CN112251426B

CN112251426B - 一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN112251426B
Application number: CN202011114027.5A
Authority: CN
Inventors: 李福川; 张庆冬; 路丹荣; 魏琳
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-10-18
Filing date: 2020-10-18
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2040-10-18
Also published as: CN112251426A

Abstract

本发明涉及一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用。本发明中的硫酸软骨素裂解酶enCSase，分离自发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中的硫酸软骨素裂解酶enCSase是一种新型CSase ABC酶，对硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸均有较高的酶活性，降解硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸时为内切酶模式；可应用于硫酸软骨素寡糖、硫酸皮肤素寡糖和透明质酸寡糖的制备，在医药及食品等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用。

背景技术

硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)是由β-D-葡萄糖醛酸(GlcUA)或α-L-艾杜糖酸(IdoUA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)组成的二糖单元重复连接而成的线性阴离子多糖。在动物组织中，通常作为蛋白聚糖的侧链在细胞表面以及细胞外基质中广泛分布。作为重要的一类糖胺聚糖，CS/DS涉及各种生理和病理过程，例如细胞粘附，细胞分化，细胞迁移，细胞增殖，伤口修复，神经系统发育，信号传导和免疫反应。在生物合成过程中，组成CS/DS糖链的基本二糖单元GlcUAβ1-3GalNAc(O unit)经常会发生各种生物合成修饰，从而导致CS/DS糖链具有很大的结构异质性，同时赋予其丰富的生物学功能。在特定的磺基转移酶的作用下，GlcUA/IdoUA残基的C2位置和GalNAc残基的C4和/或C6位置被硫酸化以形成各种特征性二糖单元，例如GlcUAβ1-3GalNAc(4-O-sulfate)(A unit)，GlcUAβ1-3GalNAc(6-O-sulfate)(C unit)，GlcUA(2-O-sulfate)β1-3GalNAc(6-O-sulfate)(D unit)，GlcUAβ1-3GalNAc(4,6-O-disulfate))(E unit)和GlcUA(2-O-sulfate)β1-3GalNAc(4,6-O-disulfate)(T unit)，这是CS链多样性的根本原因。而且，在DS链中，基本的重复二糖单元是IdoUAβ1-3GalNAc，是CS链中的GlcUA残基通过C5差向异构酶的作用向IdoUA残基的差向异构化而形成，通常导致CS和DS以杂合体的形式存在。但是，结构的复杂性极大地限制了CS/DS的结构和功能研究。

细菌来源的CS/DS裂解酶通过β-消除反应降解CS/DS，断开己糖胺和糖醛酸残基之间的1→4糖苷键，从而在非还原端形成4,5-不饱和双键，是研究CS/DS的结构和功能过程中必不可少的工具。通常，CS/DS裂解酶根据其底物特异性分为四类：CSase ABC，它降解CS和DS以及透明质酸(HA)；CSase AC，选择性催化CS和HA；CSase B，仅特异性切割DS；CSase C，倾向于降解CS/DS链中富含C单元的结构域。在这些CS/DS裂解酶中，CSase ABC由于其底物范围广，因此在CS/DS的结构和功能分析和生物活性寡糖制备以及某些疾病的治疗过程中具有重要应用，例如脊髓损伤，周围神经损伤，中风，冠状动脉再灌注，腰椎间盘突出症，帕金森氏病和某些类型的癌症。但是，迄今为止仅极少数的CSase ABC被人鉴定及报道。其中，最为广泛使用的商品化CSase ABC是寻常变形杆菌的发酵产物，它是两种酶的混合物：CSase ABC-I和CSase ABC-II。然而，很难通过纯化和重组表达来制备其高纯度和活性形式。因此，对于基础研究和应用都迫切需要鉴定具有更好的酶学特性的新型CSase ABC。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供了一种硫酸软骨素裂解酶enCSase及其编码基因与应用，该酶具有高效的降解硫酸软骨素的酶活性。

本发明的技术方案是：

一种硫酸软骨素裂解酶enCSase，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase为内切酶，分离自发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

本发明的硫酸软骨素裂解酶enCSase降解硫酸软骨素或硫酸皮肤素多糖时，终产物为不饱和四糖和不饱和二糖，降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素的最小寡糖单位为六糖；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase降解透明质酸时，终产物为不饱和六糖和不饱和四糖，降解透明质酸的最小寡糖单位为八糖。

上述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因来源于发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因。

根据本发明优选的，所述表达载体为大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

一种重组细胞，在宿主细胞中插入了上述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因。

根据本发明优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

进一步优选的，所述的大肠杆菌宿主细胞为Escherichia coli BL2 1、Escherichia coli JM 109或Escherichia coli DH 5α；所述酵母菌宿主细胞为Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris或Kluyveromyces Iactis；所述枯草杆菌宿主细胞为Bacillus subtilis R25或Bacillus subtilis 9920；所述乳酸菌宿主细胞为Lactic acid bacteria C0CC101；所述放线菌宿主细胞为Streptomyces spp.；所述丝状真菌宿主细胞为Trichoderma viride，Trichoderma reesei，Aspergillus niger或Aspergillus nidulans；所述昆虫细胞为Bombyxmori或Antharaea eucalypti；所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL。

