CN107460184A

CN107460184A - 一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16‑3及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107460184A
Application number: CN201710724774.2A
Authority: CN
Inventors: 韩文君; 刘会会; 李俊鸽; 古静燕; 李福川; 李新; 卫洁
Original assignee: Ji'nan Enlightenment Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Ji'nan Enlightenment Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2017-12-12

Abstract

本发明涉及一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16‑3及其编码基因与应用。所述透明质酸裂解酶HyaL16‑3，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的透明质酸裂解酶HyaL16‑3以透明质酸或硫酸软骨素为底物时，在50℃、pH6.0条件下具有最高酶活力。HyaL16‑3对透明质酸的比活为10,306U/mg、对硫酸软骨素A的比活为1,640U/mg、对硫酸软骨素C的比活为1,330U/mg。HyaL16‑3可用于专一性制备不饱和透明质酸二糖、不饱和CS‑A二糖、不饱和CS‑C二糖，应用前景广阔。

Description

一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸或玻尿酸，广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。1934年，Meyer和Palmer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质^[1]。HA 是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通过β-1,3-糖苷键组成的二糖单元，经β-1,4-糖苷键重复连接而成的线性大分子^[2]。

由于HA是线性大分子，且分子链中葡萄糖醛酸上的羧基所带的负电荷相互排斥，可使分子呈伸展状态。而且，即使在较低浓度下，HA分子间也有强烈的相互作用，表现为具有较高的粘度，同时具有良好的润滑作用^[3]。水溶液中的HA分子链之间可形成疏松的网状结构，水分子在透明质酸网络内通过极性键和氢键与HA分子相结合，不易流失，因此HA具有非常强的吸水能力，是目前最好的保湿材料。作为生物大分子，HA还在生物体内发挥重要生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质、水电解质扩散及运转，促进伤口愈合等^[4-6]。除此之外，因其无任何免疫原性和毒性，使得HA在化妆品、食品和医药等行业领域有着众多应用^[7]。

近年来的研究发现，低分子量的HA和HA寡糖具有更加独特的生物学功能。研究表明，低分子量的HA和HA寡糖，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，是免疫细胞、细胞因子的激活剂^[8]。另外，低分子量的 HA和HA寡糖具有更好的抗氧化自由基的作用，可有效修复紫外线造成的细胞损伤，还可以渗透入皮肤表皮层，对皮肤内源性的HA进行补充，从而营养皮肤，延缓衰老。因此，小分子HA在临床医疗、食品保健以及化妆品领域具有广阔的应用前景。目前，小分子HA的制备方法主要有物理降解、化学降解和生物降解。物理降解法难以将HA降解到10kD以下，产生的分子量分步范围广且稳定性差；化学降解法的反应条件剧烈，容易破坏单糖残基的结构^[9]，使生物活性降低，且对环境污染严重；生物降解主要是酶法降解，其特点是专一、高效且安全，不但可以制备小分子HA，还可以制备HA寡糖，具有良好的应用前景。

透明质酸酶(hyaluronidase)是一类能够催化降解HA的酶的通称，广泛存在于人体组织及体液、细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物中。1971年，Meyer根据透明质酸酶作用机制的不同，将其分为3类^[10]：(1)内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EC 3.2.1.35)，为水解酶，作用于β-1,4糖苷键，终产物主要为四糖；这类酶底物谱广，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性；哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类，研究最多的是睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶。(2)内切-β-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.36)，作用于β-1,3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解HA；这类酶主要来自水蛭、十二指肠虫等。(3)N- 乙酰氨基己糖苷酶，也称为透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase,EC4.2.2.1)，作用于β-1,4糖苷键，通过β-消去机制得到4,5-不饱和双糖；这类酶主要来自微生物。目前，HAase被广泛应用于临床，例如，整形、外科手术、眼科、内科、肿瘤治疗、皮肤科及妇科等。经美国FDA 认证，透明质酸酶的用途有3种^[11]：(1)用于眼科手术中提高麻醉效果，在加快麻醉速度的同时也降低了麻醉持续的时间；(2)皮下灌注液的添加剂，皮下输液主要用于缓解老年病人出现的脱水症状；(3)用于泌尿道造影时促进造影剂的再吸收，尤其是婴儿或儿童静脉注射达不到效果时。

