CN104593398B - 一种高L‑天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β‑丙氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工程菌及其在生产β‑丙氨酸中的应用。本发明提供的工程菌，其构建方法依次包括如下步骤：（1）将目的蛋白的编码基因插入载体pET‑30a(+)的多克隆位点，得到的重组质粒pET30‑panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示；（2）将步骤（1）得到的重组质粒pET30‑panDB导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到所述工程菌。本发明还保护一种生产β‑丙氨酸的方法，以L‑天冬氨酸为底物，采用所述工程菌进行生物转化，得到β‑丙氨酸。采用本发明提供的方法制备β‑丙氨酸，无需添加诱导剂，整个过程无需高温、高压，同时具有条件温和、操作简单、对环境友好等优点，已达工业化应用水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β-丙氨酸中的应用。
背景技术
β-丙氨酸（β-alanine），即3-氨基丙酸（3-aminopropanoic），是自然界中唯一存在的β型非蛋白氨基酸，β-丙氨酸是一种重要的生化原料，可以用于合成泛酸、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等，在医药、饲料和食品领域有着十分广泛的应用。
目前β-丙氨酸的合成方法主要有化学法和生物法。
化学法合成β丙氨酸主要有丙烯腈法、丙烯酸法及琥珀酰亚胺降解法。丙烯腈法使用丙烯腈和氨水氨化反应生成β-氨基丙腈，再在酸性或碱性条件下水解即得，该方法原料易得、成本较低，但有副反应，且水解过程中生成大量无机盐，产物较难纯化。丙烯酸法使用丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸盐与氨水氨化反应，在较高的温度和压力条件下得到β-丙氨酸，合成工艺简单、收率高，但却需要高温高压。琥珀酰亚胺法是指将琥珀酰亚胺在碱性氯酸钠溶液中发生降解得到β-丙氨酸，该法的工艺条件要求苛刻，原料成本较高且易发生其它副反应，不适合工业化。总之，化学合成法的原料、中间体有毒，同时反应条件比较苛刻，要求高温高压，对环境污染严重。
生物法合成β-丙氨酸，国内相关报道的主要有两种，一种是使用藤黄八叠球菌将丙烯酸转化为β-丙氨酸（转化率为54%），另一种是使用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主，表达来源于大肠杆菌的L-天冬氨酸α羧化酶，最终产β-丙氨酸2.94g/L，远远达不到工业化的水平。
发明内容
本发明通过筛选不同来源的L-天冬氨酸α羧化酶，构建了基因工程菌，通过酶活比较，提供了一种高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β-丙氨酸中的应用。
本发明提供的工程菌，其构建方法依次包括如下步骤：（1）将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点，得到的重组质粒pET30-panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示；（2）将步骤（1）得到的重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到所述工程菌。
所述目的蛋白的编码基因具体可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。
所述重组质粒pET30-panDB具体可为在载体pET30的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入所述目的蛋白的编码基因得到的重组质粒。
本发明还保护所述工程菌在生产β-丙氨酸中的应用。所述应用具体可为以L-天冬氨酸为底物生产β-丙氨酸。
本发明还保护一种重组质粒，是将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点，得到的重组质粒pET30-panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示。所述目的蛋白的编码基因具体可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。本发明还保护所述重组质粒在生产β-丙氨酸中的应用。
本发明还保护一种生产β-丙氨酸的方法，包括如下步骤：以L-天冬氨酸为底物，采用所述工程菌进行生物转化，得到β-丙氨酸。所述生物转化的条件可为37℃、450rpm。所述生物转化的时间具体可为1-15小时。所述的方法中，所述工程菌通过如下方法扩大培养：①挑取工程菌的单菌落，接种于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12小时；②取步骤①得到的整个培养体系，接种于100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，30℃、200rpm振荡培养12h，离心收集菌体。
本发明中通过筛选不同来源的L-天冬氨酸α羧化酶，提供了一株高产β-丙氨酸基因工程菌，该菌株可以稳定的高表达L-天冬氨酸α羧化酶，将L-天冬氨酸转化成β-丙氨酸，酶活达2.09U/mL，转化15h后β-丙氨酸的产量为178g/L，转化率达99%。
采用本发明提供的方法制备β-丙氨酸，无需添加诱导剂，整个过程无需高温、高压，同时具有条件温和、操作简单、对环境友好等优点，已达工业化应用水平。
附图说明
图1为标准品溶液的HPLC图谱。
图2为工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁进行步骤3得到的上清液的酶活。
图3为生物转化过程中转化体系中生成的β-丙氨酸浓度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
载体pET-30a(+)：Novagen公司。大肠杆菌BL21(DE3)：Novagen公司。L-天冬氨酸标准品：生工生物工程（上海）股份有限公司，产品编号AB0091CAS(56-84-8)。β-丙氨酸标准品：生工生物工程（上海）股份有限公司，产品编号A6168CAS(107-95-9)。
实施例1、重组质粒和工程菌的构建
