CN106755012B

CN106755012B - 一种内切β-1,3-葡聚糖酶编码基因及其酶和制备方法与应用

Info

Publication number: CN106755012B
Application number: CN201510843760.3A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 李悝悝; 王文霞; 谭海东; 张鑫
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2035-11-25
Also published as: CN106755012A

Abstract

本发明公开了一种来源于纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)的内切β‑1,3‑葡聚糖酶编码基因及其酶和制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该内切β‑1,3‑葡聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的内切β‑1,3‑葡聚糖酶，能直接高效降解固体Curdlan(可德兰多糖)。本发明还提供了一种防治动植物病害的生防菌剂——内切β‑1,3‑葡聚糖酶，属于生物防治领域，有望成为一种新型的生物农药。本发明提供的内切β‑1,3‑葡聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及葡寡糖制备等领域。

Description

一种内切β-1,3-葡聚糖酶编码基因及其酶和制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种内切β-1,3-葡聚糖酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该内切β-1,3-葡聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解和动植物病害防治方面的应用。本发明提供的内切β-1,3-葡聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领域。

背景技术

β-1,3-葡寡糖在营养与保健、疾病诊断与防治、畜牧养殖、植物生长调节及诱导植物抗性等方面有着巨大的应用潜力，功能性寡糖的开发利用也已应用于食品、医药、饲料和农业等各个领域。相对于其它β-葡聚糖，如昆布多糖、酵母多糖等，可德兰多糖生成和提取的成本更低，以可德兰多糖为原料制备β-葡寡糖具有更大的经济价值。

可德兰多糖，是迄今为止世界上发现的唯一一种不含分支的β-1,3-葡聚糖，为水不溶性葡聚糖，其分子式可表示为(C₆H₁₀O₅)_n，CAS号为54724-00-4，是葡糖糖残基通过β-(1-3)糖苷键连接而成的线性分子，平均聚合度约为450，分子量在44000-77000。可德兰多糖是一种白色轻质粉末，对光、热、空气均稳定，可常温长期保存而不改变粉末的流动性和凝胶的强度。不溶于水、醇类及许多有机溶剂，易分散在冷水中，经过高速搅拌处理形成更为均质的分散液，可溶于能破环氢键的物质，如：甲酸、pH12以上的碱性溶液、二甲基亚砜等。然而，其水溶性差的特点极大限制了其在农业和植物等领域更为广泛的应用。

研究表明，内切β-1,3-葡聚糖酶是降解葡聚糖制备寡糖的有效工具，广泛存在于高等植物、细菌和真菌中。根据底物特异性和水解模式的差异，β-1,3-葡聚糖酶可分为内切β-1,3-葡聚糖酶(酶学编号EC3.2.1.6和EC3.2.1.39)和外切β-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.58)两类。而根据催化区域氨基酸保守序列的差异，内切β-1,3-葡聚糖酶又可分类为不同的糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)家族，如GH16、64、81、128和132。但是目前针对内切β-1,3-葡聚糖酶纯化和性质表征的研究主要以水溶性β-1,3-葡聚糖作为底物(通常为来源于Laminaria digitata的昆布多糖)，对水不溶性底物具有亲和性的内切酶却鲜有报道。然而，能够高效降解水不溶性底物的内切β-1,3-葡聚糖酶不但对研究细胞壁结构具有重要帮助，而且对以水不溶性β-1,3-葡聚糖(如可德兰多糖)为原料制备具有较高生理活性的β-1,3-葡寡糖也具有重要的意义。但已报道的内切β-1,3-葡聚糖酶对可德兰多糖的降解活性均较弱，不适于大规模应用。因此，寻找一种能够降解不溶性可德兰多糖的葡聚糖酶是降低葡寡糖生产成本的有利途径。而由于β-1,3-葡聚糖酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高β-1,3-葡聚糖酶产量的一种有效措施。

