CN105368758B - 一株高产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法 - Google Patents

一株高产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株高产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法，属于生物技术领域，所述菌株分类命名为特基拉芽孢杆菌PanD37，已于2015年2月2日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No.10506。本发明提供的产L‑天冬氨酸α‑脱羧酶的特基拉芽孢杆菌尚属首次报道，菌株PanD37遗传稳定性好，培养成本低，产生的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶酶活力高，可直接利用该菌株发酵液直接转化β‑丙氨酸，催化合成时无需加入表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作，工业应用具有优势。

Description

一株高产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株，以及利用该菌株生产的L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液催化制备β-丙氨酸的方法。
背景技术
β-丙氨酸是天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品，用途非常广泛。目前β-丙氨酸主要采用化学合成法，成本高、条件及生产环境不友好等缺点，开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase，EC4.1.1.11，PanD)是泛酸生物合成途径中的关键酶，催化L-天冬氨酸脱羧基生成β-丙氨酸，利用该酶以廉价的L-天冬氨酸为原料可以实现β-丙氨酸绿色高效的工业生产。
PanD在大肠杆菌(Escherichia coli)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)及幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)等微生物中均有存在，目前研究较多的是大肠杆菌和结核分枝杆菌。国内外研究者利用上述菌株做了很多研究工作，如美国NSC技术有限公司扩增表达了E.coli来源的PanD基因，测得该酶酶活为0.115mmol/g·h，Chopra等人扩增了致病菌Mycobacterium tuberculosis来源的PanD基因并在E.coli BL21(DE3)中表达，粗酶液酶活达到0.035mmol/g·h，高丽娟等将E.coli DH5α来源的panD在E.coliBL21(DE3)中表达构建工程菌，酶活为224.96U/L；洪敏等将E.coli DH5a panD连接到pET28c(+)载体，转化E.coli BL21(DE3)，经诱导培养重组菌酶活为186U/L发酵液。以上报道受限于较低的酶活力，距离工业化应用尚有较大的距离。
发明内容
本发明的目的是提供从葡萄园中分离得到的一株高效生产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株，并应用该菌株产生的L-天冬氨酸α-脱羧酶酶法制备β-丙氨酸的方法。
本发明所提供的产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株是从烟台地区葡萄园土壤中分离得到，这是一株L-天冬氨酸α-脱羧酶分泌能力极高的菌株，培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以直接用于酶法制备β-丙氨酸。将其编号为PanD37，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2015年2月2日，分类命名为特基拉芽孢杆菌PanD37(Bacillustequilensis PanD37)，保藏编号为：CGMCC No.10506。该菌株的16S rDNA基因序列已递交到了GenBank数据库,获得登录号KP635214。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明菌株PanD37与Bacillus tequilensis相似度最高，达到99％。
本发明所述菌株的L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵生产及用于催化制备β-丙氨酸的方法如下：
1、培养基配制
(1)固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；(2)液体种子培养基：酵母浸粉1～10g/L，蛋白胨5～10g/L，NaCl 1～5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；(3)发酵培养基：葡萄糖10～30g/L，蛋白胨5～20g/L，天冬氨酸1～10g/L，MgSO40.1～0.5g/L，硫酸铵2～15g/L，KH2PO40.1～1g/L，pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
2、菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱30℃培养14～20h；
3、液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的三角瓶中，纱布封口，于25～37℃，160～200r/min摇床振荡培养12～24h，得液体种子；
4、液体发酵：按5～10％接种量向发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～50％，pH7.0～7.5，温度25～37℃，通气培养24～48h，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液；
5、催化制备β-丙氨酸：将L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液置于转化罐中，每100mL发酵液投放L-天冬氨酸1～3g，用盐酸调pH至6.0～8.0，温度35～45℃，敞口散气，维持转速在50～100r/min，反应5～10h。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、本发明提供的特基拉芽孢杆菌PanD37，不同于以往的L-天冬氨酸α-脱羧酶产生菌种，尚未有该菌株产L-天冬氨酸α-脱羧酶的报道，进一步拓宽了β-丙氨酸生产的菌种渠道；
2、本发明所提供的特基拉芽孢杆菌PanD37遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活力高，可直接利用该菌株发酵液直接转化β-丙氨酸，工业应用具有优势。
3、L-天冬氨酸α-脱羧酶可以自然渗透细胞外，催化合成β-丙氨酸时无需加入表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作。
具体实施方式
为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1：特基拉芽孢杆菌菌株分类
1)菌种特性
在保藏培养基上菌落呈乳白色、近圆形、表面干燥、不透明、有褶皱、无光泽、边缘不规则成裂叶状、易挑取；通过显微镜观察，菌体呈杆状，单个不成链，革兰氏阳性，培养48h后观察芽孢着生在菌体侧端位置或游离存在，不膨大，椭圆形或柱形。
2)菌株鉴定
经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16S rDNA基因序列长度为1459bp，在GenBank上进行BLAST比对，得出该菌株与特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis(JX412373)碱基相似性达99％，序列信息如下：
tggctttgcgcttgctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtcctgaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgtttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagaggaataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtgggtgcatggttgtcgtcagcttgtgtcgtgagatgtttgtttaagttccgcaacgaggcgcaacccttgttctttagttggcagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaagtgacagatgttg
3)菌种保藏
本项发明所述的特基拉芽孢杆菌PanD37(Bacillus tequilensis PanD37)，已于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.10506，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2
1)菌株活化：挑取菌种至固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，划线接种于恒温培养箱30℃培养20h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，液体种子培养基组分：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按5％接种量向组成成分为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，天冬氨酸2g/L，MgSO40.2g/L，KH2PO40.5g/L，硫酸铵3g/L的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养24h，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液；
4)催化制备β-丙氨酸：将L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液1000mL置于3L转化罐中，投放10g的L-天冬氨酸固体，搅拌均匀，温度40℃，盐酸调pH在7.0，敞口散气，维持转速在50r/min，反应4h，HPLC测定β-丙氨酸含量为6.66g/L，对L-天冬氨酸摩尔转化率为99.5％。液相色谱条件为氨基酸专用ODS-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温：33℃；检测波长：360nm；流动相A：50％乙腈，流动相B：0.45％乙酸钠缓冲液(pH6.4)，按表1梯度洗脱，流动相总流量：1mL/min，2,4-二硝基氟苯柱前衍生测定。
表1流动相洗脱方式
实施例3
1)菌株活化：挑取菌种至固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，划线接种于恒温培养箱30℃培养20h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，液体种子培养基组分：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0。八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按7％接种量向组成成分为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，天冬氨酸2g/L，MgSO40.2g/L，KH2PO40.5g/L，硫酸铵3g/L的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制25～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养28h，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液；
4)催化制备β-丙氨酸：将L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液1000mL置于3L转化罐中，投放20g的L-天冬氨酸固体，搅拌均匀，温度40℃，用盐酸调pH至7.0，敞口散气，维持转速在180r/min，反应8h，HPLC测定β-丙氨酸含量为13.2g/L，对L-天冬氨酸摩尔转化率为98.6％，液相色谱条件同实施例2。
实施例4
1)菌株活化：挑取菌种至保藏斜面培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，划线接种于恒温培养箱30℃培养20h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，液体种子培养基组分：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按10％接种量向组成成分为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，天冬氨酸2g/L，MgSO40.2g/L，KH2PO40.5g/L，硫酸铵3g/L的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养24h，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液；
4)催化制备β-丙氨酸：将L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液1000mL置于3L转化罐中，投放25g的L-天冬氨酸固体，搅拌均匀，温度37℃，盐酸调pH在7.0，敞口散气，维持转速在50r/min，反应12h，HPLC测定β-丙氨酸含量为16.25g/L，对L-天冬氨酸摩尔转化率为97.1％，液相色谱条件同实施例2。