上述重组细胞在重组表达硫酸软骨素裂解酶enCSase中的应用。

上述硫酸软骨素裂解酶enCSase在制备硫酸软骨素寡糖，硫酸皮肤素寡糖和/或透明质酸寡糖中的应用。

上述硫酸软骨素裂解酶enCSase在研究CS/DS结构与功能中的应用。

有益效果：

1、本发明中的硫酸软骨素裂解酶enCSase，分离自发光杆菌(Photobacteriumsp.)QA16，易于异源表达及纯化，理化性质稳定，降解活性高，具备工业应用的潜质。

2、本发明中的硫酸软骨素裂解酶enCSase是一种新型CSase ABC酶，对硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸均有较高的酶活性，对硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E、硫酸皮肤素和透明质酸的酶活分别为373U/mg,474U/mg,171U/mg,172U/mg,141U/mg和97U/mg。

3、本发明中的硫酸软骨素裂解酶enCSase，降解硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸时为内切酶模式；降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素时终产物为不饱和四糖和不饱和二糖，降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素的最小寡糖单位为六糖；降解透明质酸时终产物为不饱和六糖和不饱和四糖，降解透明质酸的最小寡糖单位为八糖；可应用于硫酸软骨素寡糖、硫酸皮肤素寡糖和透明质酸寡糖的制备以及CS/DS结构与功能的研究，在医药及食品等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16的电子显微镜照片；

图2为硫酸软骨素裂解酶enCSase的蛋白质三维结构模型；

图3为硫酸软骨素裂解酶enCSase的表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；

其中：泳道1、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道2、对照菌株破壁前菌液，上样量10μL；泳道3、重组菌破壁后菌液，上样量10μL；泳道4、重组菌破壁后上清，上样量10μL；泳道5、经镍柱纯化的enCSase样品，上样量10μL；

图4为温度对硫酸软骨素裂解酶enCSase的活性影响曲线；

图5为pH对硫酸软骨素裂解酶enCSase的活性影响曲线；

图6为温度对硫酸软骨素裂解酶enCSase的稳定性影响曲线；

图中，图A是以透明质酸为底物的曲线，图B是以硫酸软骨素A为底物的曲线；

图7为金属离子及化学试剂对硫酸软骨素裂解酶enCSase的活性影响曲线；

图8为NaCl浓度对硫酸软骨素裂解酶enCSase的活性影响曲线；

图9为硫酸软骨素裂解酶enCSase降解不同底物的降解产物的高效液相(HPLC)分析图；

图中：图A是以透明质酸为底物的HPLC分析图，图B是以硫酸软骨素A为底物的HPLC分析图，图C是以硫酸皮肤素为底物的HPLC分析图，图D是以硫酸软骨素C为底物的HPLC分析图，图E是以硫酸软骨素D为底物的HPLC分析图，图F是以硫酸软骨素E为底物的HPLC分析图，1：不饱和透明质酸六糖；2：不饱和透明质酸四糖；3：不饱和硫酸软骨素或硫酸皮肤素四糖；4：双硫酸化不饱和硫酸软骨素或硫酸皮肤素二糖；5：单硫酸化不饱和硫酸软骨素或硫酸皮肤素四糖；

图10为硫酸软骨素裂解酶enCSase不同时间降解硫酸软骨素A的降解产物的高效液相(HPLC)分析图；

图中：1：不饱和硫酸软骨素八糖；2：不饱和硫酸软骨素六糖；3：不饱和硫酸软骨素四糖；4：不饱和硫酸软骨素二糖；

图11为硫酸软骨素裂解酶enCSase对不同寡糖底物的降解产物的高效液相(HPLC)分析图；

图中：图A是以透明质酸四糖、六糖、八糖为底物的HPLC分析图，图B是以软骨素四糖、六糖为底物的HPLC分析图，图C是以硫酸软骨素A四糖、六糖为底物的HPLC分析图，图D是以硫酸软骨素C四糖、六糖为底物的HPLC分析图，图E是以硫酸皮肤素四糖、六糖为底物的HPLC分析图，Octa：不饱和八糖；Hexa：不饱和六糖；Tetra：不饱和四糖；Di：不饱和二糖。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是指摄氏度。

生物材料来源：

一株发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

实施例1、发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16的获得

取海泥浸出液，上清液l mL加入到9mL无菌水中，稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的浓度梯度，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于唯一碳源固体培养基上，于30℃恒温培养1天，菌落计数，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于相应的全营养琼脂平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，以备后用。