动植物病害一直严重威胁着农畜业生产，人类防治动植物病害可以追溯到几千年前，过去使用的药剂多为植物性或无机化学农药。上世纪40年代初期，有机合成农药大量使用，虽然在保证农畜业稳定、高产方面起到重要作用，但是由于化学农药本身的缺点及长期不合理的使用，逐渐暴露出一些严重的问题，如抗药性、农药残留和病虫害再猖獗，即3R问题(Resistance、Residue、Resurgence)。3R问题的出现引起了人们的广泛关注，于是生物防治的研究开发应用被提到了议事日程，并得到各国政府的重视。从动植物病害防治的角度来讲，生物防治是利用生物活体或其代谢产物对有害生物进行防治。目前，国内外学者已筛选到许多有益的微生物，为动植物病害的生物防治提供了大量的可利用资源，并且许多生防菌剂已开发成为生防制剂，广泛用于生产。所以，基于生物防治的安全性和有效性，制备出高效的生防菌剂，将有利于更好的防治动植物病害，减少化学农药的污染。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型内切β-1,3-葡聚糖酶gluE在固体可德兰多糖降解中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种新型内切β-1,3-葡聚糖酶gluE作为生防菌剂在动植物病害防治方面的应用。

本发明所提供的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE，来源于土壤中分离纯化的纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobium cellulans，从中扩增出的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE编码基因(命名为gluE)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,3-葡聚糖酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-412或21-412位氨基酸残基序列，其中1-20位为含有His-Tag的载体氨基酸序列，21-406位为具有活性内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的氨基酸序列，407-412为His-Tag的氨基酸序列；

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第21-406位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有内切β-1,3-葡聚糖酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的gluE的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶gluE的方法，是将内切β-1,3-葡聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,3-葡聚糖酶。

上述内切β-1,3-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,3-葡聚糖酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride，Trichodermareesei，Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyx mori，Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的基因序列是通过降落PCR技术从纤维化纤维微细菌菌株(Cellulosimicrobium cellulans)中克隆得到。该基因编码区长1179bp，属于多糖裂解酶16家族。

本发明提供的内切β-1,3-葡聚糖酶在降解固体可德兰多糖中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂可德兰多糖的糖苷键，获得单糖或葡寡糖中应用；

2)与其他葡聚糖酶混合后，在协同断裂葡聚糖糖苷键方面应用。

可德兰多糖底物通过如下条件处理，可以提高酶的降解效率：

通过均质的方法，将水不溶性的可德兰多糖水溶液制备成均一的胶体-可德兰多糖：在低温条件下，0.1％-10％(w/v)可德兰多糖水溶液经1200bar，均质5次。

上述内切β-1,3-葡聚糖酶在对动植物病害的防治中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在抑制真菌、细菌的生长中应用；

2)在防治动植物生长过程中感染的有害菌中应用，上述有害菌为大肠杆菌或丁香假单胞杆菌。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE，可以直接降解固体可德兰多糖，以可德兰多糖为底物时，在50℃、pH4.6的条件下具有最佳酶活性，比活为26.11U/mg。

本发明所提供的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE在降解可德兰多糖时，通过对可德兰多糖进行高压均质，制备为胶体可德兰多糖，提高了内切β-1,3-葡聚糖酶gluE对水不溶性底物可德兰多糖的降解效率。多数β-1,3-葡聚糖酶具有水解昆布多糖的活力，对可德兰多糖的水解能力较弱。而本发明中提供的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE对可德兰多糖的水解能力却优于对昆布多糖的水解活性，解决了现有β-1,3-葡寡糖生产成本高的难题，具有重要的实用价值，可应用于大规模的工业化生产。

本发明提供的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE可以作为一种新的生防菌剂，对大肠杆菌BL21(DE3)的抑菌圈直径为1.65cm，对丁香假单胞菌番茄致病变种Pst DC3000的抑菌圈直径达到2.0cm。该生防菌剂为动植物病害的生物防治提供了一种新的高效生物农药，是一种很好的化学农药替代品。

本发明的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE可广泛应用农业、食品、饲料添加、医药及葡寡糖的制备等领域。