链霉菌是放线菌门中种类最多的一个属，广泛存在于土壤中，是丝状的革兰氏阳性细菌，主要通过孢子繁殖，绝大多数链霉菌对人体无害^[12,13]。链霉菌是产生各种抗生素的主要来源，源于链霉菌的抗生素包括红霉素、四环素、链霉素、氯霉素、新霉素、制霉菌素、卡那霉素、放线菌酮和两性霉素等^[14]，因此，对于链霉菌的已有研究主要集中于菌株产生抗菌活性物质的能力和大小等方面，链霉菌产生的多糖降解酶主要有几丁质酶、木聚糖酶及纤维素酶等^[15-17]，而来源于链霉菌属的透明质酸酶只有Zainab H.Elmabrouk等^[18]做过相关研究，国内未见相关报道。Zainab H.Elmabrouk等人的研究表明：链霉菌属来源的透明质酸酶进行异源表达时，酶产量较低(约20mg/l)，且酶制剂的比活偏低。这使得链霉菌属来源的透明质酸酶无法满足商业化的需求。因此，从链霉菌属中发掘高活力、底物降解特征和寡糖生成特征明确的工具型透明质酸酶具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种来源于链霉菌CB16菌株的透明质酸裂解酶HyaL16-3，氨基酸序列如SEQ IDNO.2 所示。

链霉菌(Streptomyces sp.)CB16来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年4月 11日，保藏编号CGMCC No.12351。

上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因，全长共2412bp，所编码蛋白质含有804个氨基酸，分子量约为85.5kD。

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因。

优选的，所述的表达载体为质粒pET30a(+)或质粒pCold TF。

一种重组菌，在宿主细胞中转入了上述重组表达载体。

优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因、重组表达载体、重组菌在制备透明质酸裂解酶HyaL16-3中的应用。

上述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解透明质酸多糖(HA)制备不饱和透明质酸二糖中的应用。

上述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解A-型硫酸软骨素(CS-A)制备不饱和二糖中的应用。

上述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解C-型硫酸软骨素(CS-C)制备不饱和二糖中的应用。

有益效果

本发明所述的透明质酸裂解酶HyaL16-3以透明质酸或硫酸软骨素为底物时，在50℃、 pH6.0条件下具有最高酶活力。HyaL16-3对透明质酸的比活为10,306U/mg、对硫酸软骨素A 的比活为1,640U/mg、对硫酸软骨素C的比活为1,330U/mg。HyaL16-3可用于专一性制备不饱和透明质酸二糖、不饱和CS-A二糖、不饱和CS-C二糖，应用前景广阔。本发明还对重组酶 rHyaL16-3的底物降解特征和寡糖生成特征进行了研究，并阐明了寡糖的结构特征，为重组酶 rHyaL16-3作为工具酶使用奠定基础。

附图说明

图1、透明质酸裂解酶HyaL16-3功能模块构成的BLASTp分析结果；

图2A、重组质粒pE30-HyaL16-3在E.coli BL21(DE3)菌株中表达的重组透明质酸裂解酶 rHyaL16-3及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；

图2B、重组质粒pCTF-HyaL16-3在E.coli BL21(DE3)菌株中表达的重组透明质酸裂解酶 rHyaL16-3及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；

其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD， 18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道4、经镍柱纯化的rHyaL16-3，上样量10μL；

图3、温度对重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3活性的影响曲线；

图4、pH值对重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3活性的影响曲线；

图5、温度对重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3稳定性的影响曲线；

图6、pH值对重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3稳定性的影响曲线；

图7、金属离子及化学试剂对重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3活性的影响柱状图；

图8、重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3降解透明质酸和硫酸软骨素所得产物的高效液相色谱(HPLC)分析图；

其中：1、单硫酸化的不饱和CS二糖；2、不饱和的CS二糖或HA二糖；

图9、重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3降解透明质酸过程中寡糖产物的高效液相色谱 (HPLC)分析图；

图中：(1)UDP2，不饱和二糖；(2)UDP4，不饱和四糖；

图10、用重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸后所制备的不饱和寡糖片段 UDP2的HPLC分析图；

图11、用重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸所制备不饱和寡糖片段UDP2 的MS分析图；

图12、用重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸所制备不饱和寡糖片段UDP2 的¹H-NMR图；

图13、用重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸所制备不饱和寡糖片段UDP2 的¹³C-NMR图。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

生物材料来源

实施例1、链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株基因组DNA的提取

将链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株接种至TSB液体培养基中，在28℃、200rpm的条件下，振荡培养至600nm吸光值(OD₆₀₀)为1.2；取培养菌液20mL，在12,000×g(g，地球引力常数)、4℃条件下离心20min，收集菌体沉淀；用20mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0)悬浮菌体，在12,000×g、4℃条件下离心20min，收集菌体沉淀；

上述TSB液体培养基，其组成为：胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，pH 7.2。

向上述菌体沉淀中，加入溶菌酶缓冲液12.0mL，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶560μL，其终浓度约800μg/mL；置于冰水浴中1.0h，然后转移至37℃水浴中，温浴2h，至反应体系粘稠；加入浓度为100mg/mL的十六烷基磺酸钠溶液0.82mL、100mg/mL的蛋白酶K溶液60μL，在52℃温浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；在10,000×g、4℃条件下离心10min，收集上清，并加入2.0mL的NaAc-HAc(pH 5.2,3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇(贮于-20℃)，充分混匀；用枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的离心管中，以70％乙醇，洗涤 2次，微离心后弃掉上清；在10,000×g、4℃条件下离心2min，彻底弃掉上清；将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4℃过夜溶解DNA样品，制得基因组 DNA。

