CN113136380B - 一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16‑1，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述广谱型多糖降解酶rAly16‑1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQID NO.1所示；密码子优化后的广谱型多糖降解酶rAly16‑1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，氨基酸序列与原氨基酸序列一致；广谱型多糖降解酶rAly16‑1是首次发现的属于PL‑8家族的褐藻胶裂解酶，该酶能够降解包括硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸皮肤素(HS/DS)、黄原胶、褐藻胶在内的多种酸性多糖，且以褐藻胶为最适底物。

Description

一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基 因与应用

技术领域

本发明涉及一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

技术背景

生物质多糖(Polysaccharide)在自然界分布极广，几乎存在于所有生物体中^[1]，如构成动植物细胞壁的肽聚糖和纤维素^[2]；作为动植物储藏养分的糖原和淀粉；甲壳类动物外骨骼中的结构多糖几丁质^[3]。研究表明，部分多糖及其系列寡糖具有抗凝血、抗氧化^[4,5]、抗肿瘤^[6,7]、抗病毒^[8]、抗辐射等特殊的生物活性，参与分子识别、细胞信号转导与病毒侵染等生理过程^[9 _, ^10]。多糖降解酶能催化多糖分子内糖苷键断裂并产生低聚合度的寡糖或单糖，是实现高效利用生物质多糖的关键，且用酶催化多糖实现寡糖制备的绿色生产方式具有较大的开发潜力^[11]。随着生物质多糖结构的解析以及大量多糖降解酶的鉴定研究，通过蛋白质工程定制的专一性多糖降解酶分子可获得更高的催化效率、更优的稳定性，但对于复杂的多糖而言，专一性多糖降解酶分子仍具有非常有限的降解活性，使用单一酶难以完成生物质多糖的彻底降解。专一性多糖降解酶已有广泛研究，但仍属于基础研究，关于工具酶的改造、催化特性及应用特色系统分析较少。广谱型多糖降解酶是一类能降解多种多糖的降解酶^[12,13]，能够实现“一酶多能”，目前少见报道，具有较大的开发运用潜力。

褐藻胶是一种来源于褐藻的水溶性酸性多糖，是由α-1,4-L-古罗糖醛酸(α-1,4-L-guluronate，G)和β-1,4-D-甘露糖醛酸(β-1,4-D-mannuronate，M)组成的嵌段高聚物，长链分子中含有均聚(G)n段、均聚(M)n段及(GM)n自由杂聚段。

褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶(Polysaccharide Lyase,PL)，通过β消去反应催化糖苷键的断裂，从而生成含不饱和末端结构的低聚糖，并在232nm附近具有特征吸收^[14]。多糖裂解酶系可归类为22个家族，依据对其初级结构疏水区域的分析，褐藻胶裂解酶归属于十二个家族，PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17、PL-18、PL-31、PL-32、PL-34、PL-36、PL-39，关于属于PL-8家族的褐藻胶裂解酶未见报道。目前，关于褐藻胶裂解酶的资源发掘、生化特征与分子改造等相关研究较多，但其中关于酶的底物选择性、底物降解模式与寡糖生成特性的研究较少，尤其大多数褐藻胶裂解酶仅见其对褐藻胶底物的降解报道^[15,16]，几乎未见报道既能降解褐藻胶的同时又能降解其他多种多糖的广谱型多糖降解酶。整体上，未见关于具有M-专一性的广谱型褐藻胶内切酶的催化特性及相应机制的深入研究，因此缺少相关规律性的机制与认知，并给酶的精确运用及定向分子酶学改造带来困难。

现有技术中，发现一个酶含有多功能模块，从而催化不同多糖底物生成寡糖的特性，但是这种发现仅限于中性多糖(如，琼脂糖、淀粉和卡拉胶等)，在酸性多糖中未见报道。

本研究团队以上问题进行了深入研究，研究对象是分离自四川四姑娘山川贝母根系的放线菌(Streptomyces sp.)CB16。前期的研究发现其能在14种不同多糖为唯一碳源的条件下生长^[17]。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用。

本发明涉及的广谱型多糖降解酶rAly16-1是首次发现的属于PL-8家族的褐藻胶裂解酶，该酶能够降解包括硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸皮肤素(HS/DS)、黄原胶(Xanthan)、褐藻胶(Alginate)在内的多种酸性多糖，且以褐藻胶为最适底物。

下面内容中Δ为不饱和单糖、X是指G或M；所述M为β-1,4-D-甘露糖醛酸，G为α-1,4-L-古罗糖醛酸。

广谱型多糖降解酶rAly16-1简称“rAly16-1”

本发明的技术方案如下：

一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16-1，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

链霉菌(Streptomyces sp.)CB16来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年4月11日，保藏编号CGMCC No.12351。

上述广谱型多糖降解酶rAly16-1，仅含有一个结构域，即归类与PL-8家族的GAG_Lyase superfamily。

上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，所编码蛋白质含有809个氨基酸，分子量约为85.4kD。

一种重组表达载体Ⅰ，包含上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870。

一种重组菌Ⅰ，包含上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870。

上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870、重组表达载体Ⅰ、重组菌Ⅰ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。

一种密码子优化后的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示。

一种重组表达载体Ⅱ，包含上述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870。

一种重组菌Ⅱ，包含上述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870。

上述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870、重组表达载体Ⅱ、重组菌Ⅱ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。

上述广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解多糖中的应用。

根据本发明优选的，所述多糖为酸性多糖。

进一步优选的，所述酸性多糖为硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸皮肤素(HS/DS)、透明质酸(HA)、黄原胶(Xanthan)、褐藻胶(Alginate)。

更优选的，所述酸性多糖为褐藻胶(Alginate)。

更优选的，所述酸性多糖为褐藻胶(Alginate)、高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶(PolyM)、高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly G)、系列饱和甘露糖醛酸寡糖(M2-M8)、系列饱和古洛糖醛酸寡糖(G2-G8)、系列特征不饱和寡糖(UDP2-UDP8)。

上述广谱型多糖降解酶rAly16-1在生产非还原端含有ΔM末端结构的不饱和寡糖、不饱和单糖中的应用。

一种广谱型多糖降解酶rAly16-1突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ IDNO.3的第356位和/或第305位氨基酸。

根据本发明优选的，所述突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ ID NO.3的第356位氨基酸由赖氨酸突变为亮氨酸。

进一步优选的，所述突变酶的编码基因，根据上述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2上进行定点突变。

一种重组表达载体Ⅲ，包含上述突变酶的编码基因。

一种重组菌Ⅲ，包含上述突变酶的编码基因。

上述突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅲ、重组菌Ⅲ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1突变酶中的应用。

根据本发明优选的，所述突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ ID NO.3的第305为氨基酸由精氨酸突变为天冬氨酸。

进一步优选的，所述突变酶的编码基因，根据上述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2上进行定点突变。

一种重组表达载体Ⅳ，包含上述突变酶的编码基因。

一种重组菌Ⅳ，包含上述突变酶的编码基因。

上述突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅳ、重组菌Ⅳ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1突变酶中的应用。

上述广谱型多糖降解酶rAly16-1突变酶在降解多糖中的应用。

根据本发明优选的，所述多糖为酸性多糖。

进一步优选的，所述酸性多糖为硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸皮肤素(HS/DS)、透明质酸(HA)。

更优选的，所述酸性多糖为硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)。

有益效果

1、发明首次公开了由链霉菌属细菌(Streptomyces sp.)CB16的基因组中获得一种以褐藻胶为最适底物的M-专一性广谱多糖降解酶rAly16-1，是首次报道的来自于PL8家族的以褐藻胶为最适底物的广谱型多糖降解酶，该酶与现有已知广谱型多糖降解酶具有显著差异，理化性质稳定、活性高，具备工业应用的潜质。

2、本发明所制备的广谱型多糖降解酶rAly16-1分别对褐藻胶、高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly M)或高古洛糖醛酸褐藻胶(Poly G)的酶活可达到2134U/mg、15284.2U/mg、4381U/mg，适用于系列不饱和寡糖的生产。

3、本发明制备的广谱型多糖降解酶rAly16-1，在降解褐藻胶时易于降解富含M的糖链，因此推测不完全降解褐藻胶时的寡糖中间产物主要是富含M的片段，即MMMXn、GMMXn、ΔMMXn(n≥1，且为自然数，Δ为不饱和单糖、X是指G或M)。对其进一步降解从而得到系列非还原末端为ΔM的系列不饱和寡糖片段。特别的，rAly16-1特性在于更易于降解ΔMXn(n≥1，且为自然数，Δ为不饱和单糖、X是指G或M)或ΔGXXn(n≥1，且为自然数，Δ为不饱和单糖、X是指G或M)不饱和糖链，由此生成最终主产物包括不饱和二糖、Δ及其转化产物的系列以ΔM为非还原性末端的富含G的不饱和寡糖片段。因此，可用于降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段和不饱和单糖Δ。

