CN107574196B - 褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程重组型褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用。M‑专一性褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列不饱和寡糖产物中的应用；所述重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者，所述重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi‑rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL和Avi‑rEAlgL是M专一性的内切型褐藻胶裂解酶，是一种高效的制备富G段寡糖的工具酶。褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL和Avi‑rEAlgL具有适冷特性和广泛的pH稳定性，有望成为用于治疗囊性纤维病的酶制剂。

Description

褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用

技术领域

本发明涉及褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用，特别涉及两种甘露糖醛酸(M)专一性的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL在降解由M和古罗糖醛酸(G)混合组成的商品化褐藻胶多糖制备不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖的系列寡糖产物中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

褐藻胶(Alginate)与琼胶，卡拉胶并称三大海洋多糖。褐藻胶的主链是由β-D-1,4-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)及其C-5差向异构体α-L-1,4-古罗糖醛酸(Guluronate,G)两种糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的线性多糖分子。其中，由连续的M糖单元组成的糖链称为聚M段(M block)，连续的G糖单元组成的糖链称为聚G段(G block)，不同的糖单元交替链接称为MG或GM段(MG blocks)。褐藻胶广泛存在于海带，巨藻和马尾藻等大型藻类的细胞壁和胞间质中。某些微生物，如铜绿假单胞菌和棕色固氮菌，也能合成并分泌褐藻胶。与海藻来源的褐藻胶不同，细菌所分泌的褐藻胶在糖单元的O-2或O-3位具有一定程度的乙酰基修饰。褐藻胶无毒无害，具有良好的吸水成胶能力，是良好的支撑材料，因而广泛应用于化工、医药和食品行业。研究还表明，褐藻胶寡糖具有重要生物活性，如抗凝血、降血糖、降血脂、抗自由基、抗肿瘤、免疫保护、促植物生长等。深入研究表明：(1)聚M段和MG段可激活单核细胞，使其产生肿瘤坏死因子TNF-A、IL-1与IL-6，因而具有抗肿瘤活性；(2)耿美玉等以聚M段褐藻胶寡糖为原料，研制的一类候选药物971，具有抗β-淀粉样蛋白聚集活性，可用于治疗阿尔兹海默症；(3)聚G段寡糖是掌状海带的免疫激发子，能促进海带幼苗生长、提高海带抗病力，预防海带疾病。近年来，褐藻胶寡糖成为一种新的潜在的功能产品不断受到人们的关注，其高值化研究已经成为新的热点。

褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶(Polysaceharide Lyase,PL)，通过β消去反应催化褐藻胶分子内相邻糖单元之间1,4-O-糖苷键的断裂，并在寡糖产物中新产生的非还原端的糖单元的C4和C5位形成不饱和双键。为区别于饱和的糖单元M和G，通常将这一不饱和的糖单元称为Δ。这使得：(1)寡糖产物在235nm附近具有特征吸收；(2)不饱和糖单元的存在增加了寡糖产物的脂溶性。相比化学法(酸、碱、氧化)降解或者物理法(微波、超声)降解，褐藻胶寡糖的酶法降解，具有反应条件温和、产物结构稳定而明确、环境污染小等优点。褐藻胶裂解酶主要来源于海洋藻类、海洋软体动物、棘皮动物和多种微生物(包括海洋细菌、陆生真菌和极少数的病毒)，其中细菌来源的褐藻胶裂解酶研究最为广泛。褐藻胶裂解酶不仅具有重要的理论研究价值，还可用于制备系列不饱和褐藻胶寡糖、生产生物乙醇及解析海藻多糖结构等，因而是高效的工具酶资源。根据酶对底物的选择性，通常可将褐藻胶裂解酶分为M专一性、G专一性、以及M/G兼性等三大类；根据酶的底物降解模式，又可以分为内切酶、外切酶等两种基本类型。

铜绿假单胞菌是常见的机会致病菌，其粘性菌在宿主肺部产生褐藻多糖，这些褐藻多糖在囊性纤维化(CF)患者肺部形成生物膜，具有一定黏性和致密性，导致患者呼吸困难，并导致对抗生素的耐药性。褐藻胶裂解酶可分解这种菌体生物膜中的褐藻胶成分，从而恢复病原菌对抗生素的敏感性。铜绿假单胞菌和棕色固氮菌均能合成并分泌含乙酰化甘露糖醛酸的褐藻胶，且乙酰化的褐藻胶是铜绿假单胞菌的重要致病因子。在已有报道中能以乙酰化褐藻胶为底物的裂解酶较少(LXiao etal.,2006)，有望用于囊性纤维化疾病的辅助治疗。