附图说明

图1：内切β-1,3-葡聚糖酶基因gluE琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：内切β-1,3-葡聚糖酶gluE表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-E.coli BL21(DE3)/pET28a-gluE未诱导菌体沉淀；泳道2-E.coli BL21(DE3)/pET28a-gluE诱导后菌体沉淀；泳道3-预染蛋白分子量标准；泳道4-gluE纯化蛋白。

图3：pH值对内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的影响曲线：A-gluE的最适反应pH值；B-gluE的pH值稳定性。

图4：温度对内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的影响曲线：A-gluE的最适反应温度；B-gluE的热稳定性。

图5：内切β-1,3-葡聚糖酶gluE对胶体-可德兰多糖的降解产物MALDI-TOF-MS图谱。

图6：内切β-1,3-葡聚糖酶gluE对有害微生物的抑制活性图：A-gluE对Pst DC3000的抑制活性；B-gluE对BL21(DE3)的抑制活性。

图7：内切β-1,3-葡聚糖酶gluE对不同处理可德兰多糖的活性比较。

具体实施方式

实施例1内切β-1,3-葡聚糖酶全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，LOT 00105781)操作步骤提取纤维化纤维微细菌的基因组DNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中内切β-1,3-葡聚糖酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物glu-F:5’-GATATACATATGGCRCCSGGSGACMTCSTSTGGTCSGACGAG-3’；glu-R:5’-GTATAACTCGAGGARSGTCCACTGCTGGKYGGTCGWGCCGTKGCA-3’，以提取的纤维化纤维微细菌的基因组DNA为模板，扩增编码内切β-1,3-葡聚糖酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：94℃ 2min，1个循环；98℃ 30s，68℃ 30s每个循环降0.5℃，72℃ 2min，30个循环；72℃ 5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的片段进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET28a上后测序。

实施例2内切β-1,3-葡聚糖酶基因序列分析

测序的结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，Vector NTI Suite 8.0软件进行多序列比对，分析序列信息。

获得的内切β-1,3-葡聚糖酶基因(命名为gluE)编码区长1179bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。gluE编码412个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为44kDa，预测等电点为6.33。gluE的氨基酸序列与来源于Cellulosimicrobium cellulans E4-5菌株的β-1,3-葡聚糖酶(登录号AEK80404.1)有最高一致性(99％)，但其仅提交了序列，未对其活性进行研究。gluE的结构域特征与糖苷水解酶16家族成员更为相似，由此表明gluE为GH16家族的一名新成员。

实施例3gluE基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶切位点。将PCR扩增产物和表达载体pET28a分别用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经电泳分离和凝胶回收后，将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切的pET28a载体用T₄DNA连接酶连接(连接体系：5mL(T₄DNALigase 0.5mL，10′T₄DNALigase Buffer 0.5mL，pET28a 2.5mL，PCR产物1.5mL)，连接条件：室温连接。)。将5mL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序，结果表明，在pET28a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的gluE基因，且插入方向正确，证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET28a-gluE。

