CN105624073B - 一株产脂固氮螺菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株产脂固氮螺菌及其应用，所述的菌为产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)FZJG415，该菌株已于2016年1月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.12060。通过菌株将空气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，从而能够显著促进水稻等作物生长的菌株。

Description

一株产脂固氮螺菌及其应用
技术领域
本发明微生物领域，涉及一株产脂固氮螺菌及其应用，该产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum，FZJG415)能将空气中游离的氮转为氨对水稻有着明显的促生作用。
背景技术
内生固氮菌是一类具有固氮能力的微生物，它的主要宿主是非豆科作物。人们在研究内生固氮菌时发现某些菌类能提供植物高达70%的氮量。发掘内生固氮菌的资源已成为非豆科作物高效利用生物固氮战略的主攻方向之一。长期以来，为了确保农产品获得高产，人们大量使用化学肥料和农药，这样既造成了土壤结构的破坏及环境的污染，又不利于农业的可持续发展。通过微生物的作用将空气中游离的氮转为氨，供植物吸收利用，从而促进作物的生长。
从福建农林大学菌草所基地巨菌草根中筛选到具有高固氮酶活性的产脂固氮螺菌菌株，通过将空气中游离的氮转为氨，供植物吸收利用，从而促进作物生长具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产脂固氮螺菌及其应用，提供具有高效固氮酶活性、生长速度快、对环境适应性强的内生固氮菌株。通过菌株将空气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，从而能够显著促进水稻等作物生长的菌株。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，利用CCM与NFB两种选择性无氮培养基从福建农林大学菌草所基地巨菌草根中进行内生固氮菌的分离纯化。将分离纯化到的内生固氮菌株进行活化后，用乙炔还原法和15N2同位素标记，固氮酶活性为360.22nmol.mL-1h-1，15N测定丰度为26.19%，发现该菌株能够将空气中游离的氮转为氨，可作为接种剂对水稻具有明显的促生长作用。
本发明所述的巨菌草固氮螺菌为产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)FZJG415，已于2016年01月20日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为 CGMCC No.12060。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
本发明产脂固氮螺菌具有如下形态和生理、生化特性：
a、菌体形态特性
该产脂固氮螺菌为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状或卷曲，大小为(0.6-0.8)×(1.1-1.6) μm。
b、菌落形态特性
NFB琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形（30℃，生长48小时），表面光滑呈粘液状，边缘整齐，透明，菌落直径3-7毫米。最适生长温度是28-37℃及最佳生长pH值6-8。
c、生理生化特性
兼性厌氧，能够以D-葡萄糖，麦芽糖，D-甘露糖，α-D-乳糖，吐温40，吐温80，D-半乳糖， L-果糖，D-果糖，甘露醇，山梨醇， 氨基乙醇，山梨糖醇，α-酮戊二酸，羟基苯乙酸，葡萄糖酸钠，柠檬酸钠，琥珀酸钠，脱氧胆酸钠，乳酸钠，乌头酸，苹果酸，γ-氨基丁酸，甘油，半乳糖醛酸盐， N-乙酰葡萄糖胺， L-谷氨酸， D-丙氨酸，鸟氨酸盐酸盐，苏氨酸，脯氨酸，组氨酸， L-白氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸作为唯一碳源的培养基上生长；不能在以糊精，淀粉， L-阿拉伯糖，D-阿拉伯糖，蔗糖，山梨糖，密二糖，龙胆二糖，D-纤维二糖，棉子糖，L-鼠李糖，D-木糖，木糖，菊糖，松三糖，松二糖，D-核糖，塔格糖，海藻糖，L-阿糖醇，D-阿糖醇，木糖醇，己六醇，肌醇，赤藻糖醇，半乳糖醇，侧金盏花醇，甲酸钠，乙酸钠，丙酸钙，丙二酸钙，丙酮酸钠，草酸钠，香草酸，葵二酸，苯甲酸钠，马尿酸钠，水杨酸钠，酒石酸钾钠，衣康酸，苦杏仁苷，肌苷，尿苷，水杨苷，尿素，羟甲基纤维素，D-葡萄糖醛酸盐，丁二胺，L-谷胺酰氨，L-丙氨酸，甘氨酸，赖氨酸，色氨酸，缬氨酸，精氨酸，胱氨酸，L-羟脯氨酸，甲硫氨酸，为碳源的培养基上生长。pH生长范围较广，可耐pH3-pH8；耐NaCl的浓度可达4%；对300μg/mL氨苄青霉素、链霉素、四环素、红霉素及50μg/mL的氯霉素均具有耐受性；而5μg/mL的卡拉霉素、庆大霉素便能抑制该菌株的生长。
该菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明具有高效固氮酶活性菌株FZJG415的分子分类地位的确定：
