CN112553272A

CN112553272A - 一种提高透明质酸产率的方法

Info

Publication number: CN112553272A
Application number: CN202011550107.5A
Authority: CN
Inventors: 张天萌; 戚明; 刘金钊; 罗德学; 刘英杰; 张由恒; 王景; 郝井坤
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112553272B

Abstract

本发明公开了一种提高透明质酸产率的方法，所述方法在生产透明质酸的发酵液中根据发酵液的溶氧水平添加透明质酸酶，所述发酵液是在发酵培养基中加入合成透明质酸的菌进行发酵得到的。本发明的方法可以实现一步法制备小分子透明质酸，该方法可以应用于任何发酵合成透明质酸的菌株，和任何可以降解透明质酸的酶类。另外，本发明通过添加吐温80，在一定程度上保护细胞，解决了前期透明质酸酶对菌体的不利影响，降低透明质酸酶对细胞的损伤。且在发酵中添加透明质酸酶，可使发酵液粘度下降，传质效率提高，有利于提高前期透明质酸的生物合成速率，从而提高了透明质酸的产率。

Description

一种提高透明质酸产率的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及提高透明质酸产率的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)，俗称玻尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的大分子黏性多糖，1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。

根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA却表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×10⁶kDa)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×10⁵-10⁶kDa)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA(低于1×10⁴kDa)和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，是免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

当前制备小分子量HA的方法主要集中在物理法和化学法。物理法主要为加热、机械剪切力、紫外线、超声波、Co₆₀照射、γ-射线辐射等方法促使HA发生降解。物理降解法处理过程简单，产品易于回收。但是，这些方法都会带来一定的影响，例如加热法易使HA变色，紫外和超声效率较低等，且产生的小分子分子量范围较大，产品稳定性较差。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCl)和碱水解(NaOH)，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠(NaClO)和过氧化氢(H₂O₂)。化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易影响HA性质，不易于产品的纯化，同时其会产生大量的工业废水。

采用酶解法制备分子量分布集中的小分子透明质酸，常用技术是在高分子量透明质酸水溶液中加入一定量透明质酸酶，并控制水解时间。通过控制加入透明质酸酶的量和水解时间，根据水解分子量下降规律，可以制备出分子量分布集中的小分子HA，包括水解终产物透明质酸四糖和六糖。

CN 106367459 A一种制备不同分子量寡聚HA的方法，其在重组枯草芽孢杆菌的发酵过程中添加水蛭来源的透明质酸酶，制备了低分子量HA，同时提高了发酵产率。但是其说明在溶氧过高的情况下添加透明质酸酶会造成产率下降，且此发酵时间较短，不能实现最大化的利用设备。如果发酵时间能够延长，则可以最大化的利用设备，降低成本。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种提高透明质酸产率的方法，从而克服早期添加酶，透明质酸产率下降的问题，并延长了发酵时间。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1、一种提高透明质酸产率的方法，其特征在于，在生产透明质酸的发酵液中根据发酵液的溶氧水平添加透明质酸酶，所述发酵液是在发酵培养基中加入合成透明质酸的菌进行发酵得到的。

2、根据项1所述的方法，其特征在于，当溶氧水平下降到发酵开始时的1％-10％时，添加终浓度为600-6000U/mL的透明质酸酶。

3、根据项2所述的方法，其特征在于，在发酵过程中始终检测溶氧水平，每当溶氧水平下降到发酵开始时的1％-10％时，添加终浓度为600-6000U/mL的透明质酸酶。

4、根据项1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸酶选自动物源透明质酸酶、微生物源透明质酸酶、人源透明质酸酶，优选为水蛭源透明质酸酶或微生物源透明质酸酶。

5、根据项1所述的方法，其特征在于，所述合成透明质酸的菌是野生菌，优选兽疫链球菌。

6、根据项1所述的方法，其特征在于，所述合成透明质酸的菌是基因工程菌，选自重组枯草芽孢杆菌、重组谷氨酸棒杆菌，重组大肠杆菌中的一种。

7、根据项1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有吐温80。

8、根据项7所述的方法，其特征在于，所述吐温80在所述发酵培养基中的含量为5-10mL/L，优选为5mL/L。

9、根据项7所述的方法，其特征在于，所述吐温80在添加透明质酸酶之前加入。

10、根据项7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括酵母提取物20-30g/L，蛋白胨1.5-3g/L，MgSO₄ 1.2-2g/L，PTM1 0.5-2mL/L，葡萄糖20-40g/L。

有益效果：

本发明通过添加吐温80，在一定程度上保护细胞，解决了前期透明质酸酶对菌体的不利影响，降低透明质酸酶对细胞的损伤。且在发酵中添加透明质酸酶，可使发酵液粘度下降，传质效率提高，有利于提高前期透明质酸的生物合成速率，从而提高了透明质酸的产率。