将pET28a-gluE转化E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

序列表

SEQ ID NO.1

ATGGCGCCGGGCGACCTCCTGTGGTCCGACGAGTTCGACGGCGCGGCGGGCTCGGCGCCGAACCCGGCCGTCTGGAACCACGAGACCGGCGCGCACGGGTGGGGCAACGCCGAGCTCCAGAACTACACGGCCTCGCGCGCCAACTCCGCGCTCGACGGCCAGGGCAACCTCGTCATCACCGCGCGTCGCGAGGGCGACGGGTCGTACACGTCGGCCCGCATGACGACCCAGGGCAAGTACCAGCCGCAGTACGGGCGCATCGAGGCGCGCATCCAGATCCCGCGCGGCCAGGGGATCTGGCCGGCGTTCTGGATGCTCGGCGGGAGCTTCCCCGGGACGCCGTGGCCGTCGTCGGGCGAGATCGACATCATGGAGAACGTCGGGTTCGAGCCGCACCGCGTGCACGGCACGGTGCACGGCCCGGGGTACTCCGGCGGCTCCGGCATCACGGGCATGTACCAGCACCCGCAGGGCTGGTCGTTCGCGGACACGTTCCACACGTTCGCGGTCGACTGGAAGCCGGGGGAGATCACGTGGTTCGTCGACGGCCAGCAGTTCCACCGCGTCACGCGCGCGAGCGTCGGCGCGAACGCCTGGGTGTTCGACCAGCCGTTCTTCCTCATCCTCAACGTCGCGGTCGGCGGGCAGTGGCCCGGCTACCCCGACGGCACGACCCAGCTCCCGCAGCAGATGAAGGTCGACTACGTGCGCGTCTACGACAACGGCTCGGGCTCGTCGAACCCGGGGAACCCCGGCACCGGCCTGCCCACGGGGACCGGCGCGGTGCGCGCCGCGAACGGCATGTGCGTCGACGTCCCGTGGGCGGACCCGACCGACGGCAACCAGGTGCAGATCGTCACGTGCAGCGGCAACGCCGCGCAGACCTGGACCCGCGGCTCCGACGGGACCGTCCGTGCGCTCGGCAAGTGCCTCGACGTGCGCGACGGCGCGACGACGCGCGGCGCCGCCGTGCAGGTGTGGACGTGCAACGGGACGGGCGCGCAGAAGTGGGCGTACGACGCGGGGAGCAAGGCGCTGCGCAACCCGCAGTCCGGGCTCTGCCTCGACGCCACGGGCGGCGCGCCCCTGCACGACGGCCAGCGGCTGCAGACCTGGACGTGCAACGGCACGACCAACCAGCAGTGGACCCTCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

SEQ ID NO.2

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMAPGDLLWSDEFDGAAGSAPNPAVWNHETGAHGWGNAELQNYTASRANSALDGQGNLVITARREGDGSYTSARMTTQGKYQPQYGRIEARIQIPRGQGIWPAFWMLGGSFPGTPWPSSGEIDIMENVGFEPHRVHGTVHGPGYSGGSGITGMYQHPQGWSFADTFHTFAVDWKPGEITWFVDGQQFHRVTRASVGANAWVFDQPFFLILNVAVGGQWPGYPDGTTQLPQQMKVDYVRVYDNGSGSSNPGNPGTGLPTGTGAVRAANGMCVDVPWADPTDGNQVQIVTCSGNAAQTWTRGSDGTVRALGKCLDVRDGATTRGAAVQVWTCNGTGAQKWAYDAGSKALRNPQSGLCLDATGGAPLHDGQRLQTWTCNGTTNQQWTLLEHHHHHH

实施例4内切β-1,3-葡聚糖酶gluE的酶学性质分析

(1)内切β-1,3-葡聚糖酶gluE活力的测定

在低温条件下，1％(w/v)可德兰多糖水溶液经1200bar，均质5次。将均质后的胶体-可德兰多糖稀释至0.5％(w/v)，以450mL0.5％(w/v)的胶体-可德兰多糖为底物，加入50mL-重组酶gluE，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

(2)pH对重组酶gluE的影响

在50℃的条件下，分别以450mL 0.5％(w/v)，pH3.6-10.6(pH3.6-5.6HAc-NaAc，pH6.6-7.6Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.6Tris-HCl，pH9.6-10.6Gly-NaOH)的胶体-可德兰多糖为底物，加入50mL重组酶gluE，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。根据酶在不同pH下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH。以灭活的酶作为对照，以活性最高的值为100％，测定在各个反应pH下酶的相对活性。结果如图3A所示，gluE的最适反应pH为4.6，随着pH的升高或降低，gluE的活性均降低。

将5mL重组酶gluE分别置于45mLpH3.6-10.6(pH3.6-5.6HAc-NaAc，pH6.6-7.6Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.6Tris-HCl，pH9.6-10.6Gly-NaOH)的缓冲液中4℃放置24h，然后于50℃测定其活性，以未处理组的酶活为100％，测定在各个pH下酶的相对残余活性。结果如图3B所示，在pH5.6时pH稳定性最佳，在pH5.6-6.6之间具有较好的pH值稳定性。

