CN102154360A

CN102154360A - 产透明质酸重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法

Info

Publication number: CN102154360A
Application number: CN 201110006214
Authority: CN
Inventors: 毛自朝; 杨发祥; 尚海丽; 程倩
Original assignee: Fermentation Research Center Yunnan Co Ltd
Current assignee: Fermentation Research Center Yunnan Co Ltd
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-01-13
Also published as: CN102154360B

Abstract

本发明是生产透明质酸的重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法。本发明的pQHK和pHK均由载体pQE80L起始构建，含有透明质酸合成酶pmHas和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶kfiD基因，且T5驱动了pmHas和kfiD的共表达。pHK因含有源于质粒pBBR122，能广谱的在革兰氏阴性细菌中复制的必需片段，在大部分革兰氏阴性细菌中有较好的活性，可用于革兰氏阴性细菌（其他非大肠杆菌）来生产透明质酸。用本发明的重组表达载体构建的工程大肠杆菌能产透明质酸2g～2.5g/L,比现有通过工程大肠杆菌生产的透明质酸产量提高近10倍多。

Description

产透明质酸重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法

技术领域

本发明涉及微生物的基因工程技术领域，具体是构建用于高效产透明质酸工程菌的重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法。

背景技术

大肠杆菌K12株系因清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组的易操作性而被广泛应用在代谢工程领域，以生产各式各样的高附加值产品。目前尚未发现天然的大肠杆菌菌株有生产透明质酸的能力。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)广泛存在人和动物组织内，其分子量在5×10⁴到8×10⁶道尔顿之间，是由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖醛酸及β-1,3-糖苷键连接的氮乙酰基葡萄糖胺（β1-4 D-Glucuronic acid,GlcA，β1-3 D-N-acetylglucosamine ,GlcNAc）交替连接而成的直链聚合物。研究证实，该多糖作为结构与信号分子参与了哺乳动物的受精、胚胎发育、血管再生和关节润滑等众多生理活动；同时在炎症与损伤修复、维持皮肤的水分与弹性方面也有重要作用。特定长度的HA寡糖链在抗肿瘤免疫异常修复等方面发挥着重要功能。

由于透明质酸独特的化学特性与生理功能， HA及源于HA的寡糖链被广泛应用于眼科手术、关节炎治疗、抗肿瘤、给药方式、化妆品工业等诸多方面，仅2008年HA做为原料，在全球市场的交易金额约为10亿美元并有逐年增加的趋势。

自然界中HA广泛存在，如动物组织哺乳动物病原菌的细胞被膜及病毒PBCV-1浸染的小球藻等。目前商用HA主要从动物组织(如鸡冠，脐带、牛眼、关节滑液)和培养高等哺乳动物（包括人）的病原菌（如链锁状球菌, Streptococci ）中提取(Marcellin E. et al, Proteome analysis of the hyaluronic acid-producing bacterium, Streptococcus zooepidemicusProteome Science 2009, 7:13-20)。出于资源限制、成本问题及药物安全等诸方面的考虑，上述生产绝非理想方式，国际社会极力探索更为经济、安全和持续的生产HA的方法。

分子生物学及生物技术的发展，为上述问题的解决提供了重要的手段。对HA在动物与微生物中合成机理，诸多HA的合成过程必需基因的克隆等研究，都为通过代谢工程的手段，在安全的宿主生物中重建或改造合成途径来生产HA奠定了坚实的基础。

2004年日本学者祡谷滋郎等（公开号为CN1833026A、名称为“生产透明质酸的植物”）通过在转基因植物中表达从人类和草履虫病毒（PBCV-1）中得到的HA合成基因（Has）来尝试HA在植物组织中的合成。Widner B 等 (Bill Widner et al .,Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtilis Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(7): 3747–3752) 在枯草芽孢杆菌中成功表达从革兰氏阳性的链锁状球菌中得到的HA合成基因，工程芽孢杆菌在普通的三角瓶中发酵获0.5-0.6g／L HA 含量。

然而在植物中生产透明质酸，因植物的转化难，生长周期受季节限制，许多保守环保人士反对转基因植物，及转基因植物本身存在对环境安全的潜在危害等而受到应用限制。对于枯草芽孢杆菌，因该菌有产生内毒素，各种大环脂类和脂肽类抗生素的报道，而会导致经发酵、用于医药领域HA的分离纯化成本增高，产率降低等系列问题。

许多来源于人体肠道的大肠杆菌是维护肠道微生物平衡及人体健康的有益细菌。加之大肠杆菌K12菌株具清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组可操作性，而被广泛应用在代谢工程领域以生产高附加值的生物产品。对于用大肠杆菌为宿主进行工程改造生产透明质酸的首次报道是美国麻省理工学院的Stephanopoulos G研究组。2008该研究组通过在大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas 和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的seHas基因，该研究获得最高约 0.2g/L的HA产量。该工程大肠杆菌因HA合成产率低而难以获得产业化运用。因此，研究能在大肠杆菌中生产透明质酸甚至能在其他非大肠杆菌革兰氏阴性细菌中生产透明质酸的重组表达载体是构建高产透明质酸工程菌的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效产透明质酸工程大肠杆菌重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法，克服现有技术中生产透明质酸的资源短缺、安全性问题以及在工程大肠杆菌中较低透明质酸合成的问题。

高效产透明质酸工程大肠杆菌重组表达载体pQHK含有透明质酸合成酶基因pmHas，T5 启动子与尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的基因片段T5:kfiD和起始构建载体pQE80L，由T5启动子驱动透明质酸合成酶基因pmHas和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的共表达；所述的透明质酸合成酶基因pmHas的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因片段T5:kfiD的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

既可以用于在大肠杆菌中表达，还可以用于在其他革兰氏阴性菌中表达的重组表达载体pHK含有透明质酸合成酶基因pmHas，T5 启动子与尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的基因片段T5:kfiD，出发载体pQE80L和含革兰氏阴性菌中复制必需和表达卡那霉素抗性元件的质粒pRP；pHK含 T5启动子驱动透明质酸合成酶基因pmHas和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的共表达；所述的透明质酸合成酶基因pmHas的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因片段T5:kfiD的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述的质粒pRP的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示。