把培养出来的菌株，分别接种到唯一碳源液体培养基上，进行培养。200rpm、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，以及取培养上清进行咔唑反应检测碳源的消耗情况。依据上述两个指标选择产酶菌株。将在各唯一碳源液体培养基中均浑浊以及咔唑反应数值较小的菌株挑取到全营养培养基上培养，并保种记为QA16。

所述QA16经鉴定为发光杆菌(Photobacterium sp.)，该菌株革兰染色阴性，细菌呈杆状，长1.2～3.5μm、宽0.5～1.2μm，无芽胞和荚膜，有鞭毛，运动非常活泼；悬滴观察，可见其呈穿梭运动。发光杆菌QA16的显微镜照片如图1所示。

上述唯一碳源液体培养基每升组分如下：

K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 30g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄ 0.001g，NH₄Cl1g，硫酸软骨素A，水1000mL，pH值为7.0。另添加琼脂15g即为唯一碳源固体培养基。

上述发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

实施例2、发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16基因组DNA的提取

将发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16接种至液体培养基中，在30℃、200rpm的条件下，振荡培养至OD₆₀₀约为0.8；取培养菌液40mL，在12,000rpm条件下离心25min，收集菌体沉淀，用20mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0)洗涤，在12,000rpm条件下离心25min，收集菌体沉淀；

上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0)12.0mL，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶各560μL，其终浓度约800μg/mL；冰浴1.0h后，37℃温浴2h，至溶液粘稠；加入10wt％SDS(十二烷基磺酸钠)0.82mL，100mg/mL的蛋白酶K溶液60μL，52℃水浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；10,000g、4℃条件下离心10min，转移上清，加入2.0mL的NaAc-HAc(pH 5.2，3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇，混匀；用1.0mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的EP离心管中，以70wt％的乙醇(贮于-20℃)，洗涤2次，微离心后弃上清；10,000g、4℃条件下离心3min，彻底弃掉上清；样品于无菌工作台中，酒精灯下风吹干燥；用无菌去离子水重悬溶解DNA样品，4℃过夜，得到大分子量基因组DNA。

实施例3、发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16菌株基因组扫描及其序列分析

将实施例2制得的大分子量基因组DNA进行测序(北京源宜)。用NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local Alignment SearchTool(BLAST,http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

NCBI分析结果显示发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16菌株基因组上携带的硫酸软骨素裂解酶基因encsase，基因编码区长2943bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。硫酸软骨素裂解酶基因encsase编码的硫酸软骨素裂解酶enCSase，由980个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白质的理论分子量约为107.5kD。用BLAST软件在线分析，结果显示硫酸软骨素裂解酶enCSase与Proteus Vulgaris的全基因组序列中chondroitinase abc-I基因所编码的由1021氨基酸组成的硫酸软骨素裂解酶chondroitinase ABC-I(NCBI序列号：P59807.2)有40.9％的同源性。

用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http://smart.embl_heidelberg.de/)分析硫酸软骨素裂解酶enCSase的结构信息，结果显示N端第1至第32个氨基酸是信号肽序列，第229-923位氨基酸序列属于多糖裂解酶8家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对硫酸软骨素裂解酶enCSase的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的硫酸软骨素裂解酶enCSase蛋白质三维结构模型如图2所示。

实施例4、encsase基因在大肠杆菌中的重组表达

以实施例2制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物如下：

正向引物encsase-F:GAATTCGAACCAACTTCAATCTCAGGTCCT(SEQ ID NO.3)；

反向引物encsase-R:CTCGAGGTAAAGCTTTCTCAGCGTCAGG(SEQ ID NO.4)；

在正向和反向引物中，标注有下划线的碱基序列分别为限制性内切酶EcoRI和XhoI的酶切位点。Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃稳定15min。

encsase基因片段经PCR扩增后，利用限制性内切酶EcoRI和XhoI对PCR产物和pET-22b表达载体进行双酶切处理，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收双酶切处理过的encsase基因片段以及pET-22b表达载体酶切大片段，限制性内切酶EcoRI、XhoI以及Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，pET-22b载体购自美国Novagen公司，酶与底物反应的体系、反应温度以及反应时间均遵循使用说明书。

利用T4 DNA ligase将酶切处理过的encsase基因片段与同样经过双酶切的pET-22b表达载体于16℃水浴条件下进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株后，涂布到含50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上；37℃培养12-14h，挑取单克隆到含有50μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中，37℃、200rpm摇床培养12-14h后，提取质粒；将质粒用正向引物encsase-F和反向引物encsase-R进行菌液PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确，取出20μL重组质粒送去生工生物公司测序，测序结果表明，encsase(SEQID NO.1)基因片段成功插入到pET-22b表达载体的酶切位点EcoRI、XhoI之间，插入方向正确，且未发生碱基突变、缺失以及增加的情况，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将重组表达载体命名为pET22b-encsase。T4 DNAligase购自TaKaRa公司，连接反应体系、反应温度、反应时间均遵循使用说明书。

