CN101633931A - 一种透明质酸酶表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有兽疫链球菌透明质酸酶基因的表达质粒及其应用，其目的是提供一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体及导入该载体的重组大肠杆菌细胞和利用该细胞生产透明质酸酶并利用该透明质酸酶制备透明质酸寡糖的方法。本发明采用PCR方法，构建了含有兽疫链球菌透明质酸酶的编码基因的表达质粒，通过该表达质粒转化得到重组大肠杆菌株，并利用此工程菌表达生产得到透明质酸酶。该透明质酸酶表达载体是含有兽疫链球菌透明质酸酶基因的大肠杆菌表达载体。表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法，包括培养重组大肠杆菌细胞，温控或IPTG诱导表达透明质酸酶及利用该透明质酸酶制备HA寡糖的步骤。该生产透明质酸酶的方法具有表达水平高、易扩大生产和成本低的特点。由本发明得到的透明质酸酶可用于降解透明质酸。

Description

一种透明质酸酶表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体及其应用，特别是涉及一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体及导入该载体的重组大肠杆菌细胞和利用该重组细胞生产兽疫链球菌透明质酸酶的方法以及利用该透明质酸酶降解透明质酸(又称为玻璃酸，hyaluronic acid，以下简称HA)制备HA寡糖的方法。

背景技术

(1)HA寡糖生产研究现状

HA是一种由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖构成的双糖单位重复连接形成的酸性黏多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的夹膜中。国内外已经对HA的分布、化学结构、理化性质以及应用进行了广泛而深入的研究，其在医药、化妆品、食品等领域有广泛而独特的应用价值。目前所用的HA的平均相对分子质量一般都大于10⁶。HA寡糖(oligosaccharides ofhyaluronan，简称o-HA)是相对分子质量＜10000、单糖残基数量为2～40(一般为4～16)的HA分子片段。o-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，具有促血管生成、促进创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等生物活性。

o-HA的制备方法有化学降解、酶解和生物合成法。化学降解方法中无论是酸水解、碱水解还是氧化降解都能破坏HA分子结构，将HA降解成寡糖需要较剧烈的反应条件，如较高的酸、碱浓度等，才能达到高的降解程度。因此不但糖链上的糖苷键断裂，而且葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的结构也可能遭到破坏，如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等。DeAngelis(Deangelis PL，Oatman，Gay D F.Rapid chemoenzymatic synthesis of monedispersehvaJuronan oligosaccharides with immobilized enzyme reactors[J].J Biol Chem，2003，278(37)：35199-35203)等利用巴氏杆菌HA合成酶(pmHAS)、葡糖醛酸转移酶和N-乙酰氨基葡糖转移酶合成2～20寡糖，此反应为生物合成反应，反应需要严格的反应条件，并且需要多种反应酶，成本较高。目前研究o-HA常用酶解制备，与化学降解相比，酶降解反应条件温和，降解速度快，较适于制备o-HA。目前市场上的透明质酸酶(hyaluronidase)主要是从动物组织中提取出来的，成分较复杂，含有较多杂蛋白，易对病人产生免疫反应。用细菌表达透明质酸酶具有分离纯化简单、成本低的优点，是制备o-HA的一种安全、简便、高效的方法。

(2)透明质酸酶研究现状

透明质酸酶是对催化降解透明质酸的酶的通称。人们在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都检测到了透明质酸酶。同时，在人体组织及体液中也广泛存在透明质酸酶。而一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。

根据作用机制的不同，透明质酸酶可以分为三类：(a)内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EC3.2.1.35)，为水解酶，作用于β-1，4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。研究最多的是睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶。(b)水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-β-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.36)，作用于β-1，3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解HA。(c)细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1)，也称为透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase)，作用于β-1，4糖苷键，通过β-消去机制得到4，5-不饱和双糖。

完整的细菌透明质酸酶包含四个结构域：N末端的糖结合域，间隔域，催化反应域，最后是C末端的调节域，两个末端结构域与相邻结构域间由一段连接多肽相连(Rigden D J，Littlejohn J E，Joshi H V，et al.Alternate structural conformations of Streptococcus pneumoniaehyaluronan lyase：insights into enzyme flexibility and underlying molecular mechanism of action[J].J Mol Biol，2006，358(4)：1165-78)。稳定状态的酶由C末端的两个结构域构成，其中催化反应域由α-螺旋结构构成，一般称为α-结构域，而C末端调节域由β-片层结构构成，一般称为β-结构域。