并且本发明采用了流加酶与溶氧偶联的工艺来控制透明质酸分子量，并提高了透明质酸的产率。其原理是：在发酵过程中细菌合成透明质酸并分泌到胞外，发酵液黏度不断增加大，溶氧降低，传质效率低，从而阻碍了菌体摄取营养与氧气，进而降低透明质酸的合成效率。因此，通过监测溶氧的变化来控制加酶量，既可以及时降低发酵液的黏度，提高传质效率，又可以控制透明质酸的分子量，从而达到目标分子量的最大产率，一举两得，提高效率。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种提高透明质酸产率的方法，所述方法在生产透明质酸的发酵液中根据发酵液的溶氧水平添加透明质酸酶，所述发酵液是在发酵培养基中加入合成透明质酸的菌进行发酵得到的。其中，溶氧水平是影响发酵的一个重要因素，反映的是在发酵液中氧气的溶氧量。

每当透明质酸酶加入发酵液中后，透明质酸的分子量会降低，发酵液粘度降低，溶氧和传质效率提高，随之透明质酸的合成效率提高。透明质酸酶的用量不同，发酵液中透明质酸的分子量也不同。

在一个具体的实施方式中，当溶氧水平下降到发酵开始时的1％-10％(例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％)时，添加终浓度为600-6000U/mL(例如，600U/mL、800U/mL、1000U/mL、2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL)的透明质酸酶。具体地，在发酵开始时将溶氧定义为100％，发酵过程中测得的溶氧量与发酵开始时测得的溶氧量的百分比为相应的发酵过程中的溶氧，例如，溶氧10％指的是溶氧量为发酵开始时的10％。酶的终浓度是指在发酵结束时，添加的酶在发酵液中最终所对应的浓度。

透明质酸生产方法有动物器官提取法和发酵法。采用提取法从动物脏器中提取透明质酸时，由于原料有限，生产成本居高不下，造成商品价格昂贵，限制了它在医药和化妆品中的广泛应用。发酵法与动物组织提取法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中的透明质酸以游离形式存在、易于分离纯化、成本低、易于形成规模化工业生产、无动物来源致病病毒污染的危险等优点。发酵法得到的透明质酸通常是大分子量透明质酸，所以目前从大分子量透明质酸得到小分子透明质酸通常需要在发酵之后进一步处理。比如物理法和化学法。物理法包括加热、超声波和射线辐射等促使透明质酸随机断裂，虽过程简单，但效率较低，产品稳定性较差。化学法主要为水解和氧化降解两类，易引入化学试剂污染，反应条件复杂，不仅对透明质酸的性质产生影响，对纯化造成困难，也会产生大量工业废水。

本发明采用直接在发酵过程中添加透明质酸酶的方法能够直接获得小分子透明质酸。透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称。本发明所述透明质酸酶选自动物源透明质酸酶、微生物源透明质酸酶、人源透明质酸酶，优选为水蛭源透明质酸酶和微生物源透明质酸酶。

本发明所述发酵液是在发酵培养基中加入合成透明质酸的菌进行发酵得到的。其中，所述合成透明质酸的菌可以是野生菌或基因工程菌。在一个具体的实施方式中，所述合成透明质酸的菌是野生菌，优选兽疫链球菌。

兽疫链球菌又称马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ)常存在于皮肤、呼吸道、扁桃体及生殖道，可致各种家畜的炎症和败血症。其中以马最易感，引起子宫炎、流产或不孕症、牛的乳腺炎，对羊和猪及禽类可引起败血性链球菌病。自然康复后可形成免疫力，国内研制的链球菌弱毒苗有一定的免疫效果属于兰氏分群的C群β溶血链球菌，能够感染多种动物及人类。在我国，该菌是猪链球菌病的主要病原，能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎及突发性死亡，并对相关从业人员的健康构成潜在威胁。

在一个具体的实施方式中，所述合成透明质酸的菌是基因工程菌，选自重组枯草芽孢杆菌、重组谷氨酸棒杆菌，重组大肠杆菌中的一种。

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是近四十年来全球用以氨基酸发酵工业的主要生产菌，早在1957年由Kinoshita首次描述其为谷氨酸产生菌。谷氨酸棒状杆菌在分类上属于革兰氏阳性菌下的放线纲棒状杆菌属。镜下观察细菌短杆，小棒状，两端钝圆，菌体被染成蓝紫色，为革兰氏阳性菌。谷氨酸棒状杆菌严格好氧，不运动，不产生孢子，生物素营养缺陷型。细胞壁含有meso-二氨基庚二酸、树胶醛糖、阿拉伯糖、半乳糖和短链的C22-C36分枝菌酸。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，CAS号68038-70-0。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，是一种需氧菌。