铜绿假单胞菌来源的褐藻胶裂解酶Pae-AlgL(GenBank收录号U27829)和棕色固氮菌来源的褐藻胶裂解酶Avi-AlgL(GenBank收录号AF027499)是较早发现的细菌来源的M专一性的褐藻胶裂解酶，被人们广泛关注。已有研究主要集中在该酶参与褐藻胶生物合成过程中的功能(Aoife Boyd etal.,1994，Steven R.Monday etal.,1993,W Thiangyianetal.,1999)，即在褐藻胶分泌至胞外时酶在周质空间起到“剪刀”作用，从而调节多糖的聚合度大小。而关于酶生化性质的研究较少，关于酶的底物降解模式、寡糖产物的生成模式及结构特征等，更是未见详细报道，因而无法为酶的商品化应用提供详细的参数和背景信息。此外，在铜绿假单胞菌和棕色固氮菌中，天然褐藻胶裂解酶的表达，受褐藻胶生物合成基因簇上游基因的调节(Boy etal.,1994，Steven R.Monday etal.,1993)，产量较低，无法直接进行酶的商业化生产。早期在大肠杆菌中进行的转基因表达虽然提高了褐藻胶裂解酶的产量(Richard A etal.,1998，Neal L.Schiller,etal.,1993，Helga Ertesvag etal.,1998)，但受限于表达载体和密码子偏好性等因素的影响，产量仍不能满足商业化酶的需求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用。

本发明技术方案如下：

M-专一性的重组褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列寡糖产物中的应用，

所述底物为由β-D-1,4-甘露糖醛酸(M)和α-L-1,4-古罗糖醛酸(G)混合组成的褐藻胶多糖、由β-D-1,4-甘露糖醛酸和α-L-1,4-古罗糖醛酸混合组成的不饱和五糖及以上的不饱和多糖、聚β-D-1,4-甘露糖醛酸段饱和三糖及以上的饱和多糖；

所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者，

所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖，摩尔比为169：28：10：7：3：1。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和二糖为ΔM非还原性末端的二糖单元，不饱和五糖为ΔG非还原性末端的五糖单元，不饱和六糖为ΔG非还原性末端的六糖单元，不饱和七糖为ΔG非还原性末端的七糖单元。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和三糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的三糖单元，ΔM非还原性末端的三糖单元与ΔG非还原性末端的三糖单元的摩尔比为100：104。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和四糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的四糖单元，ΔM非还原性末端的四糖单元与ΔG非还原性末端的四糖单元的摩尔比为100：196。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的不饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为等摩尔量的不饱和二糖与不饱和三糖。

根据本发明优选的，所述底物为聚M段饱和三糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为不饱和二糖和单糖；所述底物为聚M段饱和四糖时，褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为81：9；所述底物为聚M段饱和五糖时，褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为4：17：73；所述底物为聚M段饱和六糖时，褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为6：37：52。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖的摩尔比为232：34：16：7：4：1。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和二糖为ΔM非还原性末端的二糖单元，不饱和四糖为ΔG非还原性末端的四糖单元，不饱和五糖为ΔG非还原性末端的五糖单元，不饱和六糖为ΔG非还原性末端的六糖单元，不饱和七糖为ΔG非还原性末端的七糖单元。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的褐藻胶多糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和三糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的三糖单元，ΔM非还原性末端的三糖单元与ΔG非还原性末端的三糖单元的摩尔比为134：100。

根据本发明优选的，所述底物为由M和G混合组成的不饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列寡糖产物为等摩尔量的不饱和二糖与不饱和三糖。

根据本发明优选的，所述底物为聚M段饱和四糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为65：24；所述底物为聚M段饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为9：17：69；所述底物为聚M段饱和六糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为3：32：59。

根据本发明优选的，所述的应用为辅助治疗囊性纤维化疾病中多糖降解酶制剂。

有益效果

本发明首次揭示了两种M-专一性重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL在降解由M和G混合组成的褐藻胶多糖时的特性，其寡糖终产物是含不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖等系列寡糖，具有特定的非还原端结构特征与演替规律，这不同于已知的G专一性的褐藻胶裂解酶Aly5(Wenjun Han etal.,2015)降解褐藻胶生成的寡糖终产物，同时进一步研究了重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL以褐藻胶为底物制备系列不饱和寡糖终产物时最终主产物中寡糖成分的聚合度、相对含量，这为上述裂解酶应用于辅助治疗囊性纤维化疾病中多糖降解酶制剂、特异性工具酶等方向的应用奠定了基础。

附图说明

图1、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)功能模块构成的BLASTp分析结果图；

图2、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；

图中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为 116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL；泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量 10μL；泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10μL；泳道4、经镍柱纯化的Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL，上样量10μL；

图3、温度对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)活性的影响曲线；

图4、pH值对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)活性的影响曲线；

图5、温度对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)稳定性的影响曲线；

图6、pH值对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)稳定性的影响曲线；

图7、金属离子及化学试剂对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)活性的影响柱形图；

图8、NaCl浓度对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)活性的影响曲线；

图9、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)降解褐藻胶过程中寡糖产物的分子凝胶色谱-HPLC分析图；

图中：(1)UDP2，不饱和二糖；(2)UDP3，不饱和三糖；(3)UDP4，不饱和四糖；(4)UDP5，不饱和五糖；(5)UDP6，不饱和六糖；(6)UDP7，不饱和七糖；

图10、用重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)彻底降解褐藻胶后所制备的不饱和寡糖片段UDP2、UDP3、UDP4、UDP5、UDP6和UDP7的HPLC分析图；