α-结构域有一个带正电核的疏水性的裂口(cleft)横贯其中，带负电荷的疏水性的底物HA即在此裂口中被结合、降解。催化裂口只能容纳三个双糖结构进入。酶的活性中心位于裂口中间最窄处，由Asn349、His399以及Tyr408(S.pneumoniae透明质酸酶氨基酸序列号)三个残基组成。β-结构域的作用类似一扇门，调节底物(HA/Ch/Chs)到达催化部位。完整长度的酶在N末端还包括两个结构域，均为β-片层结构。第一个很明显是个糖结合域，大概是加强细菌透明质酸酶与底物间的亲和力的。第二个结构域比较小，作为间隔域将α-结构域与N末端糖结合域隔开。

基于酶的晶体结构以及酶与HA寡糖复合体晶体结构的研究，HA结合和降解的机制称为质子施受(Proton acceptance and donation，PAD)(Li S，Kelly S J，Lamani E，et al.Structural basisof hyaluronan degradation by Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase[J].Embo J，2000，19(6)：1228-40)，并且表明是以β-消去方式进行性(processive)降解HA(Jedrzejas M J，MelloL V，de Groot B L，et al.Mechanism of hyaluronan degradation by Streptococcus pneumoniaehyaluronate lyase.Structures of complexes with the substrate[J].J Biol Chem，2002，277(31)：28287-97)。最初，透明质酸酶可能随机地与HA的某个部位结合，将其切为两段，其中含有不饱和双键的片段(即含有原HA还原端的片段)离开酶的活性中心，而含有原HA非还原端的片段留在催化裂口中，并移动一个双糖单位，继续进行下一轮降解。这样，每次在还原端产生一个不饱和双糖并离开，留下的非还原端片段移动一个双糖单位再继续降解，直到整个片段被完全降解。

进行性降解机制最初是由Pritchard通过对HA降解产物的分析提出的(Pritchard D G，LinB，Willingham T R，et al.Characterization of the group B streptococcal hyaluronate lyase[J].ArchBiochem Biophys，1994，315(2)：431-7)，并且如上所述，得到了酶结构研究的证实。但是关于降解方向，文献中出现了不同的结论。对酶与底物复合物结构的研究表明，降解是从HA链的还原端向非还原端进行，而Baker和Pritchard通过分析降解产物，认为降解是从非还原端向还原端进行(Baker J R，Pritchard D G.Action pattern and substrate specificity of the hyaluronanlyase from group B streptococci[J].Biochem J，2000，348(Pt 2)：465-71)。

(3)大肠杆菌表达系统研究现状

目前利用大肠杆菌表达蛋白的技术已经比较成熟。相对于真核表达系统而言，大肠杆菌表达系统有以下优势：对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究已相当彻底，可以根据不同的载体而选择不同的菌种；繁殖能力强，20～30min即可繁殖一代，大规模发酵成本低，具有巨大的生产潜力；表达水平一般较真核系统高，表达量可达总蛋白的5％～30％，且下游工艺简单、易于控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，这种表达载体是含有兽疫链球菌透明质酸酶基因(hyl)的大肠杆菌表达载体。

其中所述兽疫链球菌透明质酸酶基因编码具有序列表中的氨基酸残基序列；序列表中的氨基酸残基序列由862个氨基酸残基组成。

所述兽疫链球菌透明质酸酶基因具有序列表中的核苷酸序列；或与序列表中核苷酸序列的5’端168位至2756位碱基限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码序列表中的氨基酸残基序列的核苷酸序列。序列表中的核苷酸序列由2771个碱基组成，自5’端168位至2756位碱基为兽疫链球菌透明质酸酶基因序列。

所述大肠杆菌表达载体可为pBV220或pET22b，优选pBV220。将所述兽疫链球菌透明质酸酶基因插入到pBV220的多克隆位点中构建可以得到兽疫链球菌透明质酸酶表达载体pBV220-hyl。