4、本发明制备的广谱型多糖降解酶rAly16-1的系列突变体，揭示了该酶特异性降解M片段及对CSA、CSC降解活性显著提高的关键。

附图说明

图1、多糖降解酶rAly16-1功能模块构成的BLASTp分析结果(A)及与已鉴定的蛋白系统进化分析(B)。

图2、多糖降解酶rAly16-1的表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；

图中：泳道1、蛋白质分子量标准，条带自上而下大小分别是：116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道2、对照菌株破壁全菌液，上样量4μL；泳道3、重组菌破壁全菌液，上样量4μL；泳道4、重组菌破壁后上清，上样量4μL；泳道5、经镍柱纯化的多糖降解酶rAly16-1，上样量0.5μL。

图3、多糖降解酶rAly16-1对多糖降解能力分析柱状图。

图4、多糖降解酶rAly16-1降解多糖的产物TLC检测图；

图中：M，褐藻胶裂解酶rAlgL-Pae制备的不饱和寡糖(UDP2～UDP6)；泳道1，HA byE(-)；泳道2，HA by E(+)；泳道3，CSA by E(-)；泳道4，CSA by E(+)；泳道5，CSC by E(-)；泳道6，CSC by E(+)；泳道7，CSE by E(-)；泳道8，CSE by E(+)；泳道9，Xanthan by E(-)；泳道10，Xanthan by E(+)；泳道11，HS/DS by E(-)；泳道12，HS/DS by E(+)；泳道13，Alginate by E(-)；泳道14，Alginate by E(+)，上样量均为4μg；E(-)为不加rAly16-1，即阴性对照组。E(+)为加rAly16-1，即阳性实验组。

图5、多糖降解酶rAly16-1降解多糖的产物分子凝胶色谱-HPLC分析图；

图中：E(-)为不加rAly16-1，即阴性对照组；

A，褐藻胶降解产物；B，HA、CSA、CSC、CSE、HS/DS及Xanthan解产物。

图6、多糖降解酶rAly16-1降解多糖的产物¹H-NMR检测图；

图中：E(-)为不加rAly16-1，即阴性对照组，E(+)为加rAly16-1，即阳性实验组。

图7、温度对多糖降解酶rAly16-1活性的影响曲线图。

图8、pH值对多糖降解酶rAly16-1活性及稳定性的影响曲线图。

图9、温度对多糖降解酶rAly16-1稳定性的影响曲线图。

图10、金属离子及化学试剂对多糖降解酶rAly16-1活性的影响柱形图。

图11、多糖降解酶rAly16-1降解褐藻胶过程中寡糖产物的分子凝胶色谱-HPLC分析图；

图中：E(-)为不加rAly16-1，即阴性对照组；

(1)UDP2，不饱和二糖；(2)UDP3，不饱和三糖；(3)UDP4，不饱和四糖；(4)UDP5，不饱和五糖；(5)UDP6，不饱和六糖；(6)UDP7，不饱和七糖；(7)UDP8，不饱和八糖。

图12、用多糖降解酶rAly16-1彻底降解褐藻胶后所制备的不饱和寡糖片段分析图；

图中：A为UDP2、UDP3、UDP4、UDP5、UDP6、UDP7和UDP8的HPLC分析图；

B为¹H-NMR分析图。

图13、用多糖降解酶rAly16-1彻底降解系列饱和寡糖分析图；

图中：E(-)为不加rAly16-1，即阴性对照组；

A为M2-M8的HPLC分析图；

B为切割模式图；

C为G2-G8的HPLC分析图。

图14、用多糖降解酶rAly16-1彻底降解还原性末端被2-AB标记的饱和寡糖分析图；

图中：E(-)为不加rAly16-1，即阴性对照组；

A为M2-M6的HPLC分析图；

B为降解2AB-M5过程中寡糖产物HPLC分析图；

C为降解2AB-M6(C)过程中寡糖产物HPLC分析图；

D为G5-G6的HPLC分析图。

图15、用多糖降解酶rAly16-1降解还原性末端被2-AB标记的饱和M寡糖的模式图。

图16、用多糖降解酶rAly16-1降解特征不饱和寡糖UDP2-UDP8的HPLC检测图；

图中：E(-)与(-)为不加rAly16-1，即阴性对照组；

A、用M倾向性重组褐藻胶单糖外切酶Aly6不完全降解褐藻胶制备的系列不饱和寡糖，且经¹H-NMR分析证实非还原性末端均仅含ΔG；

B、多糖降解酶rAlgL-Pae完全降解褐藻胶制备的UDP3的非还原性末端有ΔG

和ΔM两种类型，且二者摩尔比约为1：1；

C、多糖降解酶rAly16-1完全降解褐藻胶制备且经¹H-NMR鉴定仅含ΔM非

还原性末端的系列不饱和寡糖。

图17、用多糖降解酶rAly16-1降解三维结构及晶体结构对比；

图中：

A为rAly16-1蛋白三维结构；

B为rAly16-1蛋白晶体结构；

C为模板蛋白透明质酸酶SpnHL(PDB号为1loh)晶体结构；

D为二者晶体结构对比，红色为rAly16-1蛋白晶体，绿色为SpnHL蛋白晶体；

E中绿色部位为rAly16-1晶体结构催化腔关键位点残基；

F为Q463G晶体结构；

G为N165G晶体结构。

图18、多糖降解酶rAly16-1与四种褐藻胶六糖分子对接图；

图中：

A为对接图；

B为对接结果对比图；

图中：红色为饱和M六糖，绿色为不饱和M六糖，黄色为饱和G六糖，蓝色为不饱和G六糖。

图19、多糖降解酶rAly16-1突变体酶对不同M/G比例褐藻胶降解能力分析；

图中：A，褐藻胶；B，富含M嵌段的褐藻胶；C：富含G嵌段的褐藻胶。

图20、多糖降解酶rAly16-1突变体K356L、R305D分别降解CSA、CSC多糖降解产物的HPLC图；

图中：A，CSC；B，CSA。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

生物材料来源

链霉菌(Streptomyces sp.)CB16来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年4与11日，保藏编号CGMCC No.12351。

本发明所用褐藻胶、硫酸皮肤素、透明质酸购买自Sigma，硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素E、黄原胶购买自Seikagaku，咪唑购买自Amresco，邻氨基苯甲酰胺购买自Sigma-aldrich，高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly M)、高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly G)、及褐藻胶系列饱和寡糖购买自青岛博智汇力生物科技有限公司。

实施例1

链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株基因组DNA的提取

将链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株接种至TSB液体培养基中，28℃、200rpm条件下，振荡培养至600nm吸光值(OD₆₀₀)为1.21；取培养菌液20mL，28℃、12,000×g(g，地球引力常数)条件下离心20min，收集菌体沉淀。

上述TBS液体培养基，其组成为：胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，pH 7.2。

向上述菌体沉淀中，加入溶菌酶缓冲液12.0mL，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶560μL，其终浓度约800μg/mL；置于冰水浴中1.0h，然后转移至37℃水浴中，温浴2h，至反应体系粘稠；加入浓度为100mg/mL的十六烷基磺酸钠溶液0.82m L、100mg/m L的蛋白酶K溶液60μL，在52℃温浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；在10,000×g、4℃条件下离心10min，收集上清，并加入2.0m L的NaAc-HAc(pH 5.2,3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇(贮于-20℃)，充分混匀；用枪头挑出丝状DNA，转移至1.5m L的离心管中，以70％乙醇，洗涤2次，微离心后弃掉上清；在10,000×g、4℃条件下离心2min，彻底弃掉上清；将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4℃过夜溶解DNA样品，制得基因组DNA。

实施例2

链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株基因组的扫描及其序列分析

采用焦磷酸测序技术进行实施例1制得的基因组DNA的扫描测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI(National Center for Biotechnology Informationh,ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的在线软件对DNA测序结果进行分析。所用到的NCBI网站的分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local Alignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