Claims (4)

1.一株产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株，其特征在于其分类名为特基拉芽孢杆菌PanD37，已于2015年2月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCCNo.10506。
2.一种利用权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌PanD37生产L-天冬氨酸α-脱羧酶并用于制备β-丙氨酸的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
1)特基拉芽孢杆菌PanD37菌株活化；
2)液体种子制备：挑取步骤1)的活化菌株接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，纱布封口，于25～37℃，160～200r/min摇床振荡培养12～24h，得特基拉芽孢杆菌PanD37液体种子；
3)按5～10％接种量向发酵培养基接入步骤2)所述的特基拉芽孢杆菌PanD37液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～50％，pH7.0～7.5，温度25～37℃，通气培养24～48h，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液；
4)催化制备β-丙氨酸：将步骤3)得到的L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液置于转化罐中，每100mL发酵液投放L-天冬氨酸1～3g，用盐酸调pH至6.0～8.0，温度35～45℃，敞口散气，维持转速在50～100r/min，反应5～10h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的特基拉芽孢杆菌PanD37活化为挑取菌株至固体保藏培养基，划线接种于恒温培养箱30℃培养14～20h；固体保藏培养基成分为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的液体种子培养基：酵母浸粉1～10g/L，蛋白胨5～10g/L，NaCl 1～5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述的发酵培养基：葡萄糖10～30g/L，蛋白胨5～20g/L，天冬氨酸1～10g/L，MgSO4 0.1～0.5g/L，硫酸铵2～15g/L，KH2PO4 0.1～1g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
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