CN104593398A - 一种高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β-丙氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工程菌及其在生产β-丙氨酸中的应用。本发明提供的工程菌,其构建方法依次包括如下步骤:(1)将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点,得到的重组质粒pET30-panDB;所述目的蛋白如序列表的序列6所示;(2)将步骤(1)得到的重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21(DE3),得到所述工程菌。本发明还保护一种生产β-丙氨酸的方法,以L-天冬氨酸为底物,采用所述工程菌进行生物转化,得到β-丙氨酸。采用本发明提供的方法制备β-丙氨酸,无需添加诱导剂,整个过程无需高温、高压,同时具有条件温和、操作简单、对环境友好等优点,已达工业化应用水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β-丙氨酸中的应用。
背景技术
β-丙氨酸(β-alanine),即3-氨基丙酸(3-aminopropanoic),是自然界中唯一存在的β型非蛋白氨基酸,β-丙氨酸是一种重要的生化原料,可以用于合成泛酸、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等,在医药、饲料和食品领域有着十分广泛的应用。
目前β-丙氨酸的合成方法主要有化学法和生物法。
化学法合成β丙氨酸主要有丙烯腈法、丙烯酸法及琥珀酰亚胺降解法。丙烯腈法使用丙烯腈和氨水氨化反应生成β-氨基丙腈,再在酸性或碱性条件下水解即得,该方法原料易得、成本较低,但有副反应,且水解过程中生成大量无机盐,产物较难纯化。丙烯酸法使用丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸盐与氨水氨化反应,在较高的温度和压力条件下得到β-丙氨酸,合成工艺简单、收率高,但却需要高温高压。琥珀酰亚胺法是指将琥珀酰亚胺在碱性氯酸钠溶液中发生降解得到β-丙氨酸,该法的工艺条件要求苛刻,原料成本较高且易发生其它副反应,不适合工业化。总之,化学合成法的原料、中间体有毒,同时反应条件比较苛刻,要求高温高压,对环境污染严重。
生物法合成β-丙氨酸,国内相关报道的主要有两种,一种是使用藤黄八叠球菌将丙烯酸转化为β-丙氨酸(转化率为54%),另一种是使用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主,表达来源于大肠杆菌的L-天冬氨酸α羧化酶,最终产β-丙氨酸2.94g/L,远远达不到工业化的水平。
发明内容
本发明通过筛选不同来源的L-天冬氨酸α羧化酶,构建了基因工程菌,通过酶活比较,提供了一种高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β-丙氨酸中的应用。
本发明提供的工程菌,其构建方法依次包括如下步骤:(1)将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点,得到的重组质粒pET30-panDB;所述目的蛋白如序列表的序列6所示;(2)将步骤(1)得到的重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21(DE3),得到所述工程菌。
所述目的蛋白的编码基因具体可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。
所述重组质粒pET30-panDB具体可为在载体pET30的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入所述目的蛋白的编码基因得到的重组质粒。
本发明还保护所述工程菌在生产β-丙氨酸中的应用。所述应用具体可为以L-天冬氨酸为底物生产β-丙氨酸。
本发明还保护一种重组质粒,是将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点,得到的重组质粒pET30-panDB;所述目的蛋白如序列表的序列6所示。所述目的蛋白的编码基因具体可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。本发明还保护所述重组质粒在生产β-丙氨酸中的应用。
本发明还保护一种生产β-丙氨酸的方法,包括如下步骤:以L-天冬氨酸为底物,采用所述工程菌进行生物转化,得到β-丙氨酸。所述生物转化的条件可为37℃、450rpm。所述生物转化的时间具体可为1-15小时。所述的方法中,所述工程菌通过如下方法扩大培养:①挑取工程菌的单菌落,接种于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养12小时;②取步骤①得到的整个培养体系,接种于100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,30℃、200rpm振荡培养12h,离心收集菌体。
本发明中通过筛选不同来源的L-天冬氨酸α羧化酶,提供了一株高产β-丙氨酸基因工程菌,该菌株可以稳定的高表达L-天冬氨酸α羧化酶,将L-天冬氨酸转化成β-丙氨酸,酶活达2.09U/mL,转化15h后β-丙氨酸的产量为178g/L,转化率达99%。
采用本发明提供的方法制备β-丙氨酸,无需添加诱导剂,整个过程无需高温、高压,同时具有条件温和、操作简单、对环境友好等优点,已达工业化应用水平。
附图说明
图1为标准品溶液的HPLC图谱。
图2为工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁进行步骤3得到的上清液的酶活。
图3为生物转化过程中转化体系中生成的β-丙氨酸浓度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
载体pET-30a(+):Novagen公司。大肠杆菌BL21(DE3):Novagen公司。L-天冬氨酸标准品:生工生物工程(上海)股份有限公司,产品编号AB0091CAS(56-84-8)。β-丙氨酸标准品:生工生物工程(上海)股份有限公司,产品编号A6168CAS(107-95-9)。
实施例1、重组质粒和工程菌的构建
序列表的序列1所示的双链DNA分子即大肠杆菌BL21(DE3)中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。序列表的序列2所示的双链DNA分子即谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。序列表的序列3所示的双链DNA分子即结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。序列表的序列4所示的双链DNA分子即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。