用上述生物学软件分析的结果显示，链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株基因组DNA上携带1个候选的多糖降解酶基因orf03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的多糖降解酶rAly16-1中有809个氨基酸，且N-端1-38位氨基酸为Ⅰ型信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。用BLAST软件在线分析，结果显示，多糖降解酶rAly16-1含有一个假定结构域，即GAG_Lyase superfamily(如图1-A所示)。系统发育树分析则表明，orf03870与PL8家族多糖降解酶聚集成簇(如图1-B所示)，其中，与Bacillus sp.来源的xanthan lyase(NCBI收录号：BAB21059.1)、Paenibacillus alginolyticus来源的XalA lyase(NCBI收录号：AAG24953.1)、Paenibacillus nanensis来源的xanthan lyase(NCBI收录号：AXR85425.1)、Streptomyces coelicolor来源的(NCBI收录号：CAA19982.1)聚类，该系统发育树中的除以上所述蛋白序列其余均是透明质酸裂解酶。且在已鉴定PL8家族多糖降解酶中，orf03870与Streptomyces coelicolor来源的CAA19982.1序列一致性最高为36.65％，提示rAly16-1具有一定的序列新颖性。

实施例3

基因orf03870在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的重组表达

以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：

正向引物orf03870-F：5’-gcatatgTCCGGCACGGCACGGACCG-3’(Nde I)SEQ IDNO.4；

反向引物orf03870-R：5’-gtctagaGCTCCTCTTCAGGGTGAGGCC-3’(Xba I)SEQ IDNO.5；

正向引物orf03870-F中下划线标注的是限制性内切酶Nde I位点，反向引物orf03870-R下划线标注的是限制性内切酶Xba I位点。所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HSDNA Polymer购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；98℃变性30秒；65℃退火30s；72℃延伸170s；35个循环；72℃延伸10min；5℃稳定10min。

将PCR产物与pEASY-Blunt simple vector进行连接，并转化至大肠杆菌Trans1-T1菌株，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用扩增引物进行PCR验证；将验证正确的重组质粒用Nde I和Xba I双酶切并与同样经过双酶切的pET30a质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有100μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有100μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；对质粒进行双酶切验证，结果得到大小为2.3kb的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在pET30a质粒的体Nde I和Xba I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的基因orf03870，且插入方向正确，所以进一步证明构建重组质粒正确，并将该重组质粒命名为pET30a-03870。

将重组质粒pET30a-03870转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤，使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行多糖降解酶rAly16-1的诱导表达。在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用缓冲液A(50mMTris，150mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎。在15,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集水溶性组分，并用Ni-琼脂糖凝胶对多糖降解酶rAly16-1进行纯化。用含有咪唑浓度为10、50、250、500mM的缓冲液A(50mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0)进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测多糖降解酶rAly16-1的纯化情况。重组质粒pET30a-03870在E.coli BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导表达后表达量极低，于是对基因orf03870进行密码子优化，获得密码子优化后的多糖降解酶rAly16-1编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；该序列对应的多糖降解酶rAly16-1氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示，并获得插入如SEQ IDNO.2所示基因的重组质粒pET30a-YH03870。随后按照相同方式获得重组质粒pET30a-YH03870表达产物，如图2所示，经镍柱亲和层析纯化后的多糖降解酶rAly16-1在电泳上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的多糖降解酶rAly16-1样品装入最小分子截留量为10kDa的透析袋，在4℃环境中进行透析，制得的多糖降解酶rAly16-1酶液，该酶液浓度为2μg/μL，并以此酶液进行后续实验。

实施例4

多糖降解酶rAly16-1的底物谱分析

将用去离子水配制的质量体积浓度分别为12g/L的纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、淀粉、果胶、琼脂、甘露聚糖、褐藻胶、卡拉胶、κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、τ-卡拉胶、透明质酸(HA)、硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸皮肤素(HS/DS)、几丁质、黄原胶(Xanthan)与实施例3制得的多糖降解酶rAly16-1酶液、150mM的HAc-NaAc(pH 6.0)缓冲液以体积比1：1：1的比例混合后50℃反应72h。将反应产物在沸水浴中加热10min灭活酶，转入冰水浴中5min，在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。分别进行DNS、TLC、HPLC和¹H-NMR分析。将一定体积的上清与等体积的DNS(3,5-对硝基二甲苯)反应液混匀，在沸水浴中加热10min，降至室温，在540nm测定吸光值。以多糖底物为横坐标，OD₅₄₀读数为纵坐标绘制多糖降解酶rAly16-1对多糖降解能力的柱状图。

取部分上述所得的反应液上清，进行TLC分析，所用为Gel silca 60F254硅胶板，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝4：6：1(体积比)，展开时间25min。展开结束后，将硅胶板烘干，用苯胺显色液(苯胺：二苯胺：磷酸：丙酮＝1g：1mL：5mL：500mL)喷洒，110℃加热10min显色。

用浓度为0.2M的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将部分上述所得的反应液上清，以自动进样器加载20μg/样品，其它条件不变，232nm检测。另取部分上述所得的反应液上清，反复冷冻干燥除盐，并用重水(D₂O)溶解所得的反应样品，以完成氢氘置换，并进行¹H-NMR数据分析。

结果如图3，4和5所示，多糖降解酶rAly16-1能微弱降解透明质酸(HA)、硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸肝素/硫酸皮肤素(HS/DS)、黄原胶(Xanthan)，能较好降解褐藻胶(Alginate)。进一步地如图6所示，在局部放大图5.6ppm处，HS/DS，HA，CSA，CSC，CSE，Xanthan阳性与阴性相比吸收峰均有明显增高，这表明多糖降解酶rAly16-1的作用使氢吸收增加，说明rAly16-1能够降解HA，CSA，CSC，CSE，Xanthan，HS/DS而形成不饱和末端。并且其对褐藻胶的活性最高，因此该多糖降解酶rAly16-1是以褐藻胶为最适底物的广谱型多糖降解酶，将其命名为广谱型多糖降解酶rAly16-1。

实施例5

广谱型多糖降解酶rAly16-1最适温度的测定

用去离子水配制质量体积浓度分别为12g/L褐藻胶底物，加热溶解后，置于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴环境孵育1h。向每100μL底物溶液中添加100μL缓冲液(150mM的NaAc-HAc,pH6.0)、70μL去离子水及30μL实施例3制得的广谱型多糖降解酶rAly16-1，混匀后继续反应12h。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的广谱型多糖降解酶rAly16-1为对照组。用DNS-还原糖法测定各个反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为该酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。

结果如图7所示：以褐藻胶为底物测定酶活时，广谱型多糖降解酶rAly16-1在50℃反应时达到最大活力，这表明广谱型多糖降解酶rAly16-1的最适反应温度是50℃。在高于50℃和低于20℃时展示出的相对酶活均低于60％，这表明广谱型多糖降解酶rAly16-1活性具有严格的温度依赖性。

实施例6

广谱型多糖降解酶最适pH及pH稳定性的测定

分别用浓度为150mM的NaAc-HAc缓冲液、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、Tris-HCl缓冲液，分别与褐藻胶配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物，所对应的pH值分别为5、6，6、7、8，8、9、10三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物溶解后置于最适温度中孵育1h，然后向每100μL底物溶液中添加100μL上述各缓冲液、70μL去离子水及30μL实施例3制得的广谱型多糖降解酶rAly16-1，混匀后继续反应12h。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的该酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应pH为多糖降解酶的最适pH，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。

同时将30μL实施例3制得的广谱型多糖降解酶rAly16-1与100μL上述各缓冲液混匀，置于在0℃环境中分别孵育2h后，与100μL质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液酶活定义为100％相对活力。

结果如图8所示：广谱型多糖降解酶rAly16-1的最适反应pH为6.0。在pH偏酸或偏碱性环境中，rAly16-1的相对酶活在50％以下，这些结果显示该酶具有较窄的pH反应活性。pH稳定性实验结果则表明广谱型多糖降解酶rAly16-1在pH 6.0-7.0的范围内预处理1h，rAly16-1酶活仍保持在90％以上。这表明rAly16-1的最适反应pH为150mM NaAc-HAc，pH6.0，具有较窄的pH耐受区间为6.0-7.0。

实施例7

广谱型多糖降解酶rAly16-1的温度稳定性分析

将实施例3制得的广谱型多糖降解酶rAly16-1在不同温度(0～70℃)下分别处理0.5h、1h、2h、4h、12h、24h后，分别与用蒸馏水配制的质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物按体积比1：9的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力。

结果如图9所示：0℃到30℃残余酶活均在80％以上，说明该酶于0℃-30℃温度稳定性良好；40℃时随着温浴时间增加，酶活性逐步下降，24h后残余酶活为0；于40℃预测蛋白酶活力损失50％所需要的时间，即蛋白酶的半衰期时间为7.7h。温度高于50℃，温浴30min后，残余酶活为0，这说明该酶嗜冷且不耐高温。