本发明的高效产透明质酸的工程大肠杆菌重组表达载体pQHK的构建方法如下：

（1）构建含有透明质酸合成酶基因的表达载体pQEpmHas，用PCR扩增方法克隆源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因（ Pasteurella multocida hyaluronic acid synthase PmHas），其PCR扩增克隆所用引物设计如下:

上游引物pmHas P1 为 5'-TAGGATCC ATGAACACATTATCACAAGCAAT-3'，(序列表中SEQ ID No:3) 含Bam H I位点GGATCC和起始密码子ATG；

下游引物为pmHasP2 为 5'-TAGAGCTC TTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3' (序列表中SEQ ID No:4)，含Sac I位点GAGCTC和终止密码子TAA；

PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经Bam H I和Sac I双酶切后,连接入商用载体pQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA 测序确证无突变后,将所获载体命名为pQEpmHas，基因为pmHas（序列表中SEQ ID No:１）

（2）构建含尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的表达载体pQEkfiD，用PCR扩增方法克隆源自源于大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）菌株k5（E. coli K5）中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因（K₅ capsule gene D，kfiD），扩增的引物设计如下:

上游引物KfiD P1: 5'- TGGAGATCT ATGTTCGGAACACTAAAAATAACT G-3'(序列表中SEQ ID No:5)，含Bgl II 位点AGATCT，和起始密码子ATG；

下游引物kfiD P2：5'-TTCTCGAG TTAGTCACATTTAAA CAAATCGCGAC-3'(序列表中SEQ ID No:6)，含Xho I位点CTCGAG和终止密码子TAA ；

PCR的模版为大肠杆菌k5菌株ATCC 23500的基因组DNA,成功扩增并纯化的产物, 经Ｂgl II和Xho I双酶切后,连接入Qiagen 公司的商用载体pQE80L的Bam H I和Sal I位点,所得载体经DNA 测序分析确证插入片段无突变后，所获载体命名为pQEkfiD，相应基因命名为kfiD基因（序列表中SEQ ID No:2）；

（3）构建大肠杆菌中共同表达透明质酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体：

根据构建好的pQEkfiD载体的DNA 序列设计PCR引物，扩增T5 启动子驱动kfiD表达的片段 T5:kfiD，具体引物序列设计如下：

上游引物T5kfiD P1：5'-TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCAC_GTCGAGA-3'（序列表中SEQ ID No:7），该引物含有 Sac I 位点,GAGCTC，其中下标G 表示将原始pQE80L载体中C突变为G，以消除其Xhol 位点,CTCGAG；

下游引物T5kfiD P2：5'-TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'（序列表中SEQ ID No:8），该引物含 Xho I site, CTCGAG ；

PCR的模版用pQEkfiD载体，纯化的T5:kfiD扩增产物, 首先连接入pGEM-T-Vector（Promega 产品， www.promega.com）并转化大肠杆菌JM109菌株，获中间载体pT-T5KfiD，该载体中T5:kfiD（序列表中SEQ ID No:9）片段，经测序分析证实核苷酸顺序无突变后，该插入T5:kfiD片段经Sac I和Xho I 双酶切后,连接入表达载体pQEpmHas的Sac I和sal I 位点而获pmHas和kfiD基因在大肠杆菌中共表达的重组载体pQHK ；

本发明的高效产透明质酸的工程大肠杆菌重组表达载体（革兰氏阴性菌宿主广谱）pHK的构建方法如下：

根据德国MoBiTec公司的革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)设计引物：

上游引物PBBR P1:5'-TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中SEQ ID NO：10)；含有SalI酶切位点，GTCGAC

下游引物PBBR P1：5'-TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3' (序列表中SEQ ID NO：11) ，含有SalI酶切位点，GTCGAC)；

用上述引物扩增质粒pBBR122中包含其复制位点及卡那霉素抗性基因在内的片段，PCR 扩增的参数为：95℃、2min , 1个循环；94℃，30s, 55℃、30s， 72℃、3min , 25个循环；72℃、10min 1个循环，纯化约3.2 kb扩增产物,用Sal I 酶解后，加入连接酶让其自连，自身连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，并用卡那霉素筛选获质粒pRP(序列表中SEQ ID NO：12)，提取质粒pRP,经SalI酶解后，连接入上述能在大肠杆菌中共表达pmHas和kfiD基因的pQHK的XhoI 位点，而获在革兰氏阴性菌中共表达pmHas和kfiD来合成透明质酸的表达载体pHK；

以上所述的大肠杆菌菌株pHK/JM109为高效产透明质酸工程大肠杆菌，其中pHK为表达载体,JM109为表达载体的宿主菌株。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、将该重组载体pHK转入大肠杆菌JM109中，可获得所述的高效产透明质酸的工程大肠杆菌pHK/JM109（保藏登记号为：CGMCC NO:3926，于2010年6月17日在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，）。该工程大肠杆菌能产透明质酸2g/L～2.5g/L,比现有技术中通过大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas 和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的seHas基因获得的最高约0.2g/L的透明质酸产量提高近10倍。

2、第一次用在革兰氏阴性菌来源的透明质酸合成酶基因pmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD在革兰氏阴性宿主中表达来生产透明质酸。

3、本发明所构建的重组表达载体pHK，含有广谱的能在革兰氏阴性细菌中复制的必需片段，且驱动透明质酸合成酶基因pmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD表达的启动子，在大部分革兰氏阴性细菌中有较好的活性，而使本发明的重组表达载体pHK，可用于（其他非大肠杆菌）革兰氏阴性细菌中生产透明质酸。