将重组质粒pET22b-encsase转化到大肠杆菌BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组硫酸软骨素裂解酶enCSase的诱导表达，利用NiSepharose 6Fast Flow(GE)凝胶对目的蛋白进行纯化，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的目的蛋白进行检测，检测结果如图3所示，纯化后的硫酸软骨素裂解酶enCSase(图3)在电泳胶上均呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合，纯度达到95％。

实施例5、重组硫酸软骨素裂解酶enCSase的酶学性质分析

1、温度对酶活性的影响

首先将3mg/mL的硫酸软骨素A或透明质酸、150mM pH8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、enCSase酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合后，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下反应20min，反应结束后，按紫外分光光度法测定酶活力，以最佳酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，检测结果如图4所示，enCSase在10～30℃对硫酸软骨素A的酶活在80％以上，在20～40℃对透明质酸的酶活在70％以上，反应温度在50℃以上时，enCSase酶活迅速下降；其中，enCSase对硫酸软骨素A和透明质酸分别在40℃和30℃时达到最大活力，表明重组硫酸软骨素裂解酶enCSase对硫酸软骨素A的最适反应温度为40℃，对透明质酸的最适反应温度为30℃。

紫外法测定酶活力的方法参考现有技术(Yamagata,T.,et al.,Purificationand properties of bacterial chondroitinases and chondrosulfatases.The Journalof biological chemistry,1968.243(7):p.1523-35)，是以灭活酶为阴性对照，利用分光光度计测定反应产物232nm光吸收判断产物生产量从而判定酶活力的大小。

2、pH对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸软骨素A或透明质酸、反应缓冲液、enCSase酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合，反应缓冲液包括150mM的NaAc-HAc(pH5.0-6.0)、150mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH6.0-8.0)、150mM的Tris-HCl(pH7.0-10.0)。在最适温度条件下反应20min，反应结束后，按紫外分光光度法测定酶活力，以最佳酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，检测结果如图5所示，重组硫酸软骨素裂解酶enCSase在NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 7.0)缓冲液中对硫酸软骨素A的酶活力最大，重组硫酸软骨素裂解酶enCSase在Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中对透明质酸的酶活力最大。

3、温度对酶稳定性的影响

将在不同温度(0℃-70℃)下热处理1、2、4、8、12、24h后的enCSase酶液与3mg/mL的硫酸软骨素A或透明质酸，在最适温度和最适pH下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，检测结果如图6所示，重组硫酸软骨素裂解酶enCSase在0-30℃热处理24h后对透明质酸仍保持80％以上的酶活力(图6A)；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase在0-20℃热处理24h后对硫酸软骨素A仍能够保持80％以上的酶活力(图6B)；说明温度对enCSase酶稳定性影响较大，不耐高温。

4、金属离子对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸软骨素A或透明质酸、150mM pH7.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液或150mM pH7.0的Tris-HCl缓冲液、enCSase酶液以及去离子水按照10:10:3:4(体积比)的比例混合，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的金属离子终浓度为5mM，在最适条件下反应20min，反应结束后，按紫外分光光度法检测残余酶活力，以未加金属离子的酶活力定义为100％相对活力(relativie activity)，检测结果如图7所示，当底物为透明质酸时，Li⁺、K⁺、Na⁺、Mn²⁺对enCSase的酶活性有微弱促进作用，Mg²⁺、Ba²⁺对enCSase的酶活性呈现强烈的促进作用，Ca²⁺、咪唑、甘油、β-巯基乙醇对enCSase的酶活性呈现微弱抑制作用，Ag⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、DTT、EDTA和SDS对enCSase的酶活性具有强烈抑制作用；当底物为硫酸软骨素A时，Li⁺、K⁺、Na⁺对enCSase的酶活性有微弱促进作用，Mg²⁺、Ca²⁺对enCSase的酶活性呈现强烈的促进作用，Mn²⁺、Ba²⁺、咪唑、甘油、β-巯基乙醇对enCSase的酶活性呈现微弱抑制作用，Ag⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、DTT、EDTA和SDS对enCSase的酶活性具有强烈抑制作用。

5.NaCl浓度对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸软骨素A或透明质酸、150mM pH7.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液或150mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液、enCSase酶液以及去离子水按照10:10:3:4(体积比)的比例混合，接着向反应体系中添加不同浓度的NaCl，添加的NaCl终浓度分别为0mM，1mM，2mM，5mM，10mM，20mM，50mM，100mM，250mM，500mM和1000mM，在最适条件下反应20min，反应结束后，按紫外分光光度法检测残余酶活力，以加NaCl终浓度为0mM的酶活力定义为100％相对活力(relativie activity)。检测结果如图8所示，当NaCl终浓度为100mM时，对enCSase酶活促进最强，对降解透明质酸的相对活性达到200％，对降解硫酸软骨素A的相对活性达到118％。