实施例8

金属离子和化学试剂对广谱型多糖降解酶rAly16-1活性的影响

将用去离子水配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶底物、实施例3制得的广谱型多糖降解酶rAly16-1、以及水按体积比5：1：4的比例混合后制得反应体系，接着向反应体系中添加不同的金属离子，至其终浓度为1mM或10mM，然后在50℃反应4h，按前述的DNS-还原糖法测定酶的活力。对照组为不加任何金属离子时该酶的活性(设定为100％)。

结果如图10所示，一价金属离子对广谱型多糖降解酶rAly16-1的活性基本没有影响，如：Li⁺、K⁺、Na⁺，但是Ag⁺离子能够显著抑制该酶的活性；二价金属离子能够显著抑制该酶的活性如Cu²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺及10mM的三价金属离子Fe³⁺等，但是Mg²⁺离子对该酶的活基本没有影响；还原剂能够抑制酶的活性如10mM的EDTA等，但是DTT和甘油对该酶的活性没有影响。

实施例9

广谱型多糖降解酶rAly16-1的酶活测定及底物选择性分析

将用去离子水配制质量体积浓度分别为12g/L的褐藻胶、高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly M)、高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly G)，实施例3制得的广谱型多糖降解酶rAly16-1液，150mM的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液以体积比1：1：1的比例混合后50℃反应12h。将反应产物在沸水浴中加热10min灭活酶，转入冰水浴中5min，在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清；将一定体积的上清与等体积的DNS(3,5-对硝基二甲苯)反应液混匀，在沸水浴中加热10min，降至室温，在540nm测定吸光值。用分析纯葡萄糖醛酸钠内酯作标准品，同样方法操作，绘制葡萄糖醛酸内酯的摩尔浓度与OD₅₄₀之间的量效关系曲线。用购于上海生工生物工程有限公司的蛋白质定量试剂盒测定广谱型多糖降解酶rAly16-1中蛋白质含量。按照国际标准定义计算酶的活力单位，即在50℃、pH6.0的条件下，每分钟内产生1μmoL产物所需的酶量为1个IU。

结果表明：广谱型多糖降解酶rAly16-1分别以褐藻胶、高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly M)、高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly G)为底物时，酶解并产生还原糖产物并表现出不同的酶活力，分别为2134U/mg、15284.2U/mg、4381U/mg。且降解高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly M)时的活性显著高于高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶(Poly G)，初步表明广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解褐藻胶时具有明显的M-倾向性。

实施例10

广谱型多糖降解酶rAly16-1降解褐藻胶的产物高效液相(HPLC)分析

取用去离子水配制质量体积浓度为12g/L的褐藻胶和150mM的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液各100μL，再加入70μL去离子水混匀后置于50℃温育1h制得底物。向每100μL底物中添加30μL实施例3制得的广谱型多糖降解酶rAly16-1酶液，混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min。在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。

用浓度为0.20mol/L的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将上述褐藻胶酶解的样品，以自动进样器加载20μg/样品，其它条件不变，232nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。如图11所示，在上述条件下，广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解褐藻胶底物时，最初产生了较大分子量的寡糖，随着时间的推移小分子量的寡糖(UDP2～UDP8)逐渐增加并趋于稳定，最终反应的主要产物是HPLC检测中出峰时间为40.2’、37.4’、35.2’、33.4’和31.9’的五种寡糖产物，参照分子量标准物的出峰时间后，确定各寡糖产物分别对应UDP2、UDP3、UDP4、UDP5、UDP6。但在出峰时间为20.6’位置，有大分子量寡糖信号峰，且随着反应时间的延长，该位置信号峰的寡糖产物含量逐渐减少且始终存在。以上表明广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解褐藻胶时是一个内切型褐藻胶裂解酶，且不能彻底降解褐藻胶。

实施例11

广谱型多糖降解酶rAly16-1降解褐藻胶终产物的¹H-NMR波谱分析

运用分子凝胶色谱柱Superdex^TM Peptide 10/300GL(GE公司)对广谱型多糖降解酶rAly16-1彻底降解褐藻胶的终产物进行分离、纯化，合并后HPLC检测纯度，色谱条件参照实例10。如图12-A所示，纯度均在99％以上。随后经冷冻干燥脱盐、重水完成氢氘置换后，进行¹H-NMR检测分析上述寡糖产物的结构特征。结果如图12-B所示，系列不饱和寡糖产物均在5.62ppm处具有特征性吸收峰，只发现了ΔM信号峰，未发现ΔG信号峰。这表明广谱型多糖降解酶rAly16-1降解M/G聚段褐藻胶所得最终寡糖产物的非还原端均为ΔM结构。

实施例12

广谱型多糖降解酶rAly16-1降解褐藻胶饱和寡糖底物降解特性

为进一步揭示广谱型多糖降解酶rAly16-1这种寡糖生成特性，系统分析该酶的底物选择性及寡糖底物降解模式。各取等摩尔量饱和寡糖包括聚M段寡糖(M2～M8)、聚G段寡糖(G2～G8)的溶液，与广谱型多糖降解酶rAly16-1于最适条件下反应24h，对反应液处理后进行HPLC检测，参照分子量标准物，确定各寡糖产物聚合度，分析各寡糖组分的积分面积，并计算相对摩尔浓度，色谱条件参照实例10。结果如图13-A所示，对M系列饱和寡糖降解显著，但不能降解M2。在降解M3时产生UM2和M，降解M4时产生UM2和M2；降解M5时切下UM2(摩尔含量为75.8％)剩余M3，或切下UM3(摩尔相对含量为24.1％)留下M2；同样的在切割M6糖时也存在三种切割模式，主产物也是UM2(摩尔相对含量为81.1％)。广谱型多糖降解酶rAly16-1降解分子量较大的饱和M系列寡糖时，以UM2/M2为主产物，且最大产物比所用底物少两分子的单糖。对G系列饱和寡糖不降解，所采用的分子凝胶柱是根据分子量大小来分离产物，较大分子量产物不经过凝胶直接流出即检测信号峰先出现，较小分子量产物经过凝胶即检测信号峰随后出现。在本申请中，不饱和二糖(UDP2)是该检测条件下能检测到的最小寡糖产物，即为在40.19’左右的信号峰，在此之后出现的峰值变化均为流动相盐峰，如图13-C所示。

这些结果充分表明广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解褐藻胶时，具有M专一性。在降解饱和M系列寡糖时，广谱型多糖降解酶rAly16-1最小饱和寡糖底物是M3，最小产物是M。

实施例13

广谱型多糖降解酶rAly16-1降解荧光标记的褐藻胶饱和寡糖底物降解特性

取约10μg饱和聚M寡糖和聚G寡糖，加入含过量邻氨基苯甲酰胺(2-AB)、硼氢化钠的二甲基亚枫(DMSO)溶液，混匀后置60℃水浴中温育2h。旋转蒸干，加入500μL去离子水溶解样品，将样品与200μL氯仿共振荡，离心，收集上清。继续用氯仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端被荧光标记了的反应液。以还原性末端被荧光标记的饱和聚M三糖(2AB-M3)、四糖(2AB-M4)、五糖(2AB-M5)、六糖(2AB-M6)及饱和聚G五糖(2AB-G5)、六糖(2AB-G6)为底物。将底物与广谱型多糖降解酶rAly16-1于最适条件下反应24h。同时，以五糖(2AB-M5)和六糖(2AB-M6)为底物进行时间梯度降解。对反应物处理后进行HPLC检测，参照分子量标准物，确定各寡糖产物的相对分子量，分析各寡糖组分的积分面积，并计算相对摩尔浓度。HPLC检测条件：色谱柱：Superdex^TM Peptide 10/300GL；检测器：荧光检测器，激发波长Ex330nm，检测波长Em 420nm；流动相：0.2M NH₄HCO₃。

如图14-A所示，广谱型多糖降解酶rAly16-1降解还原端被2AB标记的系列饱和M寡糖时可知：(1)不能降解2AB-M2及2AB-M3；(2)部分降解2AB-M4时，最终主产物以2AB-UM2为主(摩尔相对含量为62.1％)，还有少量的2AB-UM3(摩尔相对含量为7.5％)；(3)部分降解2AB-M5时，最终主产物以2AB-UM3为主(摩尔相对含量为68.1％)，及少量的2AB-UM2(摩尔相对含量为16.6％)；(4)部分降解2AB-M6时，最终主产物以2AB-UM3为主(摩尔相对含量为54.8％)，以及部分2AB-UM2(摩尔相对含量为24.6％)和2AB-UM4(摩尔相对含量为6.4％)；(5)经过面积积分计算，广谱型多糖降解酶rAly16-1降解2AB标记的M4、M5和M6时，表明在降解以上底物时均不能彻底降解；(6)在降解2AB-M4时，主产物为2AB-UM2，而在降解2AB-M5和2AB-M6时，主产物为2AB-UM3，寡糖主产物随着底物的增大而增大，表明广谱型多糖降解酶rAly16-1具有可变的底物降解模式。但仍不能降解2AB-G系列饱和寡糖(此处只列出G5-G6数据)，如图14-D所示。

