CN105713890A - 一种外切型糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种外切型糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。外切型糖胺聚糖裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明所述的外切型糖胺聚糖裂解酶可以降解还原端标记的硫酸软骨素四糖；是一种从还原端降解糖胺聚糖的外切型糖胺聚糖降解酶；运用这种酶可以成功的对硫酸化的硫酸软骨素的六糖和八糖进行测序，可应用于糖胺聚糖的构效关系研究中，具有广阔的科研前景。

Description

一种外切型糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种外切型糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，曾被称为粘多糖、氨基多糖和酸性多糖，为杂多糖的一种。主要包括透明质酸(HyaluronicAcid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/HeparanSulfate，Hep/HS)，硫酸软骨素/硫酸皮肤素(ChondroitinSulfate/DermatanSulfate，CS/DS)，硫酸角质素(KeratanSulfate，KS)。它是由重复二糖单位组成的直链多糖，除硫酸角质素的二糖单位是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺组成以外，其它糖胺聚糖的二糖单位均是由己糖醛酸(D-葡萄糖醛酸/L-艾杜糖醛酸)与己糖胺(N-乙酰葡萄糖胺/N-乙酰半乳糖胺)组成。其中透明质酸结构相对简单，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的二糖单位经β-1,4-糖苷键连接而成。其它糖胺聚糖则由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂，主要表现在糖链中不同部位羟基(-OH)和氨基(-NH₂)的硫酸化，D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖糖链结构的这种高度复杂性不是随机发生的，而是具有高度的时空特异性，是各种糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段表达调控水平所致，不同的结构使其具有不同的功能，结构的复杂性赋予其功能的多样性。

糖胺聚糖广泛存在于动物细胞细胞膜表面和胞外基质中，通过与各种蛋白的特异相互作用参与了细胞的增值和分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程(KnudsonandKnudson1993,PerrimonandBernfield2000,KarbownikandNowak2013)，糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子，在医药及功能食品中得到广泛应用，如肝素、硫酸软骨素、透明质酸(Noble2002,Jiang,Liangetal.2007)等。近年来的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的，同一多糖链中存在不同结构的功能区，与不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能，为了研究与特定蛋白作用的结构功能区的特点，需要对其进行构效关系研究分析。

糖胺聚糖降解酶是研究糖胺聚糖构效关系的重要工具酶，主要包括微生物来源的裂解酶系和动物来源的水解酶系。根据底物的不同可分为透明质酸酶、硫酸软骨素/硫酸皮肤素降解酶、肝素/硫酸乙酰肝素降解酶、硫酸角质素降解酶四大类。依据降解机制的不同又可以分为内切型糖胺聚糖降解酶和外切型糖胺聚糖降解酶。内切型糖胺聚糖降解酶较多，如来自绵羊和牛睾丸的透明质酸水解酶(Zaneveld,Polakoskietal.1973)，可以在酸性pH下将透明质酸完全降解为四糖和六糖；而来自链霉菌的透明质酸裂解酶可以降解透明质酸，终产物是非还原端带不饱和双键的四糖和六糖(OhyaandKaneko1970)；微生物来源的硫酸软骨素裂解酶(CSase)，如CSaseABC-I和CSaseAC-I除了降解硫酸软骨素/硫酸皮肤素外还都表现出一定的透明质酸降解活性，但CSaseB是高度专一性硫酸皮肤素降解酶，对硫酸软骨素和透明质酸均无降解活性。外切型硫酸软骨素降解酶较少，如来自于Proteusvulgaris的CsaseABC-II(Hashimoto1997)和来自于Artherobacteraurescens的CSaseAC-II(HiyamaandOkada1975)具有外切型硫酸软骨素降解酶的特性，其中前者是从多糖或寡糖的非还原端切割，而后者是从糖链的还原端切割，它们在糖链测序中有着重要应用。但是当糖链的还原端被荧光标记后将严重影响酶对糖链的切割，特别是对CSaseAC-II这种从还原端切割的外切酶。