(3)温度对重组酶gluE的影响

在pH4.6的条件下，以450mL0.5％(w/v)胶体-可德兰多糖为底物，分别在0-80℃下加入50mL重组酶gluE，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图4A所示，gluE的最适反应温度为50℃，且在0℃时也有68.25％的活性，说明该重组酶是一种具有冷活性的葡聚糖酶。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得gluE的比活为26.11U/mg。

将50mLgluE分别置于20-80℃下保温1h，加入450mL0.5％(w/v)的胶体-可德兰多糖，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以未处理组的酶活为100％，测定在各个温度下酶的相对残余活性。结果如图4B所示，gluE在低于40℃的温度时具有较好的热稳定性。

(4)重组酶gluE的底物特异性

选取CM-可德兰多糖(羧甲基-可德兰多糖)、胶体-可德兰多糖、laminarin(昆布多糖)、Zymosan(酵母多糖)、β-1,3/1,6-葡聚糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素、微晶纤维素、菊粉、壳聚糖、α-几丁质、胶体-几丁质11种底物考察重组酶gluE的底物特异性。分别配制成450mL pH4.6，0.5％(w/v)的不同底物，加入50mL重组酶gluE，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组酶gluE对各底物的特异性。结果如表1所示，重组酶gluE对CM-可德兰多糖表现出最高的活性，是胶体-可德兰多糖的1.4倍，对laminarin也有较高的活性，但对其它几种底物的降解能力较弱。

表1内切β-1,3-葡聚糖酶的底物特异性

实施例5EDTA、SDS及金属离子等对gluE活性的影响

在500mL水解反应体系中每组分别设定：NaCl终浓度为50mM、100mM、300mM、500mM、700mM，KCl终浓度为1mM、5mM、50mM、100mM，EDTA、SDS及其它金属离子终浓度均为1mM，加入50mL重组酶gluE，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组酶gluE的活性。以未加任何金属离子的酶活为100％。结果如表2所示，仅有二价离子Co²⁺和Mn²⁺对gluE的活性有显著提高，其余金属离子对gluE的活性没有明显提高作用，有些表现出显著抑制作用。

表2 EDTA、SDS及金属离子等对gluE活性的影响

实施例6酶gluE的降解产物分析

将0.5％胶体-可德兰多糖与纯化的gluE酶液按9:1(体积比)的比例混合后，在50℃条件下反应24h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析。如图5所示，gluE对胶体-可德兰多糖的降解可以生成多种聚合度的寡糖，DP＝2-9，主要产物为二糖和三糖，其中三糖最多。因此，gluE可用于寡糖的制备以及与可德兰多糖降解相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药及葡寡糖制备等领域。

实施例7酶gluE的抑菌活性研究

将Pst DC3000和BL21(DE3)的菌液分别涂布于固体KB培养基和固体LB培养基中，待平板将菌液完全吸收后，放入牛津杯，在牛津杯中加入100mLgluE，并设置阳性对照(噻霉酮)和阴性对照(无菌水)，过夜培养，观察抑菌效果。如图6所示，gluE对Pst DC3000和BL21(DE3)有显著的抑菌活性，形成明显的透明圈6(A)和6(B)，对丁香假单胞菌番茄致病变种Pst DC3000的抑菌圈直径为2.0cm，对大肠杆菌BL21(DE3)的抑菌圈直径为1.65cm。本研究中的内切β-1,3-葡聚糖酶具有抗菌谱广、防治效果好、环境安全、无污染等特点，与现有的防治方法相比，本研究所获得的内切β-1,3-葡聚糖酶gluE具有更为广阔的应用前景。因此，gluE可被用于抑菌及生物农药的制备等方面的研究，包括农业、科研及医药等领域。