如图14-B和C所示，广谱型多糖降解酶rAly16-1降解2AB-M5、2AB-M6的时间梯度可知：广谱型多糖降解酶rAly16-1降解2AB-M5时，短时间内产生2AB-UM2和2AB-UM3，随着时间的延长2AB-M5逐渐减少且产物逐渐增加并趋于稳定，且最终以2AB-UM3为主产物。在降解2AB-M6时，短时间内生成2AB-UM2、2AB-UM3和2AB-M4，随着时间的延长2AB-M4和2AB-M6逐渐减少，2AB-UM2和2AB-UM3逐渐增加且趋于稳定，同样的最终以2AB-UM3为主产物。因此，推测广谱型多糖降解酶rAly16-1从糖链的非还原端进行切割，其切割模式图如图15所示。

上述结果表明，广谱型多糖降解酶rAly16-1降解荧光标记的系列饱和寡糖时：(1)与广谱型多糖降解酶rAly16-1降解M系列和G系列饱和寡糖结果一致，能较好的降解2AB标记的M系列饱和寡糖，不能降解2AB标记的G系列饱和寡糖；(2)2AB-M4是广谱型多糖降解酶rAly16-1的最小人工合成M系列饱和寡糖底物，M是广谱型多糖降解酶rAly16-1的最小饱和寡糖产物；(3)还原端的2-AB标记对该酶活性影响不显著，且表明酶是从褐藻胶底物的非还原端进行降解；(4)最小主产物的大小随底物的增大而增大，具有可变的底物降解模式。

实施例14

广谱型多糖降解酶rAly16-1降解特征褐藻胶不饱和寡糖底物降解特性

为了进一步研究该酶的酶学性质，根据课题组已有的实验基础，我们分别用M-倾向性重组褐藻胶单糖外切酶rAly6^[18]不完全降解褐藻胶，使用分子凝胶色谱柱Superdex^TMPeptide10/300GL(GE公司)对降解产物进行分离、纯化，制备了系列仅以ΔG为非还原性末端的特征寡糖产物。同时以多糖降解酶rAlgL-Pae^[19]和本申请涉及的广谱型多糖降解酶rAly16-1酶解褐藻胶，制备了一批寡糖终产物，特别说明的是：rAlgL-Pae制备的不饱和三糖(UDP3)的非还原性末端有ΔG和ΔM两种类型，且二者摩尔比约为1：1；而本专利rAly16-1制备的系列不饱和寡糖仅含有以ΔM为非还原性末端的结构。将上述寡糖片段与广谱型多糖降解酶rAly16-1于最适条件下反应24h，对反应液处理后进行HPLC检测，色谱条件参照实例10。

如图16-A所示，广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解仅以ΔG为非还原性末端的特征寡糖产物时：(1)不降解不饱和三糖(UDP3，即ΔGX)；(2)微量降解不饱和四糖(UDP4，即ΔGXX)生成UDP2、UDP3和不饱和单糖，降解率仅为21％；(3)不完全降解不饱和五糖(UDP5，即ΔGXXX)生成UDP2、UDP3、UDP4和不饱和单糖，降解率为80％；(4)不完全降解不饱和六糖(UDP6，即ΔGXXXX)之后产生UDP2、UDP3、UDP4、UDP5和不饱和单糖，降解率为87％；(5)在降解不饱和七糖和八糖时也具有类似的降解情况，其降解率进一步提高。以上结果表明，广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解以ΔG为非还原性末端不饱和寡糖时，不降解ΔGX，且其降解率随着底物的增大而增大，易于降解ΔGXXXn(n≥1，且为自然数)的糖链但仍不能完全降解。

如图16-B所示，广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解UDP3(以ΔM为非还原性末端与ΔG为非还原性末端的摩尔比约为1：1)时，生成UDP2和Δ，其降解率约为45％。由图16-A广谱型多糖降解酶rAly16-1不降解ΔGX可推测，广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解以上特征不饱和三糖时，45％的降解率均是在降解ΔMX时产生的。这提示广谱型多糖降解酶rAly16-1可能存在特殊的底物识别偏好性。

进一步地，为揭示广谱型多糖降解酶rAly16-1降解褐藻胶不饱和寡糖底物时是否具有特殊的底物识别序列，利用广谱型多糖降解酶rAly16-1降解仅以ΔM为非还原性末端的系列不饱和寡糖。结果如图16-C所示，广谱型多糖降解酶rAly16-1降解仅以ΔM为非还原性末端的系列不饱和寡糖产物时：(1)广谱型多糖降解酶rAly16-1不降解不饱和二糖(UDP2，即ΔM)；(2)较好地降解不饱和三糖(UDP3，即ΔMX)生成UDP2和Δ，降解率为92％；(3)较好地降解不饱和四糖(UDP4，即ΔMXX)、不饱和五糖(UDP5，即ΔMXXX)、不饱和六糖(UDP6，即ΔMXXXX)，生成的最大不饱和寡糖比底物少一份子单糖，且降解率分别为90％、93％、94％；(4)广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解仅以ΔM为非还原性末端的系列不饱和寡糖时，其降解率进一步提高，但仍不能实现完全降解。这提示广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解褐藻胶不饱和寡糖底物时，存在特殊的底物识别及降解序列，即ΔMXn(n≥1，且为自然数)或ΔGXX(n≥1，且为自然数)的糖链。

以上结果表明：(1)多糖降解酶rAly16-1以内切模式降解不饱和寡糖；(2)广谱型多糖降解酶rAly16-1的最小不饱和寡糖底物是不饱和三糖(ΔMX)，不饱和单糖(Δ)是最小产物；(3)广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解褐藻胶不饱和寡糖底物时，具有特殊的底物识别序列，即倾向于降解ΔMXn(n≥1，且为自然数)或ΔGXXn(n≥1，且为自然数)的糖链。

进一步地，结合对不同M/G比例褐藻胶降解情况及图6和图16，推测广谱型多糖降解酶rAly16-1降解褐藻胶时的寡糖生成特性由底物选择性和底物降解模式共同决定：rAly16-1降解褐藻胶多糖底物时，易于降解富含M的区域，即MMMXn、GMMXn、ΔMMXXn(n≥1，且为自然数)等，生成ΔMXn(n≥1，且为自然数)。随即继续降解以上不饱和寡糖底物时存在显著的底物偏好性，即专一性识别且从非还原端切割ΔMXn(n≥1，且为自然数)片段。因此，该酶不能彻底降解褐藻胶底物，且产物均为仅含ΔM为非还原性末端的系列不饱和寡糖。据此可用于完全降解褐藻胶多糖以专一性制备以ΔM为非还原性末端的富含G的系列不饱和寡糖片段。

实施例15

广谱型多糖降解酶rAly16-1同源建模

通过生物信息学分析，我们发现广谱型多糖降解酶rAly16-1的序列新颖，氨基酸序列与已鉴定Streptomyces coelicolor A3来源的CAA19982.1序列一致性最高为36.65％；另外，广谱型多糖降解酶rAly16-1进化地位特殊，虽与PL8家族亲缘关系最近，却是目前首个报道的PL8家族的以褐藻胶为最适底物的多糖降解酶。因此，运用SWISS-MODEL在线对其三维结构模型进行了模拟，以PL8中已鉴定结构的透明质酸酶SpnHL(PDB号为1loh)为模板，对广谱型多糖降解酶rAly16-1进行在线同源建模，发现rAly16-1是由α/α套筒和反平行β-链组成的片层组成双弓型结构，如图17-A，这与其他PL家族的褐藻胶裂解酶所采用的螺旋式或果冻卷折叠显著不同。并通过rAly16-1与模板蛋白透明质酸SpnHL晶体结构对比发现，rAly16-1蛋白催化腔明显变小(rAly16-1催化腔大小为

SpnHL催化腔大小为

)，如图17-D，推测适当增大催化腔大小可能会提高酶活。随后找到相应催化腔关键位点残基Glu¹⁶⁵、Gln⁴⁶³，应用PyMOL软件模拟其突变体蛋白结构，结果发现N165G和Q463G催化腔显著增大，分别为