将上述兽疫链球菌透明质酸酶表达载体导入大肠杆菌细胞得到的重组细胞也属于本发明的保护范围。

所述大肠杆菌细胞可为大肠杆菌DH5α、JM109或BL21。

可用电转法或42℃热激法将上述兽疫链球菌透明质酸酶表达载体导入所述大肠杆菌细胞。

本发明的另一个目的是提供一种表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法以及该透明质酸酶在降解HA、制备HA寡糖中的应用

本发明表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法，包括培养上述重组大肠杆菌细胞，温控或IPTG诱导表达兽疫链球菌透明质酸酶的步骤。

上述表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法中，还包括包含体分离，蛋白质变性，凝胶层析纯化，柱中复性或透析复性的步骤。所述凝胶层析可为葡聚糖G25凝胶柱层析。

本发明表达兽疫链球菌透明质酸酶的具体方法如下：

(1)菌种培养：将单个新鲜大肠杆菌菌落接种于LB/Ampicillin培养液中，30℃振摇，培养过夜。次日接种于较大体积培养液。继续培养至OD600约为0.5～0.6；

(2)温度诱导：将温度迅速调至42℃，继续振摇培养4小时；

(3)表达产物纯化，离心收集细胞，超声波破碎细胞，包含体分离，蛋白质变性，凝胶层析纯化，柱中复性或透析复性。

本发明所得到的透明质酸酶可用于降解透明质酸生产或制备透明质酸寡糖。

本发明的兽疫链球菌透明质酸酶基因表达载体构建容易，表达方法简单，只需调整培养温度或添加少量IPTG即可实现大量稳定的表达。表达蛋白的分离纯化过程简单，制备的透明质酸酶可以迅速的将大分子量的透明质酸降解成透明质酸寡糖，使生产成本大大降低，本发明具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1：兽疫链球菌透明质酸酶大肠杆菌表达载体pBV220-hyl构建过程示意图。

图2：本发明表达纯化的兽疫链球菌透明质酸酶HYL的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3：透明质酸酶HYL降解HA的所得HA寡糖的HPLC分析图。

图4：透明质酸酶HYL降解HA的所得HA寡糖的质谱分析图

具体实施方式

实施例仅是为了更好的说明本发明，而绝不是限制本发明。

实施例中所用方法若无特别说明均为常规方法，所用酶试剂均为TaKaRa公司产品。

实施例一：重组透明质酸酶HYL的制备

1、编码兽疫链球菌透明质酸酶HYL基因的克隆

A.引物设计与合成

根据Streptococcus agalactiae和Streptococcus pyogenes HA裂解酶的氨基酸序列以及Streptococcus equi基因组，设计并合成两个引物，其序列如下：

HYL1-F[5’-CGGGATCCATTTAGAGGCTGTGTGCACC-3’]

HYL1-R[5’-ATACTGCAGAATGTGCTTGAATGGCTATG-3’]

B.PCR反应

94℃变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。

C.测序

将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到了长度约为2700bp的DNA扩增片段，经测序，表明该DNA扩增片段具有序列表中的核苷酸序列。其中包括-10和-35序列，以及核糖体结合位点(RBS)。

2、兽疫链球菌透明质酸酶HYL大肠杆菌表达载体的构建

A.引物设计与合成

HYL2-F[5’-ATAGAATTCTTGTGGCTTCGATGGCAA-3’]

HYL2-R[5’-TAAGGATCCGCTTGAATGGCTTGATAAG-3’]

上引含有EcoR I酶切位点，下引含有BamHI酶切位点

B.PCR反应

反应条件同1.B。

C.表达载体的构建

将PCR扩增的DNA片段用EcoR I和BamHI酶切后，与经相同酶切的质粒载体pBV220用T4DNA连接酶连接，将连接产物用电转法或42℃热激法转化大肠杆菌DH5α，用含有100ug/L氨苄青霉素的抗性LB培养基进行筛选，将阳性克隆接种于LB培养基中37℃培养12-24小时，提取质粒，得到重组表达载体pBV220-hyl。

3、兽疫链球菌透明质酸酶HYL的表达与纯化

A、菌种培养与温度诱导

将单个新鲜菌落接种于含200ug/ml Ampicillin(氨苄青霉素)的LB培养液中，30℃振摇，培养过夜。次日以2％接种量接种于较大体积培养液。30℃继续培养至OD600约为0.5～0.6，将温度迅速调至42℃，继续振摇培养4小时，离心收集细胞。