序列表的序列1所示的双链DNA分子即大肠杆菌BL21(DE3)中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。序列表的序列2所示的双链DNA分子即谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。序列表的序列3所示的双链DNA分子即结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。序列表的序列4所示的双链DNA分子即枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中L-天冬氨酸α-羧化酶的编码基因。
一、工程菌甲的构建
1、重组质粒pET30-panDE的构建
（1）合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
（2）以步骤（1）合成的双链DNA分子为模板，用Ec-pand-for和Ec-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
Ec-pand-for：5’-GGCTTCCATATGATTCGCACGATGCTGC-3’；
Ec-pand-rev：5’-TTACGGGGTACCTCAAGCAACCTGTACCGGAA-3’。
（3）用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切步骤（2）的PCR扩增产物，回收酶切产物。
（4）用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切载体pET-30a(+)，回收约5300bp的载体骨架。
（5）将步骤（3）的酶切产物和步骤（4）的载体骨架连接，得到重组质粒pET30-panDE。根据测序结果对重组质粒pET30-panDE进行结构描述如下：在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第4至381所示的双链DNA分子。
2、工程菌甲的构建
将重组质粒pET30-panDE导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到的重组菌即为工程菌甲，又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDE。
二、工程菌乙的构建
1、重组质粒pET30-panDC的构建
（1）合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
（2）以步骤（1）合成的双链DNA分子为模板，用cg-pand-for和cg-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
cg-pand-for：5’-GGCTTCCATATGCTGCGTACCATCCTG-3’；
cg-pand-rev：5’-TTACGGCTCGAGTCAAATACTACGGCTCGTCAGC-3’。
（3）用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切步骤（2）的PCR扩增产物，回收酶切产物。
（4）用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切载体pET-30a(+)，回收约5300bp的载体骨架。
（5）将步骤（3）的酶切产物和步骤（4）的载体骨架连接，得到重组质粒pET30-panDC。根据测序结果对重组质粒pET30-panDC进行结构描述如下：在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第4至411所示的双链DNA分子。
2、工程菌乙的构建
将重组质粒pET30-panDC导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到的重组菌即为工程菌乙，又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDC。
三、工程菌丙的构建
1、重组质粒pET30-panDM的构建
（1）合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。
（2）以步骤（1）合成的双链DNA分子为模板，用mt-pand-for和mt-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
mt-pand-for：5’-GGCTTCCATATGTTACGGACGATGCTG-3’；
mt-pand-rev：5’-TTACGGGGTACCCTATCCCACACCGAGCCG-3’。
（3）用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切步骤（2）的PCR扩增产物，回收酶切产物。
（4）用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切载体pET-30a(+)，回收约5300bp的载体骨架。
（5）将步骤（3）的酶切产物和步骤（4）的载体骨架连接，得到重组质粒pET30-panDM。根据测序结果对重组质粒pET30-panDM进行结构描述如下：在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列3自5’末端第4至420所示的双链DNA分子。
2、工程菌丙的构建
将重组质粒pET30-panDM导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到的重组菌即为工程菌丙，又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDM。
四、工程菌丁的构建
1、重组质粒pET30-panDB的构建
（1）合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
（2）以步骤（1）合成的双链DNA分子为模板，用bs-pand-for和bs-217-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
bs-pand-for：5’-GGCTTCCATATGTATCGAACAATGATGAGCG-3’；
bs-217-rev：5’-TGCACCGTTTAAGCAATGACGCCGCTTCCC-3’。
（3）以步骤（1）合成的双链DNA分子为模板，用bs-217-for和bs-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
bs-217-for：5’-GGGAAGCGGCGTCATTGCTTAAACGGTGCA-3’；
bs-pand-rev：5’-TTACGGGGTACC CTACAAAATTGTACGGGCTGGT-3’。
（4）同时将步骤（2）得到的PCR扩增产物和步骤（3）得到的PCR扩增产物作为模板，用bs-pand-for和bs-pand-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
