ilvD核酸序列的载体转化微生物)，过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶的微生物(例如，应用包括panD核酸序列的载体转化的微生物)，异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径去调节的微生物以及泛酸生物合成途径去调节的微生物(例如，过量表达任意酮泛解酸羟甲基转移酶、酮泛解酸还原酶、泛酸合成酶和天门冬氨酸-α-脱羧酶的微生物，如应用包括panBCD核酸序列的载体或包括panE1核酸序列的载体转化的微生物)。在一个实施方案中，重组微生物是革兰阳性菌(例如属于杆菌属、棒状杆菌属、乳酸杆菌、乳球菌属或链霉菌属的细菌)。在另一个实施方案中，重组微生物是革兰阴性菌。特别优选的是重组杆菌微生物(如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、Bacillus halodurans等)。本发明还描述了包括杆菌泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶(如枯草芽孢杆菌泛酸/或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶)编码基因的重组载体。
本发明还特别描述了制备β丙氨酸的方法，包括在可以生成β丙氨酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物，以及制备β丙氨酸的方法，包括在可以生成β丙氨酸的条件下，使分离的杆菌天门冬氨酸-α-脱羧酶与含有天门冬氨酸的组合物接触。
本发明的制备方法还可以包括泛化合物(例如泛酸或泛解酸)的回收。
本发明还特别关注了重组微生物(如AαD-O微生物)，异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节的微生物，过量表达至少一种酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)、泛酸合成酶(panC基因产物)、天门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)、酮泛解酸还原酶(panE1基因产物)的微生物，以及panBCD操纵子去调节的微生物。本发明还特别描述了panB，panC，panD，panE，ilvB，ilvN，alsS，ilvC和/或ilvD核酸分子，以及包括这些核酸分子的载体，和由这些核酸分子编码的基因产物。
本发明的方法还包括，例如除了过量表达至少一种泛酸生物合成酶外，还包括第二种泛酸生物合成酶的缺失或突变，所述第二种泛酸生物合成酶优选位于泛酸生物合成途径所需产物的下游。例如，除了过量表达panE基因产物，还使panC突变，可以导致泛解酸的产量更高或更多。因此，在一个实施方案中，本发明特别描述了一种制备泛解酸的方法，包括培养过量表达panE基因产物并缺失panC基因的微生物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种制备泛解酸的方法，包括培养过量表达panE基因产物和/或panB基因产物并缺失panC基因的微生物。其他示例实施方案还包括制备酮泛解酸的方法，包括培养过量表达panB基因产物并缺失panE基因的微生物，以及制备β丙氨酸的方法，包括培养过量表达panB基因产物并缺失panC基因的微生物。本发明还包括的是制备泛化合物的方法，包括在缺失至少一种泛酸生物合成酶的微生物中过量表达至少一种缬氨酸生物合成酶。
本发明还至少部分基于以前尚未鉴定的微生物泛酸激酶基因coaX的鉴定与其特性的发现。CoaX最先在枯草芽孢杆菌中鉴定，相应于染色体DNA部分的开放阅读框，包括ftsH基因的5’端，以及全部yacB，yacC，yacD，cysK和pabB基因。本发明的发明者业已证实，yacB开放阅读框编码一种新的泛酸激酶活性，通过同源性分析发现，该基因与前述任何已知泛酸激酶基因不相关。该基因被重新命名为coaX，因为它编码的酶催化泛酸到CoA途径的第一步。
因此，本发明特别描述了应用泛酸激酶活性经过修饰的微生物制备泛酸和泛酸生物合成途径中其他关键化合物(如泛化合物)的新的改良方法。特别是，本发明对含有coaX基因或含有突变coaX基因、泛酸激酶活性减弱的重组微生物也给予了关注。在一个实施方案中，本发明特别描述了泛酸生物合成途径进一步去调节的这类重组微生物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径进一步去调节的这类重组微生物。在一个优选实施方案中，微生物属于杆菌属(如枯草芽孢杆菌)。
本发明还特别描述了含有coaA基因或含有coaA突变基因的重组微生物(例如，属于杆菌属的微生物，如枯草芽孢杆菌)，任选包括coaX基因或其突变基因，泛酸激酶活性减弱。在一个实施方案中，本发明特别描述了泛酸生物合成途径进一步去调节或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径进一步去调节的这类重组微生物。
本发明还特别关注的是包括分离的coaX或coaA基因以及coaX和/或coaA突变基因的载体。除了分离的CoaX蛋白和突变CoaX蛋白，本发明还特别描述了包括分离的coaX基因或coaX突变基因的分离核酸分子。
上述核酸、载体和重组微生物在本发明实验方法中特别有用。特别是本发明描述的增加泛化合物生产的方法(如生产酮泛解酸，泛解酸和/或泛酸)，包括在可以增加泛化合物生产的条件下培养具有coaX突变基因的重组微生物。在一个实施方案中，重组微生物还包括一个coaA突变基因。在另一个实施方案中，重组微生物还包括avtA突变基因和/或ilvE突变基因和/或ansB突变基因和/或alsD突变基因。本发明还特别描述了应用本发明重组微生物和纯化CoaX蛋白鉴定泛酸调节子的方法。
本发明的其他特征和优点，将在以下详述部分和权利要求中清晰显现。附图简述
图1是泛酸生物合成途径的示意图。
图2是质粒pAN240的示意图，所述质粒包括P26panBCD盒上游连接序列，与PA221菌株中的整合版一致。
图3A是质粒pAN004的示意图，所述质粒包括P26和RBS1表达的panBCD操纵子。
图3B是质粒pAN006的示意图，所述质粒包括P26和RBS2表达的panBCD操纵子。
图4是质粒pAN236的示意图，所述质粒包括一个可以整合、扩增的P26-RBS2-panE1表达盒。
图5是构建质粒pAN423的示意图。
图6是构建质粒pAN426和pAN427的示意图。
图7是构建质粒pAN428和pAN429的示意图。
图8是构建质粒pAN431的示意图。
图9是构建质粒pAN441的示意图。
图10是构建质粒pAN440的示意图。
图11是质粒pAN251的示意图，设计的质粒通过双交换在panE1位点整合了单拷贝P26-panE1表达盒。
图12是质粒pAN267的示意图，设计的质粒在amyE位点整合了单拷贝P26-ilvBNC表达盒。
图13是质粒pAN257的示意图，在低拷贝载体中枯草芽孢杆菌ilvD克隆。
图14是质粒pAN263的示意图，设计的质粒在ilvD位点整合了单拷贝P26-ilvD表达盒。
图15是质粒pAN261的示意图，设计的质粒应用cat基因破坏了枯草芽孢杆菌ilvD基因。
图16是大肠杆菌中辅酶A生物合成途径的示意图。
图17是pAN296结构的示意图，设计的质粒去除了绝大部分枯草芽孢杆菌coaA基因，并用氯霉素耐药基因取代。
图18是枯草芽孢杆菌基因组coaA基因区结构的示意图。数值刻度以碱基对为单位，开放的箭头代表显著开放阅读框。
图19是质粒pAN281的示意图，该质粒在bpr位点整合后，用于表达枯草芽孢杆菌coaA。
图20A-B描述了6个已知或预期的微生物coaA基因编码的氨基酸序列的多序列比对(MSA)。序列4-6和1-3分别对应于麻风分支杆菌(Swiss ProtTM Accession No.Q9X795)、结核分支杆菌(SwissProtTM Accession No.O53440)、天蓝色链霉菌(Swiss ProtTMAccession No.O86799)、流感嗜血杆菌(Swiss ProtTM AccessionNo.P44793)、大肠杆菌(Swiss ProtTM Accession No.P15044)和枯草芽孢杆菌(Swiss ProtTM Accession No.P54556)的氨基酸序列。在Kyoto大学化学研究所，应用ClustalW MSA软件，在GenomeNet CLUSTALW服务器上进行比对。应用的参数如下：双序列比对，K-tuple(word)大小＝1，视窗大小＝5，Gap Penalty＝3，TopDiagonals数量＝5，评分方法＝百分比；多序列比对，Gap OpenPenalty＝10，Gap EXtension Penalty＝0.0，Weight Transition＝不，亲水残基＝甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸和赖氨酸，疏水间隙＝是；评分矩阵＝BLOSUM。
图21是枯草芽孢杆菌基因组coaX(yacB)基因区结构的示意图。数值刻度以碱基对为单位，开放的箭头代表显著开放阅读框，粗黑线代表某些预期的限制片段。
图22是pAN341和pAN342的结构示意图，所述质粒是枯草芽孢杆菌yacB(在本文又称为coaX)的两个独立PCR衍生克隆。
图23A-D描述了14个已知或预期微生物coaX基因的氨基酸序列的多序列比对(MSA)。序列9，74，7-8，75，11，10和12-18分别相应于枯草芽孢杆菌(Swiss ProtTM Accession No.P37564)，醋酪酸梭状芽孢杆菌(WITTM Accession No.RCA03301，Argonne国立图书馆)，天蓝色链霉菌(PIRTM Accession No.T36391)，结核分支杆菌(Swiss ProtTM Accession No.O06282)，荚膜红细菌(WITTMAccession No.RRC02473)，Desulfovibrio vulgaris(DBJTMAccession No.BAA21476.1)，耐放射微球菌(Swiss ProtTM AccessionNo.Q9RX54)，海栖热袍菌(GenBankTM Accession No.AAD35964.1)，梅毒螺旋体(Swiss ProtTM Accession No.O83446)，博氏疏螺旋体(Swiss ProtTM Accession No.O51477)，Aquifexaeolicus(SwissProtTM Accession No.O67753)，集胞蓝细菌(Swiss ProtTMAccession No.P74045)，幽门螺旋杆菌(Swiss ProtTM AccessionNo.O25533)以及百日咳鲍氏杆菌(Swiss ProtTM Accession No.Q45338)的氨基酸序列。在Kyoto大学化学研究所应用ClustalW MSA软件，在GenomeNet CLUSTALW服务器上进行比对。应用的参数如下：双序列比对，K-tuple(word)大小＝1，视窗大小＝5，Gap Penalty＝3，Top Diagonals数量＝5，评分方法＝百分比；多序列比对，GapOpen Penalty＝10，Gap Extension Penalty＝0.0，WeightTtansition＝不，亲水残基＝甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸和赖氨酸，疏水间隙＝是；评分矩阵＝BLOSUM。
图24描述了下列微生物coaA基因产物部分蛋白序列的多序列比对：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，流感嗜血杆菌，麻风分支杆菌，结核分支杆菌和天蓝色链霉菌。大肠杆菌coaA15(Ts)和枯草芽孢杆菌coaA282A的突变残基分别列于上下方进行比对。该部分分别对应于序列3的168-187氨基酸残基，序列2的167-186残基，序列1的165-184残基，序列4的169-188残基，序列5的169-188残基和序列6的179-198残基。
图25是pAN294的结构示意图，该质粒在其天然位点整合了经诱变处理的枯草芽孢杆菌coaA。
图26是pAN336的结构示意图，设计的质粒在其染色体位点上存在枯草芽孢杆菌coaX缺失，取而代之的是卡那霉素耐药基因。发明详述
本发明特别描述了利用微生物制备泛酸以及泛酸生物合成途径中其他关键化合物(本文又称为“泛化合物”，例如，泛酸，酮泛解酸，泛解酸和β丙氨酸)的新的改良方法，所述微生物的泛酸生物合成途径业已经过处理，可以生产泛酸或其他所需泛化合物。
本发明新的改良方法包括在微生物中制备泛化合物(如泛酸)的方法，所述微生物至少有一种泛酸生物合成途径酶经过处理，可以产生泛酸或其他所需泛化合物(如产量提高)。例如，本发明特别描述了在微生物中制备泛化合物(如泛酸)的方法，所述微生物至少有酮泛解酸羟甲基转移酶、酮泛解酸还原酶、泛酸合成酶或天门冬氨酸-α-脱羧酶中的一种经过处理，可以产生泛酸或其他所需泛化合物。本发明的方法还包括在微生物中制备泛化合物(如泛酸)的方法，所述微生物至少有一种本文所述的缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶经过处理，可以产生泛酸或其他所需泛化合物。例如，本发明特别描述了在微生物中制备泛化合物(如泛酸)的方法，所述微生物至少有一种乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸异构还原酶或双羟酸脱水酶经过处理，可以产生泛酸或其他所需泛化合物。
本发明还特别描述了制备泛化合物的方法，包括在可以产生泛化合物的条件下培养过量表达酮泛解酸还原酶(KPAR-O)的微生物。本发明还特别描述了以不依赖前体物质添加的形式制备泛酸的方法，包括在可以产生泛化合物的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物。本发明还特别关注的是不依赖于β丙氨酸的高产量泛酸生产方法，以及β丙氨酸制备方法。本发明还特别描述了增加泛化合物产量的方法，包括培养泛酸激酶突变株。特别是，本发明描述了应用泛酸激酶活性经过修饰的微生物制备泛酸和其他泛酸生物合成途径中关键化合物(例如，泛化合物)的新的改良方法，例如，包括coaX基因或coaX突变基因的微生物，泛酸激酶活性减低。
为了更好地理解本发明，这里首先对某些术语进行定义。
术语“泛酸生物合成途径”包括用于形成或合成泛酸的生物合成途径涉及的泛酸生物合成酶(如生物合成酶编码基因编码的多肽)、化合物(如前体物质、底物、中间产物或产品)和辅因子等。术语“泛酸生物合成途径”包括在微生物中(如体内)导致泛酸合成的生物合成途径，以及体外导致泛酸合成的生物合成途径。图1包括了泛酸生物合成途径的示意图。泛酸生物合成酶以黑体字代表，它们相应的基因以斜体字代表。
术语“泛酸生物合成酶”包括泛酸生物合成途径中用于形成化合物(如中间产物或产品)的任意酶。根据图1，从α酮异戊酸(α-KIV)合成泛解酸的过程，就经过中间产物酮泛解酸。酮泛解酸的形成是由泛酸生物合成酶酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)催化的。泛解酸的形成是由泛酸生物合成酶酮泛解酸还原酶(panE基因产物)催化的。从天门冬氨酸合成β丙氨酸是由泛酸生物合成酶天门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)催化的。从泛解酸和β丙氨酸合成泛酸(例如聚合)是由泛酸生物合成酶泛酸合成酶(panC基因产物)催化的。
术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括用于由丙酮酸转化形成或合成缬氨酸或异亮氨酸的生物合成途径涉及的异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶(如生物合成酶编码基因编码的多肽)、化合物(如前体物质、底物、中间产物或产品)和辅因子等。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括在微生物中(如体内)导致缬氨酸或异亮氨酸合成的生物合成途径，以及体外导致缬氨酸或异亮氨酸合成的生物合成途径。图1包括了异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径的示意图。异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶以黑体字代表，它们相应的基因以斜体字代表。
术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶”包括在异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中用于形成化合物(如中间产物或产品)的任意酶。根据图1，从丙酮酸合成缬氨酸的过程，就经过中间产物乙酰乳酸，α，β-双羟异戊酸(α，β-DHIV)和α酮异戊酸(α-KIV)。从丙酮酸形成乙酰乳酸是由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸合成酶(ilvBN基因产物，或者alsS基因产物)催化的。从乙酰乳酸形成α，β-DHIV是由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸异构还原酶(ilvC基因产物)催化的。从α，β-DHIV合成α-KIV是由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶双羟酸脱水酶(ilvD基因产物)催化的。而且，通过支链氨基酸转氨酶，缬氨酸和异亮氨酸可以互相转化。
如本文所用，酮泛解酸，泛解酸，β丙氨酸和泛酸中的每一种都是“泛化合物”。术语“泛化合物”包括泛酸生物合成途径中某一特定泛酸生物合成酶下游的化合物(如底物、中间产物或产品)。在一个实施例中，泛化合物位于泛酸生物合成酶酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)下游，可以包括酮泛解酸，泛解酸和/或泛酸。在另一个实施例中，泛化合物位于泛酸生物合成酶酮泛解酸还原酶(panE基因产物)下游，可以包括泛解酸和/或泛酸。在另一个实施例中，泛化合物位于泛酸生物合成酶泛酸合成酶(panC基因产物)下游，可以包括泛酸。在另一个实施例中，泛化合物位于泛酸生物合成酶天门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)下游，可以包括β丙氨酸和/或泛酸。
优选的泛化合物包括泛酸和泛解酸。术语“泛酸”包括泛酸的游离酸形式，也称为“泛酸”，及其盐类(例如，通过将泛酸或泛酸的酸性氢离子置换为阳离子，如钙、钠、钾、铵)，又称为“泛酸盐”。术语“泛化合物”还包括泛酸的醇衍生物。优选的泛酸盐是泛酸钙或泛酸钠。优选的醇衍生物是泛醇。本发明的泛酸盐和/或泛酸醇包括应用传统方法，从本文描述的游离酸制备的盐和/或醇。在另一个实施方案中，应用本发明微生物直接合成了泛酸钙。本发明的泛酸盐可以通过传统方法转化为泛酸或泛酸的游离酸形式。
术语“泛解酸”包括泛解酸的游离酸形式，也称为“泛解酸”，及其盐类(例如，通过将泛解酸或泛解酸的酸性氢离子置换为阳离子，如钙、钠、钾、铵)，又称为“泛解酸盐”。优选的泛解酸盐是泛解酸钙或泛解酸钠。本发明的泛解酸盐包括应用传统方法，从本文描述的游离酸制备的盐。本发明的泛解酸盐可以通过传统方法转化为泛解酸或泛解酸的游离酸形式。而且，泛解酸或泛解酸的游离酸形式可以通过传统方法转化为泛内酯。
术语“CoA生物合成途径”包括用于由泛酸形成或合成CoA的生物合成途径涉及的CoA生物合成酶(如生物合成酶编码基因编码的多肽)、化合物(如前体物质、底物、中间产物或产品)和辅因子等。大肠杆菌中CoA生物合成途径的示意图见图16。(假定其他微生物也应用描述的途径)。术语“CoA生物合成途径”包括在微生物中(如体内)导致CoA合成的生物合成途径，以及体外导致CoA合成的生物合成途径。术语“辅酶A或CoA生物合成酶”包括在CoA生物合成途径中用于形成化合物(如中间产物或产品)的任意酶，例如，催化泛酸磷酸化以形成4’-磷酸泛酸的coaA，panK或coaX基因产物，或者催化4’-磷酸泛酰巯基乙胺转化为去磷辅酶A的coaD基因产物。
I.重组微生物和培养微生物的方法，用来制备泛化合物
本发明方法特别描述了微生物，例如重组微生物，优选包括本文描述的载体或基因(如野生型和/或突变基因)，和/或以能够产生所需产品(如一种或多种泛化合物)的方式培养。术语“重组”微生物包括经遗传改变、修饰或工程改良(例如遗传工程)的微生物(如细菌、酵母细胞、真菌细胞等)，衍生的微生物与天然微生物相比，呈现改变、修饰或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。优选地，本发明“重组”微生物经遗传工程学修饰，过量表达至少一种本文描述的细菌基因或基因产物(如泛酸或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶编码基因)，优选在重组载体中包括本文所述的生物合成酶编码基因和/或从重组载体表达的生物合成酶。普通技术人员可以理解的是，微生物表达或过量表达一种基因产物，作为的编码基因产物核酸序列和/或基因表达或过量表达的结果，可以生成或过量生成该基因产物。
术语“经处理微生物”包括经工程改良(如遗传工程改良)或修饰的微生物，这样微生物的至少一种泛酸生物合成途径酶和/或至少一种异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径酶被修饰，可以产生泛酸或其他所需泛化合物。对这些微生物的修饰或工程改良可以根据本文所述的任意方法进行，包括但不限于生物合成途径的去调节和/或至少一种生物合成酶的过量表达。“经处理的酶”(如“经处理的生物合成酶”)包括表达或产物业已改变或修饰的酶，这样，例如与相应的野生型或天然酶相比，酶的至少一种上游或下游前体物质、底物或产品发生改变或修饰。
术语“过量表达的”或“过量表达”包括一种基因产物(如泛酸生物合成酶或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶)的表达，其水平高于该微生物处理前或未经处理的可比微生物的表达水平。在一个实施方案中，微生物经遗传学处理(如基因工程学处理)，使基因产物过量表达，水平高于该微生物处理前或未经处理的可比微生物的表达水平。遗传学处理包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如，添加强启动子、可诱导启动子或多个启动子，或者去除调控序列，使表达成为组成型的)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因邻近的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(如调控蛋白，抑制子，增强子，转录激活子等)，以及本领域常规应用的其他去调节特定基因表达的方法(包括但不限于应用反义核酸分子，例如阻断抑制子蛋白的表达)。
在另一个实施方案中，微生物可以经物理或环境处理，使基因产物过量表达，水平高于该微生物处理前或未经处理的可比微生物的表达水平。例如，可以应用一种已知或怀疑能够增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的物质处理微生物，或在该物质存在的情况下培养微生物，使转录和/或翻译增强或增加。此外，微生物还可以在能够增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的所选温度下培养，使转录和/或翻译增强或增加。
术语“去调节的”或“去调节”包括改变或修饰微生物中至少一个编码生物合成途径酶的基因，使该生物合成酶在微生物中的水平或活性发生改变或修饰。优选至少一个编码生物合成途径酶的基因经改变或修饰，使基因产物提高或增加。短语“去调节途径”包括生物合成途径，其中1个以上的编码生物合成途径酶的基因经改变或修饰，使1个以上的生物合成酶水平或活性发生改变或修饰。微生物中“去调节”一个途径(如同时去调节给定生物合成途径中1个以上的基因)的能力起因于微生物的一种特殊现象，所述微生物中，在称为“操纵子”的连续基因物质上存在的邻近基因，编码1种以上的酶(如两个或三种生物合成酶)。
术语“操纵子”包括基因表达的协同单位，包括与一个或更多的，优选至少两个结构基因(例如编码酶的基因，如生物合成酶)相关的启动子和可能的调控因子。结构基因的表达可以协同调控，例如通过调控蛋白与调控序列结合或通过抗转录终止来调控。结构基因可以转录成编码所有结构蛋白的单独mRNA。由于操纵子中包括的基因的协同调控作用，对单独启动子和/或调控因子的改变或修饰可以导致操纵子编码的每一个基因产物都发生改变或修饰。调控因子的改变或修饰包括但不限于去除内源性启动子和/或调控因子；添加强启动子、可诱导启动子或多个启动子，或者去除调控序列，使基因产物的表达得到修饰；修饰操纵子的染色体位置；改变位于操纵子内或与操纵子邻近的核酸序列，如核糖体结合位点；增加操纵子的拷贝数；修饰涉及操纵子转录和/或操纵子基因产物翻译的蛋白质(如调控蛋白，抑制子，增强子，转录激活子等)；以及本领域常规应用的其他去调节基因表达的方法(包括但不限于应用反义核酸分子，例如阻断抑制子蛋白的表达)。去调节还可包括改变一个或多个基因的编码区，以产生例如一种耐反馈或比性活性更高或更低的酶。
本发明特别优选的“重组”微生物经基因工程学修饰，过量表达源于细菌的基因或基因产物。术语“源于细菌”或“源于”(例如细菌)包括在细菌中天然存在的基因或由细菌基因(如panB，panE，panC，panD，ilvB，ilvN，alsS，ilvC或ilvD编码)编码的基因产物(如酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶，泛酸合成酶，天门冬氨酸-α-脱羧酶，乙酰羟酸合成酶，乙酰羟酸异构还原酶或双羟酸脱水酶)。
本发明的方法特别描述了至少过量表达一种酮泛解酸羟甲基转移酶、酮泛解酸还原酶、泛酸合成酶或天门冬氨酸-α-脱羧酶的重组微生物。本发明特别优选的重组微生物经基因工程学修饰，过量表达杆菌(如地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，Bacillus halodurans，枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等)的生物合成酶(如，经工程学修饰过量表达至少一种枯草芽孢杆菌酮泛解酸还原酶(panE基因产物)(如，酮泛解酸还原酶具有序列30的氨基酸序列，或由序列29的核酸序列编码)，枯草芽孢杆菌酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)(如，酮泛解酸羟甲基转移酶具有序列24的氨基酸序列，或由具有序列23核苷酸序列的核酸分子编码)，枯草芽孢杆菌泛酸合成酶(panC基因产物)(如，泛酸合成酶具有序列26的氨基酸序列，或由具有序列25核苷酸序列的核酸分子编码)，和/或枯草芽孢杆菌天门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)(如，天门冬氨酸-α-脱羧酶具有序列28的氨基酸序列，或由具有序列27核苷酸序列的核酸分子编码)。
在一个示例实施方案中，本发明特别描述了一种微生物(如KPAR-O微生物)，所述微生物业已转化了含有panE核酸序列(例如，序列29所示panE核酸序列)的载体。在另一个实施方案中，本发明特别描述了应用含有panB核酸序列(例如，序列23所示panB核酸序列)的载体、含有panC核酸序列(例如，序列25所示panC核酸序列)的载体、或含有panD核酸序列(例如，序列27所示panD核酸序列)的载体转化的微生物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了panBCD操纵子去调节的微生物(如序列59)。
本发明其他优选“重组”微生物具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径。短语“异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节微生物”包括这样的微生物，其中至少一个编码异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径酶的基因发生改变或修饰，或者其操纵子发生改变或修饰，所述操纵子包括一个以上编码异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径酶的基因。优选的“异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节微生物”经基因工程学修饰，过量表达杆菌(如枯草芽孢杆菌)的ilv生物合成酶(如，经工程学修饰过量表达至少一种乙酰羟酸合成酶(ilvBN基因产物或alsS基因产物)(如，乙酰羟酸合成酶的亚单位具有序列32和34的氨基酸序列，或由具有序列31和33核苷酸序列的核酸分子编码，或由具有序列58中1-2246核苷酸序列的核酸分子编码，或由具有序列86核苷酸序列的核酸分子编码的乙酰羟酸合成酶)，乙酰羟酸异构还原酶(ilvC基因产物)(如，乙酰羟酸异构还原酶具有序列36的氨基酸序列，或由具有序列35核苷酸序列的核酸分子编码)，双羟酸脱水酶(ilvD基因产物)(如，双羟酸脱水酶具有序列38的氨基酸序列，或由具有序列37核苷酸序列的核酸分子编码)，和/或业已应用包括ilvBNC核酸序列(序列58，1-1725，1722-2246和2263-3291号核苷酸的编码区)和/或ilvD核酸序列(序列37)的载体转化)。
在另一个优选实施方案中，设计或工程学修饰的重组微生物表达突变的CoaA和/或CoaX生物合成酶，并过量表达或去调节至少一种泛酸生物合成酶和/或至少一种异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶。
在另一个优选实施方案中，本发明微生物过量表达或表达突变的源于细菌的基因或生物合成酶(例如，CoA生物合成酶，泛酸生物合成酶或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶)。术语“源于细菌”或“源于”例如细菌包括由细菌基因(如panB，panE，panC，panD，ilvBN(或alsS)，ilvC，ilvD或由coaA或coaX编码)编码的基因产物(如酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶，泛酸合成酶，天门冬氨酸-α-脱羧酶，乙酰羟酸合成酶，乙酰羟酸异构还原酶，双羟酸脱水酶或泛酸激酶)。
本发明其他优选重组微生物是突变微生物。本文应用的术语“突变微生物”包括重组微生物，该重组微生物经基因工程学修饰，表达突变基因或蛋白，所述基因或蛋白可以由微生物正常或天然表达。优选的突变微生物表达突变基因或蛋白，使该微生物呈现改变、修饰或不同的表型(如经工程学修饰表达突变CoaA生物合成酶，例如泛酸激酶)。在一个实施方案中，设计或工程学修饰的突变微生物包括本文定义的突变coaX基因。在另一个实施方案中，设计或工程学修饰的重组微生物包括本文定义的突变coaA基因。在另一个实施方案中，设计或工程学修饰的突变微生物具有coaX基因缺失(即，不能产生coaX基因编码的蛋白)。在另一个实施方案中，设计或工程学修饰的突变微生物具有coaA基因缺失(即，不能产生coaA基因编码的蛋白)。优选的突变微生物具有coaX突变基因或coaA突变基因，或者经工程学修饰，具有coaX基因和/或coaA基因缺失，使突变微生物编码“降低了的泛酸激酶活性”。在完整微生物前提下，“降低了的泛酸激酶活性”可以通过检测或测定CoA生物合成途径中间产物或产品的减少来确定，例如，可以检测或测定微生物(如分离或源于微生物的溶菌液)或微生物培养基中的4’-磷酸泛酸、4’-磷酸泛酰半胱氨酸、4’-磷酸泛酰巯基乙胺、去磷辅酶A、辅酶A、apo-酰基载体蛋白(apo-ACP)或holo-酰基载体蛋白(ACP)(见，例如图16)。此外，“泛酸激酶活性降低”还可通过检测或测定微生物生长延缓来确定。此外，“降低了的泛酸激酶活性”还可通过检测或测定微生物或周围培养基中泛化合物(如泛酸)的增加来确定，因为泛化合物位于CoA生物合成途径的上游，而CoA生物合成途径的第一步是由泛酸激酶催化的。本发明还特别关注的重组微生物除了泛酸激酶活性降低之外(如表达coaA突变基因和/或coaX突变基因)，还具有去调节的泛酸生物合成途径和/或去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径。
在一个实施方案中，本发明重组微生物是革兰阳性生物(例如，可以保留碱性染料如结晶紫的微生物，由于存在包绕微生物的革兰阳性壁)。在一个优选实施方案中，重组微生物是属于选自芽胞杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、乳球菌和链霉菌属的微生物。在一个更优选实施方案中，重组微生物是芽胞杆菌属。在另一个优选实施方案中，重组微生物选自枯草芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、泛酸芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和其他第一组杆菌，例如以16S rRNA型为特征(Priest(1993)in Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteriaeds.Sonenshein et al.，ASM，Washington，D.C.，p.6)。在另一个优选实施方案中，重组微生物是短芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一个优选实施方案中，重组微生物选自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Bacillus halodurans、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。
在另一个实施方案中，重组微生物是革兰阴性(排斥碱性染料)生物。在一个优选实施方案中，重组微生物是属于选自沙门氏菌属、埃希氏菌属、克雷白菌属、沙雷氏菌属和变形菌属的微生物。在一个更优选实施方案中，重组微生物是埃希氏菌属。在一个更加优选的实施方案中，重组微生物是大肠杆菌。在另一个实施方案中，重组微生物是酵母菌(如酿酒酵母)。
本发明的一个重要方面包括培养本文所述的重组微生物，从而制备所需化合物(如所需泛化合物)。术语“培养”包括维持和/或生长本发明的活微生物(如维持和/或生长培养物或菌株)。在一个实施方案中，本发明微生物培养于液体培养基中。在另一个实施方案中，本发明微生物培养于固体或半固体培养基中。在一个优选实施方案中，本发明微生物培养于培养基中(如无菌液体培养基)，所述培养基含有微生物维持和/或生长的必需或有益营养元素(例如，碳源或碳底物，如碳水化合物复合物，如食用豆类或谷类，淀粉，糖，糖醇，碳氢化合物，油，脂肪，脂肪酸，有机酸和醇；氮源，如植物蛋白，蛋白胨，谷物，豆类和块茎衍生性肽和氨基酸，动物性蛋白、肽和氨基酸，如肉类、奶和动物性副产品如蛋白胨、肉类提取物和酪蛋白水解产物；无机氮源，如尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵和磷酸铵；磷源，如磷酸及其钠、钾盐类；痕量元素，如镁，铁，锰，钙，铜，锌，硼，钼和/或钴盐；以及生长因子如氨基酸，维生素和生长激动剂等)。
优选地，本发明微生物在控制pH的条件下培养。术语“控制pH”，包括任何可以导致所需产物(如泛化合物)生成的pH。在一个实施方案中，微生物在pH大约为7的条件下培养。在另一个实施方案中，微生物在pH6.0-8.5的条件下培养。所需pH可以通过本领域技术人员熟知的任何方法来维持。