B、透明质酸酶HYL的分离纯化

将42℃诱导后的菌液离心收集菌体，用0.2M的乙酸缓冲液(pH 6.0)洗涤两次，再重悬于该缓冲液中，超声波破碎菌体，离心收集上清，即得到粗酶液。沉淀即为包含体，溶于缓冲液A(8M urea，150mM NaCl，1mM EDTA，and 0.5％β-mercaptoethanol)，离心收集上清，将上清上样于G 25凝胶柱，流速9cm/h，柱子用缓冲液B平衡(2M urea，50mM NaCl，and50mM Tris-HCl，pH 8.0)并洗脱。收集的组分用缓冲液C(2M urea，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0，and 1mM glutathione(0.1mM glutathione oxidized and 0.9mM glutathione reduced))复性。

所得的透明质酸酶的聚丙烯酰胺电泳图见图2(泳道1为含有pBV220的大肠杆菌表达蛋白样品，泳道2是含有pBV220-hyl的大肠杆菌表达蛋白样品，泳道3是纯化后的蛋白样品，泳道M是蛋白Maker)。由图2可以看出，经纯化后得到了高纯度的透明质酸酶。

实施例二：HA寡糖的制备

将实施例一所得透明质酸酶的酶液与HA溶液混合，于37℃反应2小时。煮沸20min，过滤。将滤液用旋转蒸发仪浓缩，取2ml上样于Bio gel-P6柱(95cm×1.5cm)，以NH₄HCO₃(0.5mol/L)为流动相，流速12ml/h。每管收集2ml。将含糖的组分用旋转蒸发仪浓缩，再冷冻干燥，即得HA寡糖。所的HA寡糖的成分分析图(HPLC和质谱图)见图3和图4。由图3和图4可以看出得到了高纯度的HA二糖，该糖分子量为379，含有一个不饱和双键。通过控制降解时间，可以得到不同二糖单位的HA寡糖。