采用细菌16S rRNA基因通用引物25F和1492R进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定，将获得的16S rDNA序列输入GenBank进行比对，初步确定本发明的菌株FZJG415在分类学中的种、属的位置。结果发现本发明的菌株fzg415，与产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum) 模式菌株ATCC29707相似性为96.2%。结合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列分析，本发明的产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)应归属于产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)。
本发明菌种的分离纯化方法如下：
将生长于福建农林大学菌草所基地巨菌草的根用蒸馏水洗净，剪下长度3-5cm根置于灭菌的培养皿中，用3%的双氧水(H2O2)浸泡4min（以除去根、茎、叶表面的腐烂物质），无菌水洗涤一次，再用70%乙醇浸泡5min，再用0.1%的HgCl2浸泡3min，无菌水洗涤7次，每次5-10 min，并将最后一次洗涤液涂布于固体培养基，以检测消毒是否彻底。将表面消毒完全的根用灭菌剪刀剪碎，分别用灭菌镊子夹入到3支装有NFB半固体培养基的试管中，胶塞密封后，至于28℃的细菌培养箱内进行培养。待试管中长出菌体后，向管内注入1/10体积10%乙炔气体（终浓度为1%），24 h后，测定固氮酶活性（乙炔还原法）。将具有固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，以检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态及确定纯化与否。纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃保存。
NFB培养基构成: malic acid(苹果酸) 5.0 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl2 0.02 g/L，0.5% bromthymol blue 2.0 mL/L(先溶解在0.2N KOH溶液中)，vitamin solution(维生素液) 1.0 mL/L，micronutrient solution(微量元素液) 2.0 mL/L，1.64% Fe-EDTA solution 4.0 mL/L，KOH 4.5 g/L，pH=6.8。其中vitamin solution(维生素液)组成为：biotin(生物素) 100.0 mg/L，pyridoxol-HCl(盐酸吡哆醇，维生素B6) 200.0 mg/L; micronutrient solution(微量元素液)组成为：CuSO40.4 g/L，ZnSO4·7H2O 0.12 g/L，H2BO3 1.4 g/L, Na2MoO4·2H2O 1.0 g/L，MnSO4 1.5 g/L(固体培养基中加入1.7%的琼脂，半固体培养基中加入0.15－0.25%的琼脂)。
本发明的菌种可作为接种剂以促进水稻及禾本科作物生长。如可将分离纯化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，菌数达2.6×108，CFU.mL-1，用泥炭作载体。将产脂固氮螺菌液与泥炭（2:1）混合，制备成菌数达1－2×108 CFU.g-1的菌剂。
（三）接种效果
本发明为一株具有高效固氮酶活性的产脂固氮螺菌。它来源于福建农林大学菌草所基地巨菌草根部，能够固定空气中的氮气，对水稻具有明显的促生长作用。
附图说明
图1接种产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum，FZJG415)促进水稻生长，
CK为未接种产脂固氮螺菌水稻苗，FZJG415为接种产脂固氮螺菌菌株FZJG415。
具体实施方式
通过下面给出的本发明的具体接种例可以进一步清楚地理解本发明。应理解此接种例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
菌株的分离鉴定的过程如下：将采集的生长于福建农林大学菌草所基地巨菌草的新鲜根样本用蒸馏水洗净，然后剪下根、茎、叶并分别置于已灭菌的三个培养皿中，用3%的双氧水(H2O2)浸泡4min以除去根、茎、叶表面的腐烂物质，无菌水洗涤一次，再用0.1%的升汞(HgCl2)浸泡5min，无菌水中振动洗涤5次，每次5-8min。将表面消毒完全的根、茎、叶用已灭菌手术刀切碎，分别接种到三支装有5ml NFB半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于28℃的人工培养箱内进行培养。整个操作均在无菌条件下完成。待长出菌体后，向管内注入1/10体积10%乙炔气体（终浓度为1％），在相同条件下再培养24 h，用乙炔还原法测定其固氮酶活性。将具有高固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态，并确定已纯化。
实施例2
将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，培养得到的培养液与泥炭以1:2重量比混合(如1升培养液混合2公斤泥炭)制成固氮螺菌－泥炭接种剂。将固氮螺菌－泥炭接种剂与水稻种子1：1拌种后播种。30天后与未接种的对照相比，水稻的叶长、根长、鲜重、根重都达到了显著差异，对水稻有明显的促生作用。其中叶长增加了21.2%，根增长了32.5%，根重增加了122.2%，鲜重增加了150.9%，干重增加了13.4%（表1），促水稻生长效果见图1。