附图说明

图1 是本发明中透明质酸合成酶催化鸟苷二磷酸葡萄糖酸和鸟苷二磷酸氮乙酰葡萄糖胺聚合形成透明质酸的过程图。

图2是本发明的共表达pmHas和KfiD载体图，其中A：pQHK仅用于在大肠杆菌中表达；B：pHK既可以用于在大肠杆菌中表达，还可以用于在其他革兰氏阴性菌中表达。

图3是本发明的显示透明质酸合成酶基因(pmHas)和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因(kfiD)在大肠杆菌JM109菌株中的表达图，其中A：pQEpmHAS/JM109菌株中pmHAS表达检测， B：pＨＫ/JM109菌株中pmHAS和kfiD共表达检测. A1, B1分别为pQEpmHAS/JM109菌株和pHK/JM109菌株，经Ni-NTA-Agrose 纯化的电泳，显示pmHas分子量约为110kD，kfiD分子量约为45kD，A2，B2为蛋白分子量标准（从上到下分子量分别为225 150 100 75 50 35 25 15 (KDa)，A3,B3：分别为pQE80L/JM109和pBQ/JM109(空载体转化)的总可溶性蛋白电泳，A4， B4分别为pQEpmHas/M109和pHK/JM109的总可溶性蛋白电泳。

本发明所涉及的DNA序列说明

序列表中SEQ ID NO：1所示的是源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida中的透明质酸合成酶基因pmHas编码区核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是源自大肠杆菌k5菌株（中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的编码区核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是克隆源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因pmHas的上游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是克隆源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因PmHas的下游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是克隆源于大肠杆菌k5菌株中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的上游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是克隆源于大肠杆菌k5菌株中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的下游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：7所示的是克隆T5:kfiD片段的上游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：8所示的是克隆T5:kfiD片段的下游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：9 所示的是T5:kfiD片段的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：10所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及复制必需片段的上游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：11所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及复制必需片段的下游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：12所示的是质粒pRP的核苷酸序列。

本发明涉及的遗传资源

1：多杀巴斯徳菌株ATCC15742（ Pasteurella multocida subsp. multocida (Lehmann and Neumann) Rosenbusch and Merchant）；遗传资源取自：美国典型培养物保存中心（ATCC）；获取方式：购买，价格225美金；获取时间：2008年1月；原始来源：美国科学家KL Heddleston从火鸡心脏中分离，获取时间： 1962年 4月

2：大肠杆菌K5 菌株ATCC23500（Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers ，serotype O2a,2b:K5(L):H4；遗传资源取自：美国典型培养物保存中心（ATCC）获取方式：购买，价格225美金，获取时间：2008年9月原始来源：美国疾病控制中心（CDC）科学家Kauffmann从人尿中分离，及获取时间： 1943年 7 月。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作更详细的描述，但本发明并不仅限于此。

实施例1：（高效产透明质酸的工程大肠杆菌重组表达载体pQHK的构建）

源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因pmHas的克隆和含有透明质酸合成酶基因pmHas的表达载体pQEpmHas的构建具体步骤如下：

PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经Bam H I和Sac I双酶切后,连接入商用载体pQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA 测序确证无突变后,将所获载体命名为pQEpmHas，基因为pmHas如序列表中SEQ ID NO：1所示。

大肠杆菌中pmHas表达，纯化及活性测定：

将含pQEpmHas大肠杆菌JM109菌株，在含100ug/L Amp（氨卞青霉素） LB（琼脂固体）培养基，10g/L Tryptone（胰化蛋白胨），5g/L Yeast extract（酵母提取物）, 10g/L NaCl, pH 7.0, 15g/L 琼脂平板上划线以产生单菌落，挑取单菌落置于5ml含100u/L Amp 的LB 在37℃、250 rpm 培养14-16小时获种子液；将种子液按100倍（V/V）培养在新的含100u/L Amp 的LB中生长至培养物600nm光吸收约0.5-0.6；这时立刻加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷, isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG),并在30℃培养6-8小时。培养物经12000 rpm 离心5min 收集细菌，菌体用等体积50 mM（pH8.0）磷酸钠缓冲液洗涤后，再次离心收集，菌体以约0.2g鲜重/ml 浓度悬浮于pH8.0, 含50 mM磷酸钠，300mM NaCl，10mM 咪唑（imidazole），1mM 溶菌酶，2mM 的蛋白酶抑制剂（DMSF）的混合液中后，低温下（0-4℃）超声波破碎为匀浆，细胞裂解物经12000 RPM离心20 min,取上清液得pmHas粗提液。该粗提液加入到含Ni-NTA-Agrose (Sigma 公司产品)的层析柱中，用pH 8.0，含50mM磷酸钠， 300mM NaCl，20 mM 咪唑（imidazole）溶液洗涤，和用pH 8.0，含50 mM磷酸钠, 300mM NaCl，250 mM 咪唑（imidazole）溶液洗脱，收集洗脱液。该洗脱溶液经10mM pH7.0 Tris- HCl 透析过夜，得纯化的透明质酸合成酶（PmHas），从图3可见透明质酸合成酶（PmHas）在大肠杆菌JM109菌株中获得高效表达，且被纯化为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的单一条带。

透明质酸合成酶的活性分析采用体外透明质酸的积累来测定，酶促反应是在 50ul体系中进行，该体系含100mM Tris HCl (pH7.0), 40mM MgSO4, 0.5mM乙二醇二乙醚四乙酸（EGTA）, 2mM，巯基乙醇 0.1% 牛血清白蛋白, (BSA),2mM尿苷二磷酸6-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA），2mM尿苷二磷酸氮乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）和10ul 不同稀释、不同纯化过程中和不同阶段的pmHas酶液。反应物混合均匀后，在37℃条件下反应60min后，用90℃ 5min 使酶失活终止反应，离心反应混合溶液，取上清测定透明质酸含量。