和

因此，推测将rAly16-1的N¹⁶⁵、Q⁴⁶³残基位点分别突变为甘氨酸后可提高酶活。

此外，rAly16-1含有一个口袋状的催化腔，且长度约为

推测是其发挥广谱型多糖降解酶活性的基础。一个褐藻胶单糖分子长度约为

推测rAly16-1催化腔可容纳6个褐藻胶糖单元。随后运用LeDock软件，将褐藻胶六糖配体与rAly16-1蛋白分子对接，结果显示对接褐藻胶六糖分子位于rAly16-1蛋白催化腔，如图18-A，且rAly16-1与褐藻胶六糖采用-4至+2的方式与底物结合，如图18-B。其中不论饱和、不饱和的M六糖对接结果基本一致，G六糖结果一致，且两组之间-2、-3和-4亚位点基本一致，但-1与+2亚位点之间存在明显差异。rAly16-1与褐藻胶六糖配体相距

的氨基酸有：Leu⁶¹、Thr⁶²、Asn¹¹¹、Thr¹¹⁴、Lys¹¹⁸、Thr¹²²、Thr¹²⁵、Asn¹⁶⁵、Trp¹⁶⁷、Asp¹⁶⁸、Asp¹⁷⁹、Glu²⁹⁸、Arg³⁰⁵、Arg³⁴⁹、Arg³⁵³、Lys³⁵⁶、Asp⁴⁰⁵、Gln⁴⁶³、Try⁶⁴⁹总计19个氨基酸残基，初步推测其催化位点为Asp¹⁷⁹、Lys¹¹⁸，并预测rAly16-1与配体

以内的糖基潜在作用位点残基(Asn¹¹¹、Lys¹¹⁸、Thr¹²⁵、Asp¹⁷⁹、Glu²⁹⁸、Arg³⁰⁵、Arg³⁴⁹、Arg³⁵³、Lys³⁵⁶、Asp⁴⁰⁵、Gln⁴⁶³、Try⁶⁴⁹)，如表1所示。其中，rAly16-1与M六糖的相互作用位点数多于G六糖底物，-2和+1亚位点的残基仅与M六糖相互作用，主要识别底物内外两侧的基团。这也解释了rAly16-1对于不同M/G比例褐藻胶降解率不同，且表现出明显的M-专一性。

表1 rAly16-1与褐藻胶六糖配体

以内的潜在作用位点

实施例16

广谱型多糖降解酶rAly16-1分子改造与催化机理研究

为了获得广谱型多糖降解酶rAly16-1系列突变体的重组质粒，以重组质粒pET30a-YH03870为模板，使用相应突变引物，见表2运用高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，得扩增片段；利用酶DpnI去除扩增产物中甲基化模板质粒；在酶ExnaseⅡ催化下使扩增产物的5′末端和3′末端进行同源重组，完成扩增产物的环化；待反应完成后，将环化后的扩增产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mLKana的LB培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL Kana的液体LB培养基中培养，37℃震荡培养12h；用突变引物进行PCR验证，初步证明构建的重组质粒正确，并运用质粒小提试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行质粒提取；接着将该重组质粒进行测序，以验证重组质粒中插入大小和方向正确的目的片段，将构建成功的重组质粒命名为pET30a-rAly16-1-Q463G、pET30a-rAly16-1-N165G、pET30a-rAly16-1-N111A、pET30a-rAly16-1-K118A、pET30a-rAly16-1-T125A、pET30a-rAly16-1-D179A、pET30a-rAly16-1-E298A、pET30a-rAly16-1-R305A、pET30a-rAly16-1-R349A、pET30a-rAly16-1-R353A、pET30a-rAly16-1-K356A、pET30a-rAly16-1-D405A、pET30a-rAly16-1-Q463A、pET30a-rAly16-1-Y649A、pET30a-rAly16-1-R305N、pET30a-rAly16-1-R305D、pET30a-rAly16-1-K356L、pET30a-rAly16-1-E298V、pET30a-rAly16-1-E298S。系列突变体蛋白的诱导表达及纯化条件参照实例3，活性检测条件参照实例10。

运用DNS-还原糖法对多糖降解酶rAly16-1的系列突变体活性检测，如图19所示：(1)将初步推测催化位点Asp¹⁷⁹(+1亚位点)、Lys¹¹⁸(-1亚位点)突变后，蛋白失活，提示Asp¹⁷⁹和Lys¹¹⁸是rAly16-1的催化位点残基；(2)rAly16-1及其系列突变体表达产物在降解褐藻胶、Poly M、Poly G底物时的降解能力基本一致，表明Thr¹²⁵、Glu²⁹⁸、Arg³⁰⁵、Arg³⁴⁹、Lys³⁵⁶、Gln⁴⁶³是关键位点残基，对于该酶发挥催化作用至关重要；(3)增大催化腔却使得其酶活力显著降低，表明催化腔大小对于该酶与底物的结合十分重要；(4)与G六糖相互作用的残基位点的改变，对肝素、透明质酸及多种硫酸软骨素等多类糖胺聚糖降解均无明显改变；(5)仅与M六糖相互作用的-2和+1亚位点的残基位点的改变，结果显示K356L表达产物在降解褐藻胶、Poly M及Poly G时残余酶活约为50％，其余突变体残余酶活均低于20％。运用分子凝胶色谱柱Superdex^TM Peptide 10/300GL(GE公司)对多糖降解酶rAly16-1突变体K356L、R305D分别降解SCA、CSC所得产物进行HPLC检测，如图20所示，与野生型菌株相比，其中K356L和R305D表达产物分别降解CSA、CSC底物时，有明显的寡糖产物生成。并对K356L降解CSA时出峰时间为37.02的主产物二糖进行分离、纯化、合并后，进行质谱分析，确定得到CSA二糖产物。因此，表明该酶与糖链的具有潜在识别作用的系列氨基酸残基(即-2亚位点Lys³⁵⁶和+1亚位点Arg³⁰⁵)，不仅参与底物的结合，而且对底物的选择性具有一定的影响作用，即可分别专一性识别CSA和CSC。综上所述，rAly16-1的两种突变酶K356L与R305D均失去褐藻胶降解活性，然而显著提高了CSA、CSC的酶解活性。rAly16-1分别与底物CSA和CSC按体积比1：1降解72h后，利用常规检测方法HPLC未能明显观察到产物生成，而在¹H-NMR分析中观察到产物；但其K356L和R305D突变酶在相同反应条件分别与底物CSA、CSC按体积比1：9降解12h，用常规方法HPLC即可观察到明显产物的生成如图20所示。下一步将继续优化酶解条件，有望用于制备CSA、CSC系列不饱和寡糖。

表2多糖降解酶rAly16-1系列突变引物

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SEQUENCE LISTING

<110> 济南爱科替维生物科技有限公司

<120> 一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2430

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgagaggcg acatgacgaa ccgaggcacc acccggcgca ccgtcctgac cggcgcggcc 60