序列表

3    att tag agg ctg tgt gca cca aac cgt tgc cat caa tcc aga caa    47

48   gca gta ttt gct gac ctt tga cat tga gac aaa gga taa aac agg    92

                             -35

93   tca ggc ttt tgc gcg tat cat tga aga aat aaa gca agg ttc tgg    137

                           -10

138  tgc tgc aaa aga gca acg ctt gtg gct tcg atg gca aca gga act    182

                          RBS                Met Ala Thr Gly Thr    59

183  gag aaa aaa cac caa gaa aag ctt tat atc cct aag cta aag gtt    227

60   Glu Lys Lys His Gln Glu Lys Leu Tyr Ile Pro Lys Leu Lys Val    74

228  aat caa atc aag cta gag ctc ttt tat gag gcc ggt cat gga cag    272

75   Asn Gln Ile Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Ala Gly His Gly Gln    89

273  gtg gtc ttt gat aac ctt tct ttg aga gag gct ggt gat aag cca    317

90   Val Val Phe Asp Asn Leu Ser Leu Arg Glu Ala Gly Asp Lys Pro    104

318  agt gat gac atc aag att gct tca cat tac tta gag gag caa atc    362

105  Ser Asp Asp Ile Lys Ile Ala Ser His Tyr Leu Glu Glu Gln Ile    119

363  gtc ctg cct tta aat aag cac tac ctc atg gaa atg gct gac tat    407

120  Val Leu Pro Leu Asn Lys His Tyr Leu Met Glu Met Ala Asp Tyr    134

408  cat tat cag att gca gcg gag tcc agc aac att gtg cgc gtg gaa    452

135  His Tyr Gln Ile Ala Ala Glu Ser Ser Asn Ile Val Arg Val Glu    149

453  aat ggt ctt tta att cct ttg gcg cag ggg aaa acg ctt tta gag    497

150  Asn Gly Leu Leu Ile Pro Leu Ala Gln Gly Lys Thr Leu Leu Glu    164

498  gtg ttg gat caa gag ggg caa aga gta gca acg gta cca gtt gag    542

165  Val Leu Asp Gln Glu Gly Gln Arg Val Ala Thr Val Pro Val Glu    179

543  att tta gca gca gaa gcc cct caa aca acc tcc ttg atc aca aag    587

180  Ile Leu Ala Ala Glu Ala Pro Gln Thr Thr Ser Leu Ile Thr Lys    194

588  tgg tgt gag gtg att ttg gga gca gaa aac ttt gac cga tca agt    632

195  Trp Cys Glu Val Ile Leu Gly Ala Glu Asn Phe Asp Arg Ser Ser    209

633  cca gcc atg gtg gca tta aac caa aaa ctg gac gac agc gtg acc    677

210  Pro Ala Met Val Ala Leu Asn Gln Lys Leu Asp Asp Ser Val Thr    224

678  aag aat cta gct gat ctg acc aag gat cag aaa agc aca tac ctt    722

225  Lys Asn Leu Ala Asp Leu Thr Lys Asp Gln Lys Ser Thr Tyr Leu    239

723  tgg agt gat ttg gcg gat ctt cat caa tcg tct cat atg aca gct    767

240  Trp Ser Asp Leu Ala Asp Leu His Gln Ser Ser His Met Thr Ala    254

768  acc tgt agg cgt tta gag gaa atg gcc aag cag gtg agt agc cta    812

255  Thr Cys Arg Arg Leu Glu Glu Met Ala Lys Gln Val Ser Ser Leu    269

813  gcc tct agg tat tat cag gat aag gag ctg ata aga ctg atc aag    857

270  Ala Ser Arg Tyr Tyr Gln Asp Lys Glu Leu Ile Arg Leu Ile Lys    284

858  gat aaa tta gcc tgg ctg aca ctt aat tac tat cat ccg caa aag    902

285  Asp Lys Leu Ala Trp Leu Thr Leu Asn Tyr Tyr His Pro Gln Lys    299

903  gat att gaa ggc aag gct aat tgg tgg gat ttt gaa att ggt acc    947

300  Asp Ile Glu Gly Lys Ala Asn Trp Trp Asp Phe Glu Ile Gly Thr    314

948  cca aga gct att gtc aat acc cta gcc ttc att tac cct tat gtc    992

315  Pro Arg Ala Ile Val Asn Thr Leu Ala Phe Ile Tyr Pro Tyr Val    329

993  act caa gag gag atc aag cgc tat act aaa gga att tct cac ttt    1037

330  Thr Gln Glu Glu Ile Lys Arg Tyr Thr Lys Gly Ile Ser His Phe    344

1038 gtt cct aat cct aga caa ttt cgc tta acc ctt gtg aat cct ttt    1082

345  Val Pro Asn Pro Arg Gln Phe Arg Leu Thr Leu Val Asn Pro Phe    359

1083 aag gcc att ggg ggt aac ctt gtt gat atg gga cga gtg aag att    1127

360  Lys Ala Ile Gly Gly Asn Leu Val Asp Met Gly Arg Val Lys Ile    374

1128 att gaa gct ctg tta aag cat gat aag aaa gcg ctt caa gac agt    1172

375  Ile Glu Ala Leu Leu Lys His Asp Lys Lys Ala Leu Gln Asp Ser    389

1173 ata gca gcc cta gat acc tta ttt gct ttt cag cca aag gga tca    1217

390  Ile Ala Ala Leu Asp Thr Leu Phe Ala Phe Gln Pro Lys Gly Ser    404

1218 agg ggt gag ggc ttt tat gaa gat ggc tct tat att gac cat acc    1262

405  Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Glu Asp Gly Ser Tyr Ile Asp His Thr    419