一、工程菌甲的构建
1、重组质粒pET30-panDE的构建
(1)合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
(2)以步骤(1)合成的双链DNA分子为模板,用Ec-pand-for和Ec-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
Ec-pand-for:5’-GGCTTCCATATGATTCGCACGATGCTGC-3’;
Ec-pand-rev:5’-TTACGGGGTACCTCAAGCAACCTGTACCGGAA-3’。
(3)用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切步骤(2)的PCR扩增产物,回收酶切产物。
(4)用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切载体pET-30a(+),回收约5300bp的载体骨架。
(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接,得到重组质粒pET30-panDE。根据测序结果对重组质粒pET30-panDE进行结构描述如下:在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第4至381所示的双链DNA分子。
2、工程菌甲的构建
将重组质粒pET30-panDE导入大肠杆菌BL21(DE3),得到的重组菌即为工程菌甲,又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDE。
二、工程菌乙的构建
1、重组质粒pET30-panDC的构建
(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
(2)以步骤(1)合成的双链DNA分子为模板,用cg-pand-for和cg-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
cg-pand-for:5’-GGCTTCCATATGCTGCGTACCATCCTG-3’;
cg-pand-rev:5’-TTACGGCTCGAGTCAAATACTACGGCTCGTCAGC-3’。
(3)用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切步骤(2)的PCR扩增产物,回收酶切产物。
(4)用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切载体pET-30a(+),回收约5300bp的载体骨架。
(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接,得到重组质粒pET30-panDC。根据测序结果对重组质粒pET30-panDC进行结构描述如下:在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第4至411所示的双链DNA分子。
2、工程菌乙的构建
将重组质粒pET30-panDC导入大肠杆菌BL21(DE3),得到的重组菌即为工程菌乙,又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDC。
三、工程菌丙的构建
1、重组质粒pET30-panDM的构建
(1)合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。
(2)以步骤(1)合成的双链DNA分子为模板,用mt-pand-for和mt-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
mt-pand-for:5’-GGCTTCCATATGTTACGGACGATGCTG-3’;
mt-pand-rev:5’-TTACGGGGTACCCTATCCCACACCGAGCCG-3’。
(3)用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切步骤(2)的PCR扩增产物,回收酶切产物。
(4)用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切载体pET-30a(+),回收约5300bp的载体骨架。
(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接,得到重组质粒pET30-panDM。根据测序结果对重组质粒pET30-panDM进行结构描述如下:在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列3自5’末端第4至420所示的双链DNA分子。
2、工程菌丙的构建
将重组质粒pET30-panDM导入大肠杆菌BL21(DE3),得到的重组菌即为工程菌丙,又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDM。
四、工程菌丁的构建
1、重组质粒pET30-panDB的构建
(1)合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
(2)以步骤(1)合成的双链DNA分子为模板,用bs-pand-for和bs-217-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
bs-pand-for:5’-GGCTTCCATATGTATCGAACAATGATGAGCG-3’;
bs-217-rev:5’-TGCACCGTTTAAGCAATGACGCCGCTTCCC-3’。
(3)以步骤(1)合成的双链DNA分子为模板,用bs-217-for和bs-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
bs-217-for:5’-GGGAAGCGGCGTCATTGCTTAAACGGTGCA-3’;
bs-pand-rev:5’-TTACGGGGTACC CTACAAAATTGTACGGGCTGGT-3’。
(4)同时将步骤(2)得到的PCR扩增产物和步骤(3)得到的PCR扩增产物作为模板,用bs-pand-for和bs-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
(5)用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切步骤(4)的PCR扩增产物,回收酶切产物。
(6)用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切载体pET-30a(+),回收约5300bp的载体骨架。