透明质酸含量测定采用透明质酸结合蛋白（Hyaluronic Acid Binding Protein, HABP）来测定，本发明采用透明质酸放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所产品，http://www.bnibt.com，）来分析，该分析试剂盒采用竞争放射免疫分析法，即标准或待测样品中的HA和125I-HA共同与限量的透明质酸结合蛋白（HABP）在适宜的条件下进行竞争性结合反应。一部分125I-HA与HABP结合形成复合物，而另一部分呈游离状态。125I-HA与HABP结合的比例取决于标准或待测样品中非标记HA的含量，非标记HA的含量越高，125I-HA与HABP形成的复合物越少。HA-HABP复合物与HABP抗体和第二抗体形成交联的聚合物沉淀下来，测定沉淀物的放射性计数。经过数据处理后可获得标准曲线及回归方程，从标准曲线上查出被测样品的HA含量。1酶活性单位(U)定义为1小时催化形成1ug透明质酸分子数。酶液中蛋白含量采用伯乐（Bio-Rad）公司蛋白测定试剂盒（www.biorad.com）并用牛血清白蛋白（BSA）为蛋白标准品，以计算酶的比活。表1数据表明pmHas基因在大肠杆菌中获得活性表达。

备注：表1中数据为3次测定的平均值±标准误差

上游引物KfiD P1: 5'- TGGAGATCT ATGTTCGGAACACTAAAAATAACT G-3'(序列表中SEQ ID No:5)，含Bgl II 位点AGATCT，和起始密码子ATG)；

下游引物kfiD P2： 5'-TTCTCGAG TTAGTCACATTTAAA CAAATCGCGAC-3'(序列表中SEQ ID No:6)，含Xho I位点CTCGAG和终止密码子TAA ；

PCR的模版为大肠杆菌k5菌株ATCC 23500的基因组ＤＮＡ,成功扩增并纯化的产物, 经Ｂgl II和Xho I双酶切后,连接入Qiagen 公司的商用载体pQE80L的Bam H I和Sal I位点,所得载体经DNA 测序分析确证插入片段无突变后，所获载体命名为pQEkfiD，相应基因命名为kfiD基因，如序列表中SEQ ID No:2所示。

大肠杆菌中kfiD基因的表达，纯化及活性测定：

kfiD 的表达，纯化与上述透明质酸合成酶的表达纯化相似，具体是，将含pQE kfiD 的大肠杆菌JM109菌株，在含100ug/L氨卞青霉素（ Amp） LB Agar固体培养基上生长出单菌落。单菌落置于5ml 含100u/L Amp 的LB 在37℃，250 rpm 培养14-16小时后，将培养物按100倍（V/V）稀释到 LB中，37℃培养至OD600nm光吸收(OD 600=0.5-0.6)，立刻加入终浓度为1mM的IPTG, 30℃培养4小时，培养物经12000 rpm 离心5 min 收集细菌，菌体用等体积50 mM磷酸钠缓液洗涤后，再次离心收集后以0.2g鲜重/ml 悬浮于pH8.0，含 50 mM磷酸钠 300mM NaCl ，10mM 咪唑（ imidazole）， 1mM 溶菌酶，2mM 的蛋白酶抑制剂DMSF中。菌悬液在低温下（0-4℃）超声波破碎为匀浆。细胞匀浆经12000 RMP离心20 min,取上清液得 kfiD粗提液；该粗提液加入到Ni-NTA-Agrose (Sigma 公司产品) 层析柱中，经50 mM 磷酸钠缓冲液(pH 8.0),含 300mM NaCl 、20 mM 咪唑（ imidazole）洗涤和50 mM 磷酸钠缓液(pH 8.0),含 300mM NaCl、 250 mM 咪唑（ imidazole）洗脱，收集洗脱液，该溶液在0-4℃环境中，经10mM pH7.0 Tris- HCl 透析过夜，得纯化的kfiD。从图3可见kfiD基因在大肠杆菌中获得高效表达并被纯化为一条SDS-PAGE带。

KfiD的活性测定采用检测UDP-GlcA在体外的生成来进行，具体是在总体积50 μl 体系，终浓度含100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.8)，1 mM UDP-Glc, 2 mM NAD+, 5 mM 二硫苏糖醇（Dithiothreitol）,中加入2.5-5μl不同纯化阶段，不同稀释度的 KfiD酶液，37℃反应 10 min 后，100℃ 5min 终止反应。反应混合溶液，13000 rpm 离心10 min 后取上清液，上清液经0.22μl 的乙酰纤维素滤头过滤后用于HPLC分析UDP-GlcA的生成。

UDP-GlcA分析在高效液相色谱(HPLC)系统（Agilent 1100 series）进行，分析柱为碳C18反相柱（Waters Jsphere ODS H80, 150 x 4.6 mm i.d., 4 μm-particle size ). 分析的流动相为经0.22μl 的乙酰纤维素滤头过滤的溶液A （100 mM KH₂PO4 pH ,5.3内含8 mM 硫酸四丁基氨（tetrabutylammonium hydrogen sulfate ）和溶液B（70% 溶液Ａ＋ 30%甲醇 (pH 5.9)。层析条件是：柱温40℃, 0 min 100% 溶液A , 15min 30%A+70%溶液B, 20 min 100%溶液B, 30min 100%溶液B, 35min 100%溶液A, 50min 100%溶液A. 用UDP-GlcA（Sigma 产品）为标样制做标准曲线来进行酶促UDP-GlcA形成的计算。1酶活性单位(U)定义为1min催化形成1umol UDP-GlcA的酶促活力。酶液中蛋白含量采用伯乐（Bio-Rad， www.biorad.com ）公司蛋白测定试剂盒并用BSA 为蛋白标准品，以计算酶的比活。表2数据表明KfiD在大肠杆菌中获得活性表达。

备注：表2中数据为3次测定的平均值±标准误差

由表2数据可知kfiD在大肠杆菌JM109中获得活性表达。

（3）pmHas和kfiD基因在大肠杆菌中共表达载体的构建：

根据构建好的pQEkfiD载体的T5:kfiDDNA 序列（序列表中SEQ ID NO：9）设计PCR引物，扩增T5 启动子驱动kfiD表达的片段 T5:kfiD，具体的引物序列是：

