CN104120158A - 一种添加透明质酸酶提高小分子透明质酸发酵产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产HA的微生物发酵过程中添加透明质酸酶液制备小分子透明质酸的方法,属于生物工程技术领域。本发明采用水蛭来源的重组透明质酸酶,在兽疫链球菌发酵过程中添加透明质酸酶,并进行补料发酵,实现了发酵偶联酶解法制备小分子透明质酸及寡糖(分子量低于105道尔顿),同时提高了小分子HA的产量。本发明为高效制备小分子透明质酸奠定了一定的基础,适合于工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵过程中添加酶制备小分子透明质酸的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA),是一种高分子粘性多糖,以其独特的分子结构和理化性质,使其具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性,是目前发现的自然界中保湿性最好的物质,同时无任何免疫原性和毒性,被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能,如润滑关节,调节血管壁的通透性,调节蛋白质,水电解质扩散及运转,促进创伤愈合等。
近年来研究发现,低分子量的HA(低于1×104)和透明质酸寡糖具有独特的生物学功能。根据文献研究表明,分子量大小对HA的生物活性影响较大,不同分子量范围的HA却表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×106)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能,可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×106-105)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用,可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA(低于1×104)和寡聚透明质酸,表现出非常强的生物活性,具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用,且易于渗透到真皮中,免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此,小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。
随着小分子HA和HA寡糖的研究与应用迅速兴起,近些年以来,国内外开始重视HA的降解及其降解产物的制备研究。目前,HA降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解3大类。物理降解方法主要有加热、机械剪切力、紫外线、超声波、60Co照射、γ-射线辐射等因素均可使HA发生降解。但是,物理法制备的HA分子量普遍高于1万以上,产生的分子量范围分布较大,产品稳定性较差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法,水解法分酸水解(HCl)和碱水解(NaOH),氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠(NaClO)和过氧化氢(H2O2)。尽管使用化学降解方法降解产物的相对分子质量可以通过改变酸碱或氧化剂的加入量和反应时间来控制,降解成本较低,易于大规模生产,但化学降解法引入了化学试剂,反应条件复杂,易给HA性质产生影响和产品的纯化带来困难,且产生大量的工业废水。生物酶法降解是HA在透明质酸酶(HAase)的作用下,糖链上的糖苷键断裂发生降解。酶解法是温和的降解方法,不但可以制备小分子HA,而且利用此方法可制得链长为4~22的寡糖,而且经过凝胶色谱分离后可以制得单一HA寡糖。但是,目前商品化的透明质酸酶(动物组织提起制备)价格昂贵,不适合应用于工业化制备小分子HA。
本发明在兽疫链球菌发酵产HA过程中添加重组水蛭透明质酸酶,实现发酵过程中直接制备获取小分子透明质酸,这一偶联模式不仅解决了兽疫链球菌发酵后期由于HA的积累粘稠度增大的问题,同时对小分子HA的产量也具有明显的提高。该发明操作过程简单,反应条件温和、专一性高、且产品纯度高,易于实现工业化生产制备小分子透明质酸。
发明内容
本发明公开了一种微生物发酵过程中添加酶制备小分子寡聚透明质酸的方法,是向产高分子HA的微生物发酵体系中添加一定浓度的透明质酸酶溶液,发酵过程控制制备得到小分子寡聚透明质酸。
所述高分子HA的分子量高于106Da,优选105-107Da。
所述产高分子HA的微生物为兽疫链球菌、枯草芽孢杆菌或者重组工程菌株,优选兽疫链球菌。
所述透明质酸酶溶液为粗酶液,过滤除菌,其中反应体系中添加酶活单位数(U)与HA发酵罐装液量(ml)比为101-105:1,优选103-104:1;所述HA溶液与酶液的添加体积比为105:104~1,优选103:10~1。
所述发酵液的pH值控制在6.0-7.0之间,优选pH7.0。
所述发酵过程的温度37℃。
所述发酵时间为14-28h,优选16-24h。
所述发酵过程中添加酶液的时间点为接种后8h内,优选4h。
所述小分子透明质酸分子量小于105kDa,主要产物低分子量或者HA-4、HA-6、HA-8、HA-10等透明质酸寡聚糖。
本发明利用透明质酸酶直接添加到兽疫链球菌发酵液中,在产高分子HA的过程中,被透明质酸酶降解为寡聚糖小分子,具有直接的目的性。与其他方式相比,该发明具有非常大的应用优势。首先,本发明过程中添加酶液,降低了发酵液粘稠度,增加了溶氧和提高了HA的产量;其次,发酵液中酶水解制备的小分子寡聚透明质酸的转化产率高达95%以上,产物的分子量小余105道尔顿,且主要产物为低分子量寡聚糖,易于纯化回收。基于应用分析,本发明方法在工业上用于制备小分子寡聚透明质酸及其衍生体具有潜在而非常广泛的价值。
附图说明
图1所示为兽疫链球菌分批发酵时间关系曲线图;
图2所示为兽疫链球菌发酵过程中第8h添加透明质酸酶分批发酵时间关系曲线图;