同样优选地，本发明微生物在控制通风的条件下培养。术语“控制通风”包括可以导致所需产物(如泛化合物)生成的充分通风(如氧气)。在一个实施方案中，通风通过调节培养物中氧水平来控制，例如，通过调节溶解于培养基中的氧含量来控制。优选地，培养物通风通过摇动培养物来控制。摇动可以利用螺旋推进器或类似的摇动机械装置，也可以利用晃动或摆动培养容器(如发酵罐)，还可以利用多种泵装置。通风还可以利用无菌空气或氧气通过培养基(如通过发酵混合物)来进一步控制。同样优选地，本发明微生物在没有过多泡沫的条件下培养(如，通过添加防沫剂)。
而且，本发明微生物还在控制温度的条件下培养。术语“控制温度”包括可以导致所需产物(如泛化合物)生成的任何温度。在一个实施方案中，控制温度包括15-95℃。在另一个实施方案中，控制温度包括15-70℃。优选温度为20-55℃，更优选30-45℃或30-50℃。
微生物可以在液体培养基中培养(如维持和/或生长)，优选通过传统培养方法、通风旋转控制培养或发酵培养，可以连续培养，也可以间断培养，所述传统培养方法如固定培养，试管培养，摇动培养(如旋转摇动培养，摇动培养瓶培养等)。在一个优选实施方案中，微生物在摇动的培养瓶中培养。在一个更优选实施方案中，微生物在发酵罐中培养(如发酵法)。本发明发酵法包括但不限于批量发酵法、补料批量发酵法和连续发酵法。短语“批量法”或“批量发酵法”是指一个封闭的系统，其中培养基、营养物质和添加剂等组分在发酵开始时就已设定，在整个发酵过程中不再改变，但是，可以试图控制如pH和氧浓度等因素，防止培养基的过度酸化和/或微生物死亡。短语“补料批量法”或“补料批量”发酵法是指除了在发酵过程中添加一种或多种底物或添加剂(如增量添加或连续添加)以外，均与批量发酵法相同的发酵方法。短语“连续法”或“连续发酵法”是指这样一个系统，其中特定的发酵培养基连续加入发酵罐，同时排出等量已经用过的或“条件化”的培养基，优选用于回收所需产品(如泛化合物)。业已开发出很多这样的方法，并在本领域众所周知。
短语“在能够制备所需化合物(如泛化合物，例如泛酸)的条件下培养”包括在这样的条件下维持和/或生长微生物，所述条件(如温度，压力，pH，培养时间等)适于或充分适于所需化合物的生成，或者能够获得产生的特定化合物的所需产量。例如，连续培养一段时间，可以充分产生所需量的泛化合物(如泛酸，泛解酸或β丙氨酸)。优选地，连续培养时间可以充分达到泛化合物的几乎最高产量。在一个实施方案中，连续培养大约12-24小时。在另一个实施方案中，连续培养大约24-36小时，36-48小时，48-72小时，72-96小时，96-120小时，120-144小时，或者144小时以上。在另一个实施方案中，连续培养的时间足以达到泛化合物的产量，例如，细胞培养至少产生泛化合物约15-20g/L，至少产生泛化合物约20-25g/L，至少产生泛化合物约25-30g/L，至少产生泛化合物约30-35g/L，至少产生泛化合物约35-40g/L(例如，泛化合物至少大约37g/L)，或者至少产生泛化合物约40-50g/L。在另一个实施方案中，微生物在一定的条件下培养，使其在大约24小时、36小时、48小时、72小时或96小时内产生优选产量的泛化合物，例如上述范围内的产量。
本发明方法还进一步包括回收所需化合物(如泛化合物)的步骤。术语“回收”所需化合物(如泛化合物)包括从培养基中提取、收获、分离或纯化化合物。可以根据任何本领域已知的传统分离或纯化方法进行化合物的回收，所述方法包括但不限于应用传统树脂处理(如阴离子或阳离子交换树脂，非离子吸附树脂等)，应用传统吸附剂处理(如活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、矾土等)，改变pH，溶剂提取(如应用传统溶剂如乙醇、乙酸乙酯、己烷等)，透析，过滤，浓缩，结晶，再结晶，pH调整，冻干等。例如，从培养基中回收化合物(如泛化合物)可以首先从培养物中去除微生物。然后使培养基通过阳离子交换树脂以去除不需要的阳离子，然后再通过阴离子交换树脂以去除不需要的无机阴离子和有机酸，所述有机酸的酸性强于感兴趣泛化合物(如泛酸)。随后可以按照本文所述，将获得的泛化合物(如泛酸)转化为泛酸盐(如泛酸钙)。
优选地，本发明所需化合物是“提取”、“分离”或“纯化”的，这样，获得的制剂基本不含其他成分(例如，不含培养基成分和/或发酵副产品)。短语“基本不含其他成分”包括所需化合物制剂，其中化合物与制备它所用的培养物的培养基成分或发酵副产品分离(如纯化或部分纯化)。在一个实施方案中，所需化合物(干重)占制剂大约80％以上(例如，其他培养基成分或发酵到产品少于20％)，更优选所需化合物占制剂大约90％以上(例如，其他培养基成分或发酵到产品少于10％)，更优选所需化合物占制剂大约95％以上(例如，其他培养基成分或发酵到产品少于5％)，最优选所需化合物占制剂大约98-99％以上(例如，其他培养基成分或发酵到产品少于1-2％)。如果所需化合物是业已转化为盐形式的泛化合物(例如，泛酸盐或泛解酸盐)，泛化合物优选还不含(如基本不含)与盐形成相关的化学污染物。如果所需化合物是业已转化为醇形式的泛化合物，泛化合物优选还不含(如基本不含)与醇形成相关的化学污染物。
在另一个实施方案中，例如当微生物生物学无害时(如安全)，所需泛化合物可以不从微生物中纯化。例如，完全培养物(或培养上清)可以作为产品源(如产品原料)。在一个实施方案中，培养物(或培养上清)上清在没有修饰的情况下应用。在另一个实施方案中，培养物(或培养上清)经浓度。在另一个实施方案中，培养物(或培养上清)干燥或冻干。
II.以过量表达酮泛解酸还原酶微生物为对象的泛化合物制备方
法
本发明的一个方面特别描述了制备泛化合物的方法，包括在能够制备泛化合物的条件下培养过量表达酮泛解酸还原酶(KPAR-O)的微生物。术语“过量表达酮泛解酸还原酶(KPAR-O)的微生物”包括经处理使酮泛解酸还原酶过量表达(如枯草芽孢杆菌酮泛解酸还原酶蛋白，具有序列30的氨基酸序列)的微生物，和/或业已转化了含有panEl核酸序列(如序列29所示的枯草芽孢杆菌panE1核酸序列)载体的微生物。在一个实施方案中，泛化合物是泛酸。在另一个实施方案中，泛化合物是泛解酸。在另一个实施方案中，酮泛解酸还原酶是源于细菌的。在另一个实施方案中，酮泛解酸还原酶源自芽胞杆菌(如源自枯草芽孢杆菌)。在另一个实施方案中，KPAR-O微生物是革兰阳性的。在另一个实施方案中，KPAR-O微生物是属于选自芽胞杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、乳球菌和链霉菌属的微生物。在一个优选实施方案中，KPAR-O微生物是杆菌属。在一个更优选实施方案中，KPAR-O微生物选自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Bacillus halodurans、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。在一个特别优选实施方案中，KPAR-O微生物是枯草芽孢杆菌。
在另一个实施方案中，KPAR-O微生物除了过量表达酮泛解酸还原酶外，还过量表达至少一种泛酸生物合成酶。在一个示例实施方案中，KPAR-O微生物还进一步过量表达至少一种酮泛解酸羟甲基转移酶、泛酸合成酶和天门冬氨酸-α-脱羧酶。本发明还特别关注的是制备泛化合物的方法，例如，包括培养KPAR-O微生物的方法，该方法还进一步包括回收泛化合物的步骤。
III.不依赖添加前体的制备泛化合物的方法
基于处理的生物合成酶或生物合成酶组合，需要或必须为本发明微生物提供(例如添加)至少一种泛酸生物合成前体，以制备泛酸或其他所需泛化合物。术语“泛酸生物合成前体”或“前体”包括一种试剂或化合物。如果把这种试剂或化合物提供给微生物、或者与微生物接触，或者包括在微生物培养基中，能够提高或增加泛酸生物合成的试剂或化合物，在一个实施方案中，泛酸生物合成前体或前体物质是天门冬氨酸。在另一个实施方案中，泛酸生物合成前体或前体物质是β丙氨酸。天门冬氨酸或β丙氨酸的添加量优选在培养基中的浓度足以增加微生物的产量(如足以提高泛化合物产量的浓度，所述泛化合物如β丙氨酸、酮泛解酸、泛解酸或泛酸)。本发明的泛酸生物合成前体可以浓缩溶液或悬液的形式(例如溶于适宜溶剂，如水或缓冲液)或固体形式(如以粉末的形式)添加。而且，本发明泛酸生物合成前体可以在给定的一段时间内，以单独等分、连续或间断的形式添加。
在另一个实施方案中，泛酸生物合成前体是缬氨酸，见例如实施例III。在另一个实施方案中，泛酸生物合成前体是α酮异戊酸。优选地，缬氨酸或α酮异戊酸的添加量在培养基中形成的浓度足以生成所需产品(如泛化合物)。泛酸生物合成前体在本文还被称为“泛酸生物合成添加底物”。
假设本发明泛酸生物合成方法应用的泛酸生物合成前体价格昂贵，例如，在这些方法用来制备高产量泛化合物时。因此，本发明的优选方法特别关注至少一种生物合成酶或生物合成酶组合(例如，至少一种泛酸生物合成酶和/或缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶)经处理的微生物，这样，可以以不依赖添加前体的形式制备泛酸或其他所需泛化合物。例如，在指一种制备所需化合物(如泛化合物)的方法时，短语“不依赖添加前体的形式”包括制备所需化合物的方法或形式，所需化合物的制备不依赖为用于制备所需化合物的微生物提供(如添加)前体物质。例如，本发明方法特别关注的微生物可以在不需添加前体物质天门冬氨酸、β丙氨酸、缬氨酸和/或α-KIV的情况下，用来制备泛化合物。
本发明的其他优选方法特别关注至少一种生物合成酶或生物合成酶组合经处理的微生物，这样，可以以基本不依赖添加前体的形式制备泛酸或其他所需泛化合物。短语“基本不依赖添加前体的形式”包括制备所需化合物的手段或方法，用来制备所需化合物的微生物对提供(如添加)的前体物质的依赖程度较低。例如，本发明方法特别关注的微生物可以在所需前体物质天门冬氨酸、β丙氨酸、缬氨酸和/或α-KIV添加量大大减少的情况下，制备泛化合物。在一个实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物(如泛酸)的方法，在该方法中，相较于对照微生物(例如，为了有效制备所需化合物，依赖如完全依赖前体物质添加的微生物)，需要添加的前体物质少5-10％。在另一个实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物的方法，在该方法中，相较于对照微生物，需要添加的前体物质少15-20％。在另一个实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物的方法，在该方法中，相较于对照微生物，需要添加的前体物质少25-30％，35-40％，45-50％或55-60％。例如，如本文实施例III所述，本发明方法特别关注的微生物需要5g/L的天门冬氨酸，β丙氨酸，缬氨酸或α酮异戊酸(例如，在试管或摇动培养瓶培养中)。因此，在一个优选实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物(如泛酸)的方法，该方法所需添加的前体物质低于0.25g/L，0.5g/L，0.75g/L，1g/L，1.25g/L，1.5g/L，1.75g/L，2g/L，2.25g/L，2.5g/L，2.75g/L或3g/L。
以不依赖前体物质添加的形式或者以基本不依赖前体物质添加的形式制备所需化合物(如泛化合物)的优选方法包括培养微生物，所述微生物业已经过处理(如设计或工程学修饰，例如基因工程学修饰)，因此，至少一种泛酸生物合成酶和/或至少一种异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶的表达发生改变。例如，在一个实施方案中，微生物经处理(如设计或工程学修饰)，因此，至少一种泛酸生物合成酶和/或至少一种异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶的生成去调节。在一个优选实施方案中，微生物经处理(如设计或工程学修饰)，因此，具有一个去调节的生物合成途径，例如，如本文定义的去调节泛酸生物合成途径和/或去调节异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径。在另一个优选实施方案中，微生物经处理(如设计或工程学修饰)，因此，至少一种泛酸生物合成酶和/或至少一种异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶过量表达。
以不依赖前体物质添加的形式或者以基本不依赖前体物质添加的形式制备所需化合物(如泛化合物)的优选方法如下。在一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖前体物质添加的形式制备泛酸的方法，包括在能够产生泛酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物，所述微生物的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖前体物质添加的形式制备泛酸的方法，包括在能够产生泛酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物，所述微生物的泛酸(pan)途径和异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径均去调节。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖添加天门冬氨酸或β丙氨酸的形式制备泛酸的方法，包括在能够产生泛酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种以不依赖添加缬氨酸或α酮异戊酸的形式制备泛酸的方法，包括在能够产生泛酸的条件下培养异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径去调节的微生物。
术语“过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物”包括经过处理过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶的微生物。优选的“过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物”业已转化了含有枯草芽孢杆菌panD核酸序列(例如，编码天门冬氨酸-α-脱羧酶蛋白的panD核酸序列，所述天门冬氨酸-α-脱羧酶蛋白具有序列28的氨基酸序列，例如panD核酸序列如序列27所述)的载体。
术语“异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节的微生物”包括至少一个异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径酶编码基因发生改变或修饰的微生物，以及包括1个以上异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径酶编码基因的操纵子发生改变或修饰的微生物。优选的“异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节的微生物”过量表达乙酰羟酸合成酶(例如，乙酰羟酸合成酶的亚单位具有序列32和34的氨基酸序列，或乙酰羟酸合成酶具有序列87的氨基酸序列)，乙酰羟酸异构还原酶(具有序列36的氨基酸序列)或双羟酸脱水酶(具有序列38的氨基酸序列)，和/或业已转化了含有ilvB，ilvN，ilvC，ilvBN，ilvBNC或alsS核酸序列(分别为序列31，序列33，序列35，序列58的1-2246核苷酸，序列58编码区的1-1725，1722-2246和2263-3291核苷酸，或序列86)和/或ilvD核酸序列(序列37)的载体。
IV.高产量生产方法
本发明特别优选的实施方案是生产泛酸的高产量制备方法，包括在可以显著提高产量的情况下培养经处理微生物。短语“高产量制备方法”，例如，高产量制备所需化合物(如制备泛化合物)的方法包括这样一种方法，所述方法制备的所需化合物水平提高或高于通常所用的可比制备方法。优选的高产量制备方法导致生产的所需化合物产量显著提高。短语“产量显著提高”包括制备或生产的水平充分提高或高于通常所用的可比制备方法，例如，所述水平提高到足以商业生产所需化合物的水平(例如，以商业可行的价格制备产品)。在一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使泛酸的生产水平高于2g/L。在另一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使泛酸的生产水平高于10g/L。在另一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使泛酸的生产水平高于20g/L。在另一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使泛酸的生产水平高于30g/L。在另一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使泛酸的生产水平高于40g/L。
本发明还特别描述了生产所需化合物(例如，生产泛化合物)的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使制备的化合物在商业所需时间内达到足够高的水平。在一个示例实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使制备的泛酸在36小时内超过15-20g/L的水平。在另一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使制备的泛酸在48小时内超过25-30g/L的水平。在另一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使制备的泛酸在72小时内超过35-40g/L的水平，例如72小时内超过37g/L。在另一个实施方案中，本发明特别描述了生产泛酸的高产量制备方法，包括在一定条件下培养经处理微生物，使制备的泛酸在60小时内超过30-40g/L的水平，例如60小时内超过30，35或40g/L。包括在这里所述范围之内的中间数值和范围，也属于本发明范畴。例如，制备的泛酸在60小时内达到至少31，32，33，34，35，36，37，38和39g/L的水平，就属于60小时内30-40g/L的范畴。在另一个实施例中，30-35g/L或35-40g/L也属于60小时内30-40g/L的范畴。而且，应该指出，培养经处理微生物达到生产水平，例如“60小时30-40g/L”，还包括延长培养微生物时间(例如，培养时间段长于60小时)，可选导致的泛酸产量更高。
V.以泛酸激酶突变微生物为对象的泛化合物制备方法
本发明涉及应用工程学修饰的微生物制备泛酸的方法，所述微生物经工程学修饰后，可以高产量生成泛酸以及其他泛化合物。过量生成泛酸的细胞可以导致细胞内高泛酸水平，该水平可以克服CoA对泛酸激酶的反馈抑制，导致CoA的过量生成。除了泛酸消耗，CoA的合成增加还会导致对PanB，PanD，PanE或PanC反应的反馈抑制增强，并进而限制泛酸的生成。因此，降低泛酸激酶活性可能导致CoA水平的下降，进而导致PanB，PanD，PanE或PanC活性的增强，以及泛酸产量的增加。
因此，本发明的某些方法至少部分基于枯草芽孢杆菌coaA基因的鉴定和特征鉴别，并证实该基因既不是枯草芽孢杆菌生长必需的(即，枯草芽孢杆菌染色体coaA基因缺失并非致死性事件)，也不是枯草芽孢杆菌中泛酸激酶活性必需的。第二个泛酸激酶编码基因业已在枯草芽孢杆菌中鉴定，其特征也已披露，并被命名为“coaX”。该基因存在于包括温度敏感性泛酸激酶的大肠杆菌突变株中，通过同源性分析发现，该基因与以前已知的任何一种泛酸激酶基因不相关。
一个方面，本发明方法特别描述了包括coaX基因或包括coaX突变基因的重组微生物，其泛酸激酶活性降低。在一个实施方案中，这些方法还特别描述了这些重组微生物，其中泛酸生物合成途径进一步去调节。在另一个实施方案中，这些方法特别描述了这些重组微生物，其中异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径进一步去调节。在一个优选实施方案中，微生物属于芽胞杆菌属(如枯草芽孢杆菌)。
本发明方法还特别描述了包括coaA基因或包括coaA突变基因的重组微生物(例如，微生物属于杆菌属，如枯草芽孢杆菌)，可选包括coaX基因或coaX突变基因，其泛酸激酶活性降低。在一个实施方案中，这些方法还特别描述了这些重组微生物，其中泛酸生物合成途径或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径进一步去调节。本发明还特别关注的是包括分离的coaX或coaA基因以及突变coaX和/或coaA基因的载体。除了分离的CoaX蛋白和突变CoaX蛋白，本发明还特别描述了包括分离的coaX基因或突变coaX基因的分离核酸分子。
上述核酸分子(如基因)、蛋白、载体和重组微生物(如突变微生物)特别适用于制备泛化合物的方法和/或增加泛化合物产量的方法。在一个实施方案中，本发明特别描述了一种制备泛化合物(如泛酸)的方法，包括在一定条件下培养泛酸激酶突变株(例如，异常表达，如突变的，本文定义的泛酸激酶的重组微生物)，以制备泛化合物。在另一个实施方案中，本发明特别描述了一种增加泛化合物(如泛酸)产量的方法，包括在一定条件下培养泛酸激酶突变株(例如，异常表达，如突变的，本文定义的泛酸激酶的重组微生物)，以制备泛化合物。本文所用术语“增加”(例如，在短语“增加产量”中)包括与非突变微生物(如具有正常泛酸激酶基因和/或具有正常泛酸生产率和/或水平的微生物)的生产水平或生产率相比，泛化合物(如泛酸)的生产水平或生产率增加。
优选地，与非突变株(如表达非突变泛酸激酶的重组微生物)生产水平相比，以本发明泛酸激酶突变株为对象的方法制备的泛化合物水平增加至少5％。更优选地，与以非突变株为对象的方法相比，泛化合物水平增加10％。更优选地，与以非突变株为对象的方法相比，泛化合物水平(如泛酸水平)增加20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，增加2倍，5倍，10倍，50倍，100倍或更多。
VI.其他导致泛化合物产量增加的突变
本发明方法还进一步包括，例如除了过量表达或去调节泛酸生物合成酶和/或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶外，或者除了使泛酸激酶编码基因突变外，使催化关键泛酸生物合成底物或前体物质转化成不欲或不需产物的酶去调节或突变。例如，除了使泛酸激酶编码酶突变外，使ilvE基因(Kuramitsu et al.(1985)J.Biochem.97：933-999)或其类似物(序列62或序列64)突变，限制α酮异戊酸转化为缬氨酸，预期可以导致泛化合物产量的进一步提高或增加。此外，除了使泛酸激酶编码酶突变外，使ansB基因(Sun and Seflow(1991)J.Bacteriol.173：3831-3845)或其类似物(序列66)突变，限制天门冬氨酸的降解，预期可以导致泛化合物产量的进一步提高或增加。此外，除了使泛酸激酶编码酶突变外，使alsD基因(Renna et al.(1993)J.Bacteriol.175：3863-3875)或其类似物(序列68)突变，限制乙酰乳酸转化为乙酰甲基原醇，预期可以导致泛化合物产量的进一步提高或增加。此外，除了使泛酸激酶编码酶突变外，使编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的avtA基因或其类似物突变，限制α酮异戊酸转化为缬氨酸，预期可以导致泛化合物产量的进一步提高或增加。avtA基因突变包括使具有序列70核苷酸序列的avtA基因(例如大肠杆菌的avtA基因)突变，或其结构类似物(如编码蛋白与序列71氨基酸序列具有30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-95％或更高一致性的类似物)突变，或功能类似物(如编码具有丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性的结构不相关蛋白的基因)突变。这些突变可以通过实施例中的示例方法获得(例如，实施例XIII，XV，XVI和XVII)。
因此，在一个实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物的方法，包括培养具有突变的泛酸激酶编码基因的微生物，所述微生物的avtA，ilvE，ansB和/或alsD基因及其类似物进一步缺失或突变。在另一个实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物的方法，包括培养具有突变的泛酸激酶编码基因和去调节的泛酸生物合成途径酶的微生物，所述微生物的avtA，ilvE，ansB和/或alsD基因及其类似物进一步缺失或突变。在另一个实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物的方法，包括培养具有突变的泛酸激酶编码基因和去调节的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径酶的微生物，所述微生物的avtA，ilvE，ansB和/或alsD基因及其类似物进一步缺失或突变。
alsD基因突变与alsS基因过量表达或去调节联合出现时特别有用，例如，可以防止碳离子(如乙酰乳酸)从用于α-KIV制备的前体池中脱离。因此，为了使als位点在泛化合物制备过程中发挥最大作用，除了过量表达alsS基因外，还需要干扰alsD基因的表达。为了干扰alsD基因表达，位于alsD基因侧翼的als操纵子适宜片段通过PCR扩增，然后克隆产生用于干扰表达的同源片段。在alsD基因位点的侧翼DNA片段之间克隆耐药基因，如cat基因，然后用线形DNA转化泛酸制备菌株如PA824，筛选耐药菌株。为了过量表达alsS，将alsS编码序列(例如，通过PCR获得的alsS编码序列)克隆到表达载体上。将表达alsS的载体(或者表达alsS加ilvC的载体)导入泛化合物制备菌株中(例如泛酸制备菌株PA824)。
例如除了过量表达或去调节泛酸生物合成酶和/或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶，或除了使泛酸激酶编码基因突变外，本发明方法还进一步包括催化所需泛化合物转化为不欲或不需下游产物的酶的缺失或突变。
VII.分离的核酸分子和基因
本发明另一方面特别描述了编码芽胞杆菌蛋白(如枯草芽孢杆菌蛋白)，例如芽胞杆菌泛酸生物合成酶(如枯草芽孢杆菌泛酸生物合成酶)或芽胞杆菌缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶(如枯草芽孢杆菌缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶)的分离的核酸分子。本发明还特别描述了分离的coaX和/或coaA核酸分子(例如，分离的coaX和/或coaA基因)以及包括这些coaX和/或coaA核酸分子或基因的分离核酸分子。
术语“核酸分子”包括DNA分子(如线形、环状、cDNA或染色体DNA)和RNA分子(如tRNA，rRNA，mRNA)，以及应用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的，也可以是双链的，但优选双链DNA。术语“分离的”核酸分子包括的核酸分子游离于其侧翼序列(即位于核酸分子5’端和3’端的序列)，所述侧翼序列在衍生该核酸分子的生物染色体中天然存在于该核酸分子的侧翼。在多个实施方案中，分离的核酸分子可以包括少于大约10kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的核苷酸序列，所述序列在衍生该核酸分子的微生物染色体中天然存在于该核酸分子的侧翼。而且，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，在通过重组技术制备时，基本不含其他细胞物质，或者在通过化学方法合成时，基本不含其他化学物质。
本文应用的术语“基因”包括核酸分子(例如DNA分子或其片段)，例如蛋白或RNA编码核酸分子，该核酸分子在生物中通过基因间DNA(即生物染色体DNA中天然存在于基因侧翼和/或分隔基因的插入或间隔DNA)与另外的基因或其他基因分开。基因可以指导酶或其他蛋白质分子的合成(例如，可以包括编码序列，如编码蛋白质的邻近开放阅读框(ORF))，也可以在生物中直接发挥自身的功能。如本文定义，生物中的基因可以集中于一个操纵子中，所述操纵子通过基因间DNA与其他基因和/或操纵子分开。操纵子包括的单独基因可以相互交叉，所述单独基因间没有基因间DNA。本文应用的“分离的基因”包括这样的基因，所述基因基本游离于衍生该基因的生物染色体中该基因的天然侧翼序列(即不含编码第二个或独特蛋白质或RNA分子的邻近编码序列、邻近结构序列等)，并可选包括5’端和3’端调控序列，例如启动子序列和/或终止子序列。在一个实施方案中，分离的基因包括蛋白质的主要编码序列(例如，编码芽孢杆菌蛋白质的序列)。在另一个实施方案中，分离的基因包括蛋白质(例如杆菌蛋白质)的编码序列以及衍生该基因的生物染色体DNA中邻近该基因的5’端和/或3’端调控序列(例如邻近5’端和/或3’端杆菌调控序列)。优选地，分离的核酸分子包括少于大约l0kb，5kb，2kb，1kb，0.5kb，0.2kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的核苷酸序列，所述序列在衍生该核酸分子的生物染色体中天然存在于该基因的侧翼。
一方面，本发明特别描述了分离的panB核酸序列或基因，分离的panC核酸序列或基因，分离的panD核酸序列或基因，分离的panE核酸序列或基因，分离的ilvB，ilvN，ilvBN核酸序列或基因，分离的alsS核酸序列或基因，分离的ilvC核酸序列或基因，和/或分离的ilvD核酸序列或基因。
在一个优选实施方案中，核酸或基因来源于芽胞杆菌(例如，源于芽胞杆菌的)。术语“来源于芽胞杆菌”或“源于芽胞杆菌”包括天然存在于芽胞杆菌属微生物中的核酸或基因。优选地，核酸或基因源于微生物，所述微生物选自枯草芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、泛酸芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和其他第一组杆菌属，例如以16SrRNA型为特征(Priest，supra)。在另一个优选实施方案中，核酸或基因来源于短芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一个优选实施方案中，本发明核酸分子和/或基因来源于微生物，所述微生物选自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Bacillus halodurans、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。在一个特别优选的实施方案中，核酸或基因来源于枯草芽孢杆菌(例如源于枯草芽孢杆菌)。术语“来源于枯草芽孢杆菌”或“源于枯草芽孢杆菌”包括天然存在于枯草芽孢杆菌中的核酸或基因。在另一个优选实施方案中，核酸或基因是芽胞杆菌基因类似物(例如，来源于与芽胞杆菌截然不同的种属的基因，但与本发明杆菌基因如芽胞杆菌pan基因或芽胞杆菌ilv基因具有显著同源性)。
本发明范畴还包括源于细菌的核酸分子或基因和/或源于芽胞杆菌的核酸分子或基因(如，源于枯草芽孢杆菌的核酸分子或基因)，例如，本发明发明者鉴定的基因，如芽胞杆菌或枯草芽孢杆菌coaX基因，coaA基因，pan基因和/或ilv基因。本发明范畴还包括源于细菌的核酸分子或基因和/或源于芽胞杆菌的核酸分子或基因(如，源于枯草芽孢杆菌的核酸分子或基因)(如，源于枯草芽孢杆菌的核酸分子或基因)，所述核酸分子或基因与细菌和/或芽胞杆菌中天然存在的核酸分子或基因不同(如，枯草芽孢杆菌的核酸分子或基因)，例如发生核酸取代、插入或缺失的核酸分子或基因，但是这些核酸分子或基因编码的蛋白质与本发明天然基因产物基本类似。在一个实施方案中，分离的核酸分子包括至少一个序列23，序列25，序列27，序列29，序列31，序列33，序列86，序列35或序列37公布的核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，分离的核酸分子包括至少两个、三个或四个序列23，序列25，序列27，序列29，序列31，序列33，序列88，序列35或序列37公布的核苷酸序列。例如，本发明优选的分离核酸分子包括序列23，序列25和序列27的核苷酸序列，优选的连接使分离的核酸分子在微生物中表达时，可以一一产生序列23，序列25和序列27核苷酸序列编码的蛋白质(例如，序列59)。在另一个实施例中，优选的分离核酸分子包括序列31和序列33的核苷酸序列，优选的连接使分离的核酸分子在微生物中表达时，可以一一产生序列31和序列33核苷酸序列编码的蛋白质(例如，序列58的1-2246核苷酸)。在另一个实施例中，本发明优选的分离核酸分子包括序列86的核苷酸序列。在另一个实施例中，本发明优选的分离核酸分子包括序列31，序列33和序列35的核苷酸序列，优选的连接使分离的核酸分子在微生物中表达时，可以一一产生序列31，序列33和序列35核苷酸序列编码的蛋白质(例如，序列58)。
在另一个实施方案中，本发明的分离核酸分子包括的核苷酸序列与序列23，序列25，序列27，序列29，序列31，序列33，序列88，序列35或序列37公布的核苷酸序列的一致性至少大约60-65％，优选至少大约70-75％，更优选至少大约80-85％，更优选至少大约90-95％或更高。在另一个实施方案中，分离的核酸分子能够在严格条件下与具有序列23，序列25，序列27，序列29，序列31，序列33，序列88，序列35或序列37所示的核苷酸序列的核酸分子杂交。所述严格条件是本领域技术人员众所周知的，并可参考Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。严格(例如高度严格)杂交条件的非限制性优选实施例是在大约45℃，6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后用0.2×SSC，0.1％SDS在50-65℃清洗一次或多次。优选地，在严格条件下与序列23，序列25，序列27，序列29，序列31，序列33，序列88，序列35或序列37发生杂交的本发明分离核酸分子相应于天然核酸分子。本文应用的“天然”核酸分子指具有天然核苷酸序列的RNA或DNA分子。
本发明核酸分子(例如具有序列23，序列25，序列27，序列29，序列31，序列33，序列88，序列35或序列37核苷酸序列的核酸分子)可以通过标准分子生物学技术分离，本文还将提供其序列信息。例如，可以应用标准杂交和克隆技术(例如，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所述)分离核酸分子，也可以通过多聚酶链反应分离核酸分子，所述多聚酶链反应应用的合成寡核苷酸引物可以根据序列23，序列25，序列27，序列29，序列31，序列33，序列88，序列35或序列37的序列来设计。本发明核酸可以利用cDNA，mRNA或者基因组DNA作为模板，根据标准PCR扩增技术，应用适宜的寡核苷酸引物来扩增。在另一个优选实施方案中，本发明的分离核酸分子包括这样的核酸分子，该分子是序列23，序列25，序列27，序列29，序列33，序列31，序列33，序列88，序列35显示的核苷酸序列的互补序列。
另外的panC核酸序列还包括这样的序列，所述序列含有序列25的核苷酸序列，编码具有序列26公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列26公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列25核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列26氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的panC核苷酸序列的互补序列。