图11、用重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL(a)和Avi-rEAlgL(b)彻底降解褐藻胶所制备不饱和寡糖片段UDP2、UDP3、UDP4、UDP5、UDP6和UDP7的¹H-NMR图；

图12、用重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL彻底降解系列不饱和寡糖(UDP2-UDP6)的HPLC比较分析图；

图13、用重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL彻底降解系列饱和聚M段寡糖(M2-M6)的HPLC比较分析图(紫外)；

图14、用重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL彻底降解饱和聚G六糖(G6)的HPLC比较分析图(紫外)；

图15、用重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL不同时间降解还原性末端被2-AB标记的饱和聚M五糖(2AB-M5)(a)和2-AB标记的饱和聚M四糖(2AB-M4)(b)的HPLC分析图(荧光)；

图16、用重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL不同时间降解还原性末端被2-AB标记的饱和聚M五糖(2AB-M5)(a)和2-AB标记的饱和聚M四糖(2AB-M4)(b)的HPLC分析图(荧光)。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。经GenBank查询获得铜绿假单胞菌和棕色固氮菌的褐藻胶裂解酶DNA序列，人工优化密码子后全合成序列(由济南博尚生物技术有限公司完成)，所有的限制性内切酶及dNTP均购自TaKaRa公司；所有感受态细胞(如：DH5α、BL21(DE3))购自北京全式金生物技术有限公司；褐藻胶裂解酶酶活测定底物褐藻胶酸钠购自Sigma-Aldrich公司，或者为普通商品化褐藻胶，其它的化学药品均为一般分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)的褐藻胶裂解酶DNA序列及其分析。

NCBI上输入GenBank收录号U27853和AF027499，分别获得铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的褐藻胶裂解酶(Alginate Lyase)基因序列。通过信号肽在线预测软件SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的在线分析，铜绿假单胞菌来源的褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL的N-端1-27位氨基酸为分泌型信号肽，棕色固氮菌来源的褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL的N-端1-26位氨基酸为分泌型信号肽，去除编码信号肽的碱基序列并按照大肠杆菌DH5α菌株的密码子使用频率，选用高频密码子，进行编码基因的密码子优化，Pae-rEAlgL基因全长共1032bp，所编码蛋白质含有343个氨基酸，分子量约为38.6kD；Avi-rEAlgL基因全长共1056bp，所编码蛋白质含有351个氨基酸，分子量约为39.1kD，其核苷酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。

用BLASTp软件在线分析，结果显示，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的氨基酸序列最大相似度达到66％。如图1所示，BLASTp在线分析推测Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的蛋白质均只含有一个褐藻胶裂解酶超级家族保守的假定催化结构域。

实施例2、褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的重组表达载体的构建

委托济南博尚生物技术有限公司，分别人工合成实施例1中所述的两种密码子优化后的褐藻胶裂解酶的编码基因，并将全合成的基因片段分别克隆入pET-30a(+)载体，获得重组质粒Pae-pE30a-AlgL和Avi-pE30a-AlgL。上述表达载体中两种基因的插入位点均为Nde I/Xho I。

实施例3、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的重组表达

按照说明书上的操作步骤，将重组质粒Pae-pE30a-AlgL和Avi-pE30a-AlgL分别转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)。然后使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂进行重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的16℃低温诱导表达。在8,000×g、4℃条件下离心10min，收集菌体，并用缓冲液A(50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)洗涤两次，重悬菌体，冰水浴条件超声破碎至菌液澄清。在15,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集水溶性组分(粗酶液)，并用Ni Sepharose 6Fast Flow(购自GE公司)对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL进行纯化。用分别含有咪唑浓度为10、50、100、250、500mM的缓冲液A进行梯度洗脱，纯化条件按照GE公司的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳(SDS-PAGE)检测重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的纯化情况。结果如图2所示：经IPTG诱导表达后的BL21(DE3)菌体中，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的表达量不低于400mg/L菌体培养物；纯化后的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL样品装入最小分子截留量为10kD的透析袋，在4℃环境中用缓冲液A进行透析。制得重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL酶液如图2箭头所示。

实施例4、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL最适温度的测定

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的褐藻胶，加热溶解后，置于0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴环境中降温1h。向每900μL底物溶液中添加实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的稀释液100μL，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的稀释液浓度为10μg/mL，混匀后继续反应，反应4h。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比，结果如图3所示。

以褐藻胶多糖为底物测定酶活时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL在30℃反应时达到最大活力，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL在40℃反应时达到最大活力。这表明重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL的最适反应温度是30℃，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL最适反应温度是40℃。同时，以褐藻胶为底物时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL在0-20℃展示70％以上的相对酶活，这表明重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL具有一定的适冷酶学性质。

实施例5、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL最适pH的测定

分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、50mM的Tris-HCl缓冲液，与褐藻胶配制质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的褐藻胶底物，所对应的pH值分别为5、6，6、7、8，7、8、9、10三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物溶解后，置于最适温度中孵育1h，然后向每900μL底物中添加实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的稀释液100μL，混匀后开始反应，反应4h。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值和偏差。相对酶活(RA)定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图4所示：重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL的最适反应pH为7.0，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL的最适反应pH为8.0。在pH 5～10范围内，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL相对酶活在60％以上，显示该酶具有广泛的pH反应活性。