综上所述，糖胺聚糖降解酶是糖胺聚糖结构功能研究必不可少的工具，其中外切型糖胺聚糖降解酶对于糖胺聚糖活性寡糖的测序研究有着特别重要的应用价值。因此寻找和鉴定新型外切型糖胺聚糖降解酶具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种外切型糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。

一种外切型糖胺聚糖裂解酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有外切型糖胺聚糖裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。

一种外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因，核苷酸序列如(i)或(ii)所示：

(i)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

(ii)在严格条件下与(i)限定的DNA序列杂交且编码具有外切型糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白质的DNA分子。

根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)中所述严格条件下，是指：

在含0.5％SDS的6×SSC缓冲液中，在65℃下杂交，然后用含0.1％SDS的2×SSC缓冲液和含0.1％SDS的1×SSC缓冲液各洗膜一次。

根据本发明进一步优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQIDNO.5或SEQIDNO.6。

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因。

根据本发明优选的，所述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因。

根据本发明优选的，所述宿主细胞选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞或丝状真菌宿主细胞；所述细胞系选自昆虫细胞或哺乳动物细胞。

用于重组表达外切型糖胺聚糖裂解酶的重组菌可以是大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、KluyveromycesIactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如LacticacidbacteriaC0CC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)或丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride,Trichodermareesei,Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)；转基因细胞系可以是昆虫细胞(如Bombyxmori,Antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO,幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

上述外切型糖胺聚糖裂解酶做为工具酶用于糖胺聚糖构效关系的研究，特别是相关糖链的测序研究。

有益效果

本发明所述的外切型糖胺聚糖裂解酶可以降解还原端标记的硫酸软骨素四糖；是一种从还原端降解糖胺聚糖的外切型糖胺聚糖降解酶；运用这种酶可以成功的对硫酸化的硫酸软骨素的六糖和八糖进行测序，可应用于糖胺聚糖的构效关系研究中，具有广阔的科研前景。

附图说明

图1、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase的蛋白质三维结构模型；

图2、重组外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；

其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道4、经镍柱纯化的Exo-HCDLase，上样量10μL。

图3、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase的反应条件分析；

其中：A：最适温度；B：最适pH；C：金属离子影响；D：温度稳定性。

图4、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase降解透明质酸和硫酸软骨素所得最终产物的HPLC分析图；

其中：A：CS-A；B：CS-C；C：CS-E；D：DS；E：HA。1：二硫酸化二糖；2：单硫酸化二糖；3：无硫酸化二糖；

图5、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase时间梯度降解透明质酸和硫酸软骨素所得的HPLC分析图。

其中：A：HA；B：CS-C。1：二硫酸化二糖；2：单硫酸化二糖；3：无硫酸化二糖；

图6、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase降解荧光标记不同糖胺聚糖寡糖所得的HPLC分析图；

其中：A：CS四糖；B：CS六糖；C：软骨素Ch四糖；D：软骨素Ch六糖；E：DS四糖；F：DS六糖；G：HA四糖；H：HA六糖。

图7、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase降解荧光标记不同硫酸软骨素四糖所得的HPLC分析图；

其中：A：ΔA-O；B：ΔO-C；C：ΔA-A；D：ΔC-A；E：ΔE-A；F：ΔC-D；G：ΔE-D；H：ΔE-E。

图8、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase时间梯度降解荧光标记硫酸软骨素寡糖所得的HPLC分析图；

其中：A：CS六糖；B：CS八糖。1：标记八糖；2：标记六糖；3：标记二糖。

图9、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase在六糖测序中的应用。

其中：A：ΔE-A-A；B：ΔE-A-C，1：六糖；2：六糖的二糖组成分析；3：六糖的还原端二糖分析；4：六糖的非还原端二糖分析。

图10、外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase在八糖测序中的应用。

其中：A：荧光六糖收集；B：八糖的二糖组成分析；C：八糖的还原端分析；D：八糖非还原端两个二糖结构分析；E：八糖非还原端第二个二糖结构分析。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