另外的panD核酸序列还包括这样的序列，所述序列含有序列27的核苷酸序列，编码具有序列28公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列28公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列27核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列28氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的panD核苷酸序列的互补序列。
另外的panE核酸序列还包括这样的序列，所述序列含有序列29的核苷酸序列，编码具有序列30公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列30公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列29核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列30氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的panE核苷酸序列的互补序列。
另外的ilvB核酸序列是这样的序列，所述序列含有序列31的核苷酸序列，编码具有序列32公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列32公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列31核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列32氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的ilvB核苷酸序列的互补序列。
另外的ilvN核酸序列是这样的序列，所述序列含有序列33的核苷酸序列，编码具有序列34公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列34公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列33核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列34氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的ilvN核苷酸序列的互补序列。
另外的ilvC核酸序列还包括这样的序列，所述序列含有序列35的核苷酸序列，编码具有序列36公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列36公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列35核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列36氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的ilvC核苷酸序列的互补序列。
另外的ilVD核酸序列还包括这样的序列，所述序列含有序列37的核苷酸序列，编码具有序列38公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列38公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列37核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列38氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的ilvD核苷酸序列的互补序列。
另外的alsS核酸序列还包括这样的序列，所述序列含有序列86的核苷酸序列，编码具有序列87公布的氨基酸序列的多肽类似物(例如，编码的多肽与具有序列87公布的氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的一致性，并与所述多肽具有基本同等的活性)，在严格条件下能够与具有序列86核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与编码具有序列87氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或部分杂交，或者是本文公布的alsS核苷酸序列的互补序列。
在另一个实施方案中，分离的核酸分子是或包括coaX基因或其部分或片段。在一个实施方案中，分离的coaX核酸分子或基因包括序列19公布的核苷酸序列(如包括枯草芽孢杆菌coaX核苷酸序列)。在另一个实施方案中，分离的coaX核酸分子或基因包括的核苷酸序列编码序列9公布的氨基酸序列(如编码枯草芽孢杆菌CoaX氨基酸序列)。在另一个实施方案中，分离的coaX核酸分子或基因编码CoaX蛋白的类似物，所述CoaX蛋白具有序列9的氨基酸序列。本文应用的术语“类似物”包括的蛋白质或多肽与本文描述的野生型蛋白质或多肽的氨基酸序列至少大约有30-35％，优选至少大约有35-40％，更优选至少大约有40-50％，更优选至少大约有60％，70％，80％，90％或更高的一致性，并与所述野生型蛋白质或多肽具有基本等价的功能或生物活性。例如，一种CoaX类似物与具有序列9公布的氨基酸序列的蛋白质至少大约有30-35％，优选至少大约有35-40％，更优选至少大约有40-50％，更优选至少大约有60％，70％，80％，90％或更高的一致性，并与具有序列9公布的氨基酸序列的蛋白质具有基本等价的功能或生物活性(即功能等价体)(如具有基本相等的泛酸激酶活性)。在一个优选实施方案中，分离的coaX核酸分子或基因包括的核苷酸序列编码序列7，序列8，序列10，序列11，序列12，序列13，序列14，序列15，序列16，序列17，序列18，序列74或序列75公布的任一多肽。在另一个实施方案中，分离的coaX核酸分子能够与具有序列19公布的核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与一种核酸分子的全部或部分杂交，所述核酸分子的核苷酸序列编码具有序列7-18，74或75的氨基酸序列的多肽。这些杂交条件是本领域技术人员众所周知的，还可参考Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，sections2，4and6。其他严格条件可以参考Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY(1989)，chapters7，9and11。严格杂交条件的一个非限制性优选实施例包括在大约65-70℃，4×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交(或在大约42-50℃，4×SSC加50％甲酰胺中杂交)，然后在65-70℃，应用1×SSC清洗一次或多次。高度严格杂交条件的一个非限制性优选实施例包括在大约65-70℃，1×SSC中杂交(或在大约42-50℃，1×SSC加50％甲酰胺中杂交)，然后在65-70℃，应用0.3×SSC清洗一次或多次。低度严格杂交条件的一个非限制性优选实施例包括在大约50-60℃，4×SSC中杂交(或在大约40-45℃，6×SSC加50％甲酰胺中杂交)，然后在50-60℃，应用2×SSC清洗一次或多次。介于上述数值之间的中间范围，例如65-70℃或42-50℃，也属于本发明范畴。SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以取代SSC(1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)作为杂交和清洗缓冲液；杂交完成后，每次清洗需要15分钟。如果预期杂交长度短于50个碱基对，杂交温度应比杂交熔化温度(Tm)低5-10℃，其中Tm根据下述等式进行计算。如果杂交长度短于18个碱基对，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。如果杂交长度为18-49个碱基对，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交的碱基数，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。经验丰富的技术人员还应该认识到，为了减少核酸分子与膜如硝酸纤维素或尼龙膜的非特异性杂交，可以往杂交和/或清洗缓冲液中添加其他试剂，包括但不限于封闭试剂(如BSA或鲑鱼或鲱鱼精液载体DNA)，去污剂(如SDS)，螯合剂(如EDTA)，Ficoll，PVP等。特别是在应用尼龙膜时，另一个严格杂交条件的非限制性优选实施例为在大约65℃，0.25-0.5M NaH2PO4，7％SDS中杂交，然后在大约65℃，应用0.02M NaH2PO4，1％SDS清洗一次或多次，见例如Church and Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：1991-1995(或者，还可以应用0.2×SSC，1％SDS)。在另一个优选实施方案中，分离的核酸分子包括的核苷酸序列与本文公布的coaX核苷酸序列互补(例如，与序列19公布的核苷酸序列完全互补)。
在另一个优选实施方案中，分离的核酸分子是或包括coaA基因，例如芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)coaA基因，或其部分或片段。示例的分离coaA核酸分子和/或基因包括(1)分离的coaA核酸分子或基因，包括序列20-22公布的任一核苷酸序列；(2)分离的coaA核酸分子或基因，包括的核苷酸序列编码序列3公布的氨基酸序列；(3)分离的coaA核酸分子或基因，包括的核苷酸序列编码CoaA类似物(例如，多肽具有的氨基酸序列与序列3公布的氨基酸序列至少大约有30-35％，优选至少大约有35-40％，更优选至少大约有40-50％，更优选至少大约有60％，70％，80％，90％或更高的一致性，并具有基本等价酶活性：(4)分离的coaA核酸分子或基因，包括的核苷酸序列编码序列1，序列2，序列4，序列5或序列6公布的任一多肽；(5)分离的核酸分子在严格条件下，能够与具有序列20，序列21或序列22公布的核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或者能够与一种核酸分子的全部或部分杂交，所述核酸分子的核苷酸序列编码的多肽具有序列3的氨基酸序列；以及(6)分离的核酸分子，包括的核苷酸序列与本文公布的coaA核苷酸序列互补(例如，与序列20，序列21或序列22公布的核苷酸序列完全互补)。
本发明核酸分子(例如coaX核酸分子或基因，或者coaA核酸分子或基因)可以通过标准分子生物学技术进行分离，本文还提供了它们的序列信息。例如，可以应用标准杂交和克隆技术分离核酸分子(例如，Sambrook，J.Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989所述)，也可以通过多聚酶链反应分离核酸分子，所述多聚酶链反应应用的合成寡核苷酸引物，是根据本文公布的coaX或coaA核苷酸序列，或其侧翼序列设计的。本发明核酸(例如coaX核酸分子或基因，或者coaA核酸分子或基因)可以利用cDNA，mRNA或者基因组DNA作为模板，根据标准PCR扩增技术，应用适宜的寡核苷酸引物来扩增。
本发明的另一个实施方案特别描述了突变的coaX和coaA核酸分子或基因。本文应用的短语“突变的核酸分子”或“突变基因”包括的核酸分子或基因，其核苷酸序列包括至少一种改变(例如取代、插入、缺失)，使该突变核酸分子或基因编码的多肽或蛋白与野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白显示不同的活性。优选地，突变的核酸分子或突变基因(例如突变coaA或coaX基因)编码的多肽或蛋白，与野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白相比，例如在应用相同条件进行检测时(例如，在相同温度培养的微生物中进行检测)，显示的活性低。突变基因也可以不编码多肽，或者使野生型多肽的生产水平降低。
本文应用的“活性降低”或“酶活性降低”是与野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白相比，活性至少降低5％，优选与野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白相比，活性至少降低5-10％，更优选至少降低10-25％，更优选至少降低25-50％，50-75％或75-100％。介于上述数值之间的中间范围，例如75-85％，85-90％，90-95％，也属于本发明范畴。本文应用的“活性降低”或“酶活性降低”还包括活性完全缺失或“敲除”(例如，与野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白相比，活性降低大约100％)。活性可以根据任何已经被接受的测定特定感兴趣蛋白活性的方法进行测定。例如，可以通过测定分离或纯化自细胞的蛋白活性来直接测定或检测活性。此外，还可测定或检测细胞内或细胞外培养基中的活性。例如，检测coaA突变基因或coaX突变基因(即所述突变基因编码的泛酸激酶活性降低)，可以通过在微生物中表达突变基因来完成，例如，以温度敏感形式表达泛酸激酶的突变微生物，可以检测突变基因补充温度敏感型(Ts)突变株泛酸激酶活性的能力。编码“泛酸激酶活性降低”的coaX突变基因或coaA突变基因补充Ts突变株的有效性，例如相较于对应的野生型coaX基因或coaA基因为低。
本领域技术人员可以理解的是，核酸或基因序列中即使只有一个取代(例如，单碱基取代，其编码的氨基酸与相应氨基酸序列发生改变)，与相应的野生型多肽或蛋白相比，也可显著影响编码多肽或蛋白的活性。本文定义的突变核酸或突变基因(例如编码突变多肽或蛋白)可以容易地与编码蛋白类似物的核酸或基因相鉴别，因为如上所述，突变核酸或突变基因编码的蛋白或多肽，其活性发生变化，可选地，与表达野生型基因或核酸或产生所述突变蛋白或多肽的相应微生物相比，表达该突变基因或核酸的微生物具有可以观察到的不同或独特表型，或者产生所述突变蛋白或多肽(即突变微生物)。相反，与表达野生型基因或核酸的相应微生物相比，蛋白类似物具有相同或基本相似的活性，在微生物中产生时，可选具有不可识别的表型。因此，例如，区分类似物与突变株的不是核酸分子、基因、蛋白或多肽间的序列一致性程度，而是能够区分类似物与突变株的编码蛋白或多肽的活性：例如，类似物具有较低(如30-50％序列一致)的序列一致性，但具有基本等价的功能活性，而突变株，例如具有99％的序列一致性，但功能活性却显著不同或发生改变。类似物示例在图20(即CoaA类似物)和图23(即CoaX类似物)中给出。本文实施例XV和XVIII描述了突变株示例。
VIII.重组核酸分子和载体
本发明还特别描述了重组核酸分子(如重组DNA分子)，包括本文描述的核酸分子和/或基因(如分离的核酸分子和/或基因)，优选芽孢杆菌基因，更优选枯草芽孢杆菌基因，更优选枯草芽孢杆菌泛酸激酶基因(如coaX基因或coaA基因)，泛酸生物合成基因(如编码泛酸生物合成酶的基因，如编码酮泛解酸羟甲基转移酶的panB基因，编码酮泛解酸还原酶的panE基因，编码泛酸合成酶的panC基因，和/或编码天门冬氨酸-α-脱羧酶的panD基因)，和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成基因(如编码乙酰羟酸合成酶的ilvBN或alsS基因，编码乙酰羟酸异构还原酶的ilvC基因，和/或编码双羟酸脱水酶的ilvD基因)。
本发明还特别描述了包括本文所述核酸分子(如分离或重组核酸分子和/或基因)的载体(如重组载体)。特别关注的重组载体包括编码本文所述细菌基因产物的核酸序列，优选芽孢杆菌基因产物，更优选枯草芽孢杆菌基因产物，更优选枯草芽孢杆菌泛酸生物合成基因产物(例如泛酸生物合成酶，如酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶，泛酸合成酶，和/或天门冬氨酸-α-脱羧酶)和/或异亮氨酸-缬氨酸生物合成基因产物(如乙酰羟酸合成酶，优选羟酸异构还原酶和/或双羟酸脱水酶)。
术语“重组核酸分子”包括业已改变、修饰或经工程学处理的核酸分子(如DNA分子)，使其核苷酸序列与衍生该重组核酸分子的未经修饰或天然核酸分子不同(例如，通过添加、缺失或取代一个或多个核苷酸)。优选地，重组核酸分子(如重组DNA分子)包括与调控序列操作性连接的本发明分离核酸分子或基因(如分离的coaX，coaA，pan或ilv基因)。
术语“重组载体”包括业已改变、修饰或经工程学处理的载体(如质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒或其他纯化核酸载体)，使其含有的核酸序列与衍生该重组载体的未经修饰或天然核酸分子相比含有的核酸序列更多、更少或不同。优选地，重组载体包括coaX，coaA，pan或ilv基因，并与调控序列操作性连接，例如本文定义的启动子序列，终止子序列和/或人工核糖体结合位点(RBSs)。
短语“与调控序列操作性连接”意味着感兴趣核酸分子或基因的核苷酸序列与调控序列以某种方式连接，所述方式允许该核苷酸序列的表达(例如增强表达、增加表达、组成型表达、基础表达、削弱表达、降低表达或抑制表达)，优选核苷酸序列编码基因产物的表达(例如，当重组载体包括重组核酸分子，如本文定义，并导入到微生物中时)。
术语“调控序列”包括影响(例如调制或调节)其他核酸序列表达的核酸序列。在一个实施方案中，重组核酸分子或重组载体包括的调控序列，其相对于特定感兴趣基因的位置和/或方向与自然显现的调控序列和感兴趣基因近似或一致，例如在天然位置和/或方向。例如，重组核酸分子或重组载体包括的感兴趣基因与调控序列操作性连接，所述调控序列在天然微生物中就伴随该感兴趣基因，或位于该感兴趣基因附近(例如，与“天然”调控序列操作性连接，如与“天然”启动子连接)。此外，重组核酸分子或重组载体包括的感兴趣基因还可与调控序列操作性连接，所述调控序列在天然微生物中伴随其他(例如不同的)基因，或位于其他(例如不同的)基因附近。此外，重组核酸分子或重组载体包括的感兴趣基因还可与来自其他微生物的调控序列操作性连接。例如，来自其他微生物的调控序列(如其他细菌调控序列，噬菌体调控序列等)可以与特定感兴趣基因操作性连接。
在一个实施方案中，调控序列是非天然或非自然存在的序列(例如，业已经修饰、突变、取代、衍生、缺失的序列，包括化学合成序列)。优选的调控序列包括启动子、增强子、终止子信号、抗终止子信号和其他表达调控因子(例如，抑制子或诱导子结合序列，和/或转录和/或翻译调控蛋白结合位点，例如在转录mRNA中)。这些调控序列在例如Sambrook，J.Fritsh，E.F.and Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989中有述。调控序列包括在微生物中指导核苷酸序列组成型表达的序列(如组成型启动子和强组成型启动子)，在微生物中指导核苷酸序列诱导表达的序列(如诱导性启动子，例如木糖诱导性启动子)，以及在微生物中削弱或抑制核苷酸序列表达的序列(如削弱信号或抑制子序列)。通过去除或缺失调控序列来调控感兴趣基因表达的方法，也属于本发明范畴。例如，可以去除涉及负向调节转录的序列，使感兴趣基因的表达增强。
在一个实施方案中，本发明重组核酸分子或载体包括编码至少一种细菌基因产物(如泛酸生物合成酶，异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶，或CoaA生物合成酶，例如CoaA或CoaX)的核酸序列，并与启动子或启动子序列操作性连接。本发明的优选启动子包括芽孢杆菌启动子和/或噬菌体启动子(如感染芽孢杆菌的噬菌体)。在一个实施方案中，启动子是芽孢杆菌启动子，优选强芽孢杆菌启动子(如与芽孢杆菌生化管家基因相关的启动子，或与芽孢杆菌糖分解途径基因相关的启动子)。在另一个实施方案中，启动子是噬菌体启动子。在一个优选实施方案中，启动子来自噬菌体SP01。在一个特别优选实施方案中，启动子选自P15，P26或Pveg，例如，序列39，序列40或序列41公布的启动子。其他优选启动子包括tef(翻译延长因子(TEF)启动子)和pyc(丙酮酸羧化酶(PYC)启动子)，在芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)中可以启动高水平表达。其他优选启动子，例如用于革兰阳性微生物的启动子包括但不限于amyE启动子或噬菌体SPO2启动子。其他优选启动子，例如用于革兰阴性微生物的启动子包括但不限于tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL。
在另一个实施方案中，本发明重组核酸分子或重组载体包括一个或多个终止子序列(如转录终止子序列)。术语“终止子序列”包括可以发挥终止基因转录作用的调控序列。终止子序列(或串连转录终止子)还可以发挥稳定mRNA的作用(如通过向mRNA添加结构)，例如对抗核酸酶。
在另一个实施方案中，本发明重组核酸分子或重组载体包括的序列，允许检测包括所述序列的载体(即包括可检测和/或可筛选标记)，例如能够克服营养缺陷型突变的序列，如ura3或ilvE，荧光标记，和/或发光标记(如lacZ/β-半乳糖苷酶)，和/或抗生素耐药基因(如amp或tet)。
在另一个实施方案中，本发明重组核酸分子或重组载体包括人工核糖体结合位点(RBS)。术语“人工核糖体结合位点(RBS)”包括mRNA分子内(如DNA编码)的核糖体结合位点(例如，启动翻译)，该位点与天然RBS(如在天然存在的基因中发现的RBS)存在至少一个核苷酸的不同。优选的人工RBSs包括大约5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24，25-26，27-28，29-30或更多的核苷酸，其中大约1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-15或更多的核苷酸与天然RBS(例如感兴趣基因的天然RBS)不同。优选地，不同的核苷酸是取代的，这样在进行最佳比对时，可以使它们与理想RBS(如序列44，序列45，序列46，序列47或序列48)的一个或多个核苷酸完全相同。人工RBSs可以用来置换与特定基因相关的自然存在的或天然RBS。优选的人工RBSs可以增加特定基因的翻译。优选的人工RBSs(例如增加panB，如枯草芽孢杆菌panB基因翻译的RBSs)在表1A中给出(如序列49和序列50)。
表1A：优选的panB核糖体结合位点
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-------AGAAAGGAGGTGA 理想RBS(序列44)
CCCTCT-AG-AAGGAGGAGAAAACATG RBS1(序列49)
CCCTCT-AG--AGGAGGAGAAAACATG RBS2(序列50)
TAAACAT-G--AGGAGGAGAAAACATG panB天然RBS(序列42)
其他优选的人工RBSs(例如增加panD，如枯草芽孢杆菌panD基因翻译的RBSs)在表1B中给出(如序列51，序列52，序列53和序列54)。
表1B：优选的panD核糖体结合位点
10 20
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CTAGAAAA
GGAGGAATTTAAAGT pAN423 RBS(序列88)
TTAAGAAA
GGAGGTGANNNNATG 理想RBS(序列44)
TTAGAAA
GGAGGATTTAAATATG 新设计A(序列51)
TTAGAAA
GGAGGTTTAATTAATG 新设计B(序列52)
TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG 新设计C1(序列53)
TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG 新设计C2(序列54)
TTAGAAA
GGAGGTGANNNNNATG 理想RBS(序列46)
其他优选的人工RBSs(例如增加panD，如枯草芽孢杆菌panD基因翻译的RBSs)在表1C中给出(如序列55，序列56和序列57)。还显示了PanC蛋白C末端的预期氨基酸序列。下划线的是PanD翻译的起始密码子。
表1C：其他优选panD核糖体结合位点
10 20
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--- --A GAA AGG AGG TGA NNN NNN N
ATG 理想RBS(序列47)
ATT CGA GAA ATG GAG AGA ATA TAA T
ATG 自然panD RBS(序列43)
Ile Arg Glu Met Glu Arg Ile * Met 序列89
--- --A GAA AGG AGG TGA NNN NNN N
ATG 理想RBS(序列47)
ATT CGA GAA AGG AGG TGA ATA TAA T
ATG NDI(序列55)
Ile Arg Glu Arg Arg * Met 序列90
ATT CGA GAA AGG AGG TGA ATA ATA -
ATG NDII(序列56)
Ile Arg Glu Arg Arg * Met 序列90
ATT CGT AGA AAG GAG GTG AAT TAA T
ATG NDIII(序列57)
Ile Arg Arg Lys Glu Val Asn * Met 序列91
--- --- AGA AAG GAG GTG ANN NNN N
ATG 理想RBS(序列48)
因此，在一个实施方案中，本发明载体包括序列49或序列50公布的人工RBS。在另一个实施方案中，本发明载体包括序列51，序列52，序列53或序列54公布的人工RBS。在另一个实施方案中，本发明载体包括序列55，序列56或序列57公布的人工RBS。
在另一个实施方案中，本发明重组载体包括增强细菌复制的序列(例如复制增强序列)。在一个实施方案中，复制增强序列源于大肠杆菌。在另一个实施方案中，复制增强序列源于pBR322(例如，如附图公布的任意pAN载体中pBR322衍生部分包括的序列，即图3A所述载体大约5.0KB-9.0KB的NotI-NotI序列)。
在另一个实施方案中，本发明重组载体包括抗生素耐药基因。术语“抗生素耐药基因”包括使宿主微生物(如芽孢杆菌)对抗生素产生或发生耐药的序列。在一个实施方案中，抗生素耐药基因选自cat(氯霉素耐药)基因，tet(四环素耐药)基因，erm(红霉素耐药)基因，neo(新霉素耐药)基因和spec(壮观霉素耐药)基因。本发明重组载体还可进一步包括同源重组序列(例如，设计用来将重组感兴趣基因导入宿主染色体的序列)。例如，可以将amyE序列作为同源靶序列，用于重组导入宿主染色体。
本发明的优选载体包括但不限于图2-15，17，19，22，25和26公布的载体。应该指出，本领域技术人员可以根据诸如所选用于基因工程学修饰的微生物和所需基因产物表达水平等因素，设计各自适用的载体。
IX.分离的蛋白质
本发明另一方面特别描述了分离的蛋白质(如分离的泛酸生物合成酶和/或缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶和/或分离的CoA生物合成酶，例如分离的CoaA或CoaX)。在一个实施方案中，通过重组DNA技术制备蛋白质(如分离的泛酸生物合成酶和/或缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶和/或分离的CoA生物合成酶，例如分离的CoaA或CoaX)，并通过适宜的纯化方法，应用标准蛋白质纯化技术将蛋白质与本发明微生物分离。在另一种实施方案中，用标准肽合成技术化学合成蛋白质。
一种“分离的”或“纯化的”蛋白质(如分离的或纯化的生物合成酶)，基本不含衍生该蛋白质的微生物的细胞物质或其他污染蛋白；当蛋白质是化学合成时，则基本不含化学前体物质或其他化学物质。在一个实施方案中，分离的或纯化的蛋白质含有少于大约30％(干重)的污染蛋白或化学物质，更优选少于大约20％的污染蛋白或化学物质，更优选少于大约10％的污染蛋白或化学物质，最优选少于大约5％的污染蛋白或化学物质。
在一个优选实施方案中，蛋白质或基因产物来源于芽孢杆菌(如源于芽孢杆菌)。术语“来源于芽孢杆菌”或“源于芽孢杆菌”包括芽孢杆菌基因编码的蛋白质或基因产物。优选地，基因产物来源的微生物选自枯草芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、泛酸芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和其他第一组芽孢杆菌属，例如以16S rRNA型为特征(Priest，supra)。在另一个优选实施方案中，蛋白质或基因产物来源于短芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一个优选实施方案中，蛋白质或基因产物来源于选自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Bacillushalodurans、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的微生物。在一个特别优选的实施方案中，蛋白质或基因产物来源于枯草芽孢杆菌(如源于枯草芽孢杆菌)。术语“来源于枯草芽孢杆菌”或“源于枯草芽孢杆菌”包括枯草芽孢杆菌基因编码的蛋白质或基因产物。在另一个优选实施方案中，蛋白质或基因产物由杆菌基因类似物编码(如来源于与芽孢杆菌截然不同的种属的基因，但与本发明芽孢杆菌基因如芽孢杆菌pan基因或芽孢杆菌ilv基因具有显著同源性)。
包括在本发明范畴之内的有源于细菌的蛋白质或基因产物，和/或源于芽孢杆菌的蛋白质或基因产物(如源于枯草芽孢杆菌的基因产物)，所述蛋白质或基因产物由自然存在的细菌和/或芽孢杆菌基因(如枯草芽孢杆菌基因)编码，例如，本发明发明者鉴定的基因，如芽孢杆菌属或枯草芽孢杆菌coaX基因，coaA基因，pan基因和/或ilv基因。包括在本发明范畴之内的还有源于细菌的蛋白质或基因产物，和/或源于芽孢杆菌属的蛋白质或基因产物(如源于枯草芽孢杆菌的基因产物)，所述蛋白质或基因产物由与自然存在的细菌和/或芽孢杆菌基因(如枯草芽孢杆菌基因)不同的细菌和/或芽孢杆菌基因(如枯草芽孢杆菌基因)编码，例如，基因的核酸发生突变、插入或缺失，但其编码的蛋白质与本发明自然存在的基因产物基本类似。例如，应该理解，本领域技术人员可以使核酸发生突变(例如取代)，但由于遗传密码的简并性，编码的氨基酸可以与自然存在的基因编码的完全一致。而且，应该理解，本领域技术人员可以使核酸发生突变(例如取代)，使其编码保守的氨基酸置换。还应该理解，本领域技术人员还可以取代、添加或去除氨基酸到基本不影响基因产物功能的程度(与自然存在的基因产物相比)，每种情况均包括在本发明范畴之内。
在一个优选实施方案中，本发明的分离蛋白质(如分离的泛酸生物合成酶和/或分离的异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶和/或分离的CoaA生物合成酶，例如分离的CoaA或CoaX)具有序列3，序列9，序列24，序列26，序列28，序列30，序列32，序列34，序列36，序列38或序列87显示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的分离蛋白质是序列3，序列9，序列24，序列26，序列28，序列30，序列32，序列34，序列36，序列38或序列87公布的至少一种蛋白质的类似物(例如，包括的氨基酸序列分别与序列3，序列9，序列24，序列26，序列28，序列30，序列32，序列34，序列36，序列38或序列87的氨基酸序列至少大约30-40％一致，优选大约40-50％一致，更优选大约50-60％一致，更优选大约60-70％，70-80％，80-90％，90-95％或更高的一致性，并且其活性分别与序列3，序列9，序列24，序列26，序列28，序列30，序列32，序列34，序列36，序列38或序列87氨基酸序列编码的蛋白质基本类似)。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源百分比，可以将序列进行比对，达到最佳对比目的(例如，可以将间隔导入第一个氨基酸或核酸序列，与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。当第一个序列某个位点的氨基酸残基或核苷酸与第二个序列相应位点的氨基酸残基或核苷酸相同时，两个分子在该位点一致。两序列的一致百分比是两序列间一致位点数量的函数(即，一致％＝一致位点数量/总位点数量×100)，优选考虑到为了产生最佳比对而必须导入的间隔数量和所述间隔大小。
应用数学运算法则，可以进行序列对比，并确立两序列间的同源百分比。用于序列对比的数学运算法则的非限制性优选实施例是Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-68的运算法则，其改良法如Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-77。这一运算法则现已整合到NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中，Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403-10。BLAST核苷酸搜索可以通过NBLAST程序进行，score＝100，wordlength＝12，可以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以通过XBLAST程序进行，score＝50，wordlength＝3，可以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为达到对比目的进行的间隔比对，可以如Altschul et al(1997)NucleicAcids Research 25(17)：3389-3402所述，应用Gapped BLAST。在应用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以分别应用程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见
http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。另一个用于序列对比的数学运算法则的非限制性优选实施例是的Myers andMiller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17运算法则。这一运算法则现已整合到ALIGN程序中，例如，可以在法国IGH Montpellier的GENESTREAM网络服务器(http：//vega.igh.cnrs.fr)，或ISREC服务器(http：//www.ch.embnet.org)上获得。在应用ALIGN程序进行氨基酸序列对比时，可以应用PAM 120 weight residue table，gaplength penalty＝12，gap panalty＝4。
在另一个优选实施方案中，两个氨基酸序列的同源百分比可以通过应用GCG软件包的GAP程序确立(见http：//www.gcg.com)，可以应用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，gap weight可以是12，10，8，6或4，length weight可以是2，3或4。在另一个优选实施方案中，两个核酸序列的同源百分比可以通过应用GCG软件包的GAP程序确立(见http：//www.gcg.com)，可以应用gap weight＝50，lengthweight＝3。