表1菌株fzg415接种水稻后的促生效果
序列表
<110> 福建农林大学
<120> SEQ 1
<130> 一株产脂固氮螺菌及其应用
<160> 1
<170> Patent In version 1.0
<210> 1
<211> 1437
<212> rRNA
<213> Azospirillum lipoferum
<400> 1
1 GCTGGCGGCA TGCCTAACAC ATGCAAGTCG AACGAAGGCT TCGGCCTTAG TGGCGCACGG
61 GTGAGTAACA CGTGGGAACC TGCCTTTCGG TTCGGAATAA CGTCTGGAAA CGGACGCTAA
121 CACCGGATAC GTCCTTCGGG AGAAAGTTTA CGCCGAGAGA GGGGCCCGCG TCGGATTAGG
181 TAGTTGGTGA GGTAACGGCT CACCAAGCCG ACGATCCGTA GCTGGTCTGA GAGGATGATC
241 AGCCACACTG GGACTGAGAC ACGGCCCAGA CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT
301 GGACAATGGG CGGAAGCCTG ATCCAGCAAT GCCGCGTGAG TGATGAAGGC CTTAGGGTTG
361 TAAAGCTCTT TCGCACGCGA CGATGATGAC GGTAGCGTGA GAAGAAGCCC CGGCTAACTT
421 CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGAAGGGG GCTAGCGTTG TTCGGAATTA CTGGGCGTAA
481 AGGGCGCGTA GGCGGCCCGA TCAGTCAGAA GTGAAAGCCC CGGGCTCAAC CTGGGAACCG
541 CTTTTGATAC TGTCGGGCTT GAGTTCCGGA GAGGATGGTG GAATTCCCAG TGTAGAGGTG
601 AAATTCGTAG ATATTGGGAA GAACACCGGT GGCGAAGGCG GCCATCTGGA CGGACACTGA
661 CGCTGAGGCG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT
721 AAACGATGAA TGCTAGACGT CGGGGCGCAT GCGCTTCGGT GTCGCCGCTA ACGCATTAAG
781 CATTCCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGT TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC
841 ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA AGCAACGCGC AGAACCTTAC CACCCTTGAC
901 ATGTCCACTA TGGGCTTCAG AGATGAGGTC CTTCGGTTCG GCCGGGTGGA ACACAGGTGC
961 TGCATGGCTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGGT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA
1021 CCCCTACCGT CAGTTGCCAT CATTCAGTTG GGCACTCTGG TGGAACCGCC GGTGACAAGC
1081 CGGAGGAAGG CGGGGATGAC GTCAAGTCCT CATGGCCCTT ATGGGTTGGG CTACACACGT
1141 GCTACAATGG CGGTGACAGT GGGAAGCGAA GTCGCGAGAT GGAGCCAATC CCCAAAAGCC
1201 GTCTCAGTTC GGATCGTACT CTGCAACTCG AGTGCGTGAA GTTGGAATCG CTAGTAATCG
1261 CGGATCAGCA CGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA
1321 TGGGAGTTGG TTTTACCCGA AGGTGGTGCG CTAACCCGGC AACGGGAGGC AGCCAACCAC
1381 GGTAAGGTCA GCGACTGGGG TGAAGTCGTA ACAAGGTAGC CGTAGGGGAA CCTGCGG

Claims (3)

1.一种产脂固氮螺菌，其特征在于：所述的菌为产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)FZJG415，该菌株已于2016年1月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.12060。
2.一种如权利要求1所述的产脂固氮螺菌在水稻促生上的应用。
3.一种如权利要求1所述的产脂固氮螺菌在制备水稻接种剂上的应用。
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