实施例2、链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株基因组的扫描及其序列分析

将实施例1制得的基因组DNA，采用可逆链终止物和合成测序法进行基因组的扫描测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的在线软件对DNA测序结果进行分析。所用到的NCBI网站的分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local Alignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

用上述生物学软件分析的结果显示，CB16菌株基因组DNA上携带一个基因hyaL16-3，该基因的编码区长2412bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因hyaL16-3所编码的蛋白质HyaL16-3共含有804个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

用BLASTp软件在线分析，结果显示，NCBI数据库里已鉴定的蛋白中与蛋白质HyaL16-3 的氨基酸序列相似性最大的是来源于Streptomyces coelicolor A3(2)的透明质酸裂解酶 ScPL8Hyal^[18]，相似度为52％。如图1所示，BLASTp分析还推测蛋白质HyaL16-3内部含有糖胺聚糖裂解酶超级家族保守的假定催化结构域，同时含有多糖裂解酶8家族(PL8)的保守结构域。用生物学软件BioEdit 7.0.5.3进行分析，显示蛋白质HyaL16-3的理论分子量约为85.5 kD。用信号肽在线预测软件SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析，该蛋白质的N-端1-35位氨基酸为分泌型信号肽。

综上，推测基因hyaL16-3所编码的蛋白质HyaL16-3是透明质酸裂解酶。为了进一步表达基因hyaL16-3，纯化其重组表达产物rHyaL16-3，并鉴定蛋白质的功能，特别是为了阐明重组酶的生化特征、底物降解模式和寡糖生成特征等生物信息学技术无法预测到的酶学性质，本发明还提供实施例3-实施例12，以更加全面地鉴定蛋白质HyaL16-3。

实施例3、基因hyaL16-3在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的重组表达

以实施例1制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：

正向引物HyaL16-3F：5’-g CATATG CCCGAGGATGCTGCGTAC-3’(Nde I)；

反向引物HyaL16-3R：5’-g CTCGAG GGACAGCCGCACCTTCAC-3’(Xho I)；

正向引物HyaL16-3F中下划线标注的是限制性内切酶Nde I位点，反向引物HyaL16-3R 下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HSDNA Polymer购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应条件：95℃预变性4min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸75s， 35个循环；72℃延伸10min；4℃稳定10min。

将PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将购于美国Invitrogen公司的产品pET-30a(+)质粒DNA，用Nde I和XhoI 双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切酶Nde I和Xho I均购于中国大连宝生物公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过Nde I和Xho I双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-30a(+)质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用扩增引物进行PCR验证，结果得到大小为2.3kb的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在pET-30a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间插入SEQ IDNO.1所示的基因hyaL16-3，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pE30a-HyaL16-3。以同样的方法，分别设计Nde I和Xba I酶切位点，将基因hyaL16-3构建于表达质粒pCold-TF，获得重组质粒pCTF-HyaL16-3。

将重组质粒pE30a-HyaL16-3转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤，使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组透明质酸裂解酶 rHyaL16-3的诱导表达。在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用缓冲液A重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎。在15,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集水溶性组分，并用Ni-琼脂糖凝胶对重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3进行纯化。用含有咪唑浓度为10、 50、100、250、500mM的缓冲液A进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组褐藻胶裂解酶rHyaL16-3的纯化情况。结果如图2A所示：重组质粒pE30a-HyaL16-3在E.coli BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导表达后，水溶性产物较少，经镍柱亲和层析纯化后的重组酶rHyaL16-3在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3样品装入最小分子截留量为10kDa的透析袋，在4℃环境中对缓冲液A进行透析。所说缓冲液A的成分是50mM Tris、150mMNaCl， pH 7.9，制得重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3酶液。为了提高重组酶rHyaL16-3的产量，将重组质粒pCTF-HyaL16-3在E.coli BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导表达，水溶性产量大幅提高，达到1.2g/L菌体培养物，经镍柱亲和层析纯化后，同样获得纯度大于95％的重组蛋白(图 2B)。

实施例4、重组酶rHyaL16-3最适温度的测定

用去离子水配制质量体积浓度为0.1-1.2％的透明质酸，加热溶解后，置于0℃、20℃、 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴环境中孵育1h。向每900μL底物溶液中添加实施例3制得的重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的稀释液100μL，重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3 的稀释液浓度为10μg/mL，混匀后继续反应，隔时取样。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。结果如图3所示：以透明质酸测定酶活时，重组透明质酸裂解酶 rHyaL16-3在50℃反应时达到最大活力，这表明重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的最适反应温度是50℃。同时，以透明质酸为底物时，重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3在0℃展示了89％的相对酶活，这表明重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3具有适冷的酶学性质；但是，在60-70℃活性急剧下降，这表明透明质酸裂解酶rHyaL16-3对高温比较敏感，不耐热。