实施例6、重组硫酸软骨素裂解酶enCSase的酶活力测定

将3mg/mL的硫酸软骨素A或透明质酸、150mM pH7.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液或150mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液、enCSase酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合，在最适条件下进行反应，反应时间为：1-10min，阴性对照中加入等量的灭活酶，反应结束后，按前述的紫外分光光度法测定酶活力。

对硫酸软骨素C，硫酸软骨素D，硫酸软骨素E和人硫酸皮肤素底物的降解活性按照上述方法测定。

同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定enCSase酶液的蛋白含量，结果表明：重组硫酸软骨素裂解酶enCSase对硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E、硫酸皮肤素和透明质酸的酶活分别为373U/mg,474U/mg,171U/mg,172U/mg,141U/mg和97U/mg。

实施例7、重组硫酸软骨素裂解酶enCSase降解不同底物的降解产物的高效液相(HPLC)分析

将3mg/mL的底物(硫酸软骨素A，硫酸软骨素C，硫酸软骨素D，硫酸软骨素E，硫酸皮肤素和透明质酸)、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH7.0)或150mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、enCSase酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合，在最适条件下反应过夜，降解产物进行HPLC分析，HPLC分析条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

检测结果如图9所示，重组硫酸软骨素裂解酶enCSase降解硫酸软骨素或硫酸皮肤素多糖时，终产物主要为不饱和四糖和不饱和二糖；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase降解透明质酸时，终产物主要为不饱和六糖和不饱和四糖。

实施例8、重组硫酸软骨素裂解酶enCSase的降解模式

将3mg/mL的硫酸软骨素A、enCSase酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH7.0)以及水，按10：3：10：7(体积比)的比例混合后，在最适温度条件下进行反应，选取不同酶解时间的降解产物进行HPLC分析，HPLC分析条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：Ex 330nm，Em 420nm。

检测结果如图10所示，enCSase在降解硫酸软骨素A时，首先生成大量的不同分子尺度的不饱和寡糖，随后大分子量的寡糖快速被降解为更小分子量的寡糖，最后只生成不饱和四糖和不饱和二糖，该结果表明重组硫酸软骨素裂解酶enCSase是一个内切酶。

实施例9、重组硫酸软骨素裂解酶enCSase寡糖降解分析

将2mg/mL的底物(透明质酸四糖、六糖、八糖，软骨素四糖、六糖，硫酸软骨素A四糖、六糖，硫酸软骨素C四糖、六糖，硫酸皮肤素四糖、六糖)、150mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)或150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH7.0)、enCSase酶液以及去离子水按照10:2:3:15(体积比)的比例混合，在最适条件下反应过夜，降解产物进行2-AB荧光标记并进行HPLC分析。HPLC分析条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：荧光检测器，激发光330nm，发射光420nm。

检测结果如图11所示，重组硫酸软骨素裂解酶enCSase能够降解透明质酸八糖生成透明质酸四糖，但是不能进一步降解透明质酸六糖和透明质酸四糖；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase能够降解软骨素六糖生成软骨素二糖和软骨素四糖，但是不能进一步降解软骨素四糖；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase能够降解硫酸软骨素A六糖生成硫酸软骨素A四糖和硫酸软骨素A二糖，但是不能进一步降解硫酸软骨素A四糖；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase能够降解硫酸软骨素C六糖生成硫酸软骨素C四糖和硫酸软骨素C二糖，但是不能进一步降解硫酸软骨素C四糖；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase能够降解硫酸皮肤素六糖生成硫酸皮肤素四糖和硫酸皮肤素二糖，但是不能进一步降解硫酸皮肤素四糖。以上结果表明，硫酸软骨素裂解酶enCSase降解透明质酸的最小寡糖单位为八糖，生成相应的不饱和四糖；降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素的最小寡糖单位为六糖，生成相应的不饱和四糖和不饱和二糖。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2943

