CN108220272A - 一种透明质酸酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵工程技术领域，具体公开了一种透明质酸酶的制备方法。本发明通过优化发酵条件，找出了合适的甘油、甲醇补加速率和补加时间以及总诱导时间等条件，实现了透明质酸酶的高效表达，为进一步降低水蛭透明质酸酶的生产成本和扩大应用范围奠定了一定的基础，适合于工业化生产。

Description

一种透明质酸酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种透明质酸酶的制备方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。
近年来研究发现，低分子量的HA(低于1×104)和透明质酸寡糖具有独特的生物学功能。根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA却表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×106)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×105-106)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA(低于1×104)和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。
寡聚透明质酸在体内具有促血管生成作用，在体外可促进内皮细胞的增生，促进创伤愈合(West DC,Kumar S.The effect of hyaluronate and its oligosaccharides onendothelial cell proliferation and monolayer integrity.Exp Cell Res.1989,183(1):179-96)。寡聚透明质酸盐具有促血管生成、促进创伤愈合等生物活性，在医药领域具有良好的应用前景。
在炎症过程中，寡聚透明质酸对树突细胞和巨噬细胞等免疫活性细胞具有强力活化作用(Termeer C,Benedix F,Sleeman J,et al.Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cellsvia toll-like receptor4.JExp Med.2002,195(1):99-111)。
研究发现，寡聚透明质酸具有抗肿瘤作用。如寡聚透明质酸在体外可以抑制小鼠TA3/st乳腺癌细胞、大鼠C6神经胶质瘤细胞、人HCT克隆瘤细胞及人LX1肺癌细胞的生长，抑制率为50％～100％(Ghatak S,Misra S,Toole BP.Hyaluronan constitutively regulatesErbB2phosphorylation and signaling complex formation in carcinoma cells.JBiol Chem.2005,280(10):8875-83)。
目前，降解透明质酸的方法主要有物理降解法、化学降解法和生物酶降解法三大类，物理降解法很难制备寡聚透明质酸，化学降解和生物降解可以，但化学降解法制备寡聚透明质酸需要很剧烈的反应条件，会导致糖链上的糖苷键断裂，有时甚至会使单糖残基结构遭到破坏。同时，化学降解法还容易发生褐变，生产过程污染环境。相比之下，生物酶法降解就比较温和，不但可以制备小分子HA，而且利用此方法可制得链长为4～22的寡糖，而且经过凝胶色谱分离后可以制得单一HA寡糖。但是，目前商品化的透明质酸酶(动物组织提取制备)价格昂贵，不适合应用于工业化制备小分子HA。
透明质酸酶广泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明质酸，是一种重要的生理活性物质。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，将其分为三类。第一类是来源于哺乳动物的透明质酸4-糖基水解酶家族，这类透明质酸酶(EC3.2.1.35)是具有水解和转糖苷活性的糖苷酶，通过水解透明质酸(HA)的β-1、4-糖苷键，产物以四糖为主；第二类为微生物透明质酸酶，这类透明质酸酶(EC4.2.2.1)通过β-消除反应裂解HA的β-糖苷键，产生不饱和二糖；第三类代表性的透明质酸酶主要来源于水蛭，这类水蛭来源的透明质酸酶(EC3.2.1.36)属于透明质酸3-糖基水解酶家族，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。
本发明采用重组水蛭毕赤酵母菌株制备透明质酸酶具有巨大的优势，通过优化发酵条件，实现透明质酸酶的高效表达，进一步推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种透明质酸酶的制备方法。
本发明具体是通过以下方式实现的：
一种透明质酸酶的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将透明质酸酶的生产菌种接入种子培养基中并培养至对数期；
(2)将步骤1)得到的种子液按10～15％的接种量接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧20～50％、pH为5.3～5.5，在温度为29.5～30.5℃的条件下进行发酵，待发酵培养基中甘油消耗殆尽，细胞产量达到50～100g/L湿细胞；
(3)发酵结束后，开始流加浓度50％的甘油溶液，并在甘油溶液中添加PTM1，PTM1的添加量为10～15mL/L甘油；补料速度为16～20mL每小时每升初始发酵液体积，补料时间为10～14h，本阶段完成后细胞产量达到180～220g/L湿细胞；
(4)进入甲醇诱导阶段，终止甘油的补料并且开始用含10-15mL/L PTM1的甲醇进行诱导，设定补料速率为3.0～4.0mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持1～3h；然后补加速率增加至7.0～8.0mL/h每升初始发酵液体积，维持2～4h；最后，增大甲醇流加速率至10～12mL/h每升初始发酵液体积，并保持至发酵过程结束。
所述透明质酸酶的生产菌种为依据专利201310597818.1公开的方法制备的重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887，本领域技术人员根据201310597818.1公开的方法很容易获得。