X.生物转化和生物转换
本发明另一方面包括以本文描述的重组微生物(如突变微生物)和/或分离的CoA、泛酸或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶为重点的生物转化过程。术语“生物转化过程”，本文也称为“生物转换过程”，包括能够从CoA、泛酸或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶上游的任意化合物(如中间产物或产品)制备(如转化或转换)所述CoA、泛酸或异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶下游的任意化合物(如底物、中间产物或产品)的生物过程。
在一个实施方案中，本发明特别描述了制备泛化合物的生物转化过程，包括在能够生成所述泛化合物的条件下，使过量表达至少一种泛酸生物合成酶的微生物与至少一种适宜底物或前体物质接触，并回收该泛化合物。在一个优选实施方案中，本发明特别描述了制备泛解酸的生物转化过程，包括在能够生成泛解酸的条件下，使过量表达酮泛解酸还原酶(panE基因产物)的微生物与适宜底物(如酮泛解酸)接触，并回收泛解酸。在另一个优选实施方案中，本发明特别描述了制备泛酸的生物转化过程，包括在能够生成泛酸的条件下，使过量表达酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶的微生物与适宜底物(如酮泛解酸和β丙氨酸)接触，并回收泛酸。在另一个优选实施方案中，本发明特别描述了制备泛酸的生物转化过程，包括在能够生成泛酸的条件下，使过量表达酮泛解酸羟甲基转移酶、酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶的微生物与适宜底物(如α酮异戊酸和β丙氨酸)接触，并回收泛酸。用于上述生物转化的优选重组微生物包括泛酸激酶突变株。泛解酸或泛酸的生成条件分别包括任何能够导致所需泛解酸或泛酸生成的条件。
在另一个实施方案中，本发明包括制备β丙氨酸的方法，包括在能够生成β丙氨酸的条件下，培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶的微生物。优选地，过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶的微生物在编码泛酸生物合成酶的核酸序列中具有突变，所述泛酸生物合成酶选自酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶。
本发明还特别描述了制备β丙氨酸的方法，包括在能够生成β丙氨酸的条件下，使含有天门冬氨酸的组合物与分离的芽孢杆菌天门冬氨酸-α-脱羧酶接触(例如，体外合成法)。
在生物转化反应中应用的微生物和/或酶的形式允许它们发挥其固有功能(如产生所需化合物)。微生物可以是完整的细胞，也可以是为获得所需最终结果必需的细胞部分。微生物可以是悬浮的(如在适宜的溶液中，如缓冲液或缓冲培养基)，漂洗过的(如漂洗培养微生物，使之不含培养基)，丙酮干燥的，固定化的(如在聚丙烯酰胺凝胶或k-角叉胶或合成支持物上，如珠子、基质等)，固定的，交叉连接的，或经渗透处理的(如，膜和/或壁经渗透处理，这样化合物，例如底物、中间产物或产品可以更容易地穿过所述膜或壁)。
在生物转化反应中，还可应用纯化或未纯化的CoA生物合成酶(如CoaA和/或CoaX)，泛酸生物合成酶和/或缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶。酶的形式允许其发挥固有的功能(如获得所需化合物)。例如，酶的形式可以是游离的，也可以是固定化的。例如，纯化或未纯化的CoA生物合成酶(如CoaA和/或CoaX)，泛酸生物合成酶和/或缬氨酸-异亮氨酸生物合成酶可以在一个或多个体外反应中与适宜底物接触，用来制备所需产物。
关于至少上述方法(例如本发明制备方法)，本发明至少一个方面特别关注了下述方面：方法中不应用棒状杆菌属微生物和/或埃希氏菌属微生物的实施方案；方法中不应用选自大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌微生物的实施方案；方法中不应用革兰阴性微生物的实施方案；应用的微生物不包括、表达或产生源于下述微生物的核酸分子、基因或蛋白(如生物合成酶)的实施方案，所述微生物包括棒状杆菌属微生物和/或埃希氏菌属微生物；微生物不包括、表达或产生源于下述微生物的核酸分子、基因或蛋白(如生物合成酶)的实施方案，所述微生物选自大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌。
XI.筛选试验
因为CoA是细菌的必需因子，因此涉及CoA生物合成的蛋白质(如酶)为探索新型抗生素提供了有价值的工具。特别是CoaX蛋白，对于鉴定细菌杀伤性化合物特别有价值，因为它与哺乳动物泛酸激酶的一级序列没有共同之处。因此，本发明还提供了鉴定调节子的方法(本文也称为“筛选试验”)，所述调节子即能够与CoaX结合，或对例如coaX表达或CoaX活性具有刺激或抑制作用的备选或备测化合物或制剂(如肽、拟肽、小分子或其他药物)。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选备选或备测化合物的方法，所述化合物能够与CoaX蛋白或其生物活性部分结合。在另一个实施方案中，本发明提供了筛选备选或备测化合物的方法，所述化合物能够调节CoaX蛋白或其生物活性部分的活性。可以应用本领域已知的组合文库方法中的任何手段获得本发明备测化合物，包括：生物文库，空间可设定地址平行固相或液相文库，需要去卷积的合成文库法，“一珠-一化合物”文库法，以及应用亲和层析选择的合成文库法。生物文库法仅限于肽文库，而其他四种方法则可用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
本领域有分子库合成法示例，如DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：11422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37：2678；Cho et al.(1993)Science 261：1303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37：1233。化合物文库可以溶于溶液中(如Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)，也可以存在于珠子上(Lam(1991)Nature 354：82-84)，芯片上(Fodor(1993)Nature 364：555-556)，细菌中(Ladner USP5,223,409)，孢子中(Ladner USP‘409)，质粒中(Cull et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)或噬菌体中(Scott and Smith(1990)Science 249：386-390)；(Devlin(1990)Science 249：404-406)；(Cwirlaet al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310)；(Ladner，supra.)。
在一个实施方案中，试验是基于微生物的试验，其中表达CoaX蛋白或其生物活性部分的重组微生物与备测化合物接触，然后测定该备测化合物调节CoaX活性的能力。备测化合物对CoaX活性的调节能力可以通过监测例如细胞内磷酸泛解酸或CoA浓度、或者分泌的泛酸浓度来确定(因为抑制CoaX的化合物会导致备测微生物中泛酸的堆积)。CoaX底物还可以应用放射同位素或酶标记，这样CoaX活性的调节就可以通过检测标记底物或中间产物或产品的转化来测定。例如，可以应用32P，14C或3H来直接或间接标记CoaX底物，放射同位素可以通过直接计数radioemmission或通过闪烁计数来检测。测定化合物对CoaX活性的调节能力还可以通过检测报导基因(包括与可检测标记编码核酸操作性连接的CoA反应性调控因子，所述可检测标记如荧光素酶)的诱导来达成，或者通过检测CoA调控的细胞反应来达成。
在另一个实施方案中，本发明的筛选试验是无细胞试验，其中CoaX蛋白或其生物活性部分在体外与备测化合物接触，然后测定备测化合物与CoaX蛋白或其生物活性部分的结合能力或调节能力。在一个优选实施方案中，试验包括使CoaX蛋白或其生物活性部分与已知底物接触，形成试验混合物，然后使试验混合物与备测化合物接触，测定备测化合物调节CoaX对其底物酶活性的能力。
筛选试验可以在任何适于装载微生物、蛋白质和/或反应物质的容器内进行。这些容器的示例包括微量滴定板，试管和微量离心管。在本发明上述试验方法的多个实施方案中，需要固定CoaX蛋白或表达CoaX蛋白的重组微生物，这样可以使产品和/或底物的分离更加容易，并且适于试验的自动进行。例如，可以将谷胱甘肽-S转移酶/CoaX融合蛋白吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠上(Sigma Chemical，St.Louis，M0)，也可以吸附到谷胱甘肽衍生性微量滴定板上。其他将蛋白固定到基质上的技术(如生物素结合和链霉亲和素固定或抗生素结合)也可用于本发明筛选试验。
在另一个实施方案中，CoaX表达的调节子通过下述方法鉴定，其中细胞与备选化合物接触，然后测定细胞中coaX mRNA或CoaX多肽的表达。比较备选化合物存在时的表达水平与备选化合物不存在时的表达水平(或者与适宜的对照相比较，如适宜的对照或标准缓冲液)。基于这种比较，可以将备选化合物鉴定为coaX mRNA或CoaX多肽表达的调节子。
本发明还包括应用上述筛选试验鉴定的新型试剂。因此，在适宜的动物模型中应用本文描述的鉴定试剂也属于本发明范畴。例如，可以将本文所述鉴定的CoaX调节试剂(例如抗杀菌化合物)用于感染动物模型，检测应用该试剂的治疗效果、毒性或副作用。
下述实施例是对本发明的进一步说明，不应被认为是对本发明的限制。本申请引用的所有参考文献、专利、专利申请(包括与本申请相关的1999年9月21日备案的美国专利申请序列号09/400,494(未决)，2000年6月7日备案的临时美国专利申请序列号60/210,072,2000年7月28日备案的临时美国专利申请序列号60/221,938，和2000年8月24日备案的临时美国专利申请序列号60/227,860)和所示发表的专利申请内容，在此引入，作为参考。
实施例一般方法：
菌株。本发明的枯草芽孢杆菌菌株通常源于下述两种菌株之一。第一种菌株有多种命名，分别为“168”，“1A1”或“RL-1”。基因型为trpC2。该菌株通过突变源于野生型“Marburg”菌株，并已成为在枯草芽孢杆菌上进行的大部分分子生物学工作的基础。第二种菌株为PY79，是168的原养型衍生物，源于野生型菌株W23，通过转导导致Trp+。
培养基。枯草芽孢杆菌的标准最低限度培养基包括1x Spizizen盐和0.5％葡萄糖。标准固体“富培养基”是胰蛋白胨血琼脂肉汤(Difco)，标准液体“富培养基”是VY，是小牛灌输肉汤和酵母提取物的混合物。为了检测在液体试管培养物中泛酸的产生，应用了强化型VY，又称为“特殊VY”或“SVY”。SVYG和PFMG则用于批量发酵。这些培养基的组分如下。
VY，富液体培养基：25g Difco小牛灌输肉汤，5g Difco酵母提取物，1L水(高压灭菌)。
TBAB，富固体培养基：33g Difco胰蛋白胨血琼脂肉汤，1L水(高压灭菌)。
MIN，最低限度培养基：100ml 10x Spizizen盐；10ml 50％葡萄糖；2ml 10％精氨酸HCl*；10ml 0.8％色氨酸*，加水至1升。(*在某些情况下，不用精氨酸，或用终浓度为0.04％的谷氨酸钠取代。通常情况下，当添加某些氨基酸，如精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或脯氨酸作为辅助氮源时，枯草芽孢杆菌在最低限度培养基中生长得更快。)(**对于色氨酸营养缺陷型菌株，绝大多数最低限度培养基都常规添加色氨酸。)
10x Spizizen盐：174g K2HPO4·3H2O；20g(NH4)2SO4；60gKH2PO4；10g Na3柠檬酸·2H2O；2g MgSO4·7H2O；加水至993ml；然后再加3.5ml FeCl3溶液和3.5ml痕量元素溶液。
FeCl3溶液：4g FeCl3·6H2O；197g Na3柠檬酸·2H2O；加水至1升(过滤灭菌)
痕量元素溶液：0.15g Na2MoO4·2H2O；2.5g H3BO3；0.7g CoCl2·6H2O；0.25g CuSO4·5H2O；1.6g MnCl2·4H2O；0.3g ZnSO4·7H2O；加水至1升(过滤灭菌)
SVY，特殊VY，检测试管培养物中泛酸产生的添加*富培养基：25g Difco小牛灌输肉汤；5g Difco酵母提取物；5g谷氨酸钠；2.7g硫酸铵；740ml水(高压灭菌)；添加200ml 1M硫酸钾，pH7.0；60ml 50％葡萄糖。(*为在液体SVY试管培养物中检测泛酸产生，可以添加过滤灭菌的α酮异戊酸钠和/或β丙氨酸，使浓度为5g/L。)
PFMG，用于发酵罐的基于酵母提取物的培养基：20g Amberex1003TM酵母提取物；5g谷氨酸钠；2g硫酸铵；5g色氨酸；10g KH2PO4；20g K2HPO4·3H2O；1g MgCl2·6H2O；0.1g CaCl2·2H2O；1g柠檬酸钠；0.01g FeSO4·7H2O；1ml痕量元素溶液；20g葡萄糖；加水至1升。葡萄糖和其他糖类可根据需要添加。填料溶液可以包括矿物质，限制或食品级营养物质。
PF，化学定义为不含泛酸的用于检测泛酸营养缺陷的培养基：100ml 10x Spizizen盐；100ml 1x Difco泛酸试验培养基；10ml 50％葡萄糖；加水至1升。
对于泛酸营养缺陷型微生物，需要向最低限度和富培养基中添加1mM泛酸钠，因为通常情况下，富培养基中没有足够的泛酸支持枯草芽孢杆菌pan突变株生长。应用时，氨基酸每升100mg。筛选抗生素耐药需要应用5mg/L氯霉素，100mg/L壮观霉素HCl，15mg/L四环素HCl，或1mg/L红霉素加25mg/L林可霉素。
泛酸试验：生物学试验。指示微生物胚芽乳杆菌的生长需要泛酸，并对低浓度(ug/L)泛酸有反应。因此通过系列稀释，可以检测的浓度范围很宽。可以应用通过商业渠道购买的培养基(如泛酸试验培养基(PAM)，Difco)。但是，添加了泛酸的Difco PAM支持细胞生长的水平与应用新鲜配制的泛酸试验培养基(FM-PAM)获得的细胞生长水平不同，所述FM-PAM包括Difco指定的每种组分，因此，常规应用FM-PAM取代商业产品。
在检测枯草芽孢杆菌培养上清前，必须除去或灭活枯草芽孢杆菌。无论上清采用高压灭菌还是过滤灭菌，枯草芽孢杆菌培养上清中的泛酸滴度都大致相同。因此，在进行生物学试验前，常规程序包括样本高压灭菌5分钟。
泛酸试验：HPLC试验。应用HPLC测定制备的泛酸，探测器波长197nm，参考波长450nm。方法是Hewlett-Packard推荐的用于水溶性维生素检测的方法改良。应用等体积60％乙腈(ACN)稀释培养上清样本，然后离心、过滤。典型的方法在分析前还要稀释10倍，也就是最终稀释20倍。高浓度产品还需要进一步稀释。在C18 Phenomenex 5uAqua 250×4.6mm柱上应用溶于50mM磷酸钠缓冲液、pH2.5的5％乙腈(ACN)分离化合物。每个样本间，应用梯度为5％-95％的ACN洗柱。泛酸峰面积与5-1000mg/L的浓度成正比。其他泛化合物也可用该方法进行分离、定量。
氨基酸分析：HPLC试验。应用HPLC检测发酵培养基中和整个发酵过程中出现的氨基酸，探测器波长338nm，参考波长390nm。该方法是Hewlett-Packard推荐的用于氨基酸分析的方法改良。与分析泛化合物一样准备培养肉汤样本。在C18 Hypersil 5u ODS 200×2.1mm柱上分离化合物。溶剂A是20mM醋酸钠缓冲液，pH7.2。溶剂B包括40％ACN和40％甲醇。应用梯度100％溶剂A-100％溶剂B分离氨基酸，并在每个样本间洗柱。
批量发酵。泛酸制备菌株在搅动的箱式发酵罐中生长，例如，在工作容积为10升的CF3000 Chemap 14升容器中。用商业软件例如B.Braun Biotech MFCS软件进行计算机控制和数据汇总。发酵可以是批量发酵法，但优选限制糖的补料批量发酵法。一些培养基成分(如SVYG和PMFG的成分)添加到发酵罐中并适当灭菌。一部分培养基分离灭菌，并无菌添加到发酵罐中。该过程是熟悉本领域的技术人员众所周知的。额外添加的氮源分离灭菌，并在冷却后添加到碳源中。
培养基中开始含有的糖能消耗大约6小时。此后，需要添加葡萄糖或其他糖类，以及可能的矿物质、限制或食品级营养物质。此外，根据早期发酵样本获得的营养物质需求共识，按照程序进行补料。
孵育后，以相对较低的速度进行搅动，如200rpm。当氧溶解度(pO2)下降到30％时，计算机控制会自动调整搅动速度，维持氧溶解度为25-30％pO2。实施例I：应用过量表达panBCD基因产物的细菌增量制备泛化合物
本实施例描述了枯草芽孢杆菌panBCD操纵子的克隆和过量表达panBCD基因产物的微生物的产生。
为了克隆枯草芽孢杆菌panBCD操纵子，应用枯草芽孢杆菌GP275(168的衍生株)基因组DNA的质粒文库转化大肠杆菌BM4062(birAIS)，并在42℃筛选温度耐受克隆。通过对比限制性图谱与基因组序列，推导出一个包含枯草芽孢杆菌birA基因和邻近panBCD基因的特殊克隆。该质粒命名为pAN201。
为了过量表达panBCD操纵子并制备泛酸，应用两个源于枯草芽孢杆菌噬菌体SP01的强组成型启动子中的任意一个取代panBCD操纵子的天然启动子。这两个启动子命名为P26和P15。此外，应用两个人工核糖体结合位点(RBSs)中的任意一个取代天然panB RBS。这两个人工RBSs(序列49和序列50)预期能够增加panBCD的翻译；其序列如表1A所示。将三个这样的工程学修饰panBCD表达盒构建到能够在大肠杆菌中复制的环状质粒中。这些质粒的其他特征包括源于大肠杆菌核糖体RNA转录单位的rho非依赖性强转录终止子，称为T1T2，源于pC194的革兰阳性氯霉素耐药基因(cat)，以及一对NotI限制性位点，位于大肠杆菌复制子与欲整合到枯草芽孢杆菌中的片段之间的连接处。构建该系列三个质粒pAN004，pAN005和pAN006。pAN004包括启动子P26，RBS1和低拷贝大肠杆菌复制子。pAN005包括启动子P15，以我们的经验，P15没有P26强，RBS1和低拷贝复制子。pAN006包括启动子P26，RBS2和中等拷贝复制子。
在上述三个质粒中包含的三个panBCD表达盒全部与DNA片段连接，并通过同源重组以单拷贝整合到枯草芽孢杆菌RL-1和PY79菌株的panBCD位点上，取代野生型操纵子，所述DNA片段包括在天然panB基因紧邻上游自然存在的序列。该过程通过两步完成。首先，通过缺失-取代用革兰阳性壮观霉素耐药基因(spec)置换panB编码区的大约三分之二，整合到panB以产生Spec-泛酸营养缺陷株。然后在将pAN004，pAN005和pAN006的panBCD表达盒与含有panB上游染色体序列的DNA片段连接后，转化这些中间菌株。筛选引入的表达盒，是为泛酸原养型菌株。获得的菌株分别被命名为PA221，PA222和PA223(源于RL-1)，以及PA235，PA232和PA233(源于PY79)。在菌株PA221中整合的含有组合上游序列的示例质粒为pAN240(见图2)。pAN240的核苷酸序列如序列76所示。
通过采用适宜引物的多聚酶链反应来审核这些工程学菌株的染色体结构的正确性。在应用SDS-PAGE检测PA221菌株的提取物时，发现有两种蛋白质过量表达。一种蛋白质的表观分子量大约为29,000道尔顿，另一种蛋白质的分子量大约为39,000道尔顿。推测29,000道尔顿的带是PanB(预期分子量为29,761)。大一些的蛋白带可能代表PanC(预期大小为31,960道尔顿)。
按下述方法检测这些菌株在试管培养中产生泛酸的能力。每一菌株在SVY培养基中生长，所述培养基中添加5g/L的α酮异戊酸(α-KIV)和5g/L的β丙氨酸，以确保这些前体物质不受限。培养上清高压灭菌，然后应用生物试验进行检测。相对于亲本菌株RL-1和PY79，经工程学修饰的菌株生产的泛酸大约多8-30倍，在某些情况下泛酸达到1g/L。 表2.在液体试管培养物中经工程学修饰的枯草芽孢杆菌在含有5g/Lα-KIV和5g/Lβ丙氨酸的SVY培养基中生长产生泛酸的情况
Expt. 菌株 启动子 PanB的RBS [泛酸]mg/L
1 RL-1 天然 天然 30
PA221 P26 RBS1 990
790
PA222 P15 RBS1 250
250
PA223 P26 RBS2 790
790
2 PY79 天然 天然 40
PA235 P26 RBS1 930
860
PA221 P26 RBS1 1100
1030
当RBS1和RBS2大致等价时，P26启动子比P15启动子效率高3-4倍。诸pAN004，pAN005，pAN006的质粒还可以通过Campbell型(单交叉)整合，以环状的形式重组到枯草芽孢杆菌野生型panBCD位点上，然后以5mg/L筛选氯霉素耐药菌株。以该方式获得的菌株产生泛酸的量分别与PA221，PA222和PA223菌株相仿。pAN004含有P26启动子，RBS1和低拷贝大肠杆菌复制子，如图3A所示。质粒pAN004的核苷酸序列如序列93所示。pAN006含有P26启动子，RBS2和中等拷贝大肠杆菌复制子，如图3B所示。质粒pAN006的核苷酸序列如序列94所示。panBCD的核苷酸序列如序列59所示，PanB，PanC和PanD的预期氨基酸序列分别如序列24，序列26和序列28所示。芽孢杆菌的操作方法例如Harwood，C.R.and Cutting，S.M.(editors)，MolecularBiological Methods for Bacillus(1990)John Wiley & Sons，Ltd.，Chichester，England中所述，该文献的内容在此引入，作为参考。实施例II：应用过量表达panE1基因产物-酮泛解酸还原酶的细菌增量制备泛化合物
本实施例描述了枯草芽孢杆菌panE1基因的克隆和过量表达panE1基因产物的微生物的产生。
以前业已分离了Pan-枯草芽孢杆菌菌株(例如泛酸合成被阻断的枯草芽孢杆菌突变株)，报导的其中之一是酮泛解酸还原酶活性受到影响(Baigori et al.(1991)J.Bacteriol.173：4240-4242)。但是，这些菌株的突变被错误地绘制到枯草芽孢杆菌基因图的purE-tre间隔中，所述基因图不含panE或panBCD基因。而且，如下所示，panE突变株并不具有Pan-表型，因为在枯草芽孢杆菌中，与其他细菌菌株如大肠杆菌一样，ilvC基因产物可以取代panE基因产物。最近，鼠伤寒沙门氏杆菌的panE基因业已定位，并确定是apbA的等位基因，所述apbA基因是厌氧嘌呤生物合成所必需的(Frodyma et al.(1998)J.Biol.Chem.273：5572-5576)。大肠杆菌在相同作图位点携带一个与之高度同源的基因。由于ilvC基因产物乙酰羟酸异构还原酶也能够催化酮泛解酸还原酶反应，而使大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌中panE基因的鉴定变得复杂。因此，除非panE和ilvC基因同时突变，否则不能获得泛酸营养缺陷株。
为了鉴定枯草芽孢杆菌panE1基因，应用大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏杆菌ApbA(PanE)蛋白序列进行枯草芽孢杆菌基因组搜索，并鉴定了两个与ApbA同源的开放阅读框，分别命名为ylbQ和ykpB。因为预计其功能与泛酸生物合成有关，因此重新命名为panE1和panE2。应用RL-1基因组DNA作为模板，作为PCR产物，克隆了panE1和panE2。两个基因中间均有壮观霉素耐药基因(spec)或氯霉素耐药基因(cat)干扰。通过双交叉，将两个有干扰的基因分别整合到PY79中，获得PA240(ΔpanE1∷spec)和PA241(ΔpanE2∷cat)。在不含泛酸(PF)的平板上检测时发现，这些菌株都不是泛酸营养缺陷株，尽管含有ΔpanE1∷spec的PA240在不加泛酸的TBAB中生长较添加1mM泛酸时慢得多。通过比较发现，ΔpanB∷spec株在TBAB上不能产生单一集落，推测可能是由于枯草芽孢杆菌没有主动摄取泛酸的系统。
有假设认为，枯草芽孢杆菌基因ilvC，与大肠杆菌中业已显示的一样，能够发挥panE功能。因此，将panE1和panE2干扰基因导入菌株CU550中，所述菌株报告为trpC2 ilvC4 leuC124。在PF培养基中，单一panE1干扰株和panE1，panE2双干扰株均表现为泛酸营养缺陷株。 表3.在富培养基和限制培养基中，多种panE1和panE2突变株的表型
生长*：
菌株 培养基 -pan +pan
PY79 TBAB +++ +++
PF ++ ++
PA240 TBAB spec + +++
PF ++ ++
PA241 TBAB cam +++ +++
PF ++ ++
CU550 TBAB +++ +++
PF ++ ++
PA256 TBAB spec - +++
PF - ++
PA258 TBAB spec，cam +++
PF - ++
*每个“+”代表37℃过夜后，集落直径大约1mm。
因此，panE1和ilvC双双突变可以导致泛酸营养缺陷株，而仅仅panE1突变，与在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌中报导的一样，不产生泛酸营养缺陷株。
接下来，检测了泛酸过量生产株(如本文所述的PA235)敲除panE1和panE2的定量效应。将panE1和panE2干扰基因分别或共同导入PA235，产生PA245(ΔpanE1∷spec)，PA248(ΔpanE2∷cat)和PA244(ΔpanE1∷cat，ΔpanE2∷spec)。然后在液体试管培养物中，检测每种突变对泛酸生产的影响。 表4.含有panE1和panE2干扰基因的PA235衍生株的泛酸生产情况
菌株 [pan]mg/L PA235的％
PA235 990 (100)
PA235 940 95
PA245 59 6
PA245 82 8
PA248 1060 106
PA248 1030 104
PA244 25 3
PA244 50 5
因此，缺失分析显示，panE1基因对泛酸生产的影响超过90％，而panE2缺失对泛酸生产却没有显著影响。因此得出结论，在枯草芽孢杆菌中，panE1决定了酮泛解酸还原酶的绝大部分但不是全部活性。酮泛解酸还原酶的其余活性预期由ilvC补充。
既已鉴定panE1是泛酸制备的重要基因，接下来需要检测增加panE1表达是否能够在诸如PA221或PA235的菌株中增加泛酸的产量。将panE1编码序列装载到载体p0TP61的P26启动子和RBS2下游，设计的载体将在bpr位点(非必需蛋白酶基因)或克隆插入位点整合、扩增。应用获得的质粒pAN236(图4)转化PA221，在15mg/L时筛选四环素耐药株。pAN236的核苷酸序列如序列77所示。选择被命名为PA236的转化株准备进一步研究。
PA236过量表达一种大约31,000道尔顿的蛋白质，该蛋白与panE1蛋白的预期分子量33,290道尔顿非常接近。简言之，制备PY79，RL-1，PA221，PA221/pOTP61和PA236的全细胞提取物(2个样本)。通过凝胶电泳分离细胞提取物，考马斯染色凝胶使蛋白质可见。在工程学修饰过量表达panE的细胞中(PA236-1和PA236-2)，观察到分子量大约为～31,000道尔顿的带(与分子量标记物对比)。而且，PA221和PA236在相应于panB基因产物的～29,000道尔顿带处表达水平增加，并表达～39,000道尔顿的带，可能相应于panC基因产物。而且，用pAN006转化(图3B)的大肠杆菌，表达的带与panB和panC基因产物相关，用PAN236转染的大肠杆菌，表达～31,000道尔顿的带，相应于panE基因产物。
接下来，比较PA236和携带空载体pOTP61的PA221，在添加了5g/L β丙氨酸和5g/L α-KIV的液体试管培养物中产生泛酸的情况。表5.在液体试管培养物中，过量表达panE1和panE2对工程学菌株生产泛酸的影响
菌株 添加的质粒 过量表达的基因 [泛酸]
mg/L
PA221 pOTP91 没有 1,000
940
PA236 pAN236 panE1 2,030
2,050
PA238 pAN238 panE2 530
680
与亲本菌株相比，过量表达panE1可以导致泛酸增产到2倍(如，稍微超过2g/L)，而过量表达panE2的菌株，与亲本菌株相比，泛酸产量减少大约35％。序列29和序列30显示了panE1的核苷酸序列和预期氨基酸序列。实施例III：在有缬氨酸的情况下，通过培养过量表达panE1或panBCD的细菌增量制备泛化合物
评价了缬氨酸作为培养基添加剂(如作为α-KIV的替代物)，在过量表达panBCD操纵子和panE1的工程学菌株中发挥作用的能力。通过转氨基作用，缬氨酸与α-KIV密切相关，而且比α-KIV价格便宜，可以公斤的数量商业购买。在SVY培养基的标准液体试管培养物中，应用缬氨酸替代α-KIV。缬氨酸的浓度从5-50g/L不等。尽管浓度为5g/L的缬氨酸在促进泛酸制备方面的有效性稍微不及α-KIV，但10或20g/L的缬氨酸在促进泛酸制备方面，有效性与5g/L的α-KIV相等或超过。实施例IV-X：制备能够以非依赖前体的形式产生泛酸的微生物
枯草芽孢杆菌菌株例如PA221和PA235(工程学修饰过量表达panBCD)以及PA236(工程学修饰过量表达panBCD和panE1)，需要添加α酮异戊酸(α-KIV)(或缬氨酸)以及天门冬氨酸(或β丙氨酸)以获得最大程度的泛酸生成，因为这两种前体物质是泛酸合成的限制。因此，在泛酸制备过程中，设计的处理微生物应消除对泛酸生物合成限制性前体物质的添加需求，这些菌株对于制备多种泛酸生物合成途径中间产物也非常有用。实施例IV：制备能够以非依赖天门冬氨酸(或β丙氨酸)的形式产生泛酸的微生物
将panD基因克隆到枯草芽孢杆菌pOTP61表达载体上，构建pAN423(图5)。pAN423的核苷酸序列如序列78所示。含有panD的NotI限制性片段分离自pAN423，自身连接并用于转化PA221。分离耐Tet15，Tet30和Tet60的转化株，并保留以备进一步分析。
6株pAN423转化株与2株对照转化株在含有5g/L α-KIV的SVY培养基中生长，所述SVY培养基含有或不含10g/L的天门冬氨酸，然后分析泛酸生成情况(表6)。表6.在添加或不添加天门冬氨酸的情况下，过量表达panD对泛酸生成的影响
*试管培养物生长于SVY+α-KIV(5g/L)以及指示的Asp(10g/L)。**TetR＝大约Tet耐药转化株。
| 培养物*(PA221转化株) | Asp(10g/L) | TetR**(μg/ml) | OD550 | [pan](mg/L) |
| pOTP61-1 | - | 60 | 8.0 | 76 |
| pOTP61-2 | - | 60 | 7.7 | 91 |
| 423#1-1 | - | 15 | 8.5 | 180 |
| 423#1-2 | - | 15 | 8.0 | 150 |
| 423#1-3 | - | 30 | 8.3 | 220 |
| 423#1-4 | - | 30 | 8.5 | 280 |
| 423#1-5 | - | 60 | 8.9 | 580 |
| 423#1-6 | - | 60 | 8.8 | 280 |
| pOTP61-1 | + | 60 | 7.5 | 380 |
| pOTP61-2 | + | 60 | 6.9 | 560 |
| 423#1-1 | + | 15 | 8.5 | 1200 |
| 423#1-2 | + | 15 | 8.6 | 1000 |
| 423#1-3 | + | 30 | 8.8 | 1200 |
| 423#1-4 | + | 30 | 9.0 | 1200 |
| 423#1-5 | + | 60 | 9.0 | 1200 |
| 423#1-6 | + | 60 | 9.0 | 1200 |
pAN423转化株产生的泛酸至少是对照菌株的两倍(即达到或接近早期试验中培养基添加β丙氨酸获得的泛酸水平)。数据还显示，在没有添加天门冬氨酸的情况下，包括多拷贝panD基因表达盒的转化株较对照转化株，可以产生更多的泛酸。其中423#1-5转化株，产生泛酸的量是对照菌株的大约5倍。这些结果提示，PanD蛋白水平的增加可以“推动”现有的天门冬氨酸向β丙氨酸转化，而且panD基因表达的增加，无论是否添加额外的天门冬氨酸，均可以导致泛酸产量的提高。
423#1-5转化株又重新命名为PA401，并在摇动培养瓶发酵中进一步研究。摇动培养瓶中的培养基不是含有葡萄糖的SVY，而是含有麦芽糖的SYY。摇动培养瓶试验结果在头24小时内与试管试验一致。在摇动培养瓶试验中，不添加β丙氨酸，24小时内PA401产生大约1.5g/l泛酸。向培养基中额外添加β丙氨酸不能进一步提高泛酸滴度(表7)，提示在这种发酵条件下，β丙氨酸不是该菌株生成泛酸的限制。实际上，在不添加β丙氨酸的情况下，可以观察到，PA401向培养基中分泌大量β丙氨酸。表7.在含或不含β丙氨酸的情况下，菌株PA401(panD)的摇动培养瓶培养
每个数值代表含有50ml培养基的2个250ml折流培养瓶数值的平均值，在37℃摇动(200rpm)孵育。基础培养基：含10g/l α-KIV，30g/1麦芽糖的SVY2％接种体：Tet15生长24小时的SVY实施例V：工程学修饰panD基因以进一步增加天门冬氨酸脱羧酶的合成以及泛酸的增量制备
| 氨基酸(g/l) | 24小时 | |
| 开始添加的β丙氨酸 | β丙氨酸 缬氨酸 | pH OD600 泛酸(g/l) |
| 05g/l | 0.7 1.57.1 1.4 | 7.5 13.7 1.57.6 12.4 1.5 |
本实施例描述了在panD基因中生成改良核糖体结合位点(RBSs)，以增加panD mRNA的翻译。通过生成合成的panD RBSs，增加panD基因mRNA的翻译
用于在pAN423中表达panD的RBS(序列88)是合成的RBS，业已成功用于枯草芽孢杆菌高水平生产其他蛋白质。但是，在与“理想”枯草芽孢杆菌RBS(序列45)(例如与枯草芽孢杆菌核糖体16S RNA序列互补的RBS序列)比对时，该合成RBS包括6个误配(见，例如表1B，误配用黑体字提示)。这些被命名为新设计A(NDS)和新设计B(NDB)(本文也称为RBS3和RBS4)的合成RBSs，如序列51和序列52所示，并在表1B中与理想RBS进行比对。
合成、退火与每个新RBS的顶链和底链相对应的寡核苷酸，然后用来置换pAN420中的RBS，产生质粒pAN426和pAN427。这些构建物如图6所示。通过DNA序列分析，确认了pAN426和pAN427中存在的NDA和NDB RBS。然后如图7所示，将来自pAN426和pAN427的panD基因转移到枯草芽孢杆菌表达载体pOTP61中，构建pAN428和pAN429。pAN429的核苷酸序列如序列79所示。
从pAN428和pAN429中分离缺乏大肠杆菌载体序列的NotI限制性片段，自身连接，并用于转化PA221菌株，以产生对Tet15的耐药性。每次转化后分离4个Tet60抗株，与转化了空载体(p0TP61)的PA221和转化了pAN423的PA221(PA401菌株)一起，检测生成泛酸和β丙氨酸的情况(见表8)。表8试管培养转化了pAN428和pAN429的PA221菌株的泛酸生成情况
UND：低于检测下限 *重新命名为PA402 #重新合名为PA403
| 质粒 | 培养基添加剂 | OD550 | Pang/l | β-Alag/l |
| pOTP61pAN423pAN428-1 *pAN428-2pAN428-3pAN428-4pAN429-1pAN429-2pAN429-3pAN429-4 # | α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5 | 10101211111012111112 | UND0.40.60.50.30.10.60.50.60.8 | 0.040.040.040.030.03UND0.040.040.050.10 |