大肠杆菌(Escherichia coli)，又叫大肠埃希氏菌，Escherich在1885年发现的。大肠杆菌的生化代谢非常活跃。大肠杆菌可以发酵葡萄糖产酸、产气，个别菌株不产气，大肠杆菌还能发酵多种碳水化合物，也可以利用多种有机酸盐。大肠杆菌在常用的生化特性检测项目中，甲基红试验呈阳性，吲哚产生和乳糖发酵是阳性(个别菌株表现阴性)，维-培试验是阴性，尿素酶和柠檬酸盐利用呈阴性(极个别菌株表现阳性)，硝酸盐还原试验表现阳性，氧化酶表现阴性，氧化-发酵试验表现为F型。

在一个优选的实施方式中，所述发酵培养基含有吐温80。其中吐温80是一种表面活性剂，可以用做冻干保护剂，其原理为在细胞冻结和脱水过程中，降低冰水界面张力所引起的活性组分冻结和脱水变性。例如CN201911307346.5公开了吐温80参与冻干过程，具有冻干保护的作用。但是目前尚无吐温80用于发酵过程中保护细胞。

在一个具体的实施方式中，所述吐温80在所述发酵培养基中的含量为5-10mL/L，例如可以为5mL/L、6mL/L、7mL/L、8mL/L、9mL/L、10mL/L，优选为5mL/L。

其中，吐温80可以在添加透明质酸酶之前的任何时间添加，最优的在培养基灭菌前添加。

在一个具体的实施方式中，所述发酵培养基还包括酵母提取物20-30g/L，蛋白胨1.5-3g/L，MgSO₄ 1.2-2g/L，PTM1 0.5-2mL/L，葡萄糖20-40g/L。

其中，PTM1是一种通用微量元素配方，其成分如下：

使用方法:称取95g粉末，加入800mL蒸馏水溶解，然后加入5mL浓硫酸，最终定容至1L,然后0.22um过滤灭菌。

本发明通过在生产透明质酸的发酵液中根据发酵液的溶氧水平添加透明质酸酶，每当透明质酸酶加入发酵液中后，透明质酸的分子量会降低，发酵液粘度降低，溶氧和传质效率提高，随之透明质酸的合成效率提高，透明质酸的分子量也降低，从而可以实现一步法制备小分子透明质酸，提高透明质酸的产率。当溶氧水平下降到发酵开始时的1％-10％时，添加终浓度为600-6000U/mL的透明质酸酶，在发酵第72h时，发酵液中透明质酸的含量可以达到27.3-59.1g/L，透明质酸的分子量为8kDa-40kDa，尤其是相比较一次性加入透明质酸酶可以大幅提高透明质酸的产量。另外，吐温80的加入在一定程度上保护细胞，解决了前期透明质酸酶对菌体的不利影响，降低透明质酸酶对细胞的损伤。

实施例

以下实施例中使用的兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌来源于华熙生物菌种库。细菌透明质酸酶和水蛭透明质酸酶来源于华熙生物透明质酸酶库。

实施例1

将谷氨酸棒杆菌菌种接种到含50mL活化培养基(脑心浸液培养基37g/L)的250mL摇瓶中，培养10-12h。

30℃培养15h，将50mL上述培养液接种于2.5L发酵罐中进行培养。培养基：酵母提取物20g/L，蛋白胨3g/L，MgSO₄ 1.2g/L，葡萄糖40g/L，PTM1 1mL/L，5mL/L吐温80。

发酵前24h，将溶氧与转速联动，保持溶氧不低于10％，在第8h添加水蛭透明质酸酶600U/mL。在后续的发酵中，随着发酵液中透明质酸含量增加，发酵液粘度逐渐增加，溶氧逐渐降低，将溶氧与流加透明质酸酶偶联，每当溶氧低于10％时，添加600U/mL的水蛭透明质酸酶，具体到本实施例，一共添加10次。在第72h时，发酵液中透明质酸的含量为59.1g/L，分子量为10kDa-40kDa。

实施例2

30℃培养15h，将50mL上述培养液接种于2.5L发酵罐中进行培养培养基：酵母提取物20g/L，蛋白胨3g/L，MgSO₄ 1.2g/L，葡萄糖40g/L，PTM1 1mL/L，10mL/L吐温80。

发酵前24h，将溶氧与转速联动，保持溶氧不低于1％，在第8h添加细菌透明质酸裂解酶600U/mL。在后续的发酵中，随着发酵液中透明质酸含量增加，发酵液粘度逐渐增加，溶氧逐渐降低，将溶氧与流加透明质酸酶偶联，每当溶氧低于1％时，添加600U/mL的细菌透明质酸裂解酶，具体到本实施例，一共添加10次。在第72h时，发酵液中透明质酸的含量为58.7g/L，分子量为10kDa-40kDa。