<212> DNA

<213> 发光杆菌（Photobacterium sp.）

<400> 1

atgaaaaaaa taatatctcc tgccatcgcc caggtggcag gcaaactcat gcttgcttcg 60

gcaatttcgt tagggatcac aggaacagcc aacgcgaacc aacttcaatc tcaggtcctg 120

agttttgagg aaactcagct gccttcattt gttcaaaata atcacagtga actgacgcag 180

ctgcgtgcga ttcacggcga ccagtcccta ctgtggcact ggcagcaggg cgagacgctc 240

accatcgacc attcttttga gcgcctgacc gatgccgagg ccactcgcgc ttatgggcgt 300

ggcgccacgc aggtgctgtc attctggcta tataacccgg tcgccgtcga tgacaccatg 360

accgtggtgc tatcggataa agatggccgg gaatcaacag acctgaagat tcggatgaat 420

ttcaccggct ggcgcgccgt cggtgtgtct ctgaatgccg acttcacgcc agctgtgaca 480

gataatctgg caaaactcac ttttcacgcg ccagcggcat taaccgacgg ggcggccccg 540

ctctttatcg atcgggtgat ggtgtcggtg gatgacaaac gctatcagtg gtctgatcat 600

caggtcacca cccgttacga catcccggaa attgattttg ggctgccgga cacactgccg 660

gtaccgacgc aaactgagct ggacgatgcc gacacgattc aatcacaact gattgagcaa 720

tacagcggtc gctcgggaag tttcgattcg ttggagaaac gattcaaatc tttcaatatt 780

cagaaagatg cgcagggcgt gatcaccggc cgtcatattg tctcgggcta ccaaaagacc 840

atctatcagc cggatcattt gctgccggcg gataaagcgg agtttgatga gtatgctgaa 900

atctcagact acaccgatct gatgctggac ttagccaagg cgtatcacta cccgtcgttt 960

caaggggatc gccaacaggt tgcgaccatg tatcggctga tgacggagca ccttctggat 1020

cagggctatg ctgagggcag cagcctggtc acaacccatc actggggata cggtgcgcgc 1080

tggtggtata tttctgcgct gatgatggcc gatgagctga agcagcatga tttgctcaaa 1140

ccgacttatg atgcactggt ttggttctcg cgcgagttca aagaaagctt tgatatggtg 1200

ttgagcagca agagctccaa tctggactac tttaatacgc tgtcaaacca acatttagcg 1260

ctgctgttgt tgaacccgga tgacagcgag cgagtggcgc tgctgcataa gttctctgtt 1320

ttcttctccg gtgctctgag ccagacacca cccgggtacc acgacggatt ccgcccggac 1380

ggtacggctt ggcgacatcg tggtcactat cccggctatg cattccatgc ctttaagcgg 1440

gccgcactgg ttgcttacgt gctgaaacgt tcgagctttg cattggaaat ccaggcactc 1500

gacagcctga aatcggttat ggtggctggc tggcgttata gcaacccata tgtgccgctg 1560

gcgctgtcgg gccgtcatcc gttcggcaag ctgggcgtga tgcattatca gagcggtctg 1620

aagtatctgg ccaaagccta tccgaccctt gaccaggagc tggcatcgat tttcctgcag 1680

gtcagcaata ccccgcaagc gcaaagtcag tctattttcg gacaaaaggt cacgccggcg 1740

aaattaccac aaggcagttg gagctttaat ggcggtggat ttgtcgtgca tcgacatggc 1800

gagcggatgg cggtgttgaa gggctacaac aaagatgtct ggtcctctga aatttattac 1860

aaagacaacc gttatggccg ttatcagagc cacggtagtg tgcatgtgat gccatacggg 1920

gatccggatc agtttggcta tcagcaggag ggctgggact ggaaccgtaa tccgggtgca 1980

acgacgatcc atcttgatta cgatcagctg gaaagcccga atatgcacag cctgatggtg 2040

cgttcggaag aagggatcag cggtgcaacg acactgaatg agaagttcag cctgtttacc 2100

tttaaacaca aggcgccttc gaatctccac aggttcgagc cgactttcga ggcggaaaag 2160

catgtcctgg ctgttgagga tatgctgttc ctggccggaa acggtatccg taatgctgac 2220

ggtcaccacc agaccgaaac gacgctgttc cagttggcga tgggggagca gtcgaaaggg 2280

atttggatta acggggttcg ccatcaaagt gaagatttca cggcgacctt gggcagtggc 2340

gactggatca tcgacgataa cggggtggga tattatctga aggatgtcga taccgtgtat 2400

gtacgccgcg ggccgcagca atcacggcat gacaaaacta agcaggtgac ttccggtgat 2460

ttttccacgg cctggatcga ccatggccgt gcgccgcagg atgcgcatta tgaatacgtg 2520

atggtgatgg aaacgaatcc aagcgatatg gctgcatttg ccgcggagat gaagcgctat 2580

ccgtactttg tgacccgcaa gacggatgag cacgggatgt atatccgcaa ccggaccaat 2640

aacctgtttg gttacagcag cacaggatat gcggatttca aatatggccc gctgcgctcg 2700

atgagcacga cggcgcaggc gttgatccag atggcaggag agacggccta tttgagtgtt 2760

gcatcaccgg agctgatgct tcatgaaact gagccaacac cgacggtgtc catcgatgtg 2820