上游引物T5kfiD P1：5'-TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCAC_GTCGAGA-3'（序列表中SEQ ID NO：7），该引物含有 Sac I 位点,GAGCTC，其中下标G 表示将原始pQE80L载体中C突变为G，以消除其 Xhol 位点,CTCGAG；

下游引物T5kfiD P2：5'-TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'（序列表中SEQ ID NO：8），该引物含 Xho I site, CTCGAG；

引物由上海生工合成，PCR的模版用pQEkfiD载体，PCR 扩增的参数为：95℃、2min, 1个循环, 94℃、30s, 55℃、30s，72℃、1.5min ,25个循环，72℃、10 min，1个循环。纯化约1.4kb扩增产物, 首先连接入商用载体pGEM-T-Vector并转化大肠杆菌JM109菌株，获中间载体pT-T5KfiD，该载体中T5:kfiD（序列表中SEQ ID NO：9）片段，经测序分析证实核苷酸顺序无突变后，该插入T5:kfiD片段经Sac I和Xho I 双酶切后,连接入质粒pQEpmHas 的Sac I和sal I 位点而获pmHas和kfiD基因在大肠杆菌中共表达载体pQHK （见图2 A）。

实施例2：

高效产透明质酸的工程大肠杆菌重组表达载体（革兰氏阴性菌宿主广谱）pHK的构建：

为使pmHas和kfiD能在包括大肠杆菌在内的其他革兰氏阴性菌中表达，根据德国MoBiTec公司的革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)设计引物：

用上述上下引物来扩增质粒pBBR122中包含其复制位点及卡那霉素抗性基因在内的片段，PCR 扩增的参数为：95℃、2 min, 1个循环；94℃、30s, 55℃、30s，72℃、3 min , 25个循环；72℃、10 min 1个循环，纯化约3.2 kb扩增产物,用Sal I 酶解后，加入连接酶让其自连，自身连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，并用卡那霉素筛选获质粒pRP(序列表中SEQ ID NO：12)。在大肠杆菌JM109/pRP中提取质粒pRP, 用SalI酶解后连接入pQE80L, pQEpmHas 的XhoI位点后,分别获质粒pBQ和pBQpmHas. 将从pT-T5kfiD中用SacI 和XhoI 双酶切获得的T5:kfiD连接入载体pBQpmHas的SacI和SalI位点，或将SalI酶解的pRP片段连接入载体pQHK的XhoI 位点而获得在革兰氏阴性菌中能表达pmHas和kfiD以合成透明质酸的表达载体pHK（见图2 B）。

其中：商用载体pGEM-T-Vector 是从Promega 公司购买的产品, 该公司网站www.promega.com.cn，并且Promega公司提供载体pGEM-T-Vector的序列。革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122从德国MoBiTec公司购买，该革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122的DNA序列在NCBI 的GenBank的获取号为Y14439。

以上所述的重组载体pHK转入大肠杆菌JM109中，可获得高效产透明质酸的工程大肠杆菌pHK/JM109（CGMCC NO:3926）。

在含有50ug/ml卡那霉素和100ug/ml氨卞青霉素的LB平板上划线，37℃生长出pHK/JM109单菌落，该单菌落接种于相同抗生素浓度的LB，37℃，250rpm 摇床过夜培养，获种子菌。将种子菌以100稀释，37℃培养至OD600 达到0.4-0.5时,向培养液中加入终浓度达1mM的 IPTG并将培养温度降低到30℃ ，培养6小时以诱导pHK中pmHas和kfiD的表达。pHK中已表达pmHas和kfiD基因的细胞被5000rpm 10 min 离心收集用于pmHas和kfiD的表达量、酶活性测定及透明质酸的合成。经pmHas和kfiD酶活性检测（方法如上所述）证实pHK中pmHas和kfiD基因均能在大肠杆菌中活性表达（表1、表2和图3）。

以上所述的大肠杆菌菌株JM109为表达载体宿主菌株，是常用市售产品，可从生物化学、分子生物学公司（如，Sigma，Promega , 上海生工等）购买得到。

多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida ubsp. Multocida）菌株ATCC 15742为商用菌株，是从美国典型培养物保藏中心（简称ATCC）购得的保藏号为15742；

扩增的引物设计参考De Angelis PL 等, 1998 (DeAngelis, P.L et al，Identification and Molecular Cloning of a Unique Hyaluronan Synthase from Pasteurella multocida.J.Biol, Chem. 273, 8454–8458)报道的序列来进行设计,该序列在美国国家生物信息中（NCBI）的网站序列号为AF036004。

商用载体pQE80L从德国Qiagen 公司（www.qiagen.com,订货电话: 800-426-8157）购买，且该www.qiagen.com公布了载体pQE80L的序列。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司

<120> 高效产透明质酸工程大肠杆菌

<130> /

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2919

<212> DNA

<213> Pasteurella multocida subsp. Multocida(ATCC15742)