实施例5、重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3最适pH的测定

分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、50mM 的Tris-HCl缓冲液，分别与透明质酸配制质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的透明质酸底物，所对应的pH值分别为5、6，6、7、8，8、9、10三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物溶解后，置于最适温度中孵育1h，然后向每900μL底物中添加实施例3制得的重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的稀释液100μL，混匀后开始反应，隔时取样。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值和偏差。相对酶(RA)活定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图4所示：重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的最适反应pH为6.0。

实施例6、重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的温度稳定性分析

将实施例3制得的重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3酶液在不同温度(0-70℃)下热处理2h 后，分别与用蒸馏水配置的质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的透明质酸，按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力。结果如图5所示：重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3在低于40℃的温度下预处理2h后，仍然具有>90％的残余活性，表明该酶具有一定的热稳定性。

实施例7、重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的pH稳定性分析

将实施例3制得的重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的酶液，在最适温度(50℃)、不同的 pH(pH 5-10)环境中分别预孵育2h后，与质量体积浓度(g/mL)为0.1-1.2％的透明质酸底物溶液按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液酶活定义为100％相对活力。结果如图6所示，在pH5-6的范围内预处理2h，rHyaL16-3酶活保持80％以上。这表明重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3在偏酸性条件下耐受性较好。

实施例8、金属离子对重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3活性的影响

将用去离子水配置的质量浓度为0.1-1.2％透明质酸底物、实施例3制得的重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3酶液、以及水按5：1：4(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，至其终浓度为1mM或10mM，然后在50℃反应4h，按前述的DNS-还原糖法测定酶的活力。对照组为不加任何金属离子时rHyaL16-3的活性(设定为100％)。结果如图7所示，在1mM浓度下：(1)Li⁺、K⁺、Na⁺等三种一价金属试剂对rHyaL16-3的活性均表现出微弱的抑制作用，Ag⁺几乎使rHyaL16-3的活性丧失；(2)Ca²⁺对rHyaL16-3的活性具有微弱的促进作用，Mg²⁺对rHyaL16-3的活性基本无影响，Hg²⁺、Cu²⁺使rHyaL16-3的活性丧失，其他二价离子表现不同程度的抑制作用；(3)Cr³⁺和Fe³⁺这两种三价金属试剂抑制rHyaL16-3的活性；(4)咪唑、甘油对rHyaL16-3的活性无影响，DTT、EDTA、β-巯基乙醇抑制rHyaL16-3的活性；SDS几乎使rHyaL16-3的活性丧失；在10mM浓度下：只有DTT表现出微弱的促进作用，其他各金属离子与化学试剂均表现出不同程度的抑制作用，其中Ag⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、 SDS几乎使rHyaL16-3的活性丧失。

实施例9、重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3的酶活测定

将质量浓度为0.1～1.2％透明质酸或硫酸软骨素底物、rHyaL16-3酶液、150mMNaAc-HAc 缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应1-10min，用紫外法测酶活力^[19]，同时用购于上海生工生物工程有限公司的蛋白质定量试剂盒测定 rTT16酶液的蛋白含量，结果表明重组r HyaL16-3对HA的比活为10,306U/mg，对CS-A的比活为1,640U/mg，对CS-C的比活为1,330U/mg。

实施例10、重组酶rHyaL16-3降解糖胺聚糖所得产物的高效液相(HPLC)分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.1～1.2％的透明质酸和硫酸软骨素底物，加热溶解后，置于50℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实施例3制得的重组酶rHyaL16-3的稀释液10-100μL，不足200μL体积时，用无菌去离子水补足；混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min。在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。

用浓度为0.20mol/L的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将上述透明质酸的不同酶解时间的样品，以自动进样器加载20μg/样品，其它条件不变，232nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。

结果如图8和图9所示，从图8可以看出，重组酶rHyaL16-3对透明质酸的活性最高；能微弱的降解CS-A，产生少量单硫酸化的硫酸软骨素二糖(A-unit)和硫酸软骨素二糖(O-unit)；也可以微弱的降解CS-C，产生少量单硫酸化的硫酸软骨素二糖(C-unit)和硫酸软骨素二糖 (O-unit)；不能降解CS-E。

从图9可以看出，透明质酸底物被降解后，随着酶解反应时间的增加，具有232nm特征吸收的寡糖产物的含量逐渐增加，且相对含量最终趋于稳定。这初步表明重组酶rHyaL16-3 是透明质酸裂解酶。酶解反应的最终主产物是HPLC分析中出峰时间为41.85'的寡糖产物。

实施例11、重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸的寡糖主产物的分子量鉴定

按照实施例10所述，将共200mg透明质酸用重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底酶解，样品分批上样、过Superdex Peptide 10/300GL分子凝胶色谱柱(GE公司)，并按照出峰时间分收集出峰时间为41.85'的寡糖样品。将多次收集到的寡糖样品集中后，反复冷冻干燥以脱盐。用无菌去离子水溶解所得寡糖样品，进行一级质谱(MS)分析，确定寡糖的相对分子量。