实施例6、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的温度稳定性分析

将实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL酶液在不同温度(0～70℃)下热处理0.5h、1h、2h后，分别与用蒸馏水配置的质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的褐藻胶，按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力，结果如图5所示。

重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL在30℃的温度下预处理2h后仍然具有96％的残余活性，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL在40℃的温度下预处理2h后，仍然具有83％的残余活性，表明重组褐藻胶裂解Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL具有一定的热稳定性。

实施例7、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的pH稳定性分析

将实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的酶液，在最适温度(30℃和40℃)、不同的pH(pH5～10)环境中分别预孵育2h后，与质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的褐藻胶底物溶液按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液酶活定义为100％相对活力，结果如图6所示。

在pH5～10的范围内预处理2h，Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL相对酶活均保持80％以上。这表明重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL对pH值耐受范围较广。

实施例8、金属离子对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL活性的影响

将用去离子水配置的质量浓度为0.1-1.2％褐藻胶底物、实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL酶液、以及水按5：1：4(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为1mM或10mM，然后分别在30℃(Pae-rEAlgL)和40℃(Avi-rEAlgL)反应4h，按前述的DNS-还原糖法测酶的活力。对照组为不加任何金属离子时Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的活性(设定为100％)。

结果图7(a)所示，在1mM或10mM浓度下：(1)Na⁺、K⁺、Li⁺等三种一价金属试剂对Pae-rEAlgL的活性表现为微弱的促进作用，Ag⁺具有微弱的抑制作用；(2)Mg²⁺、Mn²⁺等二价金属例子对酶活具有促进作用，而其他二价、三价金属离子对酶活具有一定的抑制作用；(3)甘油、β-巯基乙醇及DTT在10mM时对Pae-rEAlgL的活性具有促进作用，其中β-巯基乙醇促进作用最大，活性达到118％。

结果图7(b)所示，在1mM或10mM浓度下：(1)Ag⁺、K⁺、Li⁺等三种一价金属试剂在10mM时对Avi-rEAlgL的活性表现为微弱的抑制作用，而Na⁺具有微弱的促进作用；(2)二价、三价金属离子对酶活均具有一定抑制作用；(3)10mM的β-巯基乙醇对Avi-rAlg具有明显促进作用，活性达到108％。

实施例9、NaCl浓度对重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL活性的影响

将用去离子水配置的质量浓度为0.1-1.2％褐藻胶底物、实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL酶液按9：1(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同体积的5M NaCl母液使终浓度分别为0M，0.2M，0.4M，0.6M，0.8M和1M，然后分别在30℃(Pae-rEAlgL)或40℃(Avi-rEAlgL)反应4h，按前述的DNS-还原糖法测酶的活力。对照组为不加NaCl时Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的活性(设定为100％)。

结果图8(a)和(b)所示，(1)在0～1M的NaCl浓度下，NaCl对Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL活性均具有促进作用；(2)在0.2M NaCl浓度时，NaCl对Pae-rEAlgL促进活性最大，活性达到130％；在0.6M NaCl浓度下，NaCl对Avi-rEAlgL促进活性最大，活性达到160％。

实施例10、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL降解褐藻胶的产物的高效液相(HPLC)分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的褐藻胶底物，加热溶解后，置于30℃和40℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实施例3制得的重组酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的稀释液10-100μL，不足200μL体积时，用无菌去离子水补足；混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min。在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。

用浓度为0.20mol/L的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将上述褐藻胶的不同酶解时间的样品，以自动进样器加载100μg/样品，其它条件不变，235nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。

如图9(a)所示，在上述条件下，褐藻胶底物被降解后，随着酶解反应时间的增加，具有235nm特征吸收的寡糖产物的含量逐渐增加，且相对含量最终趋于稳定。这初步表明重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL是褐藻胶裂解酶。酶解反应的最终产物是HPLC分析中出峰时间为32.5’，34.8’，36.0’，38.2’，40.5’和43.2’的六个主产物，分别对应不饱和寡糖产物UDP7、UDP6、UDP5、UDP4、UDP3和UDP2。且UDP7、UDP6、UDP5、UDP4、UDP3和UDP2产物的面积比约为1：3：7：10：28：169，提示其摩尔比为1：3：7：10：28：169，其中UDP2主产物质量含量占终产物的64.75％。

如图9(b)所示，在上述条件下，褐藻胶底物被降解后，随着酶解反应时间的增加，具有235nm特征吸收的寡糖产物的含量逐渐增加，且相对含量最终趋于稳定。这初步表明重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL是褐藻胶裂解酶。酶解反应的最终产物是HPLC分析中出峰时间为32.5’，34.8’，36.0’，38.2’，40.5’和43.2’的六个主产物，分别对应不饱和寡糖产物UDP7、UDP6、UDP5、UDP4、UDP3和UDP2。且UDP7、UDP6、UDP5、UDP4、UDP3和UDP2产物的面积比约为1：4：7：16：34：232，提示其摩尔比为1：4：7：16：34：232，其中UDP2主产物含量占终产物的66.67％。