图3所示为兽疫链球菌发酵过程中第8h添加透明质酸酶补料发酵时间关系曲线图;
图4所示为兽疫链球菌发酵过程中第4h添加透明质酸酶补料发酵时间关系曲线图;
图5所示为兽疫链球菌发酵过程中第4h添加透明质酸酶分批补料发酵时间关系曲线图;
图6所示为高效液相凝胶排阻色谱测定发酵产物小分子透明质酸的分子量。
具体实施方式
实施例1兽疫链球菌分批发酵(对照组)
本发明所用的菌株为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus WSH-24(本实验室筛选),菌株先在M17培养基平板上划线生长,转接与50ml种子培养基,37℃培养16h,按10%的接种量转接于3L发酵罐(装液量1.5L),培养16h。发酵条件:转速200rpm,通气量1.0vvm,温度37℃,pH7.0。种子培养基(g/L):蔗糖20,酵母粉20,七水硫酸镁2.0,四水硫酸锰0.1,磷酸二氢钾2.0,碳酸钙20,微量元素1ml/L,缓冲液40ml/L,pH7.0。微量元素(g/L):氯化钙2.0,氯化锌0.046,五水硫酸铜0.019。缓冲液(g/L):磷酸氢二钠36.76,磷酸二氢钠15.98,碳酸氢钠12.5。发酵培养基(g/L):酵母粉20,磷酸氢二钠6.2,硫酸钾1.3,蔗糖70,七水硫酸镁2.0,微量元素l mL/L,pH7.0。
发酵过程中每隔2h取一次样,测定菌体生长OD600值,,添加终浓度0.5%的SDS至发酵液中,室温孵育5min,10000rpm离心10min,收集上清液。上清液采用2倍体积的无水乙醇沉淀透明质酸,室温孵育1h,10000rpm离心10min,沉淀采用等体积的1M的NaCl溶液充分溶解,进行适当稀释后,采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测HA酸含量。对照实施例中HA的发酵产量在14h最高为3.8g/L,分子量161万道尔顿。
实施例2兽疫链球菌发酵过程中第8h添加透明质酸酶进行分批发酵
所有操作条件同实施例1,在接种后第8h添加透明质酸酶液7.5ml(106U/ml),在发酵罐中透明质酸酶的含量为5×103U/ml。HA的最高产量在14h达到4.78g/L,结果如附图2所示。发酵液取收集后,沸水煮沸2min,使透明质酸酶失活。
实施例3兽疫链球菌发酵过程中第8h添加透明质酸酶进行补料发酵
所有操作条件同实施例1,在接种后第8h添加透明质酸酶液7.5ml(106U/ml),在发酵罐中透明质酸酶的含量为5×103U/ml。同时,在第8h进行蔗糖补料,50%的蔗糖按如下程序进行补料:
该发酵过程进行添加酶和补蔗糖后,结果如附图3所示,菌体OD600值继续增长,同时HA产量在20h达到7.25g/L。
实施例4兽疫链球菌发酵过程中第4h添加透明质酸酶进行补料发酵
所有操作条件同实施例1,补料操作条件按实施例3所述。在接种后第4h添加透明质酸酶液7.5ml(106U/ml),在发酵罐中透明质酸酶的含量为5×103U/ml。同时,在第8h进行蔗糖补料。
该发酵过程在第4h进行添加酶和第8h补蔗糖后,结果如附图4所示,HA产量在20h达到最高达到7.36g/L。
实施例5兽疫链球菌发酵过程中第4h添加透明质酸酶进行分批补料发酵
所有操作条件同实施例1,但发酵培养基初始蔗糖浓度为15g/L,按如下操作条件在第2h进行补料,同时,在第4h添加透明质酸酶液15ml(106U/ml),在发酵罐中透明质酸酶的含量为1×104U/ml。
该发酵过程在第4h添加透明质酸酶,同时通过控制碳源浓度,在菌体快速生长阶段,HA的积累量迅速提高,在12h达到9.46g/L,结果如附图5所示。
上述实施例2-5中的小分子HA经乙醇纯度,纯化后,采用高效液相凝胶排阻色谱测定分子量大小,结果如附图6所示,平均分子量均集中在60000-70000道尔顿之间,同时,延长酶活反应时间,可以获得HA四糖以上的透明质酸寡糖产物。
Claims (10)
1.一种添加透明质酸酶提高小分子透明质酸发酵产量的方法,其特征在于在微生物发酵产高分子HA过程中添加透明质酸酶溶液,直接发酵并提高小分子透明质酸的产量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述产高分子HA的微生物为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus WSH-24。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述高分子HA的分子量大于106kDa。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述透明质酸酶为水蛭透明质酸酶。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,透明质酸酶添加量为:酶活单位数(U)与发酵罐装液量(体积ml)比为101-105:1;所述产HA发酵罐装液量与酶液的添加体积比为105:104-1。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,透明质酸酶添加量为:酶活单位数(U)与发酵罐装液量(体积ml)比为103-104:1;所述产HA发酵罐装液量与酶液的添加体积比为103:10-1。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述发酵体系溶液的pH为6.0-7.0,优选pH为7.0;温度为37℃,发酵时间为14-28h;透明质酸酶液的添加时间点为接种后8h内。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于透明质酸酶液的添加时间点为接种后4h。
9.根据权利要求1或6所述的方法,其特征在于所述小分子透明质酸分子量小于105kDa,主要产物低分子量或者HA-4、HA-6、HA-8、HA-10等透明质酸寡聚糖。
10.权利要求1所述的方法,其特征在于在于制备的小分子透明质酸用于化妆品、食品及医药相关领域。
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