实施例8新型胶体-可德兰多糖的制备

在低温条件下，将1％(w/v)的可德兰多糖水溶液混匀，使用高压均质机经1200bar，均质5次，得到均一的胶体-可德兰多糖。分别以450mL均质前和均质后可德兰多糖为底物，加入50mL重组酶gluE，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组酶gluE的活性，对比均质前和均质后可德兰多糖对gluE活性的影响。如图7所示，经过均质处理后所得的胶体-可德兰多糖使gluE的活性大大提高，是未经均质的可德兰多糖水溶液的6倍。将此均质工艺应用于寡糖的工业生产中，能够大大提高寡糖的得率，获得更高的效益。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种内切β-1,3-葡聚糖酶编码基因及其酶和制备方法与应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1179)

<400> 1

atggcgccgg gcgacctcct gtggtccgac gagttcgacg gcgcggcggg ctcggcgccg 60

aacccggccg tctggaacca cgagaccggc gcgcacgggt ggggcaacgc cgagctccag 120

aactacacgg cctcgcgcgc caactccgcg ctcgacggcc agggcaacct cgtcatcacc 180

gcgcgtcgcg agggcgacgg gtcgtacacg tcggcccgca tgacgaccca gggcaagtac 240

cagccgcagt acgggcgcat cgaggcgcgc atccagatcc cgcgcggcca ggggatctgg 300

ccggcgttct ggatgctcgg cgggagcttc cccgggacgc cgtggccgtc gtcgggcgag 360

atcgacatca tggagaacgt cgggttcgag ccgcaccgcg tgcacggcac ggtgcacggc 420

ccggggtact ccggcggctc cggcatcacg ggcatgtacc agcacccgca gggctggtcg 480

ttcgcggaca cgttccacac gttcgcggtc gactggaagc cgggggagat cacgtggttc 540

gtcgacggcc agcagttcca ccgcgtcacg cgcgcgagcg tcggcgcgaa cgcctgggtg 600

ttcgaccagc cgttcttcct catcctcaac gtcgcggtcg gcgggcagtg gcccggctac 660

cccgacggca cgacccagct cccgcagcag atgaaggtcg actacgtgcg cgtctacgac 720

aacggctcgg gctcgtcgaa cccggggaac cccggcaccg gcctgcccac ggggaccggc 780

gcggtgcgcg ccgcgaacgg catgtgcgtc gacgtcccgt gggcggaccc gaccgacggc 840

aaccaggtgc agatcgtcac gtgcagcggc aacgccgcgc agacctggac ccgcggctcc 900

gacgggaccg tccgtgcgct cggcaagtgc ctcgacgtgc gcgacggcgc gacgacgcgc 960

ggcgccgccg tgcaggtgtg gacgtgcaac gggacgggcg cgcagaagtg ggcgtacgac 1020

gcggggagca aggcgctgcg caacccgcag tccgggctct gcctcgacgc cacgggcggc 1080

gcgcccctgc acgacggcca gcggctgcag acctggacgt gcaacggcac gaccaaccag 1140

cagtggaccc tcctcgagca ccaccaccac caccactga 1179

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.2

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(412)

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Pro Gly Asp Leu Leu Trp Ser Asp Glu Phe

20 25 30

Asp Gly Ala Ala Gly Ser Ala Pro Asn Pro Ala Val Trp Asn His Glu

35 40 45

Thr Gly Ala His Gly Trp Gly Asn Ala Glu Leu Gln Asn Tyr Thr Ala

50 55 60

Ser Arg Ala Asn Ser Ala Leu Asp Gly Gln Gly Asn Leu Val Ile Thr

65 70 75 80

Ala Arg Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Arg Met Thr Thr

85 90 95

Gln Gly Lys Tyr Gln Pro Gln Tyr Gly Arg Ile Glu Ala Arg Ile Gln

100 105 110

Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Trp Pro Ala Phe Trp Met Leu Gly Gly

115 120 125

Ser Phe Pro Gly Thr Pro Trp Pro Ser Ser Gly Glu Ile Asp Ile Met

130 135 140

Glu Asn Val Gly Phe Glu Pro His Arg Val His Gly Thr Val His Gly

145 150 155 160

Pro Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Ile Thr Gly Met Tyr Gln His Pro