弧菌(Vibriosp.)FC509菌株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCCNO.8913。

实施例1、弧菌(Vibriosp.)FC509菌株基因组DNA的提取

将弧菌(Vibriosp.)FC509菌株接种至液体培养基中，在30℃、200rpm的条件下，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8；取培养菌液40mL，在12,000rpm条件下离心25min，收集菌体沉淀，用20mL的溶菌酶缓冲液(10mMTris-HClpH8.0)洗涤，在12,000rpm条件下离心25min，收集菌体沉淀；

上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液12.0mL，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶各560μL，其终浓度约800μg/mL；冰浴1.0h后，37℃温浴2h，至溶液粘稠；加入10wt％SDS0.82mL，100mg/mL的蛋白酶K溶液60μL，52℃水浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；10,000g、4℃条件下离心10min，转移上清，加入2.0mL的NaAc-HAc(pH5.2，3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇，混匀；用1.0mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的EP离心管中，以70％乙醇(贮于-20℃)，洗涤2次，微离心后弃上清；10,000g、4℃条件下离心3min，彻底弃掉上清；样品于无菌工作台中，酒精灯下风吹干燥；用无菌去离子水重悬溶解DNA样品，4℃过夜，得到大分子量基因组DNA。

实施例2、弧菌(Vibriosp.)FC509菌株基因组扫描及其序列分析。

将实施例1制得的大分子量基因组DNA进行测序(美吉生物公司)。用NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是OpenReadingFrameFinder(ORFFinder,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST,http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

NCBI分析结果显示Vibriosp.FC509菌株基因组上携带一个外切型糖胺聚糖裂解酶基因exo-HCDLase，exo-HCDLase基因编码区长3078bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

exo-HCDLase基因编码的外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase由1025个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，蛋白质的理论分子量约为114.7kD。用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART,http://smart.embl_heidelberg.de/)分析外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase的结构信息，结果显示N端第1至第24个氨基酸是信号肽序列，第25-1025位氨基酸序列属于糖胺聚糖裂解酶超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的Exo-HCDLase蛋白质三维结构模型如图1所示。

在严格条件下与SEQIDNO.1所示序列杂交且编码具有外切型糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白质的DNA分子，如核苷酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的DNA分子。

将核苷酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的DNA分子在含0.5％SDS的6×SSC缓冲液(购自康为世纪公司)中，在65℃下杂交，然后用含0.1％SDS的2×SSC缓冲液和含0.1％SDS的1×SSC缓冲液各洗膜一次。

上述SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的DNA分子编码的蛋白质分子，氨基酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示，其中SEQIDNO.3的蛋白质分子与SEQIDNO.2所示的蛋白质分子相比，具有2％的区别(氨基酸的替代)，SEQIDNO.4的蛋白质分子与SEQIDNO.2所示的蛋白质分子相比，具有3％区别(氨基酸的替代、缺失、插入)。

实施例3、HCDLsae基因在大肠杆菌中的重组表达

以实施例2制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物如下：

正向引物exo-HCDLase-F：CGGATCCGACGGATGAACTAAACAGCTACCAAGG；

反向引物exo-HCDLase-R：GCTCGAGCTTTCTCCTAAGTTCGAACTGCGCAGG；

正向引物下划线标注的是限制性内切酶BamHI位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶XhoI位点。PrimerstarHSDNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火延伸2.5min，35个循环；最后72℃延伸10min。

将PCR产物用BamHI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Novagen公司的产物pET-30a载体用BamHI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。BamHI和XhoI均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。

将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切pET-30a载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株后涂布于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上,37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物Exo-HCDLase-F和反向引物Exo-HCDLase-R进行菌液PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去生工生物公司测序，结果表明，在pET-22b的BamHI和XhoI酶切位点之间插入SEQIDNO.1所示的hcdlsae基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET30a-Exo-HCDLase。