如图10所示，用重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸后所制备的不饱和寡糖片段UDP2进行HPLC分析，结果显示产物在232nm具有特征吸收，出峰时间为41.85'，纯度均大于99％，符合进一步研究的需求。

在阴离子模式下进行的一级质谱分析的结果(图11)表明，这个寡糖主产物的分子量是 379。这初步表明，上述寡糖主产物是重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸之后所产生的不饱和二糖。

综合图9、10、11的结果，不饱和二糖是重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3降解透明质酸之后聚合度最小的寡糖主产物。

实施例12、重组酶rHyaL16-3彻底降解透明质酸所得寡糖主产物的核磁鉴定

将实施例11制备的透明质酸二糖，用重水(D₂O)反复冷冻干燥，以完成氢-氘置换，并进行¹H-NMR和¹³C-NMR测试，比对参考文献，最终确定该寡糖的化学结构及特征。

通过¹H-NMR数据分析透明质酸二糖的结构特征^[20]：如图12所示，5.68ppm处的特征性化学位移值表明，重组酶rHyaL16-3降解透明质酸后的二糖产物为不饱和二糖；由4.98ppm 和4.58ppm处的化学位移值表明，不饱和二糖存在α和β两种构象，说明所制备的不饱和透明质酸二糖为α、β构型的混合物。

通过¹³C-NMR数据分析不饱和透明质酸二糖的结构特征^[21]：如图13所示，¹³C-NMR给出了各个碳原子的信号，174.2ppm处为D-葡萄糖醛酸上-COO^-的^-特征性化学位移值，174.5ppm处为N-乙酰氨基葡萄糖上-CONH的特征性化学位移值，结合一级质谱所给出透明质酸二糖的分子量为379，证明重组酶rHyaL16-3降解透明质酸产生的二糖结构为Δ^4,5HexUAα1-3GlcNAc。

结果分析

通过以上检测数据可以看出，重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3来源于链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，与目前已知的Streptomyces coelicolor A3(2)来源的透明质酸裂解酶 ScPL8Hyal^[18]的序列相似度最大，为52％。但是，重组酶rHyaL16-3经表达条件优化，产量可以达到1.2g/L发酵液，明显高于ScPL8Hyal的产量(20mg/L)。另外，重组酶rHyaL16-3在降解透明质酸时，可观察到不饱和透明质酸四糖的产生，而ScPL8Hyal从始至终只产生不饱和透明质酸二糖，这说明重组酶rHyaL16-3与ScPL8Hyal具有不同的多糖的降解模式。

由上可知，本发明所述重组酶rHyaL16-3对透明质酸的比活为10,306U/mg、对硫酸软骨素A的比活为1,640U/mg、对硫酸软骨素C的比活为1,330U/mg，重组酶rHyaL16-3异源表达产量可达到1.2g/L，能够满足工具酶使用的基本条件。

参考文献

[1]Meyer K,Palmer J W.The polysaccharide of the vitreous humor[J].Journal of Biological Chemistry,1934,107(3):629-634.

[2]Weissmann B,Meyer K.The structure of hyalobiuronic acid and ofhyaluronic acid from umbilical Cord1,2[J].Journal of the american chemicalsociety,1954,76(7):1753-1757.

[3]Balazs E A.Viscoelastic properties of hyaluronan and itstherapeutic use[J].Chemistry and biology of hyaluronan,2004,1.

[4]Migliore A,Procopio S.Effectiveness and utility of hyaluronic acidin osteoarthritis[J].Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism,2015,12(1):31.

[5]Choi J H,Jun J H,Kim J H,et al.Synergistic effect of interleukin-6and hyaluronic acid on cell migration and ERK activation in humankeratinocytes[J].Journal of Korean medical science,2014, 29(Suppl 3):S210-S216.

[6]Nyman E,Huss F,Nyman T,et al.Hyaluronic acid,an important factorin the wound healing properties of amniotic fluid:in vitro studies of re-epithelialisation in human skin wounds[J].Journal of plastic surgery and handsurgery,2013,47(2):89-92.

[7]Olczyk P,Komosińska-Vassev K,Winsz-Szczotka K,et al.Hialuronian–struktura,metabolizm, funkcje i rola w procesach gojenia ran Hyaluronan:Structure,metabolism,functions,and role in wound healing[J].Journal cover,2016,70.

[8]Salwowska N M,Bebenek K A, D A,et al.Physiochemicalproperties and application of hyaluronic acid:a systematic review[J].Journalof Cosmetic Dermatology,2016.

[9]Hawkins C L,Davies M J.Degradation of hyaluronic acid,poly-andmono-saccharides,and model compounds by hypochlorite:evidence for radicalintermediates and fragmentation[J].Free Radical Biology and Medicine,1998,24(9):1396-1410.