<400> 1

atgaatacat tatcacaagc aataaaagca tataacagca atgactatca attagcactc 60

aaattatttg aaaagtcggc ggaaatctat ggacggaaaa ttgttgaatt tcaaattacc 120

aaatgcaaag aaaaactctc agcacatcct tctgttaatt cagcacatct ttctgtaaat 180

aaagaagaaa aagtcaatgt ttgcgatagt ccgttagata ttgcaacaca actgttactt 240

tccaacgtaa aaaaattagt actttctgac tcggaaaaaa acacgttaaa aaataaatgg 300

aaattgctca ctgagaagaa atctgaaaat gcggaggtaa gagcggtcgc ccttgtacca 360

aaagattttc ccaaagatct ggttttagcg cctttacctg atcatgttaa tgattttaca 420

tggtacaaaa agcgaaagaa aagacttggc ataaaacctg aacatcaaca tgttggtctt 480

tctattatcg ttacaacatt caatcgacca gcaattttat cgattacatt agcctgttta 540

gtaaaccaaa aaacacatta cccgtttgaa gttatcgtga cagatgatgg tagtcaggaa 600

gatctatcac cgatcattcg ccaatatgaa aataaattgg atattcgcta cgtcagacaa 660

aaagataacg gttttcaagc cagtgccgct cggaatatgg gattacgctt agcaaaatat 720

gactttattg gcttactcga ctgtgatatg gcgccaaatc cattatgggt tcattcttat 780

gttgcagagc tattagaaga tgatgattta acaatcattg gtccaagaaa atacatcgat 840

acacaacata ttgacccaaa agacttctta aataacgcga gtttgcttga atcattacca 900

gaagtgaaaa ccaataatag tgttgccgca aaaggggaag gaacagtttc tctggattgg 960

cgcttagaac aattcgaaaa aacagaaaat ctccgcttat ccgattcgcc tttccgtttt 1020

tttgcggcgg gtaatgttgc tttcgctaaa aaatggctaa ataaatccgg tttctttgat 1080

gaggaattta atcactgggg tggagaagat gtggaatttg gatatcgctt attccgttac 1140

ggtagtttct ttaaaactat tgatggcatt atggcctacc atcaagagcc accaggtaaa 1200

gaaaatgaaa ccgatcgtga agcgggaaaa aatattacgc tcgatattat gagagaaaag 1260

gtcccttata tctatagaaa acttttacca atagaagatt cgcatatcaa tagagtacct 1320

ttagtttcaa tttatatccc agcttataac tgtgcaaact atattcaacg ttgcgtagat 1380

agtgcactga atcagactgt tgttgatctc gaggtttgta tttgtaacga tggttcaaca 1440

gataatacct tagaagtgat caataagctt tatggtaata atcctagggt acgcatcatg 1500

tctaaaccaa atggcggaat agcctcagca tcaaatgcag ccgtttcttt tgctaaaggt 1560

tattacattg ggcagttaga ttcagatgat tatcttgagc ctgatgcagt tgaactgtgt 1620

ttaaaagaat ttttaaaaga taaaacgcta gcttgtgttt ataccactaa tagaaacgtc 1680

aatccggatg gtagcttaat cgctaatggt tacaattggc cagaattttc acgagaaaaa 1740

ctcacaacgg ctatgattgc tcaccacttt agaatgttca cgattagagc ttggcattta 1800

actgatggat tcaatgaaaa aattgaaaat gccgtagact atgacatgtt cctcaaactc 1860

agtgaagttg gaaaatttaa acatcttaat aaaatctgct ataaccgtgt attacatggt 1920

gataacacat caattaagaa acttggcatt caaaagaaaa accattttgt tgtagtcaat 1980

cagtcattaa atagacaagg cataacttat tataattatg acgaatttga tgatttagat 2040

gaaagtagaa agtatatttt caataaaacc gctgaatatc aagaagagat tgatatctta 2100

aaagatatta aaatcatcca gaataaagat gccaaaatcg cagtcagtat tttttatccc 2160

aatacattaa acggcttagt gaaaaaacta aacaatatta ttgaatataa taaaaatata 2220

ttcgttattg ttctacatgt tgataagaat catcttacac cagatatcaa aaaagaaata 2280

ctagccttct atcataaaca tcaagtgaat attttactaa ataatgatat ctcatattac 2340

acgagtaata gattaataaa aactgaggcg catttaagta atattaataa attaagtcag 2400

ttaaatctaa attgtgaata catcattttt gataatcatg acagcctatt cgttaaaaat 2460

gacagctatg cttatatgaa aaaatatgat gtcggcatga atttctcagc attaacacat 2520

gattggatcg agaaaatcaa tgcgcatcca ccatttaaaa agctcattaa aacttatttt 2580

aatgacaatg acttaaaaag tatgaatgtg aaaggggcat cacaaggtat gtttatgacg 2640

tatgcgctag cgcatgagct tctgacgatt attaaagaag tcatcacatc ttgccagtca 2700

attgatagtg tgccagaata taacactgag gatatttggt tccaatttgc acttttaatc 2760

ttagaaaaga aaaccggcca tgtatttaat aaaacatcga ccctgactta tatgccttgg 2820

gaacgaaaat tacaatggac aaatgaacaa attgaaagtg caaaaagagg agaaaatata 2880

cctgttaaca agttcattat taatagtata actctataa 2919

<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> Escherichia coli K5(ATCC23500)

<400> 2

atgttcggaa cactaaaaat aactgtttca ggcgctggtt acgttgggct ttcaaatgga 60

attctaatgg ctcaaaatca tgaagtggtt gcatttgata cccatcaaaa aaaagttgac 120

ttacttaatg ataaactctc tcctatagag gataaggaaa ttgaaaatta tctttcaact 180

aaaatactta attttcgcgc aactactaac aaatatgaag cctataaaaa tgccaattac 240

gttattattg ctacaccaac gaattatgac ccaggttcaa attactttga tacatcaagc 300

gttgaagctg tcattcgtga cgtaacggaa atcaacccaa acgcaattat ggtggttaaa 360

tctacggtcc cagtaggttt cacaaaaaca attaaagaac atttaggtat taataatatt 420

atcttctctc cagaattttt acgagaagga agagccctat acgataatct ccatccatct 480

cgcattatta tcggtgaatg ttctgaacgg gcagaacgtt tggcagtgtt atttcaggaa 540

ggagcgatta aacaaaatat acccgtttta tttacagatt ctacggaagc ggaagcgatt 600

aagttatttt caaatactta tttggctatg cgagttgcat tttttaatga attggatagt 660

tacgcagaaa gttttggtct gaatacgcgt cagattattg acggtgtttg tttggatccg 720

cgcattggta attactacaa taatccttct tttggttatg gtggctactg tttgccaaaa 780

gataccaagc aattattagc caactatcag tctgttccga ataaacttat atctgcaatt 840

gttgatgcta accgtacacg taaggacttt atcactaatg ttattttgaa acatagacca 900

caagttgtgg gggtttatcg tttgattatg aaaagtggtt cagataattt tagagattct 960

tctattcttg gtattataaa gcgtatcaag aaaaaaggcg tgaaagtaat tatttatgag 1020

ccgcttattt ctggagatac attctttaac tcacctttgg aacgggagct ggcgatcttt 1080

aaagggaaag ctgatattat tatcactaac cgaatgtcag aggagttgaa cgatgtggtc 1140

gacaaagtct atagtcgcga tttgtttaaa tgtgactaa 1179

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 3

taggatccat gaacacatta tcacaagcaa t 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 4