gctctgggcg cggcggcgac gctgcccctg acccccgccg gccccgccca cgccgcgtcc 120

ggcacggcac ggaccggggc cgaggacccc gcggcgctgc gcagccgttg gcacacactg 180

ctgaccggcg gccccgacct cgaccgggac gacgagcgga tcgtcgccgc gaccgcccgc 240

gtggggcggg ccggggccac cgccgccacc ggcctggatc cgtcccggac ggacgggctg 300

ttccccgacc tgaccagcac gacgctctcc aaccacgtca ccacgtcgtt caagcggctg 360

gcgacggcag ccaccgcctg ggcggtcccc ggcaccccgc agcacggcga cgcggcgctg 420

ctgacgaagc tgctgggcgg cgtcgactgg atgctgaccc accgttacgg tcccgagcac 480

acccggttcg acaacgactg ggactgggag ataggcgcgg cgctcgcgct caacgacacg 540

gcggtgctgc tccacgacga gctgggcgcg gagcgtctgg agcgggtcac gaccgccgtg 600

ctccattaca cgccggaccc caacctgtgg cgggtcgacc gccagatcgc gaccggcgcc 660

aaccgggtgt gggtctccac cgtggtcgcg gtcaacgcgg tgctgcgcgg cgacggcgtc 720

gcgctgggcc gggtccggga cgctctgtcc gatgtcgagg gttcgggcgc caacagcgtc 780

ctggccttca acgacagcgg cggtgcggcg gccggcacgg gcgagggctt ctcgtccgac 840

ggctcgttcc tccagcacta caagcacccg tacaacggcg gttacggcaa ggagctgctg 900

gggaacctgt cccggctgct caatctgctg gccggtacgg cgtggacggt gaccgatccc 960

gatctcgaca acgtgcgcgg ctgggtggac gacggcttcg acccgctgat gttccggggc 1020

gatgtgatgg cgtcggtgtg cgggcgggag atcgcccggc cgagcaagca ggggcacgcg 1080

tcggcgcaga cggtcgtcga ggcggtgctg cggctgatcc cgtgtttccc gggtgagccc 1140

gccgaccggt tcacggcgct ggtgaagcag tggatcgccg aggacggcta ccgggacttc 1200

ctcgccgtga ccgacctcgc ctcgctggtc gccgcgcagc gtgcgatcgc ctccgccgtc 1260

ccggccaggg gtccgctggt cgcccacagg cagcatcctc tgatggacaa ggcggcccac 1320

caccgccccg cgttcgggct gggcatctcc gcgtactcga cccggatcta caactacgag 1380

tcgatccaga acgagaacct gcgcggctgg cacctctcgg acgggatggt gctgctgtac 1440

accgacgacc tcggccacta cagcgaggac tactggccca ccgtcgaccc ggcgaggctg 1500

cccggcacca ccgtcatcgc cgggcgcccg gccgacgcgg cggggcagcg caccaccagc 1560

accgccgact gggcgggcgg gaccgcgctc ccggacacca cgctgggcgc gtacgggatg 1620

gagctgcggg ccttcggcag cacgctgcac gggctcaaga gctggttctg cctggacgac 1680

gtcatcgcct gtgtcggttc gggcatcacc gccgaggcgg ggaccgccga gacggtggtg 1740

gagaaccgca agctgcgcga cccgcgggcc gccctcctgg tgaacggcgc ggccgccccg 1800

gacggtcccg gctggtccgc cgagctggcg gacgtacggt ggctgcacct ggccggaacc 1860

ggcgggtacg tcttcccacg gcccgcctcc gtgcgcgccc tgcgcgagga acggaccgcg 1920

acctggcggg agatcaacct caagtacggc accgacaccc cggtcacccg cccgtacctg 1980

acgctctggc acgaccacgg cccggccccg agcggggccg gctacttcta tctccaggtg 2040

cccaccgcct cggccgggcg cacccggctg ctgtcggccg cgccgccggt ggagctggtc 2100

gccgactcga ccgccgtgca cgcggtgcgg cgcggcgcgg acgggctgct ggcggccaac 2160

ttctggcggg cgggctcggc acgggagctg gcttgcgacg gtccggcgtc cgtcctggtg 2220

cgcccgaagg ggcggagcgt gggcgtcgcc ctggccgatc ccacgcacct gcggtccacc 2280

gtggtggtcg agctggccgg gcgcgggctg acgctcgcct ccggcggccc ccgggtgagc 2340

gcggcccgca cgccgggcgg catccggatc accgccgaca cgtcggggct gcgcggggcg 2400

accctcggcc tcaccctgaa gaggagctag 2430

<210> 2

<211> 2313

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtggta cagcacgtac cggcgccgaa gatccggcag ccctgcgtag ccgctggcat 60

accctgctga ccggcggccc tgatctggat cgtgatgatg aacgcattgt tgcagcaacc 120

gcacgtgttg gtcgcgccgg cgctaccgct gctaccggtt tagatccgag tcgtaccgat 180

ggcctgtttc cggatctgac cagtaccacc ctgagtaatc atgttaccac cagttttaaa 240

cgcctggcca ccgccgccac cgcatgggca gttcctggta caccgcagca tggcgatgcc 300

gccctgctga ccaaactgct gggcggcgtg gattggatgc tgacccatcg ttatggcccg 360

gaacataccc gttttgataa tgattgggat tgggaaattg gtgcagccct ggcactgaat 420

gataccgcag tgctgctgca tgatgaactg ggcgcagaac gtctggaacg cgttaccacc 480

gcagttctgc attatacccc ggaccctaat ctgtggcgcg tggatcgtca gattgcaacc 540

ggcgccaatc gtgtgtgggt tagtaccgtg gttgccgtta atgccgttct gcgtggtgac 600

ggtgtggcac tgggccgcgt gcgtgatgcc ctgagtgatg tggaaggcag cggcgccaat 660

agcgtgctgg cctttaatga tagcggcggc gcagcagccg gtacaggcga aggttttagc 720

agcgatggta gctttctgca gcattataaa catccgtata atggtggtta tggtaaagaa 780

ctgctgggca atctgagccg tctgctgaat ctgctggcag gtacagcatg gaccgtgacc 840

gatccggatc tggataatgt tcgtggttgg gtggatgatg gttttgatcc gctgatgttt 900

cgtggtgacg tgatggcaag cgtttgtggc cgcgaaattg cacgtccgag caaacagggc 960

catgcaagtg cccagaccgt tgtggaagcc gtgctgcgcc tgattccgtg ttttccgggt 1020

gaaccggccg atcgttttac cgcactggtt aaacagtgga ttgccgaaga tggctatcgc 1080

gattttctgg ccgttaccga tctggcaagt ctggttgccg cccagcgtgc aattgcaagt 1140

gcagtgccgg cccgcggtcc gttagttgca catcgccagc atccgctgat ggataaagca 1200

gcccatcatc gcccggcctt tggcctgggc attagcgcct atagcacccg tatctataat 1260

tatgaaagca ttcagaacga gaacctgcgt ggttggcatc tgagtgatgg catggtgctg 1320

ctgtataccg atgatctggg tcattatagt gaagattatt ggccgaccgt tgatccggcc 1380

cgtctgccgg gtacaaccgt tattgcaggt cgtccggcag atgcagccgg ccagcgtacc 1440

accagcaccg ctgattgggc cggtggcacc gcactgccgg ataccaccct gggtgcctat 1500

ggcatggaac tgcgtgcatt tggcagtacc ctgcatggtc tgaaaagctg gttttgcctg 1560

gatgatgtga ttgcatgcgt tggtagtggt attaccgccg aagcaggcac cgccgaaacc 1620

gttgttgaaa atcgtaaact gcgtgatccg cgcgcagcac tgctggtgaa tggtgcagcc 1680

gccccggatg gtccgggttg gtcagcagaa ctggccgatg tgcgctggct gcatctggca 1740

ggcaccggcg gttatgtttt tccgcgcccg gccagcgttc gcgccttaag agaagaacgc 1800

accgccacct ggcgcgaaat taatctgaaa tatggcaccg ataccccggt tacccgtccg 1860

tatctgaccc tgtggcatga tcatggcccg gccccgagtg gcgcaggtta tttttatctg 1920

caggttccga ccgccagcgc cggtcgtacc cgtttactga gcgccgcccc gccggttgaa 1980

ctggttgcag atagcaccgc cgttcatgcc gttcgccgtg gtgccgatgg cctgctggcc 2040

gcaaattttt ggcgtgcagg tagtgcacgt gaactggcct gtgatggccc ggcaagcgtt 2100

ctggttcgtc cgaaaggtcg tagcgttggt gtggcattag ccgatccgac ccatctgcgc 2160

agcaccgtgg ttgttgaact ggccggtcgc ggcctgaccc tggcatcagg tggtccgcgt 2220

gtgagcgccg cacgtacccc tggtggcatt cgcattaccg ccgataccag cggtctgcgc 2280

ggcgcaaccc tgggtctgac cctgaaacgt agt 2313

<210> 3

<211> 771

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Gly Thr Ala Arg Thr Gly Ala Glu Asp Pro Ala Ala Leu Arg

1 5 10 15

Ser Arg Trp His Thr Leu Leu Thr Gly Gly Pro Asp Leu Asp Arg Asp

20 25 30

Asp Glu Arg Ile Val Ala Ala Thr Ala Arg Val Gly Arg Ala Gly Ala

35 40 45

Thr Ala Ala Thr Gly Leu Asp Pro Ser Arg Thr Asp Gly Leu Phe Pro

50 55 60

Asp Leu Thr Ser Thr Thr Leu Ser Asn His Val Thr Thr Ser Phe Lys

65 70 75 80

Arg Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Trp Ala Val Pro Gly Thr Pro Gln

85 90 95

His Gly Asp Ala Ala Leu Leu Thr Lys Leu Leu Gly Gly Val Asp Trp

100 105 110

Met Leu Thr His Arg Tyr Gly Pro Glu His Thr Arg Phe Asp Asn Asp

115 120 125

Trp Asp Trp Glu Ile Gly Ala Ala Leu Ala Leu Asn Asp Thr Ala Val

130 135 140

Leu Leu His Asp Glu Leu Gly Ala Glu Arg Leu Glu Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Ala Val Leu His Tyr Thr Pro Asp Pro Asn Leu Trp Arg Val Asp Arg

165 170 175

Gln Ile Ala Thr Gly Ala Asn Arg Val Trp Val Ser Thr Val Val Ala

180 185 190

Val Asn Ala Val Leu Arg Gly Asp Gly Val Ala Leu Gly Arg Val Arg

195 200 205

Asp Ala Leu Ser Asp Val Glu Gly Ser Gly Ala Asn Ser Val Leu Ala

210 215 220

Phe Asn Asp Ser Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Glu Gly Phe Ser