[10]Meyer K.11Hyaluronidases[J].The enzymes,1971,5:307-320.

[11]苏康,吉爱国.透明质酸酶的研究进展[J].生物技术通报,2014,3:15-21.

[12]Dees M W,Somervuo P,Lysoe E,et al.Species identification andmicroarray-based comparative genome analysis of Streptomyces species isolatedfrom potato scab lesions in Norway. Molecular Plant Pathology,2012,13(2):174-186.

[13]WangYong,ZhangWei,ZhangWenge,et al.Study on identification andseparation of the antifungal antibiotic from its fermentation broth ofStreptomyces hygroscopicus BOS-013strain. Asian Journal of Chemistry,2012,24(9):3821-3824.

[14]Ayari A,Morakchi H,Djamila K G.Identification and antifungalactivity of Streptomyces sp. S72isolated from Lake Oubeira sediments inNorth-East of Algeria.African Journal of Biotechnology,2012,11(2):305-311.

[15]Mitsutomi M,Hata T,Kuwahara T.Purification and characterizationof novel chitinases from Streptomyces griseus HUT6037.Journal of Fermentationand Bioengineering,1995,80:153-158.

[16]Suchita N,Mukesh K,Ramesh C K.Purification and characterizationof extracellular xylanase from Streptomyces cyaneus SN32.BioresourceTechnology,2008,99(2008):1252-1258.

[17]Katsuhiko F,Masataka S,Youhei F,et al.Streptomyces abietissp.nov.,a cellulolytic bacterium isolated from soil of a pineforest.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2013,63:4754-4759.

[18]Elmabrouk Z H,Vincent F,Zhang M,et al.Crystal structures of afamily 8polysaccharide lyase reveal open and highly occluded substrate‐binding cleft conformations[J].Proteins: Structure,Function,andBioinformatics,2011,79(3):965-974.

[19]Yamagata T,Saito H,Habuchi O,et al.Purification and properties ofbacterial chondroitinases and chondrosulfatases[J].Journal of BiologicalChemistry,1968,243(7):1523-1535.

[20]Homer,K.A.,Grootveld,M.C.,Hawkes,J.,Naughton,D.P.and Beighton,D.(1994). Degradation of hyaluronate by Streptococcus intermedius strain UNS35.J Med Microbiol 41(6): 414-22.

[21]John E.Scott,Frank Heatley(1999).Hyaluronan forms specific stabletertiary structures in aqueous solution:A¹³C NMR study.Proc.Natl.Acad.Sci.96:4850-4855。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南悟通生物科技有限公司