(7)将步骤(5)的酶切产物和步骤(6)的载体骨架连接,得到重组质粒pET30-panDB。根据测序结果对重组质粒pET30-panDB进行结构描述如下:在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列5自5’末端第4至384所示的双链DNA分子(序列5与序列4的差别仅在于将序列4自5’末端第207位核苷酸由A突变为了C,以去除序列中的NdeⅠ酶切识别序列;序列表的序列4和序列5均编码序列表的序列6所示的蛋白质)。
2、工程菌丁的构建
将重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21(DE3),得到的重组菌即为工程菌丁,又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDB。
实施例2、基因工程菌酶活检测
分别将实施例1制备的工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁进行如下操作:
1、挑取工程菌的单菌落,接种于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养12小时。
2、取步骤1得到的整个培养体系,接种于100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,30℃、200rpm振荡培养12h。
3、步骤2的终止时刻,取2mL培养体系(即OD600nm=3的菌液),加入1mL pH8.0、0.01mol/L的磷酸缓冲液,混匀,然后进行超声波破碎(功率200W,工作3秒停3秒,总时间为4min),10000rpm离心1min,取上清液。
4、取500μL步骤3得到的上清液,加入536μL60g/L的L-天冬氨酸溶液(L-天冬氨酸溶液的制备方法:取L-天冬氨酸,加入水,加入NaOH调整pH为7.0以促进L-天冬氨酸溶解),37℃静置反应2h,12000rpm离心1min,取上清液。
5、HPLC检测
取步骤4得到的上清液,用蒸馏水稀释至50倍体积,得到稀释液,稀释液衍生化后进行HPLC检测。
衍生化的方法:取300μL稀释液,加入360μL pH9.5、0.05mol/L的硼酸钠缓冲液,然后再加入240μL衍生剂,混匀,室温反应两分钟后进行HPLC检测。衍生剂:由1.3g邻苯二甲醛、0.59g N-乙酰半胱氨酸、20mL无水乙醇和78.11mL pH9.5、0.05mol/L的硼酸缓冲液组成。
HPLC检测采用Agilent色谱柱(Eclipse XDB-C18,5μm,4.6×150mm),流动相为2.871g/L的乙酸钠水溶液,流速为1mL/min,在334nm(紫外)进行实时监测。
将标准品溶液(标准品溶液即含有0.4g/L L-天冬氨酸和0.3g/Lβ-丙氨酸的溶液;标准品溶液的制备方法:取L-天冬氨酸标准品和β-丙氨酸标准品,加入水,加入NaOH调整pH为7.0以促进L-天冬氨酸和β-丙氨酸溶解)按相同的方法进行衍生化后进行HPLC检测,HPLC图谱见图1(图1中,纵坐标的单位是mAU)。L-天冬氨酸标准品的出峰时间为1.409min,β-丙氨酸标准品的出峰时间为2.910min。
β-丙氨酸的标准曲线方程为y=10437x,y代表β-丙氨酸的峰面积,x代表β-丙氨酸的浓度(g/L)。L-天冬氨酸的标准曲线方程为y=9884x,y代表L-天冬氨酸的峰面积,x代表L-天冬氨酸的浓度(g/L)。
每分钟生成1μmol产物(β-丙氨酸)所需要的酶量定义为一个酶活单位。
工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁进行步骤3得到的上清液的酶活依次见图2(设置三次重复实验,每次重复实验中含有10个重复处理,结果取平均值),工程菌丁得到的上清液的酶活最高,为2.09U/mL。
实施例3、全细胞转化
1、挑取实施例1制备的工程菌丁的单菌落,接种于100mL LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养12小时。
2、取步骤1得到的整个培养体系,接种于1000mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,30℃、200rpm振荡培养12h。
3、取步骤2得到的整个培养体系,9000rpm离心10min,收集菌体。
4、取全部步骤3得到的菌体,用300mL蒸馏水悬浮,加入L-天冬氨酸,37℃、450rpm生物转化15小时,发酵过程中,每小时取样一次,采用实施例2中的方法通过HPLC检测β-丙氨酸的浓度。
结果见图3。完成发酵时,发酵体系中β-丙氨酸的浓度达178g/L,转化率达99%。
Claims (9)
1.一种工程菌,其构建方法依次包括如下步骤:
(1)将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点,得到的重组质粒pET30-panDB;所述目的蛋白如序列表的序列6所示;
(2)将步骤(1)得到的重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21(DE3),得到所述工程菌。
2.如权利要求1所述的工程菌,其特征在于:所述目的蛋白的编码基因如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。
3.一种重组质粒,是将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点,得到的重组质粒pET30-panDB;所述目的蛋白如序列表的序列6所示。
4.如权利要求3所述的重组质粒,其特征在于:所述目的蛋白的编码基因如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。
5.权利要求1或2所述的工程菌,或,权利要求3或4所述的重组质粒,在生产β-丙氨酸中的应用。
6.一种生产β-丙氨酸的方法,包括如下步骤:以L-天冬氨酸为底物,采用权利要求1或2所述的工程菌进行生物转化,得到β-丙氨酸。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于:所述生物转化的条件为37℃、450rpm。
8.如权利要求6或7所述的方法,其特征在于:所述生物转化的时间为1-15小时。
9.如权利要求6至8中任一所述的方法,其特征在于:权利要求1或2所述的工程菌通过如下方法扩大培养:①挑取工程菌的单菌落,接种于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养12小时;②取步骤①得到的整个培养体系,接种于100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,30℃、200rpm振荡培养12h,离心收集菌体。
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C06 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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