1263 aat gtc gcc tac act gga gcc tat ggc aat gtc ctt att gat ggc    1307

420  Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu Ile Asp Gly    434

1308 ttg tct cag ctg gta cca tta ctt cag cta tta gct act agc cta    1352

435  Leu Ser Gln Leu Val Pro Leu Leu Gln Leu Leu Ala Thr Ser Leu    449

1353  gac cag caa aag cta gag gtc atg act cat tgg att gag caa gcc    1397

450   Asp Gln Gln Lys Leu Glu Val Met Thr His Trp Ile Glu Gln Ala    464

1398  ttc ttg ccc ttg atg gtt cat ggg gag ctc atg gat atg agt cgt    1442

465   Phe Leu Pro Leu Met Val His Gly Glu Leu Met Asp Met Ser Arg    479

1443  ggg cgc tcc atc agt cgt gaa aat gcc tcc tca agg cag gca gcc    1487

480   Gly Arg Ser Ile Ser Arg Glu Asn Ala Ser Ser Arg Gln Ala Ala    494

1488  tta gaa gca cta aga gga atg cta aga ctg gct gag gca ttg cca    1532

495   Leu Glu Ala Leu Arg Gly Met Leu Arg Leu Ala Glu Ala Leu Pro    509

1533  gag caa gct aaa atc agg atc aag ggt aag atc aag gct gtt ttg    1577

510   Glu Gln Ala Lys Ile Arg Ile Lys Gly Lys Ile Lys Ala Val Leu    524

1578  gcc ttc cat aat cag gag act att tta gag agc cta tca agc tac    1622

525   Ala Phe His Asn Gln Glu Thr Ile Leu Glu Ser Leu Ser Ser Tyr    539

1623  tat gac atg aag cta ttc aaa gag ctc ttg gag gat acc aca atc    1667

540   Tyr Asp Met Lys Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Asp Thr Thr Ile    554

1668  caa gcc agt cca gtt aag agc tac cta tct ctt ttt aac cag atg    1712

555   Gln Ala Ser Pro Val Lys Ser Tyr Leu Ser Leu Phe Asn Gln Met    569

1713  gat aaa ttg gcc tac tac aat gcg gaa aag gat ttt gcc ttt gct    1757

570   Asp Lys Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala Glu Lys Asp Phe Ala Phe Ala    584

1758  tta tcc atg cat tcc aac aaa act ctg aat ttt gaa gcc atg aac    1802

585   Leu Ser Met His Ser Asn Lys Thr Leu Asn Phe Glu Ala Met Asn    599

1803  gat gaa aat aca cgt ggt tgg tat aca gga gat ggc atg ttt tac    1847

600   Asp Glu Asn Thr Arg Gly Trp Tyr Thr Gly Asp Gly Met Phe Tyr    614

1848  ctt tat aac agt gat ttg ggt cat tac tca gac cac ttt tgg ccg    1892

615   Leu Tyr Asn Ser Asp Leu Gly His Tyr Ser Asp His Phe Trp Pro    629

1893  act gtt aat cct tta aag atg gct gga aca acg gaa gca gag gtc    1937

630   Thr Val Asn Pro Leu Lys Met Ala Gly Thr Thr Glu Ala Glu Val    644

1938  agg cga gag gac gtg aca gta gcc tat tta aaa aag cta acc aat    1982

645   Arg Arg Glu Asp Val Thr Val Ala Tyr Leu Lys Lys Leu Thr Asn    659

1983  gat tat aaa gaa aag gcc aaa gaa aaa gca ggc atg tct acc ctg    2027

660   Asp Tyr Lys Glu Lys Ala Lys Glu Lys Ala Gly Met Ser Thr Leu    674

2028  cca tcg tcc ttt gtt gga gcg atc aag gcg gga gac aaa aca gct    2072

675   Pro Ser Ser Phe Val Gly Ala Ile Lys Ala Gly Asp Lys Thr Ala    689

2073  tta gct gtt atg gat ttt caa aat tgg gat agg aca gtg agt gcc    2117

690   Leu Ala Val Met Asp Phe Gln Asn Trp Asp Arg Thr Val Ser Ala    704

2118  aag aag tct tgg acg atc tta gat gac caa att gtt ttt ctt ggc    2162

705   Lys Lys Ser Trp Thr Ile Leu Asp Asp Gln Ile Val Phe Leu Gly    719

2163  acc gcc atc act agt cag aca cat cag gca gtg act act acc att    2207