实施例11、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL完全降解褐藻胶的产物UDP2-UDP7的制备

按照实施例10所述，将共200mg褐藻胶用重组酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL进行彻底酶解，产物分批上样、过分子凝胶柱Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)，并按照出峰时间分别收集单个寡糖片段。将这些寡糖样品多次收集、分别集中后，反复冷冻干燥以脱盐。

如图10(a)(Pae-rEAlgL)和10(b)(Avi-rEAlgL)所示，制备的寡糖片段UDP2-UDP7经HPLC检测分析，结果显示产物在235nm具有特征吸收，纯度均大于99％，符合进一步实验要求

实施例12、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL彻底降解褐藻胶的寡糖产物的¹H-NMR鉴定

按照实施例11所述，将共200mg褐藻胶用重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL彻底酶解，样品分批上样、过Superdex Peptide 10/300GL分子凝胶色谱柱(GE公司)，并按照出峰时间分别收集出峰时间为32.5’，34.8’，36.0’，38.2’，40.5’和43.2’的六个寡糖样品。将多次收集到的六个寡糖样品分别集中后，反复冷冻干燥以脱盐。用无菌去离子水溶解所得寡糖样品，用重水(D₂O)溶解所得的寡糖样品，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，并进行¹H-NMR分析，最终确定各寡糖的的化学结构及特征。

通过¹H-NMR数据分析上述两种褐藻胶裂解酶降解褐藻胶后的寡糖产物的结构特征。

如图11(a)所示：(1)5.65ppm处的特征性化学位移值表明，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL降解褐藻胶后的产物不饱和二糖UDP2几乎全部是ΔM；(2)5.70、5.60ppm两处特征性化学位移值表明，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL降解褐藻胶后的产物不饱和三糖UDP3和不饱和四糖UDP4的非还原性末端有两种类型：ΔM和ΔG；且两处峰的面积积分之比约为100：104和100：196，这表明这两类不饱和三糖和不饱和四糖的摩尔比约为100：104和100：196；(3)5.70ppm的特征性化学位移值表明，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL降解褐藻胶后的产物不饱和五糖UDP5、不饱和六糖UDP6和不饱和七糖UDP7的非还原性末端为：ΔG。

如图11(b)所示：(1)5.65ppm处的特征性化学位移值表明，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL降解褐藻胶后的产物不饱和二糖UDP2几乎全部是ΔM；(2)5.70、5.60ppm两处特征性化学位移值表明，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL降解褐藻胶后的产物不饱和三糖UDP3非还原性末端有两种类型：ΔM和ΔG；且两处峰的面积积分之比约为134：100，这表明不饱和三糖UDP3的摩尔比约为134：100；(3)5.70ppm的特征性化学位移值表明，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL降解褐藻胶后的产物不饱和四糖UDP4、不饱和五糖UDP5、不饱和六糖UDP6和不饱和七糖UDP7的非还原性末端为：ΔG。

综上表明，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL降解褐藻胶的寡糖终产物的非还原性末端结构特征演替规律呈现为随着聚合度增大，寡糖的非还原端含ΔM比例逐渐降低而含ΔG的比例逐渐增加至完全是ΔG型。

实施例13、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL最小不饱和寡糖底物的分析

用去离子水和不饱和寡糖片段，包括：不饱和七糖UDP7、不饱和六糖UDP6、不饱和五糖UDP5、不饱和四糖UDP4、不饱和三糖UDP3及不饱和二糖UDP2。将这些寡糖样品分别配置底物溶液，与浓度为10μg/mL的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL酶液、150mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液以及水按1：1：1(体积比)的比例混合后，分别在30℃(Pae-rEAlgL)或40℃(Avi-rEAlgL)反应24h。按照实施例10所述色谱操作条件，进行HPLC分析。结果如图12所示，本申请所述重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL：

(1)降解不饱和六糖UDP6之后产生不饱和四糖UDP4、不饱和三糖UDP3和不饱和二糖UDP2；

(2)降解不饱和五糖UDP5之后产生的不饱和三糖UDP3和不饱和二糖UDP2；

(3)与不饱和四糖UDP4，不饱和三糖UDP3和不饱和二糖UDP2反应前后无显著变化。

这充分表明，不饱和五糖片段是重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的最小不饱和寡糖底物，最小不饱和寡糖产物是不饱和二糖，且重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL以内切方式降解寡糖底物。

实施例14、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL酶切饱和寡糖模式的高效液相色谱(HPLC)分析

取约含30μg饱和聚寡糖(M2-M6)、聚G寡糖(G2-G6)的溶液，150mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液、实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的稀释液，按照体积比1：1：1混匀，分别在30℃(Pae-rEAlgL)或40℃(Avi-rEAlgL)反应24h。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。收集上清，作为重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中灭活的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL酶液，做阴性对照反应。