<120> 一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2415

<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

<400> 1

atgacttctg cctggtcccg ccgtaccttc ctggccacct cagcggcgct caccgccgcg 60

ggcggcggag cgctgacgct cgccacgccc ggcgccgccg cggccgcccc cgaggatgct 120

gcgtacgcgg cgctccgcac cacctggagc gcgctgatcc tcggcgaggg gttcagcccg 180

accgccgaac ccttcaagag ccgactggcc gatctcggcg cgaaggcctc gcgcctgctg 240

gagaccatgg cgccggcgga gggttcgctc tggcccgacg cggtgttcgc ggatccggac 300

ccggacacgg acgccgagtc gtacgtcctc tcgggacgga tggccgacag cttcatccgc 360

ctgaacacgc tggcccaggc ctaccgccag cagggcaccg gcctgaccgg gaacaccggg 420

ctgcgcgatg cggtgctcag cggcctggag cacctcaaca cccaggtcta caaggacggc 480

cgggcccggt acggaaactg gtacagctgg cagatcggcg cgccgcaggc cctgctggac 540

gtgtgtgtcc tgatgtacga cgccatcgcc ccggagcggc tcacgcgcta ctgcgccgcc 600

gtcgaccact tcgtaccgga ctccgcggtc gcctcgtaca ccgggaccag caccggggcg 660

aaccgggtcg acctctgccg ggtcctggcc ctgcgcgggg tcgtcggagg gaacggctcg 720

aagatcgcac tggcccggga cgcgctctcc cccgtcttcc cgctggtgac caggggcgac 780

ggcctgtacg ccgacggctc gttcatccag cacaccaccg tgccgtacac cggcagctac 840

ggatcggtga tgctcggcgg actcggcctg ctgttcgcgc tgctcaaggg gaccacctgg 900

gagatcaccg acccgaagcg gcaggtggtg ttcgacgcgg tggagaacgc ctgggccccg 960

ttcctcttca acggcctcgt catggacgcc gtcgcggggc gtgccatcag ccggggcgag 1020

gtcgacgacc accggcgcgg acacccgatc ctcgcctccg tcgtgctgct gggccggggc 1080

gcgtcggacg cggagaacaa ccggtggcgg gggctggtca agggctgggc gcagcgcgac 1140

cactacagcc cgccactggg caacccctcg ctcgggctca ccgcgctggc ccggatcaag 1200

gacgtgctgg acgacacctc gctcactccg gtccccgagc cggagggcca ccggctcttc 1260

cccgacatgg cgcgggccac ccaccgccgt ccggggtggg cggcgtcgct gagcatggcc 1320

gaccggcgga tcacctacta cgagtccggc aacggcgaga acctgcgcgg ctggcacacc 1380

ggctcgggga tgctctactg gtggggcgac accttcgcca acggccagta cagcgacgcc 1440

ttctggccca ccgtcgaccc gtaccggctg cccggtacca cggcatcgcg caaggtgctc 1500

gccgacgggg cgggcggtga ctggggcgtc tcgctccccg atgtgaactg ggtcggcggg 1560

gtcaccgaca agaagcgggc cgccgtgggg cagtacctca agggactctc cagcacgctg 1620

atggcgaaga agtcgtggtt cttcctcgac gacaccgtcg tctgcctggg cgcgggcatc 1680

cacagccgtg acggcgcggt cgtggagacc accgtcgaca accgcaacct cgggccgacg 1740

ggcaacgccc cgttcaccgt cgacggctcg gtgaaacccc tcacgttccc ctggtcggcg 1800

accctgaccg gcgcgtcctg ggcgcatctc gccgggcacg gcggctacgt cttcccgggc 1860

gggggcaccg tgaaggcgct gcgggaggac cggacgggcc gctggcgcga catcaacaag 1920

gcgggctcca cggatccggt ctcccggaaa tacctcaccc tctggttcga ccacggccag 1980

gacccctcgg gcgccgcgta cgcctaccag ctcctgcccg gcgcgtccga acagcgcacg 2040

gcggcccggg cggcggacag cggctggctg cgggtgctcg ccaacacgga cgatcagcag 2100

ggggtggcgg tggaccggct cgggctgacc gccgtcaact tctggttcgg cgggagcgtc 2160

ggtccgctgg tggcggacgc cccgtgctcg gtgatggtca ccgagcacgc cgacgggacg 2220

gcgacgctat gcgtcagcga tcccatgcgg atgcggacga gcctgacgct cacgtggaac 2280

cgggccgtcg cctcggtcgt gtcgaagccg gcgacggtga catcggcgac cacgggggcg 2340

tcgctgcgcc tggtcttcgg cgacctctcc gggacgcgcg gggcgacgca ggcggtgaag 2400

gtgcggctgt cctga 2415

<210> 2

<211> 804

<212> PRT

<213> Streptomyces sp.

<400> 2

Met Thr Ser Ala Trp Ser Arg Arg Thr Phe Leu Ala Thr Ser Ala Ala

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Gly Gly Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Pro Gly Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Pro Glu Asp Ala Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Thr Thr

35 40 45

Trp Ser Ala Leu Ile Leu Gly Glu Gly Phe Ser Pro Thr Ala Glu Pro

50 55 60

Phe Lys Ser Arg Leu Ala Asp Leu Gly Ala Lys Ala Ser Arg Leu Leu

65 70 75 80

Glu Thr Met Ala Pro Ala Glu Gly Ser Leu Trp Pro Asp Ala Val Phe

85 90 95

Ala Asp Pro Asp Pro Asp Thr Asp Ala Glu Ser Tyr Val Leu Ser Gly

100 105 110

Arg Met Ala Asp Ser Phe Ile Arg Leu Asn Thr Leu Ala Gln Ala Tyr

115 120 125

Arg Gln Gln Gly Thr Gly Leu Thr Gly Asn Thr Gly Leu Arg Asp Ala

130 135 140

Val Leu Ser Gly Leu Glu His Leu Asn Thr Gln Val Tyr Lys Asp Gly

145 150 155 160

Arg Ala Arg Tyr Gly Asn Trp Tyr Ser Trp Gln Ile Gly Ala Pro Gln

165 170 175

Ala Leu Leu Asp Val Cys Val Leu Met Tyr Asp Ala Ile Ala Pro Glu

180 185 190

Arg Leu Thr Arg Tyr Cys Ala Ala Val Asp His Phe Val Pro Asp Ser

195 200 205

Ala Val Ala Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Thr Gly Ala Asn Arg Val Asp