将pET30a-Exo-HCDLase转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase诱导表达。并用NiSepharose6FastFlow(GE)凝胶对Exo-HCDLase进行纯化，纯化条件按照GE公司的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase的纯化情况，结果如图2所示，纯化后的重组外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4、重组外切型糖胺聚糖裂解酶Exo-HCDLase的酶学性质分析

pH和温度对酶活性的影响

将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素底物、Exo-HCDLase酶液、不同pH值的150mMHAc-NaAc、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、Tris-HCl缓冲液以及水(pH范围为5.0～10.0)，按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在30℃反应60min，按紫外法测酶活力。酶活力单位定义：每分钟催化糖胺聚糖产生1μmoL不饱和双键所需要的酶量。根据紫外法测糖胺聚糖裂酶酶活的方法(Yamagata,Saitoetal.1968)，结果显示HCDLsae在pH7.0时达到最大活力，表明Exo-HCDLase的最适反应pH为7.0(如图3A)。

在最适pH下，将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素底物、Exo-HCDLase酶液以及150mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)按2：1：3：4(体积比)的比例混合，分别在不同温度(0℃～90℃)反应60min，按前述的紫外法测酶活力。结果显示Exo-HCDLase在30℃时达到最大活力，表明Exo-HCDLase的最适反应温度为30℃(如图3B)。

金属离子对HCDLsae活性的影响

将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素底物、Exo-HCDLase酶液、150mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为5mM，然后在30℃反应60min，按前述的紫外法测酶活力。对照组为不加任何金属离子时Exo-HCDLase的活性(设定为100％)，结果图7所示。实验结果显示，Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺能提高Exo-HCDLase活性，Mn²⁺、EDTA对Exo-HCDLase活性基本无影响，Ag⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺等其他离子对酶活呈现抑制作用(图3C)。

温度对酶稳定性的影响

将在不同温度(0℃～70℃)下热处理0-4h后的Exo-HCDLase酶液与质量浓度为1％硫酸软骨素底物溶液按2：3(体积比)的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativieactivity),结果表明Exo-HCDLase的温度稳定性较差(如图4D)。

实施例5、Exo-HCDLase的酶活测定

将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素底物、Exo-HCDLase酶液、150mMTris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应2-10min，按前述的紫外法测酶活力(Yamagata,Saitoetal.1968)，同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定Exo-HCDLase酶液的蛋白含量，结果表明重组Exo-HCDLase对透明质酸的比活为0.8U/mg、对硫酸软骨素的比活为1.5U/mg。

SEQIDNO.3所示的蛋白对透明质酸的比活为0.2U/mg、对硫酸软骨素的比活为0.5U/mg；

SEQIDNO.4所示的蛋白对透明质酸的比活为0.1U/mg、对硫酸软骨素的比活为0.3U/mg；

实施例6、Exo-HCDLase降解糖胺聚糖所得终产物的分析

将质量浓度为1％透明质酸、硫酸软骨素或硫酸皮肤素底物、Exo-HCDLase酶液、150mMTris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，30℃条件下反应，降解24h，降解完成后进行高效液相色谱分析(HPLC)。HPLC分析条件为凝胶柱：Superdexpeptide10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图4所示，Exo-HCDLase可以将硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸降解成二糖。

实施例7、Exo-HCDLase降解糖胺聚糖的时间过程分析

将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素底物、Exo-HCDLase酶液、150mMTris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，30℃条件下反应，降解不同时间后进行高效液相色谱分析(HPLC)。HPLC分析条件为凝胶柱：Superdexpeptide10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图5所示，Exo-HCDLase降解硫酸软骨素、透明质酸过程中，随着时间的延长产物中除二糖相应增加外，并未检测到其它高分子量寡糖的产生，这是外切型糖胺聚糖降解酶的典型底物降解模式。