| pOTP61pAN423pAN428-1 *pAN428-2pAN428-3pAN428-4pAN429-1pAN429-2pAN429-3pAN429-4 # | α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10 | 11121212121112121213 | 0.50.90.80.80.90.80.80.80.80.8 | 0.081.321.971.511.020.301.781.661.782.28 |
当培养基中添加了5g/l的α-KIV(α-KIV5)时，pAN428-1转化株和所有4个pAN429转化株生成泛酸的量较PA401多，提示这些转化株包括更高水平的天门冬氨酸脱羧酶活性。当生长培养基中添加了α-KIV5和Asp10时，pAN428或pAN429转化株生成泛酸的量均不多于PA401。但是，pAN428-1转化株和所有4个pAN429转化株生成β丙氨酸的量显著高于PA401。这可能是由于添加天门冬氨酸后，过量产生β丙氨酸，导致泛酸生成的抑制。此外，β丙氨酸的堆积还可能是由于这些菌株受到泛解酸的限制。
产生最高水平β丙氨酸的菌株，pAN428-1和pAN429-4转化株又分别重新命名为PA402和PA403。这两个菌株在添加了多种中间产物的SVY培养基中生长，检测泛酸和β丙氨酸的生成情况。PA221和PA401作为对照包括在研究中。试验结果如表9所示。
表9 在试管培养中PA402和PA403的泛酸生成情况
UND：低于检测下限
| 质粒 | 培养基添加剂 | OD550 | Pang/l | β-Alag/l | Valg/l |
| PA221PA401PA402PA403 | α-KIV5α-KIV5α-KIV5α-KIV5 | 7.98.78.59.4 | UND0.30.50.7 | UND0.040.040.07 | 0.90.90.90.9 |
| PA221PA401PA402PA403 | α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10α-KIV5+Asp10 | 9.89.19.49.7 | 0.40.80.80.7 | 0.111.152.022.40 | 0.80.80.80.8 |
| PA221PA401PA402PA403 | 泛解酸5泛解酸5泛解酸5泛解酸5 | 8.98.710.610.5 | UND0.30.50.7 | UND0.020.020.02 | 0.20.20.20.2 |
| PA221PA401PA402PA403 | 泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10 | 9.59.29.110.2 | 0.42.22.82.9 | 0.060.621.171.58 | 0.20.20.20.2 |
当生长培养基中添加了α-KIV5或泛解酸5时，PA402和PA403产生泛酸的量显著高于PA401。如前所述，当生长培养基中添加了α-KIV5和Asp10时，即使PA402和PA403产生β丙氨酸的量显著高于PA401，它们生成泛酸的量并未按比例增加。但是，当生长培养基中添加了泛解酸5和Asp10时，PA402和PA403产生泛酸的量均较PA401显著增加，大约增加30％。
从这些实验可以得出结论，改良的NDA和NDB panD核糖体结合位点经工程学分别整合到pAN428和pAN429中后，可以导致天门冬氨酸脱羧酶活性水平增加。通过在panBCD操纵子内生成合成的panD RBSs，增加panD基因mRNA 的翻译
在PA221(以及本文所述其他工程学修饰的泛酸制备菌株)P26panBCD操纵子盒中发现的天然枯草芽孢杆菌panD基因核糖体结合位点(RBS)(序列43)在表1C中与理想核糖体结合位点(序列47)进行了比对。比对显示，在天然枯草芽孢杆菌panD基因RBS和理想RBS之间存在误配，所示天然RBS存在于PanC编码序列之内。生成三个新的RBSs(位于P26 panBCD操纵子盒)以增加panD基因mRNA的翻译，并使天门冬氨酸脱羧酶的合成增加。这些合成的RBSs(分别命名为NDI，NDII和NDIII，在本文还被称为RBS5，RBS6和RBS7)分别如序列55，序列56和序列57所示，并在表1C中给出。应该指出，尽管panBCD操纵子中panD RBS的变化也会改变该操纵子编码的PanC蛋白C末端的氨基酸序列，但是，应用已知和疑为PanC蛋白的氨基酸序列比对分析发现，枯草芽孢杆菌PanC蛋白最后9个氨基酸可以在不影响任何保守氨基酸残基的情况下发生改变，说明这些改变不会降低泛酸合成酶活性或表达。如下合成这些新的RBSs，并整合到P26panBCD操纵子表达盒内。
首先，设计的PCR引物需要包括以下因子：(1)编码PanD前5个氨基酸的核酸序列，直到并包括事先通过PCR导入panD的独特BsiWI限制性位点；(2)panC的终止密码子；(3)至少一个合成的RBS；以及(4)与panD RBS上游panC具有100％一致性的30-39bp核酸序列。引物命名为TP102，TP103和TP104，分别包括NDI，NDII和NDIII核糖体结合位点。这三个引物与在panC起始密码子附近杂交的5’引物TP101联合应用，在3个独立PCR反应中，分别产生NDI，NDII和NDIII PCR产物。纯化PCR产物，并应用XbaI消化，然后克隆到业已经XbaI和SmaI消化的质粒载体pASK-1BA3中。获得的质粒被命名为pAN431，pAN432和pAN433。pAN431的构建如图8所示，并代表所有三个质粒的构建。在每个新建质粒中，所需合成panD基因RBS的存在通过DNA序列分析进行确证。
然后，应用独特的BsiWI限制性位点，将含有新panD RBSs的改良panC基因与panD基因连接。这可以通过下述步骤完成，从pAN431，pAN432和pAN433中分离适宜的NsiI-BsiWI限制性片段，并将它们与来自pAN420的2395bp的NsiI-BsiWI限制性片段连接，后者提供了BsiWI改良的panD基因。这些构建分别获得质粒pAN441，pAN442和pAN443。代表性构建(pAN441)如图9所示。pAN443的核苷酸序列如序列80所示。
然后如下所述，用新的panD基因RBSs取代进入P26panBCD操纵子表达盒。首先，创建缺失插入突变，去除含有panD RBS的panC区域。这可以通过在BspE1和BglII混合物中消化pAN430，然后回收4235bp片段来构建，所述片段不含panC的3’端和panD的5’端。该片段与来自质粒pECC4的AvaI-BamHI限制性片段连接，后者含有氯霉素乙酰转移酶(cat)基因。AvaI消化产生的5’延伸片段与BspEI产生的兼容，BglII与BamHI的延伸片段也兼容。获得的质粒命名为pAN440，其构建如图10所示。
应用线形pAN440转化PA221，通过同源重组将获得的缺失插入突变交叉导入P26panBCD操纵子，并在含有1mM泛酸的Cam5平板上筛选氯霉素耐药株。检测了几个转化株，结果与预期一致，所有的转化株都需要1mM的泛酸才能生长。这些转化株中的两株重新命名为PA408A和PA408B，然后检测泛酸的生成情况。甚至在培养基中含有5g/l的泛解酸和β丙氨酸，也没有一株合成泛酸的量能够检测到，提示这些菌株缺乏泛酸合成酶活性。然后，应用线形pAN441，pAN442和pAN443质粒DNA转化PA408，将新的panD RBSs交叉导入P26panBCD操纵子，并在没有添加泛酸的TBAB平板上筛选生长。应用线性化pAN430(包括天然panD RBS)转化作为对照，预期产生的转化株与本文所述的PA221一致。在添加了多种中间产物的SVY培养基中检测4种转化分离株的泛酸和β丙氨酸生成情况(表10和11)。
表10 PA410-PA413在试管培养物中生成泛酸的情况
UND：低于检测下限。
| 菌株 | RBS | 培养基添加剂 | OD550 | Pang/l | β-Alag/l |
| PA221 | 天然 | 泛解酸5 | 11 | UND | UND |
| PA410-1PA410-2PA410-3PA410-4 | 天然 | 泛解酸5泛解酸5泛解酸5泛解酸5 | 12121212 | UNDUNDUNDUND | UNDUNDUNDUND |
| PA411-1PA411-2PA411-3PA411-4 | NDI | 泛解酸5泛解酸5泛解酸5泛解酸5 | 12121212 | 0.230.200.19UND | UNDUNDUNDUND |
| PA412-1PA412-2PA412-3PA412-4 | NDII | 泛解酸5泛解酸5泛解酸5泛解酸5 | 12111312 | UNDUND0.180.18 | UNDUNDUNDUND |
| PA413-1PA413-2PA413-3PA413-4 | NDIII | 泛解酸5泛解酸5泛解酸5泛解酸5 | 12121212 | 0.180.170.160.17 | UNDUNDUNDUND |
表11 PA410-PA413在试管培养物中生成泛酸的情况
| 菌株 | RBS | 培养基添加剂 | OD550 | Pang/l | β-Alag/l |
| PA221 | 天然 | 泛解酸5+Asp10 | 11 | 0.3 | UND |
| PA410-1PA410-2PA410-3PA410-4 | 天然 | 泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10 | 12121212 | 0.40.40.40.4 | UNDUNDUNDUND |
| PA411-1PA411-2PA411-3PA411-4 | NDI | 泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10 | 13131313 | 1.71.71.80.4 | 0.40.40.3UND |
| PA412-1PA412-2PA412-3PA412-4 | NDII | 泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10 | 13121212 | 0.40.41.61.5 | UNDUND0.30.2 |
| PA413-1PA413-2PA413-3PA413-4 | NDIII | 泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10泛解酸5+Asp10 | 13131313 | 1.61.61.71.7 | 0.30.40.40.4 |
UND：低于检测下限。
与应用PA221进行的前述试验预期一致，没有一株包括天然panDRBS的转化株在添加了泛解酸的培养基中生长，产生的泛酸量能够检测到。但是，含有改良panD RBSs的转化株，12株中有9株预期在这样的条件下可以产生大量泛酸(160-230mg/l)，提示它们具有的天门冬氨酸脱羧酶活性水平提高。当在添加了泛解酸和天门冬氨酸的培养基中生长时，这9株转化株产生的泛酸量比含有天然panD RBS的菌株高约4倍。此外，这9株转化株还累积了可以检测到的p丙氨酸(230-410mg/l)。当生长培养基中包括泛解酸和β丙氨酸时，所有转化株产生大致等量的泛酸，提示每个转化株都含有具有功能的泛酸合成酶。
这些数据提示，在指导panD基因mRNA翻译方面，合成的panD RBSs的效率比天然panD RBS高4倍，并提供证据支持在提高泛酸产量时应用合成的RBSs。其他增加泛酸产量的方法可以包括，例如增加panD基因mRNA的半衰期，增加panD转录启动子的强度，和/或增加PanD蛋白的稳定性。实施例VI：构建含有整合的P26panE1盒但不含抗生素耐药基因的菌株
实施例II描述了枯草芽孢杆菌panE1基因的鉴定，所述基因编码的酶代表枯草芽孢杆菌酮泛解酸还原酶的绝大部分活性。在SVY试管培养物中，PA236(含有pAN236质粒)24小时内产生泛酸的量(2g/l)大约是其亲本菌株PA221(1g/l)的2倍。基于四环素耐药的筛选(除了P26panE1盒，pAN236质粒也编码tetR基因产物)，预计PA236含有多个(～3拷贝)整合的pAN236质粒。本发明方法中还非常有用的是在panE1位点包括不可扩增拷贝的单一整合P26panE1的菌株，例如，没有抗生素耐药基因的菌株。这样的菌株可以按照下述方法生成。
通过在pAN236的P26panE1盒的紧邻上游和紧邻下游插入额外的染色体序列，获得命名为pAN251的质粒。这些额外序列是以染色体DNA作为模板通过PCR获得的，并提供同源性，允许通过双交叉在panE1位点整合P26panE1盒。pAN251如图11所示。pAN251的核苷酸序列如序列81所示。
然后，构建能够筛选引入的P26panE1盒的菌株。该菌株包括下述3个组分：(1)P26panBCD；(2)ΔpanE1；以及(3)ilvC，因为只有panE1和ilvC同时突变，才能获得pan-表型。起始菌株为CU550(trpC2，ilvC4，leuC124)。来自PA221染色体DNA的P26panBCD盒通过两步导入，创建菌株PA290。然后，应用来自菌株PA240的染色体DNA，将ΔpanE1∷spec转化进入PA290，获得菌株PA294(trpC2，ilvC4，leuC124，P26panBCD，ΔpanE1∷spec)，该菌株是严格的泛酸营养缺陷型菌株。最后，应用质粒pAN251转化PA294，选择泛酸原养型菌株，获得菌株PA303。该菌株预期具有基因型trpC2，ilvC4，leuC124，P26panBCD，P26panE1。应用panE1上游P26插入点的侧翼序列作为引物，通过PCR，检验PA303在panE1位点染色体结构的正确性。从PA303获得的PCR产物具有预期大小，同时没有野生型panE1基因的PCR产物，与所需双交叉事件获得的一致。而且，PA303四环素敏感，也与所需双交叉事件一致，与质粒Campbell型单交叉入染色体相反。从亲本菌株获得的trp，ilv和leu营养缺陷型均在PA303中维持。
如表12所示，在24小时液体SVY试管培养中，PA303产生泛酸的水平几乎与阳性对照PA236一致，是PA221的大约2倍，所述PA221不含工程学panE1。表12.在添加了5g/l α-KIV和5g/l β丙氨酸的SVY中培养PA303和对照菌株，24小时试管培养物中泛酸的产生量
菌株 OD600 [pan]g/l
PA221-1 10.9 0.85
PA221-2 10.5 0.85
PA236-1 9.5 1.74
PA236-2 9.3 1.70
PA303-1 10.8 1.66
PA303-2 10.7 1.61实施例VII：制备能够以非依赖α-KIV(或缬氨酸)的形式产生泛酸的微生物
在某些泛酸合成去调节菌株中，α酮异戊酸(α-KIV)是泛酸产生的速率限制中间产物。对于诸如PA221的菌株，在试管培养中添加5g/l的α-KIV或缬氨酸，泛酸产量可以增加大约5倍。为了减少对补料α-KIV或缬氨酸的需求，菌株需要工程学修饰，增加其合成α-KIV的能力。
在枯草芽孢杆菌中，通过三个酶的连续作用，可以从丙酮酸生成α-KIV，所述三个酶由四个基因ilvB，ilvN，ilvC和ilvD编码。在野生型枯草芽孢杆菌中，其中三个基因(ilvB，ilvN和ilvC)是大ilv-leu操纵子的前三个基因。第四个α-KIV合成所需的基因ilvD独自位于染色体的其它部位。目前认为，枯草芽孢杆菌ilv-leu操纵子只受亮氨酸水平的调节。外源性添加亮氨酸，可能通过衰减机制，使ilv-leu操纵子的转录水平下降约13倍(Grandoni et al.(1992)J.Bacteriol.174：3212-3219)。唯一已知的ilv-leu途径反馈调节是亮氨酸抑制leuA基因产物。
作为α-KIV合成去调节的第一步，应用PCR分离来自野生型枯草芽孢杆菌ilv-leu操纵子的一个拷贝的ilvBNC区，然后安装到载体p0LL8的P26启动子和RBS2邻近，所述载体通过在amyE位点的双重重组，设计整合了单一P26表达盒。amyE基因编码非必需α-淀粉酶，是装载表达盒非常有用的位点。获得的质粒pAN267如图12所示。pAN267的核苷酸序列如序列82所示。如下详述，通过在枯草芽孢杆菌菌株的amyE位点双交叉，可以获得稳定的pAN267转化株。构建过量产生泛酸的亮氨酸原养型菌株
开始，在不应用抗生素耐药基因的情况下，应用含有ilvC4和ΔpanE1的枯草芽孢杆菌菌株将单一拷贝的P26panE1导入染色体。需要双突变株来筛选P26panE1盒的引入，因为单独的ΔpanE1突变不能导致泛酸营养缺陷型菌株。获得的一种被称为CU550，并含有ilvC4的菌株成为构建这类菌株的基础。但是，CU550也含有紧密连接的leuC124突变，所以从CU550衍生的所有菌株都需要亮氨酸。业已显示，P26panBCD和P26panE1联合有利于泛酸产生，下一步就是将这两个盒的组合重新导入亮氨酸原养型菌株中。
因此，将这两个盒在两个不同的菌株背景RL-1和PY79中组合。为了在不应用抗生素耐药基因的情况下将染色体P26panE1导入PY79和RL-1背景菌株，应用了不依赖ilvC4的策略。(该策略利用以下观察结果，ΔpanE1突变导致泛酸营养缓慢型菌株，其表现为在(富)TBAB平板上出现相对较小的集落)。首先，将ΔpanB∷cat和ΔpanE∷spec导入两个背景菌株中。然后，应用来自两个菌株PA221(P26panBCD)和PA303(P26panE1)的DNA同时转化获得的菌株，并在TBAB平板上筛选Pan+。在选择性平板上有两种大小不同的集落生长，其中较大集落占2％。设定较大集落代表P26panBCD和P26panE1的共同转化株，而较小集落只接受了P26panBCD。与该假设一致，较大集落丧失了Camr和Specr，而较小集落只丧失了cat基因，依然保留spec基因。而且，被称为PA327的PY79衍生代表株和被称为PA328的RL-1衍生代表株在试管培养中，产生的泛酸水平提高，大约为1.6-1.7g/l(表13)。表13. PA327，PA328和对照菌株在添加了5g/l α-KIV和β丙氨酸的试管培养物中24小时产生的泛酸量
P26panEl菌株 背景 拷贝数 [pan]g/lPA221-1 RL-1 0 0.92PA221-2 RL-1 0 0.95PA236-1 RL-1 扩增(～3) 1.60PA236-2 RL-1 扩增(～3) 1.73PA327-1 PY79 1 1.66PA327-2 PY79 1 1.65PA328-1 RL-1 1 1.61PA328-2 RL-1 1 1.91
因此，可以得出结论，PA327和PA328含有P26panBCD和P26panE1，并如下所述，被用来进行进一步构建。PCR分析确证了这两个盒的存在。将稳定的P26 ilvBNC盒装载到两个过量产生泛酸的细胞系中
业已构建PA327和PA328，这两个菌株是PY79和RL-1的衍生菌株，含有P26panBCD和P26panE1，并且Leu+，下一步是导入稳定拷贝的P26ilvBNC。可以通过质粒pAN267转化PA327和PA328，并筛选Specr来达成。PCR筛选显示，大约85％的获得转化株通过双交叉在amyE位点整合了P26ilvBNC。被称为PA340的PA327转化株和被称为PA342的PA328转化株被选用于进一步研究。
在试管培养中，SVY培养基添加了5g/l β丙氨酸但没有添加α-KIV，PA340和PA342与预期一致，泛酸产生量比PA327和PA328多，达到大约1.3-2g/l(表14)。表14.SVY添加5g/l β丙氨酸和α-KIV，或只添加5g/l β丙氨酸，在24小时试管培养中，含有P26ilvBNC的PA340和PA342的泛酸和缬氨酸产量
| 菌株 背景 | OD600-α-KIV +α-KIV | [pan]g/l-α-KIV +α-KIV | [val]g/l-α-KIV +α-KIV |
| PA340-1 PY79PA340-2 PY79PA342-1 RL-1PA342-2 RL-1 | 11.8 7.110.3 7.510.2 8.09.6 9.2 | 2.02 2.101 97 2.031.29 1 891.34 2.04 | 0.38 0.900.40 0.910.27 0 780.21 0.79 |
两个新菌株缬氨酸分泌量也有轻微增加，提示ilvBNC基因业已去调节。但是，当相同菌株在添加了5g/l α-KIV的培养基中生长时，PA342的泛酸产量进一步增加，提示在该菌株背景中，α-KIV仍然是速率限制物质。在摇动培养瓶培养中，观察到相似结果，只是生长更多，因此泛酸产量更高(表15)。表15.SVY添加5g/l β丙氨酸和α-KIV，或只添加5g/l β丙氨酸，在24小时摇动培养瓶培养中，含有P26ilvBNC的PA340和PA342的泛酸和缬氨酸产量
实施例VIII：在工程学修饰过量产生panE1和ilvBNC基因产物的菌株中增加panD拷贝数量可以提高泛酸产量
| 菌株 背景 | OD600-α-KIV +α-KIV | [pan]g/l-α-KIV +α-KIV | [val]g/l-α-KIV +α-KIV |
| PA327 PY79PA340-1 PY79PA340-2 PY79PA328 RL-1PA342-1 RL-1PA342-2 RL-1 | 21 2220 2022 1920 1617 1618 18 | 0.6 3.03.5 4.13.0 2.11.4 2.73.3 3.63.1 4.2 | 0.5 1.31.0 1.90.8 1.40.6 1.30.9 1.60.8 1.4 |
在工程学修饰枯草芽孢杆菌菌株培养中添加β丙氨酸的试验始终提示，β丙氨酸是泛酸合成过程中的一种速率限制中间产物。检测了在PA340和PA342中增加panD拷贝数量对泛酸产量的影响。应用分离自PA401的染色体DNA转化PA340和PA342菌株，然后在含有15ug/ml四环素的平板(Tet15平板)上进行筛选。再将从每一亲本菌株衍生的转化株接种到Tet60平板上，鉴别可能含有多拷贝表达盒的菌株。在Tet60上生长的来自每次转化的12株转化株划线接种于该培养基中选择单独集落，然后在SVY培养基的试管培养物中检测泛酸生成情况。结果发现，每组中都有一株转化株在24小时泛酸产量超过300mg/l。保存这两株转化株，并分别命名为PA404(PA340菌株背景)和PA405(PA342菌株背景)。这两个菌株对壮观霉素耐药，提示P26ilvBNC表达盒仍然存在于amyE位点。对每一菌株分离的染色体DNA进行PCR分析，确证panE1基因的去调节得到保留。
然后，在摇动培养瓶培养中评价PA404和PA405，所述培养物生长于SVY培养基中，所述培养基包括作为碳源的麦芽糖，并添加了多种中间产物。培养物生长24小时或48小时，然后检测泛酸、β丙氨酸和缬氨酸产量。该试验结果如表16所示。表中还包括亲本菌株(PA340和PA342)在类似摇动培养瓶培养中的数据，用来比较。表16.在摇动培养瓶中培养24小时后，PA404和PA405泛酸产量
| 菌株 | 培养基填料 | OD600 | Pang/l | β-Alag/l | Valg/l |
| PA340PA404PA342PA405 | 无无无无 | 20221919 | 0.41.80.31.4 | ＜0.1＜0.10.20.4 | 1.00.70.70.5 |
| PA340PA404PA342*PA405* | β丙氨酸5β丙氨酸5β丙氨酸5β丙氨酸5 | 18181719 | 3.62.83.31.3 | 3.25.13.36.5 | 0.60.70.50.6 |
除了*标示，所有数据都是两个培养瓶的平均值。
在没有添加任何培养基填料的情况下，PA404和PA405在24小时产生的泛酸较其同源亲本菌株多4-5倍(表16)。在亲本菌株PA340和PA342中，β丙氨酸供应显然是限制物质。增加P26panD可以显著增加β丙氨酸的供应。实施例IX：枯草芽孢杆菌ilvD基因去调节可以提高泛酸产量
为了去调节ilvD基因的表达，应用标准程序(上述)在ilvD编码区上游整合组成型P26启动子与人工核糖体结合位点RBS2。ilvD基因的自身图谱显示，它不与ilvBNC操纵子连接。首先，通过PCR克隆含有ilvD编码区的2.4kb RL-1染色体及其730bp的上游序列，然后导入被称为pOK12的低拷贝载体中(大约15个/大肠杆菌细胞)，形成质粒pAN257，如图13所示。
利用紧邻天然ilvD基因启动子上游的天然EcoRI位点和位于ilvD启动密码子的天然NcoI位点，将含有P26和RBS2的人工序列插入pAN257，形成pAN263(图14)。pAN263的核苷酸序列如序列83所示。与此构建平行，在相同的上游EcoRI位点和位于ilvD编码区中间的BglII位点之间，将cat基因也插入到pAN257中，形成缺失大部分ilvD基因的pAN261(图15)。应用pAN261和pAN263，可以通过两步将P26ilvD盒装载到枯草芽孢杆菌染色体中。第一步，通过转化将pAN261导入，筛选氯霉素耐药株，然后确认Ilv-表型。第二步，导入pAN263，筛选Ilv+，检测氯霉素敏感性，通过PCR确认正确的局部结构。
首先将pAN261转化进入RL-1菌株(高感受态)，获得PA343菌株(ΔilvD∷cat)，然后应用来自PA343的染色体DNA转化PA340和PA342，获得Ilv-营养缺陷型菌株，产生的菌株分别命名为PA348和PA349。在转化枯草芽孢杆菌时，染色体DNA较单节显性质粒天生更有效。同样，将pAN263 DNA转化进入PA343(中感受态)，获得PA345菌株(P26ilvD)，然后应用PA345染色体DNA转化PA348和PA349，获得Ilv+原养型菌株，产生的菌株分别命名为PA374和PA354。
与预期一致，PA374和PA354在添加了5g/l β丙氨酸的SVY试管培养中生长，泛酸产量进一步增加(表17)。表17.SVY添加5g/l β丙氨酸和5g/l α-KIV，或只添加5g/l β丙氨酸，在24小时试管培养中，含有P26ilvD的PA374和PA354，以及对照菌株的泛酸和缬氨酸产量
| 菌株 背景 ilvD状态 | OD600 | [pan]g/l | [val]g/l |
| α-KIV α-KIV | α-KIV α-KIV | α-KIV α-KIV- + | |
| PA340 PY79 w.tPA348 PY79 ilvD∷catPA374-1 PY79 P26ilvDPA374-2 PY79 P26ilvDPA342 RL-1 w.t.PA349 RL-1 ilvD∷catPA354-1 RL-1 P26ilvDPA354-2 RL-1 P26ilvD | 9.2 9.011.7 10.09.1 7.38.2 7.710.2 8.08.1 7.79.6 9.67.5 8.2 | 2.14 2.230.19 2 232.93 2.402.99 2 361.29 1.890.17 1.872.57 2.032.48 2.24 | 0.38 0.900.19 0.910.58 0.870.60 0.950.27 0.780.22 0.880.65 1.230.64 0.97 |
在没有添加β丙氨酸的情况下，在试管培养中，PA374和PA354只产生大约0.2g/l的泛酸，提示PanD活性是显著的速率限制物质。
为了减轻这种限制，装载了来自菌株PA401的可扩增P26panD盒。用PA401的染色体DNA转化PA374和PA354，在15mg/l筛选Tetr，分别产生菌株PA377和PA365。获得转化株后，在含有30和60mg/l四环素的平板上划线接种这些菌株，再次扩增在bpr位点整合的P26panD盒拷贝数。在不添加α-KIV或β丙氨酸的SVY试管培养物中，这些菌株的泛酸滴度较PA374和PA354显著提高(表18和19)。表18.在不添加β丙氨酸或α-KIV的SVY-葡萄糖试管培养物中生长24小时或36小时，含有扩增的P26panD的PA365及对照菌株的泛酸产量
| 菌株 相关基因型 | OD600 | [pan]g/l |
| 24小时 36小时 | 24小时 36小时 | |
| PA342-1-1 w.t.ilvDPA342-1-2 w.t.ilvDPA354-1-1 P26ilvDPA354-1-2 P26ilvDPA365-1 P26ilvD，P26panDPA365-2 P26ilvD，P26panD | 11.7 8.812.8 8.8n.d. 11.0n.d. 8.49.8 10.09.9 10.4 | b.d. 0.27b.d. 0.26n d 0.19n.d. 0.201.01 2.070.96 2.09 |
n.d.＝没有检测；b.d.＝低于检测限度表19.在不添加α-KIV，添加或不添加β丙氨酸的SVY-葡萄糖或SVY-麦芽糖试管培养物中生长27小时，含有扩增的P26panD的PA377及对照菌株的泛酸产量
| 菌株 相关基因型 | OD600 |
| -β-ala +β-ala -β-ala +β-ala葡萄糖 葡萄糖 葡萄糖 葡萄糖 | |
| PA374-1 P26ilvDPA374-2 P26ilvDPA377-1 P26ilvD，P26panDPA377-2 P26ilvD，P26panD菌株 相关基因型 | 9.4 9.8 7.0 6.49.2 9.6 6.6 6.310.0 7.6 7.2 6.110.5 7.8 9.4 5.4[pan]g/l |
| -β-ala +β-ala -β-ala +β-ala葡萄糖 萄萄糖 葡萄糖 葡萄糖 | |
| PA374-1 P26ilvDPA374-2 P26ilvDPA377-1 P26ilvD，P26panDPA377-2 P26ilvD，P26panD | 0.04 2.76 0.14 1.310.10 2.65 0.15 1.331.25 2.76 1.26 1.101.25 2.35 1.31 1.26 |
在SVY葡萄糖中，添加5g/l β丙氨酸可以获得泛酸产量提高，提示panD表达增加可以进一步提高泛酸产量。在SVY麦芽糖中，添加β丙氨酸没有获得泛酸产量提高，提示β丙氨酸和/或天门冬氨酸的合成受到葡萄糖的抑制。如下所述，在10升发酵罐中评价菌株PA377和PA365，发现，在不添加β丙氨酸和α-KIV或缬氨酸的情况下，它们在48小时产生泛酸的量超过20g/l。实施例X：10升发酵泛酸生产微生物
工程学修饰P26ilvBNC和P26ilvD盒产生的菌株PA342和PA354，在发酵培养基不添加缬氨酸或α-KIV的情况下，可以分别产生泛酸22和26g/l(表20)。在48小时，两种菌株向培养基分泌大约0.5g/l的缬氨酸。
表20. 10升发酵五种过量产生泛酸的菌株
发酵罐中的泛酸合成
| 菌株 | 培养基 | 补料40％葡萄糖加 | OD60048小时 | 缬氨酸 β丙氨酸48小时 48小时g/l g/l | 泛酸g/L36小时 48小时 72小时 |
| PA236PA342PA354PA365PA377PA377PA377 | SVYGSVYGSVYGSVYGSVYGPFMGPFMG | 50g/lβ-ala25g/lα-KIV50g/lβ-ala50g/lβ-ala25g/l YE25g/l YE25g/l YE- | 108929077859671 | added added0.5 added0.5 added0.85 0.41.5 0.50.8 0.40.7 0.l | 16 19 2117 22 --19 26 --18 21 2718 22 3119 25 2916 21 - |
将P26panD盒添加到菌株PA354和PA374中，创建菌株PA365和PA377，既不需要向发酵罐中添加β丙氨酸，也不需要添加α-KIV。在培养基中不添加任何前体物质的情况下，PA365菌株在48小时产生泛酸21g/l，在72小时产生27g/l(表20)。PA377还要好些，在36小时产生泛酸18g/l，48小时22g/l，72小时31g/l。在SVYG培养基中，PA365和PA377菌株在48小时分别检测到的缬氨酸为0.85和1.5g/l。菌株PA377在整个发酵的绝大部分时间中，缬氨酸维持在1-1.5g/l，β丙氨酸在0.2-0.5g/l。
10升发酵罐中，应用基于酵母提取物的PFMG培养基评价菌株PA377。在PFMG和SVYG培养基中，泛酸产量近似。在PFMG中，PA377在36小时产生泛酸19g/l，在48小时25g/l，72小时29g/l。在SVYG中，PA377在36小时产生泛酸18g/l，在48小时22g/l，72小时31g/l(表20)。
例XI：将菌株PA377转化成原养型
用源于PY79的染色体DNA将PA377(Trp-)转化成Trp+，产生菌株PA824。再次扩增P26panO盒，然后在生长于有工没有5g/L-β-丙氨酸的SVY葡萄糖中的试管培养物中比较PA824和PA377的泛酸产量(表21)。表21.PA377的Trp+衍生菌株：在SVY葡萄糖±β丙氨酸试管培养48小时的泛酸产量
| 菌株 trpC供者 | OD600 | [pan]g/L |
| -β丙氨酸 +β丙氨酸 | -β丙氨酸 +β丙氨酸 | |
| PA377-1 RL-1PA377-2 RL-1PA824-1 PY79PA824-2 PY79 | 8 88 912 1011 11 | 1.5 3.41.6 3.60.7 3.71.9 4.9 |
Trp+菌株的生长密度稍高于PA377。在没有外源性β丙氨酸的情况下，所有菌株产生泛酸的水平相似，而在添加β丙氨酸的情况下，Trp+衍生株产生的泛酸稍多。应用PA824的发酵罐研究
在工作容积为10升的CF3000 Chemap 14升容器中评价PA824。表22和23给出了在发酵罐中应用的两种培养基的配方。
表22 PFMG-5培养基配方
批量
| 材料 | g/L(终[]) | |
| 1 | Amberex 1003 | 10 |
| 2 | 谷氨酸钠 | 5 |
| 3 | (NH4)2SO4 | 8 |
| 4 | MAZUDF 37C | 2.5 |
灭菌冷却后添加
| 1 | KH2PO4 | 10 |
| 2 | K2HPO4·3H2O | 20 |
| 1 | 葡萄糖 | 20 |
| 2 | MgCl2·6H2O | 1 |
| 3 | CaCl2·2H2O | 0.1 |
| 1 | 柠檬酸钠 | 1 |
| 2 | FeSO4·7H2O | 0.01 |
| 3 | SM-1000X | 1.0ml |
| H2O | 加至6000ml |
补料
| 材料 | g/L | |
| 1 | 葡萄糖 | 600 |
| 2 | CaCl2·2H2O | 0.6 |
| H2O | 加至3000ml |
表23：SXY-培养基配方
批量
| 材料 | g/L(终[]) | |
| 1 | 小牛灌输肉汤 | 25 |
| 2 | 酵母提取物 | 5 |
| 3 | 谷氨酸钠 | 5 |
| 4 | (NH4)2SO4 | 4 |
| 5 | MAZU DF 37C | 2.5 |
灭菌冷却后添加
| 1 | KH2PO4 | 10 |
| 2 | K2HPO4·3H2O | 20 |
| 1 | 葡萄糖 | 20 |
| 2 | MgCl2·6H2O | 1 |
| 3 | CaCl2·2H2O | 0.1 |
| 1 | 柠檬酸钠 | 1 |
| 2 | FeSO4·7H2O | 0.01 |
| 3 | SM-1000X | 1.0ml |
| H2O | 加至6000ml |
补料
| 材料 | g/L | |
| 1 | 葡萄糖 | 600 |
| 2 | CaCl2·2H2O | 0.6 |
| H2O | 加至3000ml |
所有的发酵都是葡萄糖限制的补料批量发酵过程。接种后立即将搅动设定在200rpm。在指数生长阶段消耗开始批量的2％葡萄糖。然后，通过持续添加60％葡萄糖溶液，将葡萄糖浓度维持在0.2-1.0g/L。可调节速率补料泵受计算机控制，并通过运算法则与容器中溶解氧浓度[pO2]相联系。当[pO2]下降到30％时，计算机控制开始自动调节搅动速率，使溶解氧浓度维持在25-30％[pO2]。通过Braun MFCS软件进行计算机控制和数据记录。