tagagctctt atagagttat actattaata at 32

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 5

tggagatcta tgttcggaac actaaaaata actg 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 6

ttctcgagtt agtcacattt aaacaaatcg cgac 34

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 7

tagagctccc tttcgtcttc acgtcgaga 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 8

tactcgagtt ctgaggtcat tactggatct 30

<210> 9

<211> 1423

<212> DNA

<213> 工程构建片段

<400> 9

tagagctccc tttcgtcttc acgtcgagaa atcataaaaa atttatttgc tttgtgagcg 60

gataacaatt ataatagatt caattgtgag cggataacaa tttcacacag aattcattaa 120

agaggagaaa ttaactatga gaggatcgca tcaccatcac catcacggat ctatgttcgg 180

aacactaaaa ataactgttt caggcgctgg ttacgttggg ctttcaaatg gaattctaat 240

ggctcaaaat catgaagtgg ttgcatttga tacccatcaa aaaaaagttg acttacttaa 300

tgataaactc tctcctatag aggataagga aattgaaaat tatctttcaa ctaaaatact 360

taattttcgc gcaactacta acaaatatga agcctataaa aatgccaatt acgttattat 420

tgctacacca acgaattatg acccaggttc aaattacttt gatacatcaa gcgttgaagc 480

tgtcattcgt gacgtaacgg aaatcaaccc aaacgcaatt atggtggtta aatctacggt 540

cccagtaggt ttcacaaaaa caattaaaga acatttaggt attaataata ttatcttctc 600

tccagaattt ttacgagaag gaagagccct atacgataat ctccatccat ctcgcattat 660

tatcggtgaa tgttctgaac gggcagaacg tttggcagtg ttatttcagg aaggagcgat 720

taaacaaaat atacccgttt tatttacaga ttctacggaa gcggaagcga ttaagttatt 780

ttcaaatact tatttggcta tgcgagttgc attttttaat gaattggata gttacgcaga 840

aagttttggt ctgaatacgc gtcagattat tgacggtgtt tgtttggatc cgcgcattgg 900

taattactac aataatcctt cttttggtta tggtggctac tgtttgccaa aagataccaa 960

gcaattatta gccaactatc agtctgttcc gaataaactt atatctgcaa ttgttgatgc 1020

taaccgtaca cgtaaggact ttatcactaa tgttattttg aaacatagac cacaagttgt 1080

gggggtttat cgtttgatta tgaaaagtgg ttcagataat tttagagatt cttctattct 1140

tggtattata aagcgtatca agaaaaaagg cgtgaaagta attatttatg agccgcttat 1200

ttctggagat acattcttta actcaccttt ggaacgggag ctggcgatct ttaaagggaa 1260

agctgatatt attatcacta accgaatgtc agaggagttg aacgatgtgg tcgacaaagt 1320

ctatagtcgc gatttgttta aatgtgacta actcgaccca agcttaatta gctgagcttg 1380

gactcctgtt gatagatcca gtaatgacct cagaactcga gta 1423

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 10

tggtgtcgac cttgccagcc cgtggatatg tgg 33

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成DNA

<400> 11

aggtgtcgac tctgtgatgg cttccatgtc ggcag 35

<210> 12

<211> 3266

<212> DNA

<213> pBBR122

<400> 12

gtcgaccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc gagcggccac cggctggctc 60

gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga tggacaggct gcgcctgccc 120

acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc ttcgaccaca tacccaccgg 180

ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt ttaattttct ctggggaaaa 240

gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg acaccaagtg gaaggcgggt 300

caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac gcgcctggaa cgacccaagc 360

ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc tgccccccga gacctgcagg 420

gggggggggg cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg 480

aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta 540

ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg 600

aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg 660

tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag 720

aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca 780

tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg 840

atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt 900

aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa 960

tccggtgaga atggcaaaag cttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca 1020

ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc 1080

tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc 1140

aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct 1200

tctaatacct ggaatgctgt tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca 1260

ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt 1320

ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac 1380

tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta 1440

tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc 1500

gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa 1560

gcagacagtt ttattgttca tgatgatata tttttatctt gtgcaatgta acatcagaga 1620

ttttgagaca caacgtggct ttcccccccc cccctgcagg tcccgagcct cacggcggcg 1680

agtgcggggg ttccaagggg gcagcgccac cttgggcaag gccgaaggcc gcgcagtcga 1740

tcaacaagcc ccggaggggc cactttttgc cggaggggga gccgcgccga aggcgtgggg 1800

gaaccccgca ggggtgccct tctttgggca ccaaagaact agatataggg cgaaatgcga 1860

aagacttaaa aatcaacaac ttaaaaaagg ggggtacgca acagctcatt gcggcacccc 1920

ccgcaatagc tcattgcgta ggttaaagaa aatctgtaat tgactgccac ttttacgcaa 1980

cgcataattg ttgtcgcgct gccgaaaagt tgcagctgat tgcgcatggt gccgcaaccg 2040

tgcggcaccc taccgcatgg agataagcat ggccacgcag tccagagaaa tcggcattca 2100

agccaagaac aagcccggtc actgggtgca aacggaacgc aaagcgcatg aggcgtgggc 2160

cgggcttatt gcgaggaaac ccacggcggc aatgctgctg catcacctcg tggcgcagat 2220

gggccaccag aacgccgtgg tggtcagcca gaagacactt tccaagctca tcggacgttc 2280

tttgcggacg gtccaatacg cagtcaagga cttggtggcc gagcgctgga tctccgtcgt 2340

gaagctcaac ggccccggca ccgtgtcggc ctacgtggtc aatgaccgcg tggcgtgggg 2400

ccagccccgc gaccagttgc gcctgtcggt gttcagtgcc gccgtggtgg ttgatcacga 2460

cgaccaggac gaatcgctgt tggggcatgg cgacctgcgc cgcatcccga ccctgtatcc 2520

gggcgagcag caactaccga ccggccccgg cgaggagccg cccagccagc ccggcattcc 2580

gggcatggaa ccagacctgc cagccttgac cgaaacggag gaatgggaac ggcgcgggca 2640

gcagcgcctg ccgatgcccg atgagccgtg ttttctggac gatggcgagc cgttggagcc 2700

gccgacacgg gtcacgctgc cgcgccggta gcacttgggt tgcgcagcaa cccgtaagtg 2760

cgctgttcca gactatcggc tgtagccgcc tcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg 2820

cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct 2880

cgctaacgga ttcaccgttt ttatcaggct ctgggaggca gaataaatga tcatatcgtc 2940

aattattacc tccacgggga gagcctgagc aaactggcct caggcatttg agaagcacac 3000

ggtcacactg cttccggtag tcaataaacc ggtaaaccag caatagacat aagcggctat 3060

ttaacgaccc tgccctgaac cgacgaccgg gtcgaatttg ctttcgaatt tctgccattc 3120

atccgcttat tatacttatt caggcgtagc accaggcgtt taagggcacc aataactgcc 3180

ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat 3240

tctgccgaca tggaagccat cacaga 3266

Claims

1.一种产透明质酸重组表达载体pQHK，其特征在于含有透明质酸合成酶基因pmHas，T5 启动子与尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的基因片段T5:kfiD和起始构建载体pQE80L，由T5启动子驱动透明质酸合成酶基因pmHas和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的共表达；所述的透明质酸合成酶基因pmHas的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因片段T5:kfiD的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

2.权利要求1所述的产透明质酸重组表达载体pQHK的构建方法，其特征在于按以下步骤进行：

上游引物pmHas P1 为 5'-TAGGATCC ATGAACACATTATCACAAGCAAT-3'(序列表中SEQ ID No:3)，含Bam H I位点GGATCC和起始密码子ATG；

下游引物为pmHasP2 为 5'-TAGAGCTC TTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3'(序列表中SEQ ID No:4)，含Sac I位点GAGCTC和终止密码子TAA；

PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经Bam H I和Sac I双酶切后,连接入商用载体pQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA 测序确证无突变后,将所获载体命名为pQEpmHas，基因为pmHas（序列表中SEQ ID No:1）；

（2）构建含尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的表达载体pQEkfiD，用PCR扩增方法克隆源自源于大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）菌株k5中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因（K₅ capsule gene D，kfiD），扩增的引物设计如下:

PCR的模版为大肠杆菌菌k5菌株ATCC 23500的基因组ＤＮＡ,成功扩增并纯化的产物, 经Ｂgl II和Xho I双酶切后,连接入Qiagen 公司的商用载体pQE80L的Bam H I和Sal I位点,所得载体经DNA 测序分析确证插入片段无突变后，所获载体命名为pQEkfiD，相应基因命名为kfiD基因（序列表中SEQ ID No:2）；

根据构建好的pQEkfiD载体的DNA 序列设计PCR引物，扩增T5 启动子驱动kfiD表达的片段 T5:kfiD，引物序列设计如下：

上游引物T5kfiD P1：5'-TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCAC_GTCGAGA-3'（序列表中SEQ ID No:7），该引物含有Sac I 位点,GAGCTC，其中下标G 表示将原始pQE80L载体中C突变为G，以消除其Xhol 位点,CTCGAG；

PCR的模版用pQEkfiD载体，纯化的T5:kfiD扩增产物, 首先连接入pGEM-T-Vector并转化大肠杆菌JM109菌株，获中间载体pT-T5KfiD，该载体中T5:kfiD（序列表中SEQ ID No:9）片段，经测序分析证实核苷酸顺序无突变后，该插入pT-T5KfiD片段经Sac I和Xho I 双酶切后,连接入表达载体pQEpmHas的Sac I和sal I 位点而获pmHas和kfiD基因在大肠杆菌中共表达的重组载体pQHK。

3.一种产透明质酸重组表达载体pHK的构建方法，其特征在于含有透明质酸合成酶基因pmHas，T5 启动子与尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的基因片段T5:kfiD，出发载体pQE80L和含革兰氏阴性菌中复制必需和表达卡那霉素抗性元件的质粒pRP；pHK含 T5启动子驱动透明质酸合成酶基因pmHas和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的共表达；所述的透明质酸合成酶基因pmHas的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因片段T5:kfiD的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述的质粒pRP的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求3所述的产透明质酸重组表达载体pHK的构建方法，其特征在于用德国MoBiTec公司的革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)设计引物：

上游引物PBBR P1:5'-TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中SEQ ID NO：10)；含有SalI酶切位点，GTCGAC；

下游引物PBBR P1：5'-TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3' (序列表中SEQ ID NO：11) ，含有SalI酶切位点，GTCGAC；

用上述引物扩增质粒pBBR122中包含其复制位点及卡那霉素抗性基因在内的片段，PCR 扩增的参数为：95℃、2 min, 1个循环；94℃、30s, 55℃、30s， 72℃、3 min, 25 个循环；72℃、10 min 1个循环，纯化3.2 kb扩增产物,用Sal I 酶解后，加入连接酶让其自连，自身连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，并用卡那霉素筛选获质粒pRP(序列表中SEQ ID NO：12)，提取质粒pRP,经SalI酶解后，连接入权利要求2中所述的能在大肠杆菌中共表达pmHas和kfiD基因的pQHK的XhoI 位点，获得在革兰氏阴性菌中共表达pmHas和kfiD来合成透明质酸的表达载体pHK。