按照实施例10所述的色谱条件，将重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL酶解饱和聚M寡糖(M2-M6)、聚G寡糖(G2-G6)的样品，以自动进样器加载20μg/样品，其它条件不变，235nm检测。按照实施例10所述色谱操作条件，进行HPLC分析。结果如图13和如图14所示，本申请所述重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL：

(1)降解饱和聚M寡糖(M3-M6)，不降解饱和聚G寡糖(G6)；

(2)降解饱和的M5和M6糖时均生成不饱和二糖UM2、不饱和三糖UM3和少量不饱和四糖UM4；

(3)降解饱和的M3时主要生成不饱和二糖UM2，降解饱和的聚M四糖时主要生成不饱和三糖UM3；

实施例15、重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL酶切模式的荧光-高效液相色谱(HPLC)分析

取约含10μg饱和聚M五糖(M5)和饱和聚M四糖(M4)的溶液，旋转蒸干。加入含过量邻氨基苯甲酰胺(2-AB)、硼氰化钠的二甲亚砜(DMSO)溶液，混匀后置60℃水浴中温育2h。旋转蒸干，加入500μL去离子水溶解样品，将样品与200μL氯仿共振荡，离心，收集上清。继续用氯仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端被荧光标记了的饱和聚M五糖(2AB-M5)和饱和聚M四糖(2AB-M4)。

取上述2AB-M5和2AB-M4样品、150mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、实施例2制得的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL的稀释液，按照体积比1：1：1混匀，分别在30℃(Pae-rEAlgL)或40℃(Avi-rEAlgL)反应10s，1min，1h，48h。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心10min，转移上清，二次离心。收集上清，作为重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中加热10min的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL酶液，做阴性对照反应。

按照实施例10所述的色谱条件，将2AB-M5、2AB-M4及其酶解产物的标记样品，以自动进样器加载50-200ng/样品，其它条件不变，330nm激发，420nm检测。按照实施例10所述色谱操作条件，进行HPLC分析。结果如图14和如图15所示，本申请所述重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL：

(1)用过量的重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL或Avi-rEAlgL与2AB-M5反应后，首先产生2AB-UM4，2AB-UM3，最终生成2AB-UM3，2AB-UM2为主的，含少量2AB-UM4的终产物；

(2)降解2AB-M4时，首先生成2AB-UM3，最终生成以2AB-UM3为主，并含少量的2AB-UM2的终产物。

综上所述，这表明Pae-rEAlgL和Avi-rEAlgL降解2AB-M5时，是一种兼具内外切行为的混合模式。

说明书中涉及到的参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110> 济南悟通生物科技有限公司

<120> 褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1032

<212> DNA

<213> Pseudomonasaeruginosa

<400> 1

catatggcag atctggttcc gccgccgggt tattatgcag cagttggtga acgtaaaggt 60

agcgcaggta gctgtccggc agttccgccg ccgtataccg gtagcctggt ttttaccagc 120

aaatatgaag gtagcgatag cgcacgtgca accctgaatg ttaaagcaga aaaaaccttt 180

cgtagccaga ttaaagatat taccgatatg gaacgtggtg caaccaaact ggttacccag 240

tatatgcgta gcggtcgtga tggtgatctg gcatgtgcac tgaattggat gagcgcatgg 300

gcacgtgcag gtgcactgca gagcgatgat tttaatcata ccggtaaaag catgcgtaaa 360

tgggcactgg gtagcctgag cggtgcatat atgcgtctga aatttagcag cagccgtccg 420

ctggcagcac atgcagaaca gagccgtgaa attgaagatt ggtttgcacg tctgggtacc 480

caggttgttc gtgattggag cggtctgccg ctgaaaaaaa ttaataatca tagctactgg 540

gccgcatgga gcgttatgag caccgcagtt gttaccaatc gtcgtgatct gtttgattgg 600

gcagttagcg aatttaaagt tgcagcaaat caggttgatg aacagggttt tctgccgaat 660

gaactgaaac gtcgtcagcg tgcactggca tatcataatt atgcactgcc gccgctggca 720

atgattgcag catttgcaca ggttaatggt gttgatctgc gtcaggaaaa tcatggtgca 780

ctgcagcgtc tggcagaacg tgttatgaaa ggtgttgatg atgaagaaac ctttgaagaa 840

aaaaccggtg aagatcagga tatgaccgat ctgaaagttg ataataaata cgcatggctg 900

gaaccgtatt gtgcactgta tcgttgtgaa ccgaaaatgc tggaagcaaa aaaagatcgt 960

gaaccgttta atagctttcg tctgggtggt gaagttaccc gtgtttttag ccgtgaaggt 1020

ggtagcctcg ag 1032

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> Pseudomonasaeruginosa

<400> 2

Met Ala Asp Leu Val Pro Pro Pro Gly Tyr Tyr Ala Ala Val Gly Glu

1 5 10 15

Arg Lys Gly Ser Ala Gly Ser Cys Pro Ala Val Pro Pro Pro Tyr Thr

20 25 30

Gly Ser Leu Val Phe Thr Ser Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Ser Ala Arg