gttgtgaaag ggctgtggga gacagaaggg gccgattact tctaccaggg cgagaatacg 2880

gtgattaccg tagagagctt cttcggagag tcagtaaacc tgacgctgag aaagctttac 2940

tga 2943

<210> 2

<211> 980

<212> PRT

<213> 发光杆菌（Photobacterium sp.）

<400> 2

Met Lys Lys Ile Ile Ser Pro Ala Ile Ala Gln Val Ala Gly Lys Leu

1 5 10 15

Met Leu Ala Ser Ala Ile Ser Leu Gly Ile Thr Gly Thr Ala Asn Ala

20 25 30

Asn Gln Leu Gln Ser Gln Val Leu Ser Phe Glu Glu Thr Gln Leu Pro

35 40 45

Ser Phe Val Gln Asn Asn His Ser Glu Leu Thr Gln Leu Arg Ala Ile

50 55 60

His Gly Asp Gln Ser Leu Leu Trp His Trp Gln Gln Gly Glu Thr Leu

65 70 75 80

Thr Ile Asp His Ser Phe Glu Arg Leu Thr Asp Ala Glu Ala Thr Arg

85 90 95

Ala Tyr Gly Arg Gly Ala Thr Gln Val Leu Ser Phe Trp Leu Tyr Asn

100 105 110

Pro Val Ala Val Asp Asp Thr Met Thr Val Val Leu Ser Asp Lys Asp

115 120 125

Gly Arg Glu Ser Thr Asp Leu Lys Ile Arg Met Asn Phe Thr Gly Trp

130 135 140

Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn Ala Asp Phe Thr Pro Ala Val Thr

145 150 155 160

Asp Asn Leu Ala Lys Leu Thr Phe His Ala Pro Ala Ala Leu Thr Asp

165 170 175

Gly Ala Ala Pro Leu Phe Ile Asp Arg Val Met Val Ser Val Asp Asp

180 185 190

Lys Arg Tyr Gln Trp Ser Asp His Gln Val Thr Thr Arg Tyr Asp Ile

195 200 205

Pro Glu Ile Asp Phe Gly Leu Pro Asp Thr Leu Pro Val Pro Thr Gln

210 215 220

Thr Glu Leu Asp Asp Ala Asp Thr Ile Gln Ser Gln Leu Ile Glu Gln

225 230 235 240

Tyr Ser Gly Arg Ser Gly Ser Phe Asp Ser Leu Glu Lys Arg Phe Lys

245 250 255

Ser Phe Asn Ile Gln Lys Asp Ala Gln Gly Val Ile Thr Gly Arg His

260 265 270

Ile Val Ser Gly Tyr Gln Lys Thr Ile Tyr Gln Pro Asp His Leu Leu

275 280 285

Pro Ala Asp Lys Ala Glu Phe Asp Glu Tyr Ala Glu Ile Ser Asp Tyr

290 295 300

Thr Asp Leu Met Leu Asp Leu Ala Lys Ala Tyr His Tyr Pro Ser Phe

305 310 315 320

Gln Gly Asp Arg Gln Gln Val Ala Thr Met Tyr Arg Leu Met Thr Glu

325 330 335

His Leu Leu Asp Gln Gly Tyr Ala Glu Gly Ser Ser Leu Val Thr Thr

340 345 350

His His Trp Gly Tyr Gly Ala Arg Trp Trp Tyr Ile Ser Ala Leu Met

355 360 365

Met Ala Asp Glu Leu Lys Gln His Asp Leu Leu Lys Pro Thr Tyr Asp

370 375 380

Ala Leu Val Trp Phe Ser Arg Glu Phe Lys Glu Ser Phe Asp Met Val

385 390 395 400

Leu Ser Ser Lys Ser Ser Asn Leu Asp Tyr Phe Asn Thr Leu Ser Asn

405 410 415

Gln His Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asn Pro Asp Asp Ser Glu Arg Val

420 425 430

Ala Leu Leu His Lys Phe Ser Val Phe Phe Ser Gly Ala Leu Ser Gln

435 440 445

Thr Pro Pro Gly Tyr His Asp Gly Phe Arg Pro Asp Gly Thr Ala Trp

450 455 460

Arg His Arg Gly His Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe His Ala Phe Lys Arg

465 470 475 480

Ala Ala Leu Val Ala Tyr Val Leu Lys Arg Ser Ser Phe Ala Leu Glu

485 490 495

Ile Gln Ala Leu Asp Ser Leu Lys Ser Val Met Val Ala Gly Trp Arg

500 505 510

Tyr Ser Asn Pro Tyr Val Pro Leu Ala Leu Ser Gly Arg His Pro Phe

515 520 525

Gly Lys Leu Gly Val Met His Tyr Gln Ser Gly Leu Lys Tyr Leu Ala

530 535 540

Lys Ala Tyr Pro Thr Leu Asp Gln Glu Leu Ala Ser Ile Phe Leu Gln

545 550 555 560

Val Ser Asn Thr Pro Gln Ala Gln Ser Gln Ser Ile Phe Gly Gln Lys

565 570 575

Val Thr Pro Ala Lys Leu Pro Gln Gly Ser Trp Ser Phe Asn Gly Gly

580 585 590

Gly Phe Val Val His Arg His Gly Glu Arg Met Ala Val Leu Lys Gly

595 600 605

Tyr Asn Lys Asp Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Tyr Lys Asp Asn Arg