实施例3

将兽疫链球菌接种到含50mL活化培养基(脑心浸液培养基37g/L)的250mL摇瓶中，培养10-12h。

30℃培养15h，将50mL上述培养液接种于2.5L发酵罐中进行培养培养基：酵母提取物20g/L，蛋白胨3g/L，MgSO₄ 1.2g/L，葡萄糖40g/L，PTM1 1mL/L，5mL/L吐温80。

发酵前24h，将溶氧与转速联动，保持溶氧不低于3％，在第8h添加水蛭透明质酸酶600U/mL。在后续的发酵中，随着发酵液中透明质酸含量增加，发酵液粘度逐渐增加，溶氧逐渐降低，将溶氧与流加透明质酸酶偶联，每当溶氧低于3％时，添加600U/mL的水蛭透明质酸酶，一共添加10次。培养72h后，发酵液中HA含量为27.3g/L，分子量为10kDa-40kDa。

实施例4

30℃培养15h，将50mL上述培养液接种于2.5L发酵罐中进行培养培养基：酵母提取物20g/L，蛋白胨3g/L，MgSO₄ 1.2g/L，葡萄糖40g/L，PTM1 1mL/L。

发酵前24h，将溶氧与转速联动，保持溶氧不低于10％，在第8h添加水蛭透明质酸酶600U/mL。在后续的发酵中，随着发酵液中透明质酸含量增加，发酵液粘度逐渐增加，溶氧逐渐降低，将溶氧与流加透明质酸酶偶联，每当溶氧低于10％时，添加600U/mL的水蛭透明质酸酶，具体到本实施例，一共添加10次。在第72h时，发酵液中透明质酸的含量为40.1g/L，分子量为4kDa-8kDa。

实施例5

30℃培养15h，将50mL上述培养液接种于2.5L发酵罐中进行培养培养基：酵母提取物20g/L，蛋白胨3g/L，MgSO₄ 1.2g/L，葡萄糖40g/L，PTM1 1mL/L，1mL/L吐温80。

发酵前24h，将溶氧与转速联动，保持溶氧不低于1％，在第8h添加细菌透明质酸裂解酶600U/mL。在后续的发酵中，随着发酵液中透明质酸含量增加，发酵液粘度逐渐增加，溶氧逐渐降低，将溶氧与流加透明质酸酶偶联，每当溶氧低于1％时，添加600U/mL的细菌透明质酸裂解酶，具体到本实施例，一共添加10次。在第72h时，发酵液中透明质酸的含量为42.7g/L，分子量为10kDa-40kDa。

对比例1

在溶氧为10％时一次性添加水蛭透明质酸酶6000U/mL。在第72h时，发酵液中透明质酸的含量为35.8g/L，分子量为4kDa-10kDa。

对比例2

30℃培养15h，将50mL上述培养液接种于2.5L发酵罐中进行培养。培养基：酵母提取物20g/L，蛋白胨3g/L，MgSO₄ 1.2g/L，葡萄糖40g/L，PTM11mL/L，5mL/L吐温80。

发酵前24h，将溶氧与转速联动，保持溶氧不低于30％，在第8h添加水蛭透明质酸酶600U/mL。在后续的发酵中，随着发酵液中透明质酸含量增加，发酵液粘度逐渐增加，溶氧逐渐降低，将溶氧与流加透明质酸酶偶联，每当溶氧低于30％时，添加600U/mL的水蛭透明质酸酶，具体到本实施例，一共添加10次。在第72h时，发酵液中透明质酸的含量为24.1g/L，分子量为10kDa-40kDa。

具体地，上述各实施例和对比例的反应条件如表1所示。

表1

其中“-”表示未添加。

Claims

1.一种提高透明质酸产率的方法，其特征在于，在生产透明质酸的发酵液中根据发酵液的溶氧水平添加透明质酸酶，所述发酵液是在发酵培养基中加入合成透明质酸的菌进行发酵得到的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当溶氧水平下降到发酵开始时的1％-10％时，添加终浓度为600-6000U/mL的透明质酸酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵过程中始终检测溶氧水平，每当溶氧水平下降到发酵开始时的1％-10％时，添加终浓度为600-6000U/mL的透明质酸酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸酶选自动物源透明质酸酶、微生物源透明质酸酶、人源透明质酸酶，优选为水蛭源透明质酸酶或微生物源透明质酸酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成透明质酸的菌是野生菌，优选兽疫链球菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成透明质酸的菌是基因工程菌，选自重组枯草芽孢杆菌、重组谷氨酸棒杆菌、重组大肠杆菌中的一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有吐温80。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述吐温80在所述发酵培养基中的含量为5-10mL/L，优选为5mL/L。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述吐温80在添加透明质酸酶之前加入。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括酵母提取物20-30g/L，蛋白胨1.5-3g/L，MgSO₄ 1.2-2g/L，PTM1 0.5-2mL/L，葡萄糖20-40g/L。