35 40 45

Ala Thr Leu Asn Val Lys Ala Glu Lys Thr Phe Arg Ser Gln Ile Lys

50 55 60

Asp Ile Thr Asp Met Glu Arg Gly Ala Thr Lys Leu Val Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Met Arg Ser Gly Arg Asp Gly Asp Leu Ala Cys Ala Leu Asn Trp Met

85 90 95

Ser Ala Trp Ala Arg Ala Gly Ala Leu Gln Ser Asp Asp Phe Asn His

100 105 110

Thr Gly Lys Ser Met Arg Lys Trp Ala Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ala

115 120 125

Tyr Met Arg Leu Lys Phe Ser Ser Ser Arg Pro Leu Ala Ala His Ala

130 135 140

Glu Gln Ser Arg Glu Ile Glu Asp Trp Phe Ala Arg Leu Gly Thr Gln

145 150 155 160

Val Val Arg Asp Trp Ser Gly Leu Pro Leu Lys Lys Ile Asn Asn His

165 170 175

Ser Tyr Trp Ala Ala Trp Ser Val Met Ser Thr Ala Val Val Thr Asn

180 185 190

Arg Arg Asp Leu Phe Asp Trp Ala Val Ser Glu Phe Lys Val Ala Ala

195 200 205

Asn Gln Val Asp Glu Gln Gly Phe Leu Pro Asn Glu Leu Lys Arg Arg

210 215 220

Gln Arg Ala Leu Ala Tyr His Asn Tyr Ala Leu Pro Pro Leu Ala Met

225 230 235 240

Ile Ala Ala Phe Ala Gln Val Asn Gly Val Asp Leu Arg Gln Glu Asn

245 250 255

His Gly Ala Leu Gln Arg Leu Ala Glu Arg Val Met Lys Gly Val Asp

260 265 270

Asp Glu Glu Thr Phe Glu Glu Lys Thr Gly Glu Asp Gln Asp Met Thr

275 280 285

Asp Leu Lys Val Asp Asn Lys Tyr Ala Trp Leu Glu Pro Tyr Cys Ala

290 295 300

Leu Tyr Arg Cys Glu Pro Lys Met Leu Glu Ala Lys Lys Asp Arg Glu

305 310 315 320

Pro Phe Asn Ser Phe Arg Leu Gly Gly Glu Val Thr Arg Val Phe Ser

325 330 335

Arg Glu Gly Gly Ser Leu Glu

340

<210> 3

<211> 1056

<212> DNA

<213> Azotobacter vinelandii

<400> 3

catatgctgg ttccgccgaa aggttattat gcaccggttg atattcgtaa aggtgaagca 60

ccggcatgtc cggttgttcc ggaaccgttt accggtgaac tggtttttcg tagcaaatat 120

gaaggtagcg atgcagcacg tagcaccctg aatgaagaag cagaaaaagc atttcgtacc 180

aaaaccgcac cgattaccca gattgaacgt ggtgttagcc gtatggttat gcgttatatg 240

gaaaaaggtc gtgcaggtga tctggaatgt accctggcat ggctggatgc atgggcagaa 300

gatggtgcac tgctgaccac cgaatataat cataccggta aaagcatgcg taaatgggca 360

ctgggtagcc tggcaggtgc atatctgcgt ctgaaattta gcagcagcca gccgctggca 420

gcatatccgg aacaggcacg tcgtattgaa agctggtttg caaaagttgg tgatcaggtt 480

attaaagatt ggagcgatct gccgctgaaa cgtattaata atcatagcta ttgggcagca 540

tgggcagtta tggcagcagg tgttgcaacc aatcgtcgtc cgctgtttga ttgggcagtt 600

gaacagtttc atattgcagc aggtcaggtt gatagcaatg gttttctgcc gaatgaactg 660

aaacgtcgtc agcgtgcact ggcatatcat aattatagcc tgccgccgct gatgatggtt 720

gcagcatttg cactggcaaa tggtgttgat ctgcgtggtg ataatgatgg tgcactgggt 780

cgtctggcag gtaatgttct ggcaggtgtt gaaaaaccgg aaccgtttgc agaacgtgca 840

ggtgatgaag atcaggatat ggaagatctg gaaaccgatg caaaatttag ctggctggaa 900

ccgtattgtg cactgtatag ctgtagcccg gcactgcgtg aacgtaaagc agaaatgggt 960

ccgtttaaaa attttcgtct gggtggtgat gttacccgta tttttgatcc ggcagaaaaa 1020

tcaccgcgta gcaccgttgg taaacgtgat ctcgag 1056

<210> 4

<211> 351

<212> PRT

<213> Azotobacter vinelandii

<400> 4

Met Leu Val Pro Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Pro Val Asp Ile Arg Lys

1 5 10 15

Gly Glu Ala Pro Ala Cys Pro Val Val Pro Glu Pro Phe Thr Gly Glu

20 25 30

Leu Val Phe Arg Ser Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Ala Ala Arg Ser Thr