实施例8、荧光标记糖胺聚糖寡糖经Exo-HCDLase降解的产物分析

将摩尔浓度为2pmol/μL的2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记(Biggeetal.1995)的各种糖胺聚糖寡糖、Exo-HCDLase酶液、150mMTris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，30℃条件下反应24h后进行高效液相色谱分析(HPLC)。HPLC分析条件为凝胶柱：Superdexpeptide10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：Ex330nm，Em420nm。

结果如图6所示，Exo-HCDLase与其它大多数的酶不同，它可以降解2-AB标记的硫酸软骨素四糖并产生荧光标记二糖，这对于寡糖的测序研究具有重要意义。此外，我们注意到exo-HCDLase不能降解2-AB标记的软骨素、皮肤素和透明质酸寡糖，这意味着硫酸化是寡糖在标记后酶降解的一个关键因素。

实施例9、Exo-HCDLase降解还原端2-AB标记四糖底物特异性分析

将摩尔浓度为2pmol/μL的2-AB标记的硫酸软骨素四糖底物、Exo-HCDLase酶液、150mMTris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，30℃条件下反应24h后进行高效液相色谱分析(HPLC)。HPLC分析条件为离子交换柱：YMCPackPA-G(YMC)；流动相：NaH₂PO₄；洗脱梯度：在1小时内，NaH₂PO₄的浓度从16mM增加到46mM；流速：1mL/min；检测条件：Ex330nm，Em420nm。

结果如图7所示，Exo-HCDLase可以降解各种硫酸化的荧光标记的硫酸软骨素四糖，但是如果还原端的二糖没有硫酸化，Exo-HCDLase则不能有效降解。

实施例10、Exo-HCDLase降解还原端荧光标记硫酸软骨素寡糖的时间过程分析

将摩尔浓度为2pmol/μL的2-AB标记的硫酸软骨素六糖和八糖、Exo-HCDLase酶液、150mMTris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，30℃条件下反应不同时间后进行高效液相色谱分析(HPLC)。HPLC分析条件为凝胶柱：Superdexpeptide10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：Ex330nm，Em420nm。

结果如图8所示，Exo-HCDLase降解还原端荧光标记的寡糖，并没有产生四糖、六糖中间产物，而是只有二糖。随着时间的延长，荧光标记的二糖不断增加直至寡糖完全降解。这一结果表明，Exo-HCDLase是一种从还原端切割的糖胺聚糖外切酶。

实施例11、Exo-HCDLase在CS六糖测序中的应用

将物质的量为10pmol的结构均一的硫酸软骨素六糖底物用商品化硫酸软骨素裂解酶ChondroitinaseABC进行完全降解，并将降解产物进行荧光标记从而确定其二糖组成；同时将20pmol的六糖底物进行还原端荧光标记，标记完成后取一半用ChondroitinaseABC进行二次降解并再标记，从而确定六糖的非还原端二糖。另一半用Exo-HCDLase在pH8.0，30℃条件下反应24小时后分析，从而确定其还原端二糖。根据以上结果，确定两种六糖的序列为ΔE-A-A和ΔE-A-C。HPLC分析条件为离子交换柱：YMCPackPA-G(YMC)；流动相：NaH₂PO₄；洗脱梯度：在1小时内，NaH₂PO₄的浓度从16mM增加到46mM；流速：1mL/min；检测条件：Ex330nm，Em420nm。