在一项研究中，PA284在发酵罐中表22描述的培养基中生长，生长温度有两个(40℃和43℃)。两个试验结果显示，在早期时间点，最高泛酸滴度出现在43℃。在43℃56小时，细胞团在OD600达到150光学密度单位，泛酸滴度在36，48和72小时分别为21g/L，28g/L和36g/L。在40℃进行的平行试验中，细胞团在56小时OD500达到120光学密度单位，泛酸滴度在36，48和72小时分别为18g/L，26g/L和37g/L。
在另一项研究中，PA824在43℃、在发酵罐中表23描述的培养基中生长。细胞团在36小时OD600超过160光学密度单位，泛酸滴度在24，36，48和60小时分别为23g/L，34g/L，37g/L和40g/L。在另一个发酵中，在葡萄糖补料中增加痕量元素的量(例如，将SM的浓度从1X增加到2X)，可以导致泛酸滴度更高。实施例XII：枯草芽孢杆菌coaA基因产物的鉴定和特征分析
在“Subtilist”网站上能查到的注释版枯草芽孢杆菌基因组序列中，不包括coaA基因。但是，应用大肠杆菌泛酸激酶的蛋白质序列作为问询序列进行同源搜索，可以找到匹配良好的枯草芽孢杆菌基因yqjS，该基因的注释是：“未知；与泛酸激酶类似”。该基因似乎是包括五个开放阅读框的操纵子的倒数第二个基因(图18)。其中两个开放阅读框编码与D丝氨酸脱水酶和“酮酰基还原酶”类似的蛋白，另两个没有已知的同系化合物。对于与coaA相应的开放阅读框，有三个可能的起始密码子；每个起始密码子有一个可能与其相关的核糖体结合位点(RBS)。这三个潜在coaA ORFs从最长到最短依次命名为coaA1，coaA2和coaA3。
所有三个潜在coaA开放阅读框都通过PCR与其各自的RBSs一起克隆，然后与表达质粒pAN229连接。pAN229是大肠杆菌内的低拷贝载体，可以提供从SP01噬菌体P15启动子的表达，并可通过单交叉在bpr位点与四环素筛选基因连接。获得的代表性质粒pAN281如图19所示。
为了检测克隆的假定coaA ORFs是否编码泛酸激酶活性，所有三个质粒的几个分离株被转化到大肠杆菌YH1菌株中，所述菌株包括coaA15(Ts)等位基因。转化株划线接种于平板上，在30℃和43℃孵育，检测温度敏感等位基因的补偿作用。所有三个coaA变异体的所有分离株，除了一个pAN282分离株，在43℃均补偿良好，提示所有三个质粒构建物都编码具有活性的泛酸激酶。因此，可以得出结论，枯草芽孢杆菌yqjS开放阅读框编码具有活性的泛酸激酶。实施例XIII：从枯草芽孢杆菌基因组中缺失coaA基因
通过传统方法从枯草芽孢杆菌菌株染色体中去除枯草芽孢杆菌coaA基因(yqjS)。从质粒克隆中去除大部分coaA编码序列，并用氯霉素耐药基因(cat)置换，但保留大约1kb的上游和下游序列，允许在染色体内进行同源重组，获得的质粒称为pAN296(见图17)。然后应用pAN296转化枯草芽孢杆菌菌株(PY79)，筛选氯霉素耐药菌株。大多数转化株通过双交叉获得，所述双交叉可以有效地用cat基因取代coaA基因。包括coaA基因缺失、cat基因插入的所述转化菌株可以正常生长，因为存在本文所述的第二个枯草芽孢杆菌泛酸激酶编码基因。实施例XIV：第二个枯草芽孢杆菌泛酸激酶活性编码基因的鉴定和特征分析
如本说明中详述，为了使泛酸产量最大化，必须限制泛酸向辅酶A(CoA)的转化，例如，通过降低从泛酸到CoA途径第一个酶——泛酸激酶的活性。在发现从枯草芽孢杆菌染色体中去除coaA基因并非致死性事件后(见实施例XIII)，得出结论，枯草芽孢杆菌一定还包括第二个基因，编码具有活性的泛酸激酶，因为泛酸激酶是必需酶活性。
第二个泛酸激酶编码基因是通过下述方法鉴定的，包括将大肠杆菌菌株YH1(coaA15(Ts))与枯草芽孢杆菌基因库互补，然后筛选能够在43℃生长的转化株。在转化株中发现两个家族质粒，每个家族内部有限制性图谱的重叠，但两个家族之间没有重叠。与预期相符，其中一个家族的限制性图谱与枯草芽孢杆菌基因组序列中预期与大肠杆菌coaA基因(我们也称之为coaA，见上)及周围序列同源的序列相同。另一个家族的限制性图谱则与第一个完全没有重叠。
第二个家族克隆插入末端的DNA序列分析显示，克隆来自枯草芽孢杆菌染色体区域，包括ftsH基因的3’端，sul基因的5’端，以及yacB，yacC，yacD，cysK，pabB，pabA和pabC基因的全部。这些克隆插入的开放阅读框没有一个与任何已知泛酸激酶序列同源，无论是原核生物的泛酸激酶，还是真核生物的泛酸激酶。
在枯草芽孢杆菌基因组序列的克隆插入点创建了几种缺失。每种缺失都检测了对大肠杆菌温度敏感性泛酸激酶的补充作用。特别是，一种缺失在克隆载体StuI位点和yacC基因SwaI位点之间去除了所有DNA，只在克隆插入中保留yacB完整的开放阅读框(见图21)。该缺失质粒仍可补偿大肠杆菌泛酸激酶突变。但是，另一种缺失却不能补偿大肠杆菌泛酸激酶突变，所述缺失去除了从yacC基因SwaI位点到(已经截短的)ftsH基因Bst1107I位点的DNA。从这些结果可以得出结论，yacB开放阅读框是形成补偿活性的原因。为了确定yacB就是泛酸激酶基因，应用PCR在两个独立反应中扩增了yacB ORF和112个下游侧翼序列碱基对，并克隆了下游构建启动，获得质粒pAN341和pAN342(图22)。pAN341和pAN342补偿了YH1在44℃的缺陷，而对照质粒却不能补偿，所述对照质粒具有相同骨干结构，但表达panBCD，不表达yacB。该试验进一步确证了yacB开放阅读框是YH1补偿作用的原因。
如此，发现了在枯草芽孢杆菌中编码泛酸激酶活性的新基因，通过同源性分析发现，该基因与原先任何已知的泛酸激酶基因无相关性。该基因业已被命名为coaX，作为第二个替代基因，编码催化从泛酸到CoaA途径第一步的酶。应用上述去除coaA的方法去除coaX，并同时降低CoaA酶的活性，为将泛酸激酶活性降低到所需水平提供了一种方法。
应用公布的yacB(coaX)开放阅读框序列和预期氨基酸序列(分别如序列84和85所示)，可以在多种所示的数据库中通过同源搜索鉴定枯草芽孢杆菌coaX基因的类似物。在两种情况下(结核分支杆菌和天蓝色链霉菌)，coaX基因类似物紧邻或几乎紧邻泛酸生物合成基因，与这些类似物在泛酸代谢中具有作用一致。CoaX蛋白与泛酸激酶CoaA家族没有同源性，也与酿酒酵母PanK代表的真核泛酸激酶家族没有同源性。
将几种细菌CoaX同系化合物的氨基酸序列与公布的枯草芽孢杆菌基因组序列中描述的枯草芽孢杆菌yacB ORF的预期翻译氨基酸序列进行比对，发现来自其他细菌的CoaX蛋白在其羧基末端还包括另外的氨基酸残基。而且，在枯草芽孢杆菌基因产物预期氨基酸末端以外的这些延伸包括两个相对保守的序列片段。
从枯草芽孢杆菌yacB ORF终止密码子下游不同阅读框的核苷酸序列翻译发现，存在的氨基酸序列与其他细菌CoaX蛋白的羧基末端延伸非常相似。因此相信，在枯草芽孢杆菌yacB ORF序列的所示DNA序列中存在一个错误，导致框架漂移，产生与事实不符的下游氨基酸序列以及不成熟的翻译终止。
在pAN341和pAN342中存在的通过PCR产生的枯草芽孢杆菌CoaX序列(如上所述)包括足够的下游侧翼序列编码上述假定的羧基末端延伸，与克隆在补偿试验中发挥作用的结果一致。但是，当PCR3’引物的位置只包括从公布序列中预期的较短yacB ORF，而不包括假定羧基末端延伸时，获得的质粒pAN329和pAN330(结构与pAN341和pAN342类似；见图22)却不能补偿YH1中的缺陷。该结果支持上述观点，即所示的yacB编码序列包括移码错误，而且CoaX的羧基末端是泛酸激酶活性必需的。预期正确的枯草芽孢杆菌coaX核苷酸序列如序列19所示，其翻译氨基酸序列如序列9所示。枯草芽孢杆菌CoaX氨基酸序列与11种同系化合物的多序列比对如图23所示。实施例XV：生成编码泛酸激酶的突变coaA基因，其中泛酸激酶活性减弱或具有温度敏感活性
该实施例描述了修饰coaA基因的策略(如通过引入点突变)，在从基因组中去除coaX后，降低泛酸激酶的活性。大肠杆菌coaA基因的温度敏感性等位基因的克隆和序列分析
从大肠杆菌基因存储中心获得两株表现不同CoaA突变表型的大肠杆菌菌株。DV62菌株包括coaA15(Ts)等位基因，DV79包括coaA16(Fr)突变。DV62在43℃温度敏感，并产生温度敏感性泛酸激酶。DV79通过将DV62逆转为温度抵抗株而获得，并产生温度稳定、反馈耐受的泛酸激酶活性。因为这些等位基因的DNA序列在文献中查阅不到，因此通过PCR克隆了两个突变株的coaA基因，并进行序列分析，除此之外还对野生型MM294 coaA位点的coaA基因进行了克隆分析。5’端PCR引物设计包括起始密码子及其上游4个碱基，以及任选的核糖体结合位点(RBS)。产生的3个PCR片段分别在pAN229的XbaI和BamHI位点间连接，得到pAN284(源于coaA15(Ts))，pAN285(源于野生型coaA)和pAN286(源于coaA16(Fr))。pAN229是大肠杆菌中的低拷贝载体，可以提供源于P15启动子的表达，并可通过单交叉在枯草芽孢杆菌bpr位点与四环素筛选基因连接。
所有三个质粒都转化进入大肠杆菌YH1菌株进行补偿试验。所有三个质粒都可以补偿大肠杆菌YH1的温度敏感性coaA突变。假设pAN284中的coaA15(Ts)基因可能相对于正常染色体基因显著过量表达，因此过量产生的基因产物补偿了温度敏感缺陷。大肠杆菌中由于过量表达而产生的缺陷补偿作用是有文献记载的现象。
将来自pAN284，pAN285和pAN286的coaA编码区分别亚克隆到pGEM7中，获得pAN306，307和308，进行序列分析。与预期一致，插入到pAN307中的DNA序列(源于野生型coaA)与来自大肠杆菌基因组数据库(GenBankTM)中的coaA序列匹配良好。源于pAN306的序列包括单个碱基改变，导致S176L置换(即在序列2所示氨基酸序列中发生丝氨酸→亮氨酸取代)。有趣的是，源于反馈耐受菌株的pAN308的插入DNA序列与其温度敏感亲本菌株获得的DNA序列一致(pAN306代表的)。这与显示温度敏感性突变逆转发生在与coaA基因无关的第二个位点的遗传学数据相符。
预期将导致大肠杆菌泛酸激酶温度敏感性缺陷的S176L突变，改变了丝氨酸残基，所述残基在所有已知或疑是细菌coaA编码泛酸激酶中保守，包括枯草芽孢杆菌的泛酸激酶(见序列3，并参考比对)。基于此点，在枯草芽孢杆菌泛酸激酶同源残基中丝氨酸向亮氨酸的转变，预期可以导致温度敏感性酶或活性降低的酶。因此，为了产生枯草芽孢杆菌coaA突变基因，将此特异性改变引入枯草芽孢杆菌coaA基因。例如，可以将突变版本装载到coaX缺失的枯草芽孢杆菌菌株染色体中，然后检测重组微生物的温度敏感性(如在43℃生长减缓)。然后将该突变装载到过量产生泛酸的菌株中，优选通过标准方法缺失上述coaX基因的菌株，获得的菌株有利于在枯草芽孢杆菌中制备泛酸，即在典型发酵条件下泛酸激酶活性已经降低的菌株。导致泛酸激酶活性降低的其他coaA点突变
当然期望在枯草芽孢杆菌coaA中存在的其他多个点突变或1个以上联合点突变也能导致活性降低。适宜的突变可以通过致突变多聚酶链反应以及体外重组获得，然后通过筛选对大肠杆菌coaA15(Ts)突变补偿作用很差的等位基因来鉴定。这种类型突变的示例是通过致突变多聚酶链反应产生的第181个氨基酸由组氨酸取代酪氨酸的枯草芽孢杆菌coaA基因(见序列3，以及图24的第一行比对)。
分离的pAN282A源于实施例XII所述的中等大小枯草芽孢杆菌coaA开放阅读框。pAN282A对大肠杆菌coaA15(Ts)突变的补偿作用很弱，但虽然如此，其补偿水平却在背景以上，可以检测到。与对大肠杆菌coaA克隆进行的工作一致，将pAN282A的开放阅读框亚克隆到pGEM7中，获得pAN303。pAN303的插入DNA序列显示了单个碱基改变，导致在序列3相对于Y181酪氨酸的位置发生组氨酸对酪氨酸的取代。该酪氨酸残基在GenBank中存在的所有细菌coaA基因/同系化合物中都是保守的(图24)。该酪氨酸残基和上述大肠杆菌温度敏感性泛酸激酶中发生改变的丝氨酸，在某区域只有3个氨基酸残基间隔，该区域在细菌泛酸激酶中高度保守，而从pAN282B中分离的第二个中等大小开放阅读框的DNA序列与枯草芽孢杆菌基因组序列分析项目的野生型序列完全一致。PAN303中发现的单个碱基改变很可能是在coaA基因PCR扩增过程中发生的。如果coaA2变异在枯草芽孢杆菌中具有充足的残基生物活性，它在将来降低泛酸激酶活性的研究中将很有用。
可以作为coaA开放阅读框致突变作用基础的优选质粒是pAN294(见例如图25和实施例XII)。简言之，应用pAN294作为模板进行致突变PCR，然后如上所述，筛选泛酸激酶活性减低的coaA变异株。此外，如在pAN282A中分离的突变也可装载到pAN294中。然后，应用适宜的pAN294衍生质粒通过转化将所需突变引入枯草芽孢杆菌菌株的染色体，并在5mg/L筛选氯霉素耐药株。在获得的转化株中可以分离包括所需突变的菌株。
以相似方式可以产生并鉴定降低CoaX酶活性的突变，这种突变可以通过降低CoA产量，如上所述，用来最优化泛酸制备。实施例XVI：从枯草芽孢杆菌中去除第二个泛酸激酶基因，coaX基因
由于上面获得的对coaX存在和性质的知识，我们可以从枯草芽孢杆菌染色体中去除coaX开放阅读框，从而去除该基因编码的活性，但不会对coaX下游基因的表达产生负向影响。在这种缺失菌株中，coaA基因成为编码泛酸激酶的唯一基因。
为了从枯草芽孢杆菌中去除coaX基因，构建了质粒pAN336(序列92)，该质粒包括双交叉所需的上游和下游同源序列，并用卡那霉素耐药基因置换了coaX ORF的绝大部分(图26)。应用pAN336转化PY79菌株，使之获得卡那霉素耐药性，然后通过PCR确认了双交叉得到的分离株，命名为PA876。与预期一致，coaX本身的缺失对于枯草芽孢杆菌并非致命的。而且，PA876的染色体DNA不能转化胜任PA861(PY79ΔcoaA∷cat)，使之产生卡那霉素耐药性。这些结果提示，ΔcoaA∷cat与ΔcoaA∷kan联合才会对枯草芽孢杆菌产生致命作用，进一步确证枯草芽孢杆菌包括两个编码泛酸激酶的无关联基因，coaA和coaX，而且每个基因都不能单独提供细菌正常生长速率所需的足够泛酸激酶。实施例XVII：构建能够指导枯草芽孢杆菌coaA基因突变的质粒
为了能将coaA突变基因容易地导入枯草芽孢杆菌染色体，必须在coaA基因附近装载一个抗生素耐药基因。这可以通过在载体pGEM5上连接三个DNA片段达成：(1)含有2.5kb coaA开放阅读框及其上游基因组序列的3.4kb DNA序列；(2)含有氯霉素耐药基因(cat)的1.1kb DNA序列以及(3)1.4kb DNA序列，包括含有coaA操纵子的下游区域。获得的质粒被称为pAN294，应用cat基因有效置换了yqjT的开放阅读框(coaA下游的开放阅读框)，但在cat基因两侧保留了足够的同源侧翼序列，允许通过双重重组导入枯草芽孢杆菌染色体(图25)。将pAN294转化进入枯草芽孢杆菌菌株PY79，在5mg/l筛选氯霉素耐药菌株，获得PA836和PA837菌株，并假设它们是相同的。通过诊断性PCR检测PA836和PA837，显示cat基因业已通过双交叉整合，与单交叉不同。PA836和PA837可以正常生长，得出结论，yqjT开放阅读框不是必需的(即从PA836和PA837菌株中去除yqjT开放阅读框，不会显著影响生长或泛酸生成)。因此，coaA基因的变异等位基因(即突变)可以导入pAN294，获得的质粒可以用来将变异等位基因导入例如枯草芽孢杆菌菌株的染色体。实施例XVIII：生成编码泛酸激酶的突变coaX基因，其中泛酸激酶活性减弱或具有温度敏感活性
通过将点突变引入基因可以产生突变的coaX基因，并如实施例XII所述，检测获得的突变株补偿大肠杆菌YH1菌株的能力。coaX基因序列中的优选突变是在多种细菌来源的CoaX序列中编码保守残基的取代(如图23所示的保守残基)。此外，可以通过致突变PCR在coaX基因序列中产生随机突变，然后体外重组，并通过筛选对大肠杆菌coaA15(Ts)突变补偿作用很差的等位基因来鉴定。
这样产生的突变株(即coaX活性降低的突变株)还可进一步工程学修饰，去除内源性coaA基因(如实施例XIII所述)。CoaX活性降低突变株也可进一步工程学修饰，包括如实施例XV所述的活性降低的CoaA基因产物。实施例XIX：应用去除一种或多种泛酸生物合成酶的细菌增量生成泛化合物
如果所需的泛化合物不是泛酸，那么从过量生成泛酸的菌株中去除一种或多种适宜的泛酸生物合成基因，就会提供能够生成所需泛化合物的菌株。在该实施例中，所需泛化合物是泛解酸。例如，起始菌株为，例如PA236，PA313或PA824，可以将panC和/或panD去除。在另一个实施例中，酮泛解酸是所需泛化合物。起始菌株为，例如PA244，PA245或PA824，可以从起始菌株中将两个或所有的ilvC，panE1，panC和panD基因去除。如果β丙氨酸是所需泛化合物，那么可以去除panB和panC基因，优选以保留框架融合形式从菌株PA221，PA235，PA245或PA313中去除，所述融合包括panB的小部分5’端和panC的小部分3’端。在所有上述实施例中，泛化合物生成菌株可以是泛酸营养缺陷型菌株。因此，生长培养基需要添加足够的泛酸促进菌株生长。如上所述设计过量表达panD的载体可以转化进入上述菌株，进一步增加β丙氨酸的产量。
上述缺失可以通过本领域技术人员众所周知的方法达成，例如，通过插入抗生素耐药基因，从靶基因中去除足够序列，使所述靶基因失活。此外，在去除靶序列的同时，可以不在该靶基因中引入抗生素耐药基因，然后通过congression(与其他任何适宜筛选的DNA序列共同转化)引入，随后再通过影印培养筛选靶基因功能的丧失。
表24.泛化合物生产菌株(及其相应表型)名称 表型 耐药 panBCD位点 panE位点 ilvD位 amyE位点 bpr位点 亲本菌株PA221 Trp- P26panBCDPA222 P15panBCD RL-1PA235 P26panBCDPA236 P26panBCD P26panEl PA221PA327 Trp- P26panBCD P26panEl PA221PA328 Trp- P26panBCD P26panE1 PA235PA340 Trp- Spc P26panBCD P26panE1 P26ilvBNC PA327PA342 Trp- Spc P26panBCD P26panEl P26ilvBNC PA328PA354 Trp- Spc P26panBCD P26panEl P26ilvD P26ilvBNC PA342PA365 Trp- Spc， P26panBCD P26panEl P26ilvD P26ilvBNC P26panD423 PA354PA374 Trp- Spc P26panBCD P26panEl P26ilvD P26ilvBNC PA340PA377 Trp- Spc， P26panBCD P26panEl P26ilvD P26ilvBNC P26panD423 PA374
TetPA401 Trp- P26panBCD P26panD423 PA221PA402 Trp- P26panBCD P26panD428 PA221PA403 Trp- P26panBCD P26panD429 PA221PA404 Trp- Spc， P26panBCD P26panEl P26ilvBNC P26panD423 PA340PA405 Trp- Spc， P26panBCD P26panEl P26ilvBNC P26panD423 PA342PA651 Trp- Spc P26panBC*D P26panEl P26ilvD P26ilvBNC PA374PA284 Spc， P26’panBC P26panEl P26ilvD P26ilvBNC P26panD423 PA377
Tet D
等价物 本领域技术人员应该认识到或能够确定，只应用常规试验方法，很多等价物可以用于本文所述方面的特定实施方案。这些等价物也应该包括在后述权利要求中。
序列表<110>全基因生物产品公司(OMNIGENE BIOPRODUCTS)<120>制备泛化合物的方法和微生物<130>BGI-141CPPC<140><141><150>USSN 09/400,494<151>1999-09-21<150>USSN 60/210,072<151>2000-06-07<150>USSN 60/221,836<151>2000-07-28<150>USSN 60/221,836<151>2000-08-24<160>94<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>311<212>PRT<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)<400>1Met Glu Phe Ser Thr Gln Gln Thr Pro Phe Leu Ser Phe Asn Arg Glu1 5 10 15Gln Trp Ala Glu Leu Arg Lys Ser Val Pro Leu Lys Leu Thr Glu Gln
20 25 30Asp Leu Lys Pro Leu Leu Gly Phe Asn Glu Asp Leu Ser Leu Asp Glu
35 40 45Val Ser Thr Ile Tyr Leu Pro Leu Thr Arg Leu Ile Asn Tyr Tyr Ile
50 55 60Asp Glu Asn Leu His Arg Gln Thr Val Leu His Arg Phe Leu Gly Arg65 70 75 80Asn Asn Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser Val Ala
85 90 95Val Gly Lys Ser Thr Ser Ala Arg Ile Leu Gln Ser Leu Leu Ser His
100 105 110Trp Pro Thr Glu Arg Lys Val Asp Leu Ile Thr Thr Asp Gly Phe Leu
115 120 125Tyr Pro Leu Asn Lys Leu Lys Gln Asp Asn Leu Leu Gln Lys Lys Gly
130 135 140Phe Pro Val Ser Tyr Asp Thr Pro Lys Leu Ile Arg Phe Leu Ala Asp145 150 155 160Val Lys Ser Gly Lys Ser Asn Val Thr Ala Pro Ile Tyr Ser His Leu
165 170 175Thr Tyr Asp Ile Ile Pro Asp Lys Phe Asp Val Val Asp Lys Pro Asp
180 185 190Ile Leu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Val Leu Gln Thr Gly Asn Asn Lys
195 200 205Thr Asp Gln Thr Phe Val Ser Asp Phe Val Asp Phe Ser Ile Tyr Val
210 215 220Asp Ala Glu Glu Lys Leu Leu Lys Glu Trp Tyr Ile Lys Arg Phe Leu225 230 235 240Lys Phe Arg Glu Ser Ala Phe Asn Asp Pro Asn Ser Tyr Phe Lys His
245 250 255Tyr Ala Ser Leu Ser Lys Glu Glu Ala Ile Ala Thr Ala Ser Lys Ile
260 265 270Trp Asp Glu Ile Asn Gly Leu Asn Leu Asn Gln Asn Ile Leu Pro Thr
275 280 285Arg Glu Arg Ala Asn Leu Ile Leu Lys Lys Gly His Asn His Gln Val
290 295 300Glu Leu Ile Lys Leu Arg Lys305 310<210>2<211>316<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>2Met Ser Ile Lys Glu Gln Thr Leu Met Thr Pro Tyr Leu Gln Phe Asp1 5 10 15Arg Asn Gln Trp Ala Ala Leu Arg Asp Ser Val Pro Met Thr Leu Ser
20 25 30Glu Asp Glu Ile Ala Arg Leu Lys Gly Ile Asn Glu Asp Leu Ser Leu
35 40 45Glu Glu Val Ala Glu Ile Tyr Leu Pro Leu Ser Arg Leu Leu Asn Phe
50 55 60Tyr Ile Ser Ser Asn Leu Arg Arg Gln Ala Val Leu Glu Gln Phe Leu65 70 75 80Gly Thr Asn Gly Gln Arg Ile Pro Tyr Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser
85 90 95Val Ala Val Gly Lys Ser Thr Thr Ala Arg Val Leu Gln Ala Leu Leu
100 105 110Ser Arg Trp Pro Glu His Arg Arg Val Glu Leu Ile Thr Thr Asp Gly
115 120 125Phe Leu His Pro Asn Gln Val Leu Lys Glu Arg Gly Leu Met Lys Lys
130 135 140Lys Gly Phe Pro Glu Ser Tyr Asp Met His Arg Leu Val Lys Phe Val145 150 155 160Ser Asp Leu Lys Ser Gly Val Pro Asn Val Thr Ala Pro Val Tyr Ser
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180 185 190Pro Asp Ile Leu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Val Leu Gln Ser Gly Met
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275 280 285Asn Ile Leu Pro Thr Arg Glu Arg Ala Ser Leu Ile Leu Thr Lys Ser
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180 185 190Gln Ala Asp Ile Val Ile Ile Glu Gly Ile Asn Val Leu Gln Ser Pro
195 200 205Thr Leu Glu Asp Asp Arg Glu Asn Pro Arg Ile Phe Val Ser Asp Phe
210 215 220Phe Asp Phe Ser Ile Tyr Val Asp Ala Glu Glu Ser Arg Ile Phe Thr225 230 235 240Trp Tyr Leu Glu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Glu Thr Ala Phe Gln Asn
245 250 255Pro Asp Ser Tyr Phe His Lys Phe Lys Asp Leu Ser Asp Gln Glu Ala
260 265 270Asp Glu Met Ala Ala Ser Ile Trp Glu Ser Val Asn Arg Pro Asn Leu
275 280 285Tyr Glu Asn Ile Leu Pro Thr Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ile Leu Arg
290 295 300Lys Gly Asp Gly His Lys Val Glu Glu Val Leu Val Arg Arg Val305 310 315<210>4<211>312<212>PRT<213>麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)<400>4Met Pro Arg Leu Ser Glu Pro Ser Pro Tyr Val Glu Phe Asp Arg Lys1 5 10 15Gln Trp Arg Ala Leu Arg Met Ser Thr Pro Leu Ala Leu Thr Glu Glu
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210 215 220Asp Ala Arg Ile Gln Asp Ile Glu Gln Trp Tyr Val Ser Arg Phe Leu225 230 235 240Ala Met Arg Gly Thr Ala Phe Ala Asp Pro Glu Ser His Phe His His
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260 265 270Trp Arg Ser Ile Asn Arg Pro Asn Leu Val Glu Asn Ile Leu Pro Thr
275 280 285Arg Pro Arg Ala Thr Leu Val Leu Arg Lys Asp Ala Asp His Ser Ile
290 295 300Asn Arg Leu Arg Leu Arg Lys Leu305 310<210>5<211>312<212>PRT<213>结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>5Met Ser Arg Leu Ser Glu Pro Ser Pro Tyr Val Glu Phe Asp Arg Arg1 5 10 15Gln Trp Arg Ala Leu Arg Met Ser Thr Pro Leu Ala Leu Thr Glu Glu
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275 280 285Arg Pro Arg Ala Thr Leu Val Leu Arg Lys Asp Ala Asp His Ser Ile
290 295 300Asn Arg Leu Arg Leu Arg Lys Leu305 310<210>6<211>329<212>PRT<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)<400>6Met Ile Ser Pro Val Pro Ser Ile Pro Arg Ser Ala His Arg Gln Arg1 5 10 15Pro Glu Ala Thr Pro Tyr Val Asp Leu Thr Arg Pro Glu Trp Ser Ala
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290 295 300Thr Arg Gly Arg Ala Thr Leu Val Leu Arg Lys Gly Pro Asp His Lys305 310 315 320Val Gln Arg Leu Ser Leu Arg Lys Leu
325<210>7<211>265<212>PRT<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)<400>7Met Leu Leu Thr Ile Asp Val Gly Asn Thr His Thr Val Leu Gly Leu1 5 10 15Phe Asp Gly Glu Asp Ile Val Glu His Trp Arg Ile Ser Thr Asp Ser
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115 120 125Pro Ala Ile Val Val Asp Phe Gly Thr Ala Thr Thr Phe Asp Ala Val
130 135 140Ser Ala Arg Gly Glu Tyr Ile Gly Gly Val Ile Ala Pro Gly Ile Glu145 150 155 160Ile Ser Val Glu Ala Leu Gly Val Lys Gly Ala Gln Leu Arg Lys Ile
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245 250 255Val Tyr Glu Arg Asn Val Ser Arg Met
260 265<210>8<211>272<212>PRT<213>结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)<400>8Met Leu Leu Ala Ile Asp Val Arg Asn Thr His Thr Val Val Gly Leu1 5 10 15Leu Ser Gly Met Lys Glu His Ala Lys Val Val Gln Gln Trp Arg Ile
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180 185 190Gly Ala Val Phe Gly Phe Ala Gly Leu Val Asp Gly Leu Val Gly Arg
195 200 205Ile Arg Glu Asp Val Ser Gly Phe Ser Val Asp His Asp Val Ala Ile
210 215 220Val Ala Thr Gly His Thr Ala Pro Leu Leu Leu Pro Glu Leu His Thr225 230 235 240Val Asp His Tyr Asp Gln His Leu Thr Leu Gln Gly Leu Arg Leu Val
245 250 255Phe Glu Arg Asn Leu Glu Val Gln Arg Gly Arg Leu Lys Thr Ala Arg
260 265 270<210>9<211>258<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>9Leu Leu Leu Val Ile Asp Val Gly Asn Thr Asn Thr Val Leu Gly Val1 5 10 15Tyr His Asp Gly Lys Leu Glu Tyr His Trp Arg Ile Glu Thr Ser Arg
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100 105 110Asn Ala Val Ala Ala Ile His Leu Tyr Gly Asn Pro Leu Ile Val Val
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165 170 175Asp Asn Ile Ile Gly Lys Asn Thr Val Ser Ala Met Gln Ser Gly Ile
180 185 190Leu Phe Gly Tyr Val Gly Gln Val Glu Gly Ile Val Lys Arg Met Lys
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245 250 255Ser Val<210>10<211>262<212>PRT<213>耐放射微球菌(Deinococcus radiopugnans)<400>10Met Pro Ala Phe Pro Leu Leu Ala Val Asp Ile Gly Asn Thr Thr Thr1 5 10 15Val Leu Gly Leu Ala Asp Ala Ser Gly Ala Leu Thr His Thr Trp Arg