35 40 45

Leu Asn Glu Glu Ala Glu Lys Ala Phe Arg Thr Lys Thr Ala Pro Ile

50 55 60

Thr Gln Ile Glu Arg Gly Val Ser Arg Met Val Met Arg Tyr Met Glu

65 70 75 80

Lys Gly Arg Ala Gly Asp Leu Glu Cys Thr Leu Ala Trp Leu Asp Ala

85 90 95

Trp Ala Glu Asp Gly Ala Leu Leu Thr Thr Glu Tyr Asn His Thr Gly

100 105 110

Lys Ser Met Arg Lys Trp Ala Leu Gly Ser Leu Ala Gly Ala Tyr Leu

115 120 125

Arg Leu Lys Phe Ser Ser Ser Gln Pro Leu Ala Ala Tyr Pro Glu Gln

130 135 140

Ala Arg Arg Ile Glu Ser Trp Phe Ala Lys Val Gly Asp Gln Val Ile

145 150 155 160

Lys Asp Trp Ser Asp Leu Pro Leu Lys Arg Ile Asn Asn His Ser Tyr

165 170 175

Trp Ala Ala Trp Ala Val Met Ala Ala Gly Val Ala Thr Asn Arg Arg

180 185 190

Pro Leu Phe Asp Trp Ala Val Glu Gln Phe His Ile Ala Ala Gly Gln

195 200 205

Val Asp Ser Asn Gly Phe Leu Pro Asn Glu Leu Lys Arg Arg Gln Arg

210 215 220

Ala Leu Ala Tyr His Asn Tyr Ser Leu Pro Pro Leu Met Met Val Ala

225 230 235 240

Ala Phe Ala Leu Ala Asn Gly Val Asp Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly

245 250 255

Ala Leu Gly Arg Leu Ala Gly Asn Val Leu Ala Gly Val Glu Lys Pro

260 265 270

Glu Pro Phe Ala Glu Arg Ala Gly Asp Glu Asp Gln Asp Met Glu Asp

275 280 285

Leu Glu Thr Asp Ala Lys Phe Ser Trp Leu Glu Pro Tyr Cys Ala Leu

290 295 300

Tyr Ser Cys Ser Pro Ala Leu Arg Glu Arg Lys Ala Glu Met Gly Pro

305 310 315 320

Phe Lys Asn Phe Arg Leu Gly Gly Asp Val Thr Arg Ile Phe Asp Pro

325 330 335

Ala Glu Lys Ser Pro Arg Ser Thr Val Gly Lys Arg Asp Leu Glu

340 345 350

Claims (12)

1.两种甘露糖醛酸专一性的重组褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列寡糖产物中的应用，

所述底物为由β-D-1, 4-甘露糖醛酸M和α-L-1, 4-古罗糖醛酸G混合组成的褐藻胶多糖、由β-D-1, 4-甘露糖醛酸和α-L-1, 4-古罗糖醛酸混合组成的不饱和五糖及以上的不饱和多糖、聚β-D-1, 4-甘露糖醛酸段饱和三糖及以上的饱和多糖；

所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，或者，

所述M-专一性的重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；

所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖，摩尔比为169：28：10：7：3：1。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和二糖为ΔM非还原性末端的二糖单元，不饱和五糖为ΔG非还原性末端的五糖单元，不饱和六糖为ΔG非还原性末端的六糖单元，不饱和七糖为ΔG非还原性末端的七糖单元。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和三糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的三糖单元，ΔM非还原性末端的三糖单元与ΔG非还原性末端的三糖单元的摩尔比为100：104。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物中，不饱和四糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的四糖单元，ΔM非还原性末端的四糖单元与ΔG非还原性末端的四糖单元的摩尔比为100：196。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化不饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为等摩尔量的不饱和二糖与不饱和三糖。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为聚M段饱和三糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列寡糖产物为不饱和二糖和单糖；所述底物为聚M段饱和四糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为81：9；所述底物为聚M段饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为4：17：73；所述底物为聚M段饱和六糖时，重组褐藻胶裂解酶Pae-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为6：37：52。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物中，不饱和二糖、不饱和三糖、不饱和四糖、不饱和五糖、不饱和六糖和不饱和七糖的摩尔比为232：34：16：7：4：1。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物中，不饱和二糖为ΔM非还原性末端的二糖单元，不饱和四糖为ΔG非还原性末端的四糖单元，不饱和五糖为ΔG非还原性末端的五糖单元，不饱和六糖为ΔG非还原性末端的六糖单元，不饱和七糖为ΔG非还原性末端的七糖单元。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化褐藻胶时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物中，不饱和三糖为含有ΔM、ΔG两种非还原性末端的三糖单元，ΔM非还原性末端的三糖单元与ΔG非还原性末端的三糖单元的摩尔比为134：100。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为由M和G混合组成的商品化不饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列寡糖产物为等摩尔量的不饱和二糖与不饱和三糖。

11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底物为聚M段饱和四糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为65：24；所述底物为聚M段饱和五糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为9：17：69；所述底物为聚M段饱和六糖时，重组褐藻胶裂解酶Avi-rEAlgL制备的系列不饱和寡糖产物为不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，摩尔比为3：32：59。

12.如权利要求1所述的应用，其特征在于，应用于制备辅助治疗囊性纤维化疾病中的多糖降解酶制剂。

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