610 615 620

Tyr Gly Arg Tyr Gln Ser His Gly Ser Val His Val Met Pro Tyr Gly

625 630 635 640

Asp Pro Asp Gln Phe Gly Tyr Gln Gln Glu Gly Trp Asp Trp Asn Arg

645 650 655

Asn Pro Gly Ala Thr Thr Ile His Leu Asp Tyr Asp Gln Leu Glu Ser

660 665 670

Pro Asn Met His Ser Leu Met Val Arg Ser Glu Glu Gly Ile Ser Gly

675 680 685

Ala Thr Thr Leu Asn Glu Lys Phe Ser Leu Phe Thr Phe Lys His Lys

690 695 700

Ala Pro Ser Asn Leu His Arg Phe Glu Pro Thr Phe Glu Ala Glu Lys

705 710 715 720

His Val Leu Ala Val Glu Asp Met Leu Phe Leu Ala Gly Asn Gly Ile

725 730 735

Arg Asn Ala Asp Gly His His Gln Thr Glu Thr Thr Leu Phe Gln Leu

740 745 750

Ala Met Gly Glu Gln Ser Lys Gly Ile Trp Ile Asn Gly Val Arg His

755 760 765

Gln Ser Glu Asp Phe Thr Ala Thr Leu Gly Ser Gly Asp Trp Ile Ile

770 775 780

Asp Asp Asn Gly Val Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Val Asp Thr Val Tyr

785 790 795 800

Val Arg Arg Gly Pro Gln Gln Ser Arg His Asp Lys Thr Lys Gln Val

805 810 815

Thr Ser Gly Asp Phe Ser Thr Ala Trp Ile Asp His Gly Arg Ala Pro

820 825 830

Gln Asp Ala His Tyr Glu Tyr Val Met Val Met Glu Thr Asn Pro Ser

835 840 845

Asp Met Ala Ala Phe Ala Ala Glu Met Lys Arg Tyr Pro Tyr Phe Val

850 855 860

Thr Arg Lys Thr Asp Glu His Gly Met Tyr Ile Arg Asn Arg Thr Asn

865 870 875 880

Asn Leu Phe Gly Tyr Ser Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Phe Lys Tyr Gly

885 890 895

Pro Leu Arg Ser Met Ser Thr Thr Ala Gln Ala Leu Ile Gln Met Ala

900 905 910

Gly Glu Thr Ala Tyr Leu Ser Val Ala Ser Pro Glu Leu Met Leu His

915 920 925

Glu Thr Glu Pro Thr Pro Thr Val Ser Ile Asp Val Val Val Lys Gly

930 935 940

Leu Trp Glu Thr Glu Gly Ala Asp Tyr Phe Tyr Gln Gly Glu Asn Thr

945 950 955 960

Val Ile Thr Val Glu Ser Phe Phe Gly Glu Ser Val Asn Leu Thr Leu

965 970 975

Arg Lys Leu Tyr

980

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaattcgaac caacttcaat ctcaggtcct 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgaggtaa agctttctca gcgtcagg 28

Claims

1.一种硫酸软骨素裂解酶enCSase，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase，其特征在于，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase为内切酶，分离自发光杆菌（Photobacterium sp.）QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

3.权利要求1所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因来源于发光杆菌（Photobacterium sp.）QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

5.一种重组表达载体，其特征在于，在表达载体中插入了权利要求3所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

7.一种重组细胞，其特征在于，在宿主细胞中插入了权利要求3所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因。

8.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

9.如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主细胞为Escherichia coli BL2 1、Escherichia coli JM 109或Escherichia coli DH 5α；所述酵母菌宿主细胞为Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris或Kluyveromyces lactis；所述枯草杆菌宿主细胞为Bacillus subtilis R25或Bacillus subtilis 9920；所述乳酸菌宿主细胞为Lactic acid bacteria C0CC101；所述放线菌宿主细胞为Streptomycesspp.；所述丝状真菌宿主细胞为Trichoderma viride，Trichoderma reesei，Aspergillus niger或Aspergillus nidulans；所述昆虫细胞为Bombyxmori或Antharaea eucalypti；所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL。

10.权利要求7所述的重组细胞在重组表达硫酸软骨素裂解酶enCSase中的应用。

11.权利要求1所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase在制备硫酸软骨素寡糖，硫酸皮肤素寡糖和/或透明质酸寡糖中的应用。