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195 200 205Leu Arg Arg Ile Arg Ala Glu Leu Pro Gly Glu Ala Val Ala Val Ala
210 215 220Thr Gly Gly Phe Ser Arg Thr Val Gln Gly Ile Cys Gln Glu Ile Asp225 230 235 240Tyr Tyr Asp Glu Thr Leu Thr Leu Arg Gly Leu Val Glu Leu Trp Ala
245 250 255Ser Arg Ser Glu Val Arg
260<210>11<211>212<212>PRT<213>普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)<400>11Met Thr Gln His Phe Leu Leu Phe Asp Ile Gly Asn Thr Asn Val Lys1 5 10 15Ile Gly Ile Ala Val Glu Thr Ala Val Leu Thr Ser Tyr Val Leu Pro
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195 200 205Val Leu Ala Ala
210<210>12<211>246<212>PRT<213>海栖热袍菌(Thermotoga meritima)<400>12Met Tyr Leu Leu Val Asp Val Gly Asn Thr His Ser Val Phe Ser Ile1 5 10 15Thr Glu Asp Gly Lys Thr Phe Arg Arg Trp Arg Leu Ser Thr Gly Val
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50 55 60Thr Gln Asn Thr Val Ile Glu Arg Phe Ser Gln Lys Tyr Phe His Ile65 70 75 80Ser Pro Ile Trp Val Lys Ala Lys Asn Gly Cys Val Lys Trp Asn Val
85 90 95Lys Asn Pro Ser Glu Val Gly Ala Asp Arg Val Ala Asn Val Val Ala
100 105 110Phe Val Lys Glu Tyr Gly Lys Asn Gly Ile Ile Ile Asp Met Gly Thr
115 120 125Ala Thr Thr Val Asp Leu Val Val Asn Gly Ser Tyr Glu Gly Gly Ala
130 135 140Ile Leu Pro Gly Phe Phe Met Met Val His Ser Leu Phe Arg Gly Thr145 150 155 160Ala Lys Leu Pro Leu Val Glu Val Lys Pro Ala Asp Phe Val Val Gly
165 170 175Lys Asp Thr Glu Glu Asn Ile Arg Leu Gly Val Val Asn Gly Ser Val
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195 200 205Leu Pro Val Val Leu Thr Gly Gly Gln Ser Lys Ile Val Lys Asp Met
210 215 220Ile Lys His Glu Ile Phe Asp Glu Asp Leu Thr Ile Lys Gly Val Tyr225 230 235 240His Phe Cys Phe Gly Asp
245<210>13<211>273<212>PRT<213>梅毒螺旋体(Treponema pallidum)<400>13Met Leu Leu Ile Asp Val Gly Asn Ser His Val Val Phe Gly Ile Gln1 5 10 15Gly Glu Asn Gly Gly Arg Val Cys Val Arg Glu Leu Phe Arg Leu Ala
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100 105 110Thr Asp Leu Val Ala Asn Ala Val Ala Ala Tyr Val His Phe Arg Ser
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195 200 205Ile Ala Gln Cys Gln Lys Glu Leu Gly Cys Arg Cys Ala Ala Val Ile
210 215 220Thr Gly Gly Leu Ser Arg Leu Phe Ser Ser Glu Val Asp Phe Pro Pro225 230 235 240Ile Asp Ala Gln Leu Thr Leu Ser Gly Leu Ala His Ile Ala Arg Leu
245 250 255Val Pro Thr Ser Leu Leu Pro Pro Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gly
260 265 270Asn<210>14<211>262<212>PRT<213>博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)<400>14Met Asn Lys Pro Leu Leu Ser Glu Leu Ile Ile Asp Ile Gly Asn Thr1 5 10 15Ser Ile Ala Phe Ala Leu Phe Lys Asp Asn Gln Val Asn Leu Phe Ile
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35 40 45Phe Glu Glu Asn Phe Asp Phe Asn Val Asn Lys Val Phe Ile Ser Ser
50 55 60Val Val Pro Ile Leu Asn Glu Thr Phe Lys Asn Val Ile Phe Ser Phe65 70 75 80Phe Lys Ile Lys Pro Leu Phe Ile Gly Phe Asp Leu Asn Tyr Asp Leu
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100 105 110Phe Ala Asn Leu Val Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Ser Phe Glu Asn Val
115 120 125Leu Val Val Asp Leu Gly Thr Ala Cys Thr Ile Phe Ala Val Ser Arg
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245 250 255Asp Phe Lys Phe Val Asn
260<210>15<211>229<212>PRT<213>Aquifex aeolicus<400>15Met Arg Phe Leu Thr Val Asp Val Gly Asn Ser Ser Val Asp Ile Ala1 5 10 15Leu Trp Glu Gly Lys Lys Val Lys Asp Phe Leu Lys Leu Ser His Glu
20 25 30Glu Phe Leu Lys Glu Glu Phe Pro Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Ser
35 40 45Val Lys Gln Ser Phe Ser Glu Lys Val Arg Gly Lys Ile Pro Lys Ile
50 55 60Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Phe Pro Ile Gln Val Asp Tyr Lys Thr65 70 75 80Pro Glu Thr Leu Gly Thr Asp Arg Val Ala Leu Ala Tyr Ser Ala Lys
85 90 95Lys Phe Tyr Gly Lys Asn Val Val Val Ile Ser Ala Gly Thr Ala Leu
100 105 110Val Ile Asp Leu Val Leu Glu Gly Lys Phe Lys Gly Gly Phe Ile Thr
115 120 125Leu Gly Leu Gly Lys Lys Leu Lys Ile Leu Ser Asp Leu Ala Glu Gly
130 135 140Ile Pro Glu Phe Phe Pro Glu Glu Val Glu Ile Phe Leu Gly Arg Ser145 150 155 160Thr Arg Glu Cys Val Leu Gly Gly Ala Tyr Arg Glu Ser Thr Glu Phe
165 170 175Ile Lys Ser Thr Leu Lys Leu Trp Arg Lys Val Phe Lys Arg Lys Phe
180 185 190Lys Val Val Ile Thr Gly Gly Glu Gly Lys Tyr Phe Ser Lys Phe Gly
195 200 205Ile Tyr Asp Pro Leu Leu Val His Arg Gly Met Arg Asn Leu Leu Tyr
210 215 220Leu Tyr His Arg Ile225<210>16<211>257<212>PRT<213>集胞蓝细菌属种(Synechocystis sp.)<400>16Met Glu Thr Ser Lys Pro Gly Cys Gly Leu Ala Leu Asp Asn Asp Lys1 5 10 15Gln Lys Pro Trp Leu Gly Leu Met Ile Gly Asn Ser Arg Leu His Trp
20 25 30Ala Tyr Cys Ser Gly Asn Ala Pro Leu Gln Thr Trp Val Thr Asp Tyr
35 40 45Asn Pro Lys Ser Ala Gln Leu Pro Val Leu Leu Gly Lys Val Pro Leu
50 55 60Met Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Gln Thr Glu Val Trp Arg Val Tyr65 70 75 80Gln Pro Lys Ile Leu Thr Leu Lys Asn Leu Pro Leu Val Asn Leu Tyr
85 90 95Pro Ser Phe Gly Ile Asp Arg Ala Leu Ala Gly Leu Gly Thr Gly Leu
100 105 110Thr Tyr Gly Phe Pro Cys Leu Val Val Asp Gly Gly Thr Ala Leu Thr
115 120 125Ile Thr Gly Phe Asp Gln Asp Lys Lys Leu Val Gly Gly Ala Ile Leu
130 135 140Pro Gly Leu Gly Leu Gln Leu Ala Thr Leu Gly Asp Arg Leu Ala Ala145 150 155 160Leu Pro Lys Leu Glu Met Asp Gln Leu Thr Glu Leu Pro Asp Arg Trp
165 170 175Ala Leu Asp Thr Pro Ser Ala Ile Phe Ser Gly Val Val Tyr Gly Val
180 185 190Leu Gly Ala Leu Gln Ser Tyr Leu Gln Asp Trp Gln Lys Leu Phe Pro
195 200 205Gly Ala Ala Met Val Ile Thr Gly Gly Asp Gly Lys Ile Leu His Gly
210 215 220Phe Leu Lys Glu His Ser Pro Asn Leu Ser Val Ala Trp Asp Asp Asn225 230 235 240Leu Ile Phe Leu Gly Met Ala Ala Ile His His Gly Asp Arg Pro Ile
245 250 255Cys<210>17<211>223<212>PRT<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)<400>17Met Pro Ala Arg Gln Ser Phe Thr Asp Leu Lys Asn Leu Val Leu Cys1 5 10 15Asp Ile Gly Asn Thr Arg Ile His Phe Ala Gln Asn Tyr Gln Leu Phe
20 25 30Ser Ser Ala Lys Glu Asp Leu Lys Arg Leu Gly Ile Gln Lys Glu Ile
35 40 45Phe Tyr Ile Ser Val Asn Glu Glu Asn Glu Lys Ala Leu Leu Asn Cys
50 55 60Tyr Pro Asn Ala Lys Asn Ile Ala Gly Phe Phe His Leu Glu Thr Asp65 70 75 80Tyr Val Gly Leu Gly Ile Asp Arg Gln Met Ala Cys Leu Ala Val Asn
85 90 95Asn Gly Val Val Val Asp Ala Gly Ser Ala Ile Thr Ile Asp Leu Ile
100 105 110Lys Glu Gly Lys His Leu Gly Gly Cys Ile Leu Pro Gly Leu Ala Gln
115 120 125Tyr Ile His Ala Tyr Lys Lys Ser Ala Lys Ile Leu Glu Gln Pro Phe
130 135 140Lys Ala Leu Asp Ser Leu Glu Val Leu Pro Lys Ser Thr Arg Asp Ala145 150 155 160Val Asn Tyr Gly Met Val Leu Ser Val Ile Ala Cys Ile Gln His Leu
165 170 175Ala Lys Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Cys Gly Gly Asp Ala Lys Tyr Leu
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275 280 285gag tgg atc gtc gaa aac caa gta aac cgt cct cgt ttc aac gct atc 912Glu Trp Ile Val Glu Asn Gln Val Asn Arg Pro Arg Phe Asn Ala Ile
290 295 300aat gca agc gag aac gaa cat caa atc gaa gta gtg gga aga aag ctt 960Asn Ala Ser Glu Asn Glu His Gln Ile Glu Val Val Gly Arg Lys Leu305 310 315 320cgt gaa atg atg ccg ttt gtg aaa caa ggc aag aag aag gaa gcg gtg 1008Arg Glu Met Met Pro Phe Val Lys Gln Gly Lys Lys Lys Glu Ala Val
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130 135 140Gly Val Pro Ala Leu Phe Ala Ile Tyr Gln Asp Val Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Arg Asp Lys Ala Leu Ala Tyr Ala Lys Gly Ile Gly Gly Ala Arg Ala
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结合位点<400>47agaaaggagg tgannnnnnn atg 23<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：核糖体
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结合位点<400>49ccctctagaa ggaggagaaa acatg 25<210>50<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：核糖体
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结合位点<400>52ttagaaagga ggtttaatta atg 23<210>53<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：核糖体
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结合位点<400>55attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg 28<210>56<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：核糖体
结合位点<400>56attcgagaaa ggaggtgaat aataatg 27<210>57<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：核糖体
结合位点<400>57attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28<210>58<211>3291<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>58atggggacta atgtacaggt ggattcagca tctgccgaat gtacacagac gatgagcgga 60gcattaatgc tgattgaatc attaaaaaaa gagaaagtag aaatgatctt cggttatccg 120ggcggggctg tgcttccgat ttacgataag ctatacaatt cagggttggt acatatcctt 180ccccgtcacg aacaaggagc aattcatgca gcggagggat acgcaagggt ctccggaaaa 240ccgggtgtcg tcattgccac gtcagggccg ggagcgacaa accttgttac aggccttgct 300gatgccatga ttgattcatt gccgttagtc gtctttacag ggcaggtagc aacctctgta 360atcgggagcg atgcatttca ggaagcagac attttaggga ttacgatgcc agtaacaaaa 420cacagctacc aggttcgcca gccggaagat ctgccgcgca tcattaaaga agcgttccat 480attgcaacaa ctggaagacc cggacctgta ttgattgata ttccgaaaga tgtagcaaca 540attgaaggag aattcagcta cgatcatgag atgaatctcc cgggatacca gccgacaaca 600gagccgaatt atttgcagat ccgcaagctt gtggaagccg tgagcagtgc gaaaaaaccg 660gtgatcctgg cgggtgcggg cgtactgcac ggaaaagcgt cagaagaatt aaaaaattat 720gctgaacagc agcaaatccc tgtggcacac acccttttgg ggctcggagg cttcccggct 780gaccatccgc ttttcctagg gatggcggga atgcacggta cttatacagc caatatggcc 840cttcatgaat gtgatctatt aatcagtatc ggcgcccgtt ttgatgaccg tgtcacagga 900aacctgaaac actttgccag aaacgcaaag atagcccaca tcgatattga tccagctgaa 960atcggaaaaa tcatgaaaac acagattcct gtagtcggag acagcaaaat tgtcctgcag 1020gagctgatca aacaagacgg caaacaaagc gattcaagcg aatggaaaaa acagctcgca 1080gaatggaaag aagagtatcc gctctggtat gtagataatg aagaagaagg ttttaaacct 1140cagaaattga ttgaatatat tcatcaattt acaaaaggag aggccattgt cgcaacggat 1200gtaggccagc atcaaatgtg gtcagcgcaa ttttatccgt tccaaaaagc agataaatgg 1260gtcacgtcag gcggacttgg aacgatggga ttcggtcttc cggcggcgat cggcgcacag 1320ctggccgaaa aagatgctac tgttgtcgcg gttgtcggag acggcggatt ccaaatgacg 1380cttcaagaac tcgatgttat tcgcgaatta aatcttccgg tcaaggtagt gattttaaat 1440aacgcttgtc tcggaatggt cagacagtgg caggaaattt tctatgaaga acgttattca 1500gaatctaaat tcgcttctca gcctgacttc gtcaaattgt ccgaagcata cggcattaaa 1560ggcatcagaa tttcatcaga agcggaagca aaggaaaagc tggaagaggc attaacatca l620agagaacctg ttgtcattga cgtgcgggtt gccagcgaag aaaaagtatt cccgatggtg 1680gctccgggga aagggctgca tgaaatggtg ggggtgaaac cttgaaaaga attatcacat 1740tgactgtggt gaaccgctcc ggggtgttaa accggatcac cggtctattc acaaaaaggc 1800attacaacat tgaaagcatt acagttggac acacagaaac agccggcgtt tccagaatca 1860ccttcgtcgt tcatgttgaa ggtgaaaatg atgttgaaca gttaacgaaa cagctcaaca 1920aacagattga tgtgctgaaa gtGacagaga tcacaaatca atcgattgtc cagagggagc 1980tggccttaat caaggttgtc tccgcacctt caacaagaac agagattaat ggaatcatag 2040aaccgtttag agcctctgtc gttgatgtca gcagagacag catcgttgtt caggtgacag 2100gtgaatctaa caaaattgaa gcgcttattg agttattaaa accttatggc attaaagaaa 2160tcgcgagaac aggtacaacg gcttttgcga ggggaaccag caaaaggcgt catccaataa 2220aacaatatct attgtataaa acataacaag ggagagattg aaatggtaaa agtatattat 2280aacggtgata tcaaagagaa cgtattggct ggaaaaacag tagcggttat cgggtacggt 2340tcgcaaggcc acgcacatgc cctgaacctt aaagaaagcg gagtagacgt gatcgtcggt 2400gttagacaag gaaaatcttt cactcaagcc caagaagacg gacataaagt attttcagta 2460aaagaagcgg cagcccaagc cgaaatcatc atggttctgc ttccggatga gcagcagcaa 2520aaagtatacg aagctgaaat caaagatgaa ttgacagcag gaaaatcatt agtattcgct 2580catggattta acgtgcattt ccatcaaatt gttcctccgg cggatgtaga tgtattctta 2640gtggccccta aaggcccggg acacttggta agaagaacat atgagcaagg agctggcgta 2700cctgcattgt tcgcaatcta tcaagatgtg actggagaag caagagacaa agccctcgct 2760tatgctaaag gaatcggcgg cgcaagagcg ggcgtattag aaacgacatt taaagaagaa 2820acagaaacag atttgttcgg tgagcaagca gttctttgcg gcggattaag cgcgcttgtc 2880aaagccggat ttgaaacctt aactgaagca ggttatcagc ctgaacttgc atacttcgag 2940tgtcttcatg agctgaaatt aatcgtagac cttatgtacg aagaaggact tgcaggaatg 3000agatattcaa tctctgacac agcacagtgg ggagatttcg tatcaggccc tcgcgttgtg 3060gacgccaaag taaaagaatc tatgaaagaa gtattaaaag atatccaaaa cggtacattc 3120gcaaaagagt ggatcgtcga aaaccaagta aaccgtcctc gtttcaacgc tatcaatgca 3180agcgagaacg aacatcaaat cgaagtagtg ggaagaaagc ttcgtgaaat gatgccgttt 3240gtgaaacaag gcaagaagaa ggaagcggtg gtctccgttg cgcaaaatta a 3291<210>59<211>2363<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<220><221>CDS<222>(242)..(1072)<220><221>CDS<222>(1077)..(1934)<220><221>CDS<222>(1939)..(2319)<400>59ttggtacaag cccgttgatt ttggtatact tccattgggc agtatcgcct gcgaactgca 60cctattatta aaatagatag acattgcagc agtctgcctt gatccaaaaa aggactggga 120cagagggatg aaactcgccg aactttagaa agtgaagaat ccttctcgtt gtaacggaag 180gttttttggc ttgcagaaga aaacggcaga tcatctcctc taaacatgag gaggagaaaa 240c atg aaa aca aaa ctg gat ttt cta aaa atg aag gag tct gaa gaa ccg 289Met Lys Thr Lys Leu Asp Phe Leu Lys Met Lys Glu Ser Glu Glu Pro
1 5 10 15att gtc atg ctg acc gct tat gat tat ccg gca gct aaa ctt gct gaa 337Ile Val Met Leu Thr Ala Tyr Asp Tyr Pro Ala Ala Lys Leu Ala Glu
20 25 30caa gcg gga gtt gac atg att tta gtc ggt gat tca ctt gga atg gtc 385Gln Ala Gly Val Asp Met Ile Leu Val Gly Asp Ser Leu Gly Met Val
35 40 45gtc ctc ggc ctt gat tca act gtc ggt gtg aca gtt gcg gac atg atc 433Val Leu Gly Leu Asp Ser Thr Val Gly Val Thr Val Ala Asp Met Ile
50 55 60cat cat aca aaa gcc gtt aaa agg ggt gcg ccg aat acc ttt att gtg 481His His Thr Lys Ala Val Lys Arg Gly Ala Pro Asn Thr Phe Ile Val65 70 75 80aca gat atg ccg ttt atg tct tat cac ctg tct aag gaa gat acg ctg 529Thr Asp Met Pro Phe Met Ser Tyr His Leu Ser Lys Glu Asp Thr Leu
85 90 95aaa aat gca gcg gct atc gtt cag gaa agc gga gct gac gca ctg aag 577Lys Asn Ala Ala Ala Ile Val Gln Glu Ser Gly Ala Asp Ala Leu Lys
100 105 110ctt gag ggc gga gaa ggc gtg ttt gaa tcc att cgc gca ttg acg ctt 625Leu Glu Gly Gly Glu Gly Val Phe Glu Ser Ile Arg Ala Leu Thr Leu
115 120 125gga ggc att cca gta gtc agt cac tta ggt ttg aca ccg cag tca gtc 673Gly Gly Ile Pro Val Val Ser His Leu Gly Leu Thr Pro Gln Ser Val
130 135 140ggc gta ctg ggc ggc tat aaa gta cag ggc aaa gac gaa caa agc gcc 721Gly Val Leu Gly Gly Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asp Glu Gln Ser Ala145 150 155 160aaa aaa tta ata gaa gac agt ata aaa tgc gaa gaa gca gga gct atg 769Lys Lys Leu Ile Glu Asp Ser Ile Lys Cys Glu Glu Ala Gly Ala Met
165 170 175atg ctt gtg ctg gaa tgt gtg ccg gca gaa ctc aca gcc aaa att gcc 817Met Leu Val Leu Glu Cys Val Pro Ala Glu Leu Thr Ala Lys Ile Ala
180 185 190gag acg cta agc ata ccg gtc att gga atc ggg gct ggt gtg aaa gcg 865Glu Thr Leu Ser Ile Pro Val Ile Gly Ile Gly Ala Gly Val Lys Ala
195 200 205gac gga caa gtt ctc gtt tat cat gat att atc ggc cac ggt gtt gag 913Asp Gly Gln Val Leu Val Tyr His Asp Ile Ile Gly His Gly Val Glu
210 215 220aga aca cct aaa ttt gta aag caa tat acg cgc att gat gaa acc atc 961Arg Thr Pro Lys Phe Val Lys Gln Tyr Thr Arg Ile Asp Glu Thr Ile225 230 235 240gaa aca gca atc agc gga tat gtt cag gat gta aga cat cgt gct ttc 1009Glu Thr Ala Ile Ser Gly Tyr Val Gln Asp Val Arg His Arg Ala Phe
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260 265 270ttg tac ggg gga aaa taag atg aga cag att act gat att tca cag ctg 1106Leu Tyr Gly Gly Lys Met Arg Gln Ile Thr Asp Ile Ser Gln Leu
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355 360 365ttt acg cca gat gct cat gat atg tat ccc ggt gaa aag aat gtc acg 1394Phe Thr Pro Asp Ala His Asp Met Tyr Pro Gly Glu Lys Asn Val Thr
370 375 380att cat gta gaa aga cgc aca gac gtg tta tgc ggg cgc tca aga gaa 1442Ile His Val Glu Arg Arg Thr Asp Val Leu Cys Gly Arg Ser Arg Glu
385 390 395gga cat ttt gac ggg gtc gcg atc gta ctg acg aag ctt ttc aat cta 1490Gly His Phe Asp Gly Val Ala Ile Val Leu Thr Lys Leu Phe Asn Leu400 405 410 415gtc aag ccg act cgt gcc tat ttc ggt tta aaa gat gcg cag cag gta 1538Val Lys Pro Thr Arg Ala Tyr Phe Gly Leu Lys Asp Ala Gln Gln Val