结果如图9所示，Exo-HCDLase与ChondroitinaseABC配合使用可以方便地硫酸软骨素六糖进行测序分析。

实施例12、Exo-HCDLase在CS八糖测序中的应用

将物质的量为50pmol的结构均一的硫酸软骨素八糖底物进行2-AB标记并用商品化硫酸软骨素裂解酶ChondroitinaseABC进行部分降解，并将降解产物进行凝胶色谱分析以及对荧光标记六糖进行收集。将物质的量为10pmol的硫酸软骨素八糖底物用商品化硫酸软骨素裂解酶ChondroitinaseABC进行完全降解，并将降解产物进行荧光标记从而确定其二糖组成；将20pmol的八糖底物进行还原端荧光标记，标记完成后取出一半用ChondroitinaseABC进行二次降解并标记，从而确定八糖的非还原端的两个二糖单元；另一半用Exo-HCDLase在pH8.0，30℃条件下反应24小时后分析，从而确定其还原端；最后取10pmol收集的荧光六糖用ChondroitinaseABC进行二次降解并标记，从而确定六糖的非还原端的二糖单元即八糖的非还原端第二个二糖单元。对上述结果进行汇总，所测八糖的序列为ΔC-A-D-C。

HPLC收集六糖条件凝胶柱：Superdexpeptide10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：Ex330nm，Em420nm。

八糖分析条件离子交换柱：YMCPackPA-G(YMC)；流动相：NaH₂PO₄；洗脱梯度：在1小时内，NaH₂PO₄的浓度从16mM增加到460mM；流速：1mL/min；检测条件：Ex330nm，Em420nm。

结果如图10所示，Exo-HCDLase与ChondroitinaseABC配合使用可以成功对硫酸化的硫酸软骨素八糖进行测序分析。

说明书中涉及的参考文献

1、Hashimoto,N.(1997)."TwoDistinctChondroitinSulfateABCLyases.ANENDOELIMINASEYIELDINGTETRASACCHARIDESANDANEXOELIMINASEPREFERENTIALLYACTINGONOLIGOSACCHARIDES."JournalofBiologicalChemistry272(14):9123-9130.

2、Hiyama,K.andS.Okada(1975)."CrystallizationandsomepropertiesofchondroitinasefromArthrobacteraurescens."JournalofBiologicalChemistry250(5):1824-1828.

3、Jiang,D.,etal.(2007).Hyaluronanintissueinjuryandrepair.AnnualReviewofCellandDevelopmentalBiology.23:435-461.

Karbownik,M.S.andJ.Z.Nowak(2013)."Hyaluronan:Towardsnovelanti-cancertherapeutics."PharmacologicalReports65(5):1056-1074.

4、Knudson,C.B.andW.Knudson(1993)."Hyaluronan-bindingproteinsindevelopment,tissuehomeostasis,anddisease."FASEBjournal:officialpublicationoftheFederationofAmericanSocietiesforExperimentalBiology7(13):1233-1241.

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8、Yamagata,T.,etal.(1968)."Purificationandpropertiesofbacterialchondroitinasesandchondrosulfatases."JournalofBiologicalChemistry243(7):1523-1535.

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10、Bigge,J.C.,etal.(1995)"Nonselectiveandefficientfluorescentlabelingofglycansusing2-aminobenzamideandanthranilicacid."Analytical.Biochemstry.230(2),229-238。

Claims (10)

1.一种外切型糖胺聚糖裂解酶，其特征在于，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有外切型糖胺聚糖裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的外切型糖胺聚糖裂解酶，其特征在于，所述氨基酸序列(b)如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。

3.一种外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如(i)或(ii)所示：

(i)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

(ii)在严格条件下与(i)限定的DNA序列杂交且编码具有外切型糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白质的DNA分子。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列(ii)中所述严格条件下，是指：

在含0.5％SDS的6×SSC缓冲液中，在65℃下杂交，然后用含0.1％SDS的2×SSC缓冲液和含0.1％SDS的1×SSC缓冲液各洗膜一次。

5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列(ii)如SEQIDNO.5或SEQIDNO.6。

6.一种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求3所述的外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因。

7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

8.一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了权利要求3所述的外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因。

9.如权利要求8所述的重组菌或转基因细胞系，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞或丝状真菌宿主细胞；所述细胞系选自昆虫细胞或哺乳动物细胞。

10.权利要求1所述外切型糖胺聚糖裂解酶在糖胺聚糖类构效关系研究中的应用。