720   Thr Ala Ile Thr Ser Gln Thr His Gln Ala Val Thr Thr Thr Ile    734

2208  gat caa cgc aaa gaa aac cca gac aac agc tac act ctt ttt atc    2252

735   Asp Gln Arg Lys Glu Asn Pro Asp Asn Ser Tyr Thr Leu Phe Ile    749

2253  aat ggg cag gag aca gcg cta aca gag gag atc ctg tat cga gat    2297

750   Asn Gly Gln Glu Thr Ala Leu Thr Glu Glu Ile Leu Tyr Arg Asp    764

2298  gat gtg acc agt ctt tta cta ctt tct aaa gac ggt caa gct aat    2342

765   Asp Val Thr Ser Leu Leu Leu Leu Ser Lys Asp Gly Gln Ala Asn    779

2343  att ggt tac ctt ttt gcc aag cca acc gca tta gcg cta tcg cga    2387

780   Ile Gly Tyr Leu Phe Ala Lys Pro Thr Ala Leu Ala Leu Ser Arg    794

2388  aag gtg cag tca ggc tgt tgg tct gag att aat aca aat agt aac    2432

795   Lys Val Gln Ser Gly Cys Trp Ser Glu Ile Asn Thr Asn Ser Asn    809

2433  aat aaa gac ctc atc tcc caa agc ttt atc aca atc agt caa act    2477

810   Asn Lys Asp Leu Ile Ser Gln Ser Phe Ile Thr Ile Ser Gln Thr    824

2478  cat tct cag gct agt gat agc tat gcc tac acc cta ctt cca aat    2522

825   His Ser Gln Ala Ser Asp Ser Tyr Ala Tyr Thr Leu Leu Pro Asn    839

2523  atc agc aaa gca gac ttt gac aag gtg tgc agc gaa gca cgt att    2567

840   Ile Ser Lys Ala Asp Phe Asp Lys Val Cys Ser Glu Ala Arg Ile    854

2568  gag gtg ctt cga aat gac agt aag ctt cag ctg atc cat gat aag    2612

855   Glu Val Leu Arg Asn Asp Ser Lys Leu Gln Leu Ile His Asp Lys    869

2613  aaa caa ggc ctg ttg gcg gtg gtc aaa tac aat cag gct aag gag    2657

870   Lys Gln Gly Leu Leu Ala Val Val Lys Tyr Asn Gln Ala Lys Glu    884

2658  gtg gtt aat ggt caa ttg agt ctt gaa aaa tca ggc tta tac ctc    2702

885   Val Val Asn Gly Gln Leu Ser Leu Glu Lys Ser Gly Leu Tyr Leu    899

2703  tat caa aag gtg gga aat gac ttt aag cag cta tct ttt aag gcc    2747

900   Tyr Gln Lys Val Gly Asn Asp Phe Lys Gln Leu Ser Phe Lys Ala    914

2748  tta tca tag cca ttc aag cac att    2771

915   Leu Ser End

Claims (10)

1、一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于：该表达载体是含有兽疫链球菌透明质酸酶基因的大肠杆菌表达载体。

2、权利要求1所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于：所述的兽疫链球菌透明质酸酶基因编码具有序列表中的氨基酸残基序列。

3、权利要求2所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于：所述的兽疫链球菌透明质酸酶基因具有序列表中的核苷酸序列；或与序列表中核苷酸序列的自5’端168位至2756位碱基限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码序列表中的氨基酸残基序列的核苷酸序列。

4、权利要求3所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于：所述大肠杆菌表达载体为pBV220、pET22b，优选为pBV220。

5、权利要求4所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于：该表达载体为pBV220-hyl。

6、权利要求1-5中任一所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体导入大肠杆菌细胞得到的重组细胞。

7、权利要求6所述的重组细胞，其特征在于：所述大肠杆菌细胞为大肠杆菌DH5α、JM109或BL21。

8、一种表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法，其特征在于：该方法包括培养权利要求6或7所述的重组细胞，温控或IPTG诱导表达兽疫链球菌透明质酸酶的步骤；具体步骤如下：①菌种培养：将单个新鲜大肠杆菌菌落接种于LB/Ampicillin培养液中，30℃振摇，培养过夜。次日接种于较大体积培养液。继续培养至OD600约为0.5～0.6；

②温度诱导：将温度迅速调至42℃，继续振摇培养4小时；

③表达产物纯化，离心收集细胞，超声波破碎细胞，包含体分离，蛋白质变性，凝胶层析纯化，柱中复性或透析复性。

9、权利要求8所述的方法得到的透明质酸酶在降解透明质酸中的应用。

10、权利要求8所述的方法得到的透明质酸酶在制备或生产透明质酸寡糖中的应用。

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