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450 455 460cgc aat gta tac tta aca gct gag gaa aga aaa gaa gcg cct aag ctg 1682Arg Asn Val Tyr Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Glu Ala Pro Lys Leu
465 470 475tat cgg gcc ctt caa aca agt gcg gaa ctt gtc caa gcc ggt gaa aga 1730Tyr Arg Ala Leu Gln Thr Ser Ala Glu Leu Val Gln Ala Gly Glu Arg480 485 490 495gat cct gaa gcg gtg ata aaa gct gca aaa gat atc att gaa acg act 1778Asp Pro Glu Ala Val Ile Lys Ala Ala Lys Asp Ile Ile Glu Thr Thr
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530 535 540ttt tca aaa gcg cgt tta ata gat aat atc att att gat att cga gaa 1922Phe Ser Lys Ala Arg Leu Ile Asp Asn Ile Ile Ile Asp Ile Arg Glu
545 550 555atg gag aga ata taat atg tat cga aca atg atg agc ggc aaa ctt cac 1971Met Glu Arg Ile Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His560 565 570agg gca act gtt acg gaa gca aac ctg aac tat gtg gga agc att aca 2019Arg Ala Thr Val Thr Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr575 580 585 590att gat gaa gat ctc att gat gct gtg gga atg ctt cct aat gaa aaa 2067Ile Asp Glu Asp Leu Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys
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640 645 650atg atg tct gat caa gaa gcg gca agc cat gag ccg aaa gtg gct gtt 2259Met Met Ser Asp Gln Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val655 660 665 670ctg aat gat caa aac aaa att gaa caa atg ctg ggg aac gaa cca gcc 2307Leu Asn Asp Gln Asn Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala
675 680 685cgt aca att ttg tagaagaaaa gcccccttta tcgggggttt tcttttaaga tttt 2363Arg Thr Ile Leu
690<210>60<21l>293<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subillis)<400>60Met Ser Ile Ala Val Ser Glu Glu Glu Ala Lys Ala Val Glu Gly Leu1 5 10 15Asn Asp Tyr Leu Ser Val Glu Glu Val Glu Thr Ile Tyr Ile Pro Leu
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50 55 60Ile Ile Gly Ile Ala Gly Ser Val Ala Val Gly Lys Ser Thr Thr Ala65 70 75 80Arg Ile Leu Gln Lys Leu Leu Ser Arg Leu Pro Asp Arg Pro Lys Val
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115 120 125Lys Ala Leu Leu Glu Phe Leu Asn Asp Leu Lys Ser Gly Lys Asp Ser
130 135 140Val Lys Ala Pro Val Tyr Ser His Leu Thr Tyr Asp Arg Glu Glu Gly145 150 155 160Val Phe Glu Val Val Glu Gln Ala Asp Ile Val Ile Ile Glu Gly Ile
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275 280 285Leu Val Arg Arg Val
290<210>61<211>281<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>61Met Glu Gly Leu Asn Asp Tyr Leu Ser Val Glu Glu Val Glu Thr Ile1 5 10 15Tyr Ile Pro Leu Val Arg Leu Leu His Leu His Val Lys Ser Ala Ala
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195 200 205Arg Leu Leu Arg Glu Thr Ala Phe Gln Asn Pro Asp Ser Tyr Phe His
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245 250 255Thr Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ile Leu Arg Lys Gly Asp Gly His Lys
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pAN294质粒<400>72tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 60tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 120ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 180ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctgg atgaaaagcc 240gatgaccgct tttcaggtct gtcagcagct ttttcctgct gtatatgaaa aggaattgtt 300tttaacgatg tcagaaacgg caggtcacct tgatgtgttg gaggctgaag aagccatcac 360gtcatattgg gaaggaaata ccgtatactt taaaacaatg aagaggtgaa atgggtgaaa 420catatagcgg gaaaaaggat ttggataacc ggcgcttcag gagggcttgg agaaagaatc 480gcatacttat gcgcggctga aggagcccat gtcctgctgt cggctagacg cgaggatcgt 540ttgatagaaa tcaaaaggaa aataaccgag gaatggagcg gacagtgtga gatttttcct 600ctggatgtcg gccgcctaga ggatatcgcc cgggtccgcg atcagatcgg ctcgattgat 660gtactgatta acaatgcagg cttcggtata tttgaaacgg ttttagactc tacattggat 720gacatgaaag cgatgtttga tgtgaatgtc ttcggcctga tcgcctgtac aaaagcggtg 780cttccgcaaa tgcttgagca aaaaaaggga catatcatca atatcgcctc tcaagcgggg 840aaaatcgcca 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245 250<210>75<2l1>258<212>PRT<213>荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)<400>75Met Leu Leu Cys Ile Asp Cys Gly Asn Thr Asn Thr Val Phe Ser Val1 5 10 15Trp Asp Gly Thr Asp Phe Ala Ala Thr Trp Arg Ile Ala Thr Asp His
20 25 30Arg Arg Thr Ala Asp Glu Tyr Phe Val Trp Leu Asn Thr Leu Met Gln
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l30 135 140Tyr Ile Gly Gly Val Ile Ala Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Glu Ala145 150 155 160Leu His Met Ala Ala Ala Ala Leu Pro His Val Asp Val Thr Lys Pro
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245 250 255Gly Ala<210>76<211>10801<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：重组
pAN240质粒<400>76gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840ttttttaaaa 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pAN423质粒<400>78ggcggccgct tcgtcgaccg aaacagcagt tataaggcat gaagctgtcc ggtttttgca 60aaagtggctg tgactgtaaa aagaaatcga aaaagaccgt tttgtgtgaa aacggtcttt 120ttgtttcctt ttaaccaact gccataactc gaggcctacc tagcttccaa gaaagatatc 180ctaacagcac aagagcggaa agatgttttg ttctacatcc agaacaacct ctgctaaaat 240tcctgaaaaa ttttgcaaaa agttgttgac tttatctaca aggtgtggta taataatctt 300aacaacagca ggacgctcta gaaaaggagg aatttaaatg tatcgtacga tgatgagcgg 360caaacttcac agggcaactg ttacggaagc aaacctgaac tatgtgggaa gcattacaat 420tgatgaagat ctcattgatg ctgtgggaat gcttcctaat gaaaaagtac aaattgtgaa 480taataataat ggagcacgtc ttgaaacgta tattattcct ggtaaacggg gaagcggcgt 540catatgctta aacggtgcag ccgcacgcct tgtgcaggaa ggagataagg tcattattat 600ttcctacaaa atgatgtctg atcaagaagc ggcaagccat gagccgaaag tggctgttct 660gaatgatcaa aacaaaattg aacaaatgct ggggaacgaa ccagcccgta caattttgta 720aaggatcctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac 780gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg 840accccatgcc 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pAN267质粒<400>82aacaaaattc tccagtcttc acatcggttt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 60gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaatgttt 120gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgccg ttattcgctg gatttttatt gctgtttcat 180ttggttctgg caggaccggc ggctgcgagt gctgaaacgg cgaacaaatc gaatgagctt 240acagcaccgt cgatcaaaag cggaaccatt cttcatgcat ggaattggtc gttcaatacg 300ttaaaacaca atatgaagga tattcatgat gcaggatata cagccattca gacatctccg 360attaaccaag taaaggaagg gaatcaagga gataaaagca tgtcgaactg gtactggctg 420tatcagccga catcgtatca aattggcaac cgttacttag gtactgaaca agaatttaaa 480gaaatgtgtg cagccgctga agaatatggc ataaaggtca ttgttgacgc ggtcatcaat 540cataccacca gtgattatgc cgcgatttcc aatgaggtta agagtattcc aaactggaca 600catggaaaca cacaaattaa aaactggtct gatcgaaata gtacataatg gatttcctta 660cgcgaaatac gggcagacat ggcctgcccg gttattatta tttttgacac cagaccaact 720ggtaatggta gcgaccggcg ctcaggatcg tctcggtacc aagagtttgt agaaacgcaa 780aaaggccatc cgtcaggatg gccttctgct taatttgatg cctggcagtt tatggcgggc 840gtcctgcccg 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actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 10260gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 10320gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 10380cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaatt 10426<210>83<211>4191<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：重组
pAN263质粒<400>83ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag cccggatccg 60aaagaagagg atatcccggt tttacagaag gcattggatg atccaaaggt gtccatcaga 120agacaggctg ttgtgtactt aggaatgatt gaaacacctg atgttcttcc tctattgtat 180aaagcacttg aggacaaagc tgtatcagtc agaagaacgg ccggagactg cctgtctgat 240atcggcgatc ctcaagccat tcctgctatg atcaagtcat taagcgactc cagcaagctt 300gttcgctggc gtgccgccat gttcctgtac gaagtcggcg atgaaagtgc aattgaagct 360ttgcgcgctg ccgaagatga ccccgaattt gaggtcagcc ttcaagtcaa aatggcgctt 420gaacgtattg agcatggaga agaagcaaaa ggttctgttt ggaaacaaat gacggaaagc 480agaaaaaaag gcgaataaag ataaaaaagg tgcagatcat gcaccttttt tatgtgaatt 540ggtcgaccga aacagcagtt ataaggcatg aagctgtccg gtttttgcaa aagtggctgt 600gactgtaaaa agaaatcgaa aaagaccgtt ttgtgtgaaa acggtctttt tgtttccttt 660taaccaactg ccataactcg aggcctacct agcttccaag aaagatatcc taacagcaca 720agagcggaaa gatgttttgt tctacatcca gaacaacctc tgctaaaatt cctgaaaaat 780tttgcaaaaa gttgttgact ttatctacaa ggtgtggtat aataatctta acaacagcag 840gacgctctag 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C末端<400>91Ile Arg Arg Lys Glu Val Asn1 5<210>92<211>6688<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：重组
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8503<210>94<211>7381<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：重组
pAN006质粒<400>94ttgcggccgc ttcgaaagct gtaatataaa aaccttcttc aactaacggg gcaggttagt 60gacattagaa aaccgactgt aaaaagtaca gtcggcatta tctcatatta taaaagccag 120tcattaggcc tatctgacaa ttcctgaata gagttcataa acaatcctgc atgataacca 180tcacaaacag aatgatgtac ctgtaaagat agcggtaaat atattgaatt acctttatta 240atgaattttc ctgctgtaat aatgggtaga aggtaattac tattattatt gatatttaag 300ttaaacccag taaatgaagt ccatggaata atagaaagag aaaaagcatt ttcaggtata 360ggtgttttgg gaaacaattt ccccgaacca ttatatttct ctacatcaga aaggtataaa 420tcataaaact ctttgaagtc attctttaca ggagtccaaa taccagagaa tgttttagat 480acaccatcaa aaattgtata aagtggctct aacttatccc aataacctaa ctctccgtcg 540ctattgtaac cagttctaaa agctgtattt gagtttatca cccttgtcac taagaaaata 600aatgcagggt aaaatttata tccttcttgt tttatgtttc ggtataaaac actaatatca 660atttctgtgg ttatactaaa agtcgtttgt tggttcaaat aatgattaaa tatctctttt 720ctcttccaat tgtctaaatc aattttatta aagttcattt gatatgcctc ctaaattttt 780atctaaagtg aatttag9ag gcttacttgt ctgctttctt cattagaatc aatccttttt 840taaaagtcaa 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Claims (110)
1.制备泛化合物的方法，包括在可以生成泛化合物的条件下培养微生物，所述微生物过量表达至少一种芽孢杆菌泛酸生物合成酶。
2.权利要求1的方法，其中微生物过量表达至少一种枯草芽孢杆菌泛酸生物合成酶。
3.权利要求1或2的方法，其中泛酸生物合成酶选自酮泛解酸羟甲基转移酶，泛酸合成酶，天门冬氨酸-α-脱羧酶和酮泛解酸还原酶。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中微生物过量表达至少两种泛酸生物合成酶。
5.权利要求1-3任一项的方法，其中微生物过量表达至少三种泛酸生物合成酶。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中泛化合物选自泛酸，泛解酸，酮泛解酸和β丙氨酸。
7.制备泛化合物的方法，包括在可以生成泛化合物的条件下培养过量表达酮泛解酸还原酶的(KPAR-O)微生物。
8.权利要求7的方法，其中泛化合物是泛酸或泛解酸。
9.权利要求7或8的方法，其中酮泛解酸还原酶源于细菌。
10.权利要求7或8的方法，其中酮泛解酸还原酶源于芽孢杆菌。
11.权利要求7或8的方法，其中酮泛解酸还原酶源于枯草芽孢杆菌。
12.权利要求7-11任一项的方法，其中KPAR-O微生物除了过量表达酮泛解酸还原酶之外，还过量表达至少一种泛酸生物合成酶。
13.权利要求12的方法，其中KPAR-O微生物还过量表达至少一种酮泛解酸羟甲基转移酶，泛酸合成酶和天门冬氨酸-α-脱羧酶。
14.以不依赖添加前体物质的形式制备泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物，所述微生物异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径去调节。
15.以不依赖添加天门冬氨酸或β丙氨酸的形式制备至少2g/L泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物。
16.以不依赖添加缬氨酸或α酮异戊酸的形式制备至少2g/L泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径去调节的微生物。
17.以不依赖添加天门冬氨酸或β丙氨酸的形式制备至少30g/L泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物。
18.以不依赖添加缬氨酸或α酮异戊酸的形式制备至少30g/L泛酸的方法，包括在可以生成泛酸的条件下培养异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径去调节的微生物。
19.不依赖β丙氨酸的高产量制备泛酸的生产方法，包括在可以显著提高泛酸产量的条件下培养经处理微生物。
20.权利要求14-19任一项的方法，其中微生物过量表达乙酰羟酸合成酶，或者用包括ilvBN核酸序列或alsS序列的载体转化。
21.权利要求14-19任一项的方法，其中微生物过量表达乙酰羟酸异构还原酶，或者用包括ilvC核酸序列的载体转化。
22.权利要求14-19任一项的方法，其中微生物过量表达双羟酸脱水酶，或者用包括ilvD核酸序列的载体转化。
23.权利要求19-22任一项的方法，其中微生物过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶，或者用包括panD核酸序列的载体转化。
24.权利要求14-23任一项的方法，其中微生物的泛酸生物合成途径进一步去调节。
25.权利要求14-24任一项的方法，其中微生物还具有至少一个突变基因，所述突变基因选自avtA突变基因，ilvE突变基因，ansB突变基因和alsD突变基因。
26.权利要求24的方法，其中微生物过量表达任意酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶，泛酸合成酶和天门冬氨酸-α-脱羧酶。
27.权利要求24或26的方法，其中微生物应用含panBCD核酸序列的载体或含panE1核酸序列的载体转化。
28.权利要求14-16以及19-27任一项的方法，其中泛酸的制备水平选自超过10g/L，超过20g/L以及超过40g/L的水平。
29.权利要求20的方法，其中微生物过量表达源于芽孢杆菌的乙酰羟酸合成酶，或者用包括源于芽孢杆菌的ilvBN核酸序列或alsS核酸序列的载体转化。
30.权利要求21的方法，其中微生物过量表达源于芽孢杆菌的乙酰羟酸异构还原酶，或者用包括源于芽孢杆菌的ilvC核酸序列的载体转化。
31.权利要求22的方法，其中微生物过量表达源于芽孢杆菌的双羟酸脱水酶，或者用包括源于芽孢杆菌的ilvD核酸序列的载体转化。
32.权利要求23的方法，其中微生物过量表达源于芽孢杆菌的天门冬氨酸-α-脱羧酶，或者用包括源于芽孢杆菌的panD核酸序列的载体转化。
33.权利要求24或26的方法，其中微生物过量表达源于芽孢杆菌的任意酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶，泛酸合成酶和天门冬氨酸-α-脱羧酶。
34.权利要求27的方法，其中载体包括源于芽孢杆菌的panBCD核酸序列或panE1核酸序列。
35.制备泛化合物的方法，包括在可以生成泛化合物的条件下，使包括至少一种泛酸生物合成途径前体物质或异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径前体物质的组合物与至少一种分离的芽孢杆菌酶接触，所述芽孢杆菌酶选自酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶，泛酸合成酶和天门冬氨酸-α-脱羧酶。
36.制备β丙氨酸的方法，包括在可以生成β丙氨酸的条件下，培养过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶(AαD-O)的微生物。
37.权利要求36的方法，其中AαD-O微生物编码泛酸生物合成酶的核酸序列存在突变，所述泛酸生物合成酶选自酮泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶。
38.制备β丙氨酸的方法，包括在可以生成β丙氨酸的条件下，使含天门冬氨酸的组合物与分离的芽孢杆菌天门冬氨酸-α-脱羧酶接触。
39.增量制备泛化合物的方法，包括在泛化合物产量可以提高的条件下培养coaX基因发生突变的突变微生物。
40.权利要求39的方法，其中所述重组微生物具有coaA突变基因。
41.制备泛化合物的方法，包括在可以显著提高泛化合物产量的条件下的泛酸激酶突变微生物。
42.权利要求41的方法，其中所述突变微生物具有coaA突变基因。
43.权利要求41的方法，其中所述突变微生物具有coaX突变基因。
44.权利要求41的方法，其中所述突变微生物具有coaA和coaX突变基因。
45.权利要求39-44任一项的方法，其中所述泛化合物选自酮泛解酸，泛解酸或泛酸。
46.权利要求39-44任一项的方法，其中所述泛化合物是泛酸。
47.权利要求39-44任一项的方法，其中所述泛化合物的制备水平选自超过10g/L，超过20g/L以及超过40g/L的水平。
48.权利要求39-44任一项的方法，其中所述重组微生物的泛酸生物合成途径还进一步去调节，或者异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径进一步去调节。
49.权利要求39-44任一项的方法，其中所述重组微生物还过量表达panD和panE。
50.权利要求39-44任一项的方法，其中所述重组微生物还具有至少一个突变基因，所述突变基因选自avtA突变基因，ilvE突变基因，ansB突变基因和alsD突变基因。
51.增量制备泛化合物的方法，包括在泛化合物产量可以提高的条件下培养微生物，所述微生物泛酸生物合成途径去调节，并还具有突变，导致泛酸激酶活性降低。
52.鉴定能够调节泛酸激酶活性的化合物的方法，包括使表达coaX基因编码的泛酸激酶的重组细胞与备测化合物接触，然后测定备测化合物调节所述细胞内泛酸激酶活性的能力。
53.权利要求52的方法，其中所述细胞进一步包括一个coaA突变基因，所述基因编码活性降低的泛酸激酶。
54.权利要求1-51任一项的方法，其中所述微生物是革兰阳性微生物。
55.权利要求1-51任一项的方法，其中所述微生物是革兰阴性微生物。
56.权利要求1-51任一项的方法，其中所述微生物属于选自芽孢杆菌属、棒状杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属和链霉菌属的微生物。
57.权利要求1-51以及54-56任一项的方法，其中微生物是芽孢杆菌属微生物。
58.权利要求1-51以及54-57任一项的方法，其中微生物是枯草芽孢杆菌。
59.权利要求1-13，35，39-51以及54-58任一项的方法，还进一步包括回收泛化合物。
60.权利要求14-34以及54-58任一项的方法，还进一步包括回收泛酸。
61.权利要求1-14，35，39-46，48-51以及54-59任一项的方法，其中泛化合物的制备水平超过2g/L。
62.重组微生物，过量表达至少一种芽孢杆菌泛酸生物合成酶。
63.权利要求62的重组微生物，过量表达至少一种枯草芽孢杆菌泛酸生物合成酶。
64.权利要求62或63的重组微生物，其中泛酸生物合成酶选自酮泛解酸羟甲基转移酶，泛酸合成酶，天门冬氨酸-α-脱羧酶和酮泛解酸还原酶。
65.权利要求62-64任一项的方法，其中泛酸生物合成酶是酮泛解酸还原酶。
66.重组微生物，过量表达天门冬氨酸-α-脱羧酶，并具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径。
67.具有coaX突变基因的重组微生物，所述coaX突变基因在该微生物中编码活性降低的泛酸激酶。
68.权利要求67的重组微生物，还进一步包括coaA突变基因，所述coaA突变基因在该微生物中编码活性降低的泛酸激酶。
69.具有coaX突变基因并任选具有coaA突变基因的重组微生物，该突变微生物与具有野生型coaA和coaX具有的微生物相比，泛酸激酶活性降低。
70.重组微生物，它包括的载体含有分离的coaX基因。
71.过量生成泛化合物的重组微生物，该微生物具有去调节的泛酸生物合成途径，并具有至少一个突变，导致微生物合成辅酶A(CoA)的能力减弱。
72.权利要求71的重组微生物，具有至少一个突变，导致泛酸激酶活性水平下降。
73.权利要求72的重组微生物，在coaA基因或其类似物中具有突变，导致CoaA酶活性水平降低。
74.权利要求72的重组微生物，在coaX基因或其类似物中具有突变，导致CoaX酶活性水平降低。
75.权利要求72的重组微生物，在coaA基因或其类似物中具有突变，并在coaX基因或其类似物中具有突变，突变导致CoaA酶活性水平降低以及CoaX酶活性水平降低。
76.权利要求66-70的任一重组微生物，还进一步具有去调节的泛酸生物合成途径。
77.权利要求62-65以及67-75的任一重组微生物，还进一步具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径。
78.权利要求62-77的任一重组微生物，是革兰阳性微生物。
79.权利要求78的重组微生物，属于选自芽孢杆菌属、棒状杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属和链霉菌属的微生物。
80.权利要求79的重组微生物，属于芽孢杆菌属。
81.权利要求80的重组微生物，其为枯草芽孢杆菌。
82.重组微生物，选自PA221，PA235，PA236，PA313，PA410，PA402，PA403，PA411，PA412，PA413，PA303，PA327，PA328，PA401，PA340，PA342，PA404，PA405，PA374，PA354，PA365，PA377，PA651和PA824。
83.用于泛化合物制备的重组载体，包括编码至少一种芽孢杆菌泛酸生物合成酶的核酸序列，其与调控序列操作性连接。
84.权利要求83的载体，包括编码至少一种枯草芽孢杆菌泛酸生物合成酶的核酸序列。
85.权利要求84的载体，其中所述核酸序列编码至少一种酮泛解酸羟甲基转移酶，泛酸合成酶，天门冬氨酸-α-脱羧酶和酮泛解酸还原酶。
86.重组载体，包括至少一个选自序列23，序列25，序列27，序列29和序列59的核酸序列。
87.权利要求84的载体，其中核酸序列编码酮泛解酸还原酶。
88.包括coaX突变基因的载体，所述突变基因编码活性降低的泛酸激酶。
89.包括分离的coaX基因的载体。
90.包括分离的芽孢杆菌coaX基因的载体。
91.包括分离的枯草芽孢杆菌coaX基因的载体。
92.权利要求86以及89-91的任一载体，还进一步包括调控序列。
93.权利要求83-85，87和92的任一载体，其中调控序列包括组成型的活性启动子。
94.权利要求93的载体，其中所述组成型的活性启动子包括Pveg(序列41)，P15(序列39)或P26(序列40)序列。
95.权利要求83的载体，其中调控序列包括至少一个人工核糖体结合位点(RBS)。
96.权利要求95的载体，其中人工RBS包括的核苷酸序列选自序列49，序列50，序列51，序列52，序列53，序列54，序列55，序列56和序列57。
97.载体，选自pAN004，pAN005，pAN006，pAN236，pAN423，pAN428，pAN429，pAN441，pAN442，pAN443，pAN251，pAN267，pAN256，pAN257，pAN263，pAN240，pAN294，pAN296，pAN336，pAN341和pAN342。
98.重组微生物，包括权利要求86或93的载体。
99.分离的核酸分子，编码至少一种芽孢杆菌泛酸生物合成基因。
100.权利要求99的分离核酸分子，编码至少一种枯草芽孢杆菌泛酸生物合成基因。
101.权利要求99或100的分离核酸分子，编码酮泛解酸还原酶。
102.分离的芽孢杆菌泛酸生物合成酶多肽。
103.分离的枯草芽孢杆菌泛酸生物合成酶多肽。
104.分离的芽孢杆菌酮泛解酸还原酶多肽。
105.分离的枯草芽孢杆菌酮泛解酸还原酶多肽。
106.分离的芽孢杆菌天门冬氨酸-α-脱羧酶多肽。
107.分离的枯草芽孢杆菌天门冬氨酸-α-脱羧酶多肽。
108.分离的包括coaX突变基因的核酸分子。
109.分离的包括coaX基因的核酸分子。
110.分离的由coaX基因编码的泛酸激酶蛋白。
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