165 170 175

Gln Gly Trp Ser Phe Ala Asp Thr Phe His Thr Phe Ala Val Asp Trp

180 185 190

Lys Pro Gly Glu Ile Thr Trp Phe Val Asp Gly Gln Gln Phe His Arg

195 200 205

Val Thr Arg Ala Ser Val Gly Ala Asn Ala Trp Val Phe Asp Gln Pro

210 215 220

Phe Phe Leu Ile Leu Asn Val Ala Val Gly Gly Gln Trp Pro Gly Tyr

225 230 235 240

Pro Asp Gly Thr Thr Gln Leu Pro Gln Gln Met Lys Val Asp Tyr Val

245 250 255

Arg Val Tyr Asp Asn Gly Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gly Asn Pro Gly

260 265 270

Thr Gly Leu Pro Thr Gly Thr Gly Ala Val Arg Ala Ala Asn Gly Met

275 280 285

Cys Val Asp Val Pro Trp Ala Asp Pro Thr Asp Gly Asn Gln Val Gln

290 295 300

Ile Val Thr Cys Ser Gly Asn Ala Ala Gln Thr Trp Thr Arg Gly Ser

305 310 315 320

Asp Gly Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Cys Leu Asp Val Arg Asp Gly

325 330 335

Ala Thr Thr Arg Gly Ala Ala Val Gln Val Trp Thr Cys Asn Gly Thr

340 345 350

Gly Ala Gln Lys Trp Ala Tyr Asp Ala Gly Ser Lys Ala Leu Arg Asn

355 360 365

Pro Gln Ser Gly Leu Cys Leu Asp Ala Thr Gly Gly Ala Pro Leu His

370 375 380

Asp Gly Gln Arg Leu Gln Thr Trp Thr Cys Asn Gly Thr Thr Asn Gln

385 390 395 400

Gln Trp Thr Leu Leu Glu His His His His His His

405 410

Claims

1.一种内切β-1,3-葡聚糖酶编码基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.一种内切β-1,3-葡聚糖酶编码基因，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求1或2所述的内切β-1,3-葡聚糖酶基因编码的内切β-1,3-葡聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2；可用于降解固体可德兰多糖。

4.一种权利要求3所述的内切β-1,3-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于：将内切β-1,3-葡聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,3-葡聚糖酶；

所述的重组表达内切β-1,3 -葡聚糖酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达内切β-1,3-葡聚糖酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞，酵母菌宿主细胞，枯草杆菌宿主细胞，乳酸菌宿主细胞，放线菌宿主细胞，丝状真菌宿主细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞中的一种或二种以上。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，是指大肠杆菌宿主细胞Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α，酵母菌宿主细胞Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris 、Kluyveromyces lactis，枯草杆菌宿主细胞Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920，乳酸菌宿主细胞Lactic acidbacteria COCC101，放线菌宿主细胞Streptomyces spp.，丝状真菌宿主细胞Trichodermaviride、Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans，昆虫细胞Bombyx mori、Antharaea eucalypti，哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL中的一种或二种以上。

7.一种权利要求3所述的内切β-1,3-葡聚糖酶基因编码的内切β-1,3-葡聚糖酶的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：

1）在断裂可德兰多糖的糖苷键，获得单糖或葡寡糖中的应用；2）与其他葡聚糖酶混合后，在协同断裂葡聚糖糖苷键方面的应用。

8.按照权利要求7所述的内切β-1,3-葡聚糖酶基因编码的内切β-1,3-葡聚糖酶的应用，其特征在于：可德兰多糖底物通过如下条件处理，提高酶的降解效率：

通过均质的方法，将水不溶性的可德兰多糖水溶液制备成均一的胶体-可德兰多糖：在低温条件下，0.1%-10%w/v的可德兰多糖水溶液经1200 bar，均质5次。

9.一种权利要求3所述的内切β-1,3-葡聚糖酶在对动植物病害的防治中的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：

1）在抑制真菌、细菌的生长中的应用；

2）在防治动植物生长过程中感染的有害菌中的应用。