210 215 220

Leu Cys Arg Val Leu Ala Leu Arg Gly Val Val Gly Gly Asn Gly Ser

225 230 235 240

Lys Ile Ala Leu Ala Arg Asp Ala Leu Ser Pro Val Phe Pro Leu Val

245 250 255

Thr Arg Gly Asp Gly Leu Tyr Ala Asp Gly Ser Phe Ile Gln His Thr

260 265 270

Thr Val Pro Tyr Thr Gly Ser Tyr Gly Ser Val Met Leu Gly Gly Leu

275 280 285

Gly Leu Leu Phe Ala Leu Leu Lys Gly Thr Thr Trp Glu Ile Thr Asp

290 295 300

Pro Lys Arg Gln Val Val Phe Asp Ala Val Glu Asn Ala Trp Ala Pro

305 310 315 320

Phe Leu Phe Asn Gly Leu Val Met Asp Ala Val Ala Gly Arg Ala Ile

325 330 335

Ser Arg Gly Glu Val Asp Asp His Arg Arg Gly His Pro Ile Leu Ala

340 345 350

Ser Val Val Leu Leu Gly Arg Gly Ala Ser Asp Ala Glu Asn Asn Arg

355 360 365

Trp Arg Gly Leu Val Lys Gly Trp Ala Gln Arg Asp His Tyr Ser Pro

370 375 380

Pro Leu Gly Asn Pro Ser Leu Gly Leu Thr Ala Leu Ala Arg Ile Lys

385 390 395 400

Asp Val Leu Asp Asp Thr Ser Leu Thr Pro Val Pro Glu Pro Glu Gly

405 410 415

His Arg Leu Phe Pro Asp Met Ala Arg Ala Thr His Arg Arg Pro Gly

420 425 430

Trp Ala Ala Ser Leu Ser Met Ala Asp Arg Arg Ile Thr Tyr Tyr Glu

435 440 445

Ser Gly Asn Gly Glu Asn Leu Arg Gly Trp His Thr Gly Ser Gly Met

450 455 460

Leu Tyr Trp Trp Gly Asp Thr Phe Ala Asn Gly Gln Tyr Ser Asp Ala

465 470 475 480

Phe Trp Pro Thr Val Asp Pro Tyr Arg Leu Pro Gly Thr Thr Ala Ser

485 490 495

Arg Lys Val Leu Ala Asp Gly Ala Gly Gly Asp Trp Gly Val Ser Leu

500 505 510

Pro Asp Val Asn Trp Val Gly Gly Val Thr Asp Lys Lys Arg Ala Ala

515 520 525

Val Gly Gln Tyr Leu Lys Gly Leu Ser Ser Thr Leu Met Ala Lys Lys

530 535 540

Ser Trp Phe Phe Leu Asp Asp Thr Val Val Cys Leu Gly Ala Gly Ile

545 550 555 560

His Ser Arg Asp Gly Ala Val Val Glu Thr Thr Val Asp Asn Arg Asn

565 570 575

Leu Gly Pro Thr Gly Asn Ala Pro Phe Thr Val Asp Gly Ser Val Lys

580 585 590

Pro Leu Thr Phe Pro Trp Ser Ala Thr Leu Thr Gly Ala Ser Trp Ala

595 600 605

His Leu Ala Gly His Gly Gly Tyr Val Phe Pro Gly Gly Gly Thr Val

610 615 620

Lys Ala Leu Arg Glu Asp Arg Thr Gly Arg Trp Arg Asp Ile Asn Lys

625 630 635 640

Ala Gly Ser Thr Asp Pro Val Ser Arg Lys Tyr Leu Thr Leu Trp Phe

645 650 655

Asp His Gly Gln Asp Pro Ser Gly Ala Ala Tyr Ala Tyr Gln Leu Leu

660 665 670

Pro Gly Ala Ser Glu Gln Arg Thr Ala Ala Arg Ala Ala Asp Ser Gly

675 680 685

Trp Leu Arg Val Leu Ala Asn Thr Asp Asp Gln Gln Gly Val Ala Val

690 695 700

Asp Arg Leu Gly Leu Thr Ala Val Asn Phe Trp Phe Gly Gly Ser Val

705 710 715 720

Gly Pro Leu Val Ala Asp Ala Pro Cys Ser Val Met Val Thr Glu His

725 730 735

Ala Asp Gly Thr Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Pro Met Arg Met Arg

740 745 750

Thr Ser Leu Thr Leu Thr Trp Asn Arg Ala Val Ala Ser Val Val Ser

755 760 765

Lys Pro Ala Thr Val Thr Ser Ala Thr Thr Gly Ala Ser Leu Arg Leu

770 775 780

Val Phe Gly Asp Leu Ser Gly Thr Arg Gly Ala Thr Gln Ala Val Lys

785 790 795 800

Val Arg Leu Ser

Claims

1.一种来源于链霉菌CB16菌株的透明质酸裂解酶HyaL16-3，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.权利要求1所述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求2所述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为质粒pET30a(+)或质粒pCold TF。

5.一种重组菌，在宿主细胞中转入了权利要求3所述重组表达载体。

6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求2所述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4所述重组菌在制备透明质酸裂解酶HyaL16-3中的应用。

8.权利要求1所述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解透明质酸多糖(HA)制备不饱和透明质酸二糖中的应用。

9.权利要求1所述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解A-型硫酸软骨素(CS-A)制备不饱和二糖中的应用。

10.权利要求1所述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解C-型硫酸软骨素(CS-C)制备不饱和二糖中的应用。