（5）用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切步骤（4）的PCR扩增产物，回收酶切产物。
（6）用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切载体pET-30a(+)，回收约5300bp的载体骨架。
（7）将步骤（5）的酶切产物和步骤（6）的载体骨架连接，得到重组质粒pET30-panDB。根据测序结果对重组质粒pET30-panDB进行结构描述如下：在载体pET-30a(+)的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列5自5’末端第4至384所示的双链DNA分子(序列5与序列4的差别仅在于将序列4自5’末端第207位核苷酸由A突变为了C，以去除序列中的NdeⅠ酶切识别序列；序列表的序列4和序列5均编码序列表的序列6所示的蛋白质)。
2、工程菌丁的构建
将重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到的重组菌即为工程菌丁，又称工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panDB。
实施例2、基因工程菌酶活检测
分别将实施例1制备的工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁进行如下操作：
1、挑取工程菌的单菌落，接种于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12小时。
2、取步骤1得到的整个培养体系，接种于100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，30℃、200rpm振荡培养12h。
3、步骤2的终止时刻，取2mL培养体系（即OD600nm=3的菌液），加入1mL pH8.0、0.01mol/L的磷酸缓冲液，混匀，然后进行超声波破碎（功率200W，工作3秒停3秒，总时间为4min），10000rpm离心1min，取上清液。
4、取500μL步骤3得到的上清液，加入536μL60g/L的L-天冬氨酸溶液（L-天冬氨酸溶液的制备方法：取L-天冬氨酸，加入水，加入NaOH调整pH为7.0以促进L-天冬氨酸溶解），37℃静置反应2h，12000rpm离心1min，取上清液。
5、HPLC检测
取步骤4得到的上清液，用蒸馏水稀释至50倍体积，得到稀释液，稀释液衍生化后进行HPLC检测。
衍生化的方法：取300μL稀释液，加入360μL pH9.5、0.05mol/L的硼酸钠缓冲液，然后再加入240μL衍生剂，混匀，室温反应两分钟后进行HPLC检测。衍生剂：由1.3g邻苯二甲醛、0.59g N-乙酰半胱氨酸、20mL无水乙醇和78.11mL pH9.5、0.05mol/L的硼酸缓冲液组成。
HPLC检测采用Agilent色谱柱（Eclipse XDB-C18，5μm，4.6×150mm），流动相为2.871g/L的乙酸钠水溶液，流速为1mL/min，在334nm（紫外）进行实时监测。
将标准品溶液（标准品溶液即含有0.4g/L L-天冬氨酸和0.3g/Lβ-丙氨酸的溶液；标准品溶液的制备方法：取L-天冬氨酸标准品和β-丙氨酸标准品，加入水，加入NaOH调整pH为7.0以促进L-天冬氨酸和β-丙氨酸溶解）按相同的方法进行衍生化后进行HPLC检测，HPLC图谱见图1（图1中，纵坐标的单位是mAU）。L-天冬氨酸标准品的出峰时间为1.409min，β-丙氨酸标准品的出峰时间为2.910min。
β-丙氨酸的标准曲线方程为y=10437x，y代表β-丙氨酸的峰面积，x代表β-丙氨酸的浓度（g/L）。L-天冬氨酸的标准曲线方程为y=9884x，y代表L-天冬氨酸的峰面积，x代表L-天冬氨酸的浓度（g/L）。
每分钟生成1μmol产物（β-丙氨酸）所需要的酶量定义为一个酶活单位。
工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁进行步骤3得到的上清液的酶活依次见图2（设置三次重复实验，每次重复实验中含有10个重复处理，结果取平均值），工程菌丁得到的上清液的酶活最高，为2.09U/mL。
实施例3、全细胞转化
1、挑取实施例1制备的工程菌丁的单菌落，接种于100mL LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12小时。
2、取步骤1得到的整个培养体系，接种于1000mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，30℃、200rpm振荡培养12h。
3、取步骤2得到的整个培养体系，9000rpm离心10min，收集菌体。
4、取全部步骤3得到的菌体，用300mL蒸馏水悬浮，加入L-天冬氨酸，37℃、450rpm生物转化15小时，发酵过程中，每小时取样一次，采用实施例2中的方法通过HPLC检测β-丙氨酸的浓度。
结果见图3。完成发酵时，发酵体系中β-丙氨酸的浓度达178g/L，转化率达99%。
Claims (6)
1.一种工程菌，其构建方法依次包括如下步骤：
(1)将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点，得到的重组质粒pET30-panDB；所述目的蛋白的编码基因如序列表的序列5所示；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到所述工程菌。
2.权利要求1所述的工程菌，在生产β-丙氨酸中的应用。
3.一种生产β-丙氨酸的方法，包括如下步骤：以L-天冬氨酸为底物，采用权利要求1所述的工程菌进行生物转化，得到β-丙氨酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述生物转化的条件为37℃、450rpm。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述生物转化的时间为1-15小时。
6.如权利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于：权利要求1或2所述的工程菌通过如下方法扩大培养：①挑取工程菌的单菌落，接种于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12小时；②取步骤①得到的整个培养体系，接种于100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，30℃、200rpm振荡培养12h，离心收集菌体。
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