225 230 235 240

Ser Asp Gly Ser Phe Leu Gln His Tyr Lys His Pro Tyr Asn Gly Gly

245 250 255

Tyr Gly Lys Glu Leu Leu Gly Asn Leu Ser Arg Leu Leu Asn Leu Leu

260 265 270

Ala Gly Thr Ala Trp Thr Val Thr Asp Pro Asp Leu Asp Asn Val Arg

275 280 285

Gly Trp Val Asp Asp Gly Phe Asp Pro Leu Met Phe Arg Gly Asp Val

290 295 300

Met Ala Ser Val Cys Gly Arg Glu Ile Ala Arg Pro Ser Lys Gln Gly

305 310 315 320

His Ala Ser Ala Gln Thr Val Val Glu Ala Val Leu Arg Leu Ile Pro

325 330 335

Cys Phe Pro Gly Glu Pro Ala Asp Arg Phe Thr Ala Leu Val Lys Gln

340 345 350

Trp Ile Ala Glu Asp Gly Tyr Arg Asp Phe Leu Ala Val Thr Asp Leu

355 360 365

Ala Ser Leu Val Ala Ala Gln Arg Ala Ile Ala Ser Ala Val Pro Ala

370 375 380

Arg Gly Pro Leu Val Ala His Arg Gln His Pro Leu Met Asp Lys Ala

385 390 395 400

Ala His His Arg Pro Ala Phe Gly Leu Gly Ile Ser Ala Tyr Ser Thr

405 410 415

Arg Ile Tyr Asn Tyr Glu Ser Ile Gln Asn Glu Asn Leu Arg Gly Trp

420 425 430

His Leu Ser Asp Gly Met Val Leu Leu Tyr Thr Asp Asp Leu Gly His

435 440 445

Tyr Ser Glu Asp Tyr Trp Pro Thr Val Asp Pro Ala Arg Leu Pro Gly

450 455 460

Thr Thr Val Ile Ala Gly Arg Pro Ala Asp Ala Ala Gly Gln Arg Thr

465 470 475 480

Thr Ser Thr Ala Asp Trp Ala Gly Gly Thr Ala Leu Pro Asp Thr Thr

485 490 495

Leu Gly Ala Tyr Gly Met Glu Leu Arg Ala Phe Gly Ser Thr Leu His

500 505 510

Gly Leu Lys Ser Trp Phe Cys Leu Asp Asp Val Ile Ala Cys Val Gly

515 520 525

Ser Gly Ile Thr Ala Glu Ala Gly Thr Ala Glu Thr Val Val Glu Asn

530 535 540

Arg Lys Leu Arg Asp Pro Arg Ala Ala Leu Leu Val Asn Gly Ala Ala

545 550 555 560

Ala Pro Asp Gly Pro Gly Trp Ser Ala Glu Leu Ala Asp Val Arg Trp

565 570 575

Leu His Leu Ala Gly Thr Gly Gly Tyr Val Phe Pro Arg Pro Ala Ser

580 585 590

Val Arg Ala Leu Arg Glu Glu Arg Thr Ala Thr Trp Arg Glu Ile Asn

595 600 605

Leu Lys Tyr Gly Thr Asp Thr Pro Val Thr Arg Pro Tyr Leu Thr Leu

610 615 620

Trp His Asp His Gly Pro Ala Pro Ser Gly Ala Gly Tyr Phe Tyr Leu

625 630 635 640

Gln Val Pro Thr Ala Ser Ala Gly Arg Thr Arg Leu Leu Ser Ala Ala

645 650 655

Pro Pro Val Glu Leu Val Ala Asp Ser Thr Ala Val His Ala Val Arg

660 665 670

Arg Gly Ala Asp Gly Leu Leu Ala Ala Asn Phe Trp Arg Ala Gly Ser

675 680 685

Ala Arg Glu Leu Ala Cys Asp Gly Pro Ala Ser Val Leu Val Arg Pro

690 695 700

Lys Gly Arg Ser Val Gly Val Ala Leu Ala Asp Pro Thr His Leu Arg

705 710 715 720

Ser Thr Val Val Val Glu Leu Ala Gly Arg Gly Leu Thr Leu Ala Ser

725 730 735

Gly Gly Pro Arg Val Ser Ala Ala Arg Thr Pro Gly Gly Ile Arg Ile

740 745 750

Thr Ala Asp Thr Ser Gly Leu Arg Gly Ala Thr Leu Gly Leu Thr Leu

755 760 765

Lys Arg Ser

770

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcatatgtcc ggcacggcac ggaccg 26

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtctagagct cctcttcagg gtgaggcc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcattggtaa cgagaacctg cgtggttg 28

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcgttacca atgctttcat aattatagat acgg 34

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgttttgatg gtgattggga ttgggaaatt g 31

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atcaccatca aaacgggtat gttccg 26

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctgagtaat gcacatgtta ccaccagttt taaacg 36

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catgtgcatt actcagggtg gtactggtca ga 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttttaaagca cgcctggcca ccgccgccac cg 32

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccaggcgtgc tttaaaactg gtggtaacat gattac 36

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

accgcagcat gggcagttcc tggtacaccg ca 32

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

actgcccatg ctgcggtggc ggcggtggcc ag 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgaatgatgc caccgcagtg ctgctgcatg at 32

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgcggtggca tcattcagtg ccagggctgc ac 32

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taaagaagca ctgctgggca atctgagccg tc 32

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccagcagtgc ttctttacca taaccaccat tatacg 36

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgtgccctgc tgaatctgct ggcaggtaca gc 32

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agattcagca gggcacggct cagattgccc agc 33

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcgccgaaat tgcacgtccg agcaaacagg gc 32

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acgtgcaatt tcggcgcggc cacaaacgct tgc 33

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aattgcacgt gccccgagca aacagggcca tg 32

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tcggggcacg tgcaatttcg cggccacaaa cg 32

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

agcaaagccc agggccatgc aagtgcccag ac 32

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tggccctggg ctttgctcgg acgtgcaatt tc 32

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

taccgatgca ctggcaagtc tggttgccgc cc 32

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ttgccagtgc atcggtaacg gccagaaaat cg 32

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cattcaggca aacgagaacc tgcgtggttg gc 32

<210> 31

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tctcgtttgc ctgaatgctt tcataattat agatacg 37

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gaaatatgca ggcaccgata ccccggttac cc 32

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cggtgcctgc atatttcaga ttaatttcgc gcc 33

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgtcaactgc tgaatctgct ggcaggtaca gc 32

<210> 35

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agattcagca gttgacggct cagattgccc agc 33

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cgtgacctgc tgaatctgct ggcaggtaca gc 32

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

agattcagca ggtcacggct cagattgccc agc 33

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

agcaaactac agggccatgc aagtgcccag ac 32

<210> 39

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tggccctgta gtttgctcgg acgtgcaatt tc 32

<210> 40

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

taaagaagta ctgctgggca atctgagccg tc 32

<210> 41

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ccagcagtac ttctttacca taaccaccat tatacg 36

<210> 42

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

taaagaaagc ctgctgggca atctgagccg tc 32

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

ccagcaggct ttctttacca taaccaccat tatacg 36

Claims (14)

1.一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16-1，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组表达载体Ⅰ，其特征在于，包含权利要求2所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种重组菌Ⅰ，其特征在于，包含权利要求2所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.权利要求2所述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870、权利要求3所述的重组表达载体Ⅰ、权利要求4所述的重组菌Ⅰ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。

6.一种密码子优化后的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示。

7.一种重组表达载体Ⅱ，其特征在于，包含权利要求6所述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

8.一种重组菌Ⅱ，其特征在于，包含权利要求6所述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

9.权利要求6所述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870、权利要求7所述重组表达载体Ⅱ、权利要求8所述重组菌Ⅱ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。

10.权利要求1所述广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解酸性多糖中的应用。

11.如权利要求10所述应用，其特征在于，所述酸性多糖为硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸皮肤素、透明质酸(HA)、黄原胶(Xanthan)、褐藻胶(Alginate)。

12.如权利要求11所述应用，其特征在于，所述酸性多糖为高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶、高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶。

13.权利要求1所述广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解寡糖中的应用，所述寡糖为系列饱和甘露糖醛酸寡糖、系列饱和古洛糖醛酸寡糖、系列特征不饱和寡糖。

14.权利要求1所述广谱型多糖降解酶rAly16-1在生产非还原端含有ΔM末端结构的不饱和寡糖、不饱和单糖中的应用。

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