本发明的技术方案中，步骤(1)具体的操作步骤为：挑取大小均一的透明质酸酶的生产菌种如毕赤酵母单菌落于种子培养基中，在30±0.5℃、pH为6～8、摇床转速200±20rpm的条件下培养至对数期，步骤(1)一般需要培养22～24h才能达到对数期。步骤(1)优选地，挑取大小均一的毕赤酵母单菌落于种子培养基中，在30℃、摇床转速200rpm的条件下培养24h至对数期。步骤(1)中当将氨基葡萄糖生产菌培养至对数期后，种子液的OD值(600nm)一般为3.0～3.5。
上述种子培养基包括酵母抽提物9～11g/L，蛋白胨19～21g/L，葡萄糖19～21g/L，优选种子培养基包括酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
上述发酵培养基包括甘油35～45g/L，K2SO4 18～19g/L，MgSO4·7H2O 14～15g/L，KOH4～5g/L，85％H3PO4 26～27mL/L，CaSO4·2H2O 0.5～1.0g/L，PTM1微量元素4.35mL/L，优选发酵培养基包括甘油40g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，85％H3PO426.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，PTM1微量元素4.35mL/L。
步骤(2)中优选将步骤1)得到的产物按接种量15％、控制溶氧在20～40％、pH为5.3～5.5、温度30℃，发酵24h，这个阶段所要达到的理想细胞产量为70～80g/L湿细胞。
所述甘油补加阶段，优选为补加的甘油为50％(m/v)的甘油水溶液，并添加PTM1 12mL/L甘油溶液，恒速补加，补加速度为18.15mL每小时每升初始发酵液体积，补加12h。
所述发酵液初始体积优选为1.6L，装液比优选为32％。
所述PTM1的配方(g/L)：CuSO4·5H2O6、KI 0.09、MnSO4·H2O3、H3BO3 0.02、MoNa2O4·2H2O0.2、CoCl20.5、ZnCl220、FeSO4·7H2O65、生物素0.2、H2SO4 5.0mL。
所述开始诱导培养，是通过添加甲醇，控制甲醇的浓度在1.5～2.0％(v/v)。
所述控制甲醇的浓度，在本发明的一种实施方式是1.8％(v/v)。
在本发明中可以通过甲醇在线检测器控制流加甲醇的浓度。
所述甲醇诱导阶段，补加的甲醇为纯甲醇，并含有PTM1 12mL/L甲醇。甲醇补加情况优选为最初的甲醇补料速率3.6mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持2h；然后补料速率增加至7.3mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持3h；最后，增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始发酵液体积至诱导结束。
上述方法，在本发明的一种实施方式中的具体步骤是：
(1)挑取透明质酸酶生产菌单菌落于种子培养基中，在30℃、pH为6～8、200～220rpm的条件下培养24h；
(2)将步骤(1)得到的产物按15％接种量接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧20～40％、pH为5.3～5.5，在温度为29.5～30.5℃的条件下进行发酵，待甘油消耗殆尽，细胞产量达到70～80g/L湿细胞；
(3)发酵结束后，开始流加浓度50％的甘油溶液，并在甘油溶液中添加PTM1，PTM1的添加量为12mL/L甘油溶液；甘油补料速率为18.15mL每小时每升初始发酵液体积，并维持12个小时；本阶段完成后细胞产量达到180～220g/L湿细胞。
(4)进入甲醇诱导阶段，终止甘油的补料，流加含有12mL/L PTM1的纯甲醇进行诱导，甲醇在发酵液中的含量为1.8％(v/v)；设定最初的甲醇补料速率3.6mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持2h；然后补料速率增加至7.3mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持3h；最后，增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始发酵液体积至诱导结束。
本发明方法进行诱导表达透明质酸酶其发酵液酶比活高达700580U/ml。利用本发明获得透明质酸酶产量提高的方法，透明质酸酶可以直接从菌株培养条件上进一步挖掘重组菌株产透明质酸酶的潜能，在工业上具潜在的应用价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1透明质酸酶活力测定方法
酶活定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
采用3，5——二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量。反应体系为1mL，含800μL的HA溶液、40μL(稀释10倍)发酵上清液酶液，缓冲液补足1mL；其中HA溶液是用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置，浓度为2mg/mL，分子量为2.5×106Da。对照组采用pPIC9K-GS115灭活的发酵上清液。在38℃反应15min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算发酵液产生的酶活单位数。
实施例2优化发酵条件提高透明质酸酶表达量
以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887为生产菌株，挑取大小均一的菌种于种子培养基中，在30℃、pH为6～8、摇床转速200rpm的条件下培养22～24h至对数期，得到的种子液OD值(600nm)为3.0～3.5；所述种子培养基为酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；
将得到的种子液接入发酵培养基(BSM培养基)，发酵条件为：将培养24h的种子液按15％的接种量接种到含1.6L BSM培养基的5L发酵罐中，通入氧气，控制溶氧20～40％、温度30℃、pH为5.5，培养24h，待发酵培养基中的甘油消耗殆尽，细胞产量达到80g/L湿细胞，发酵结束；开始流加浓度50％的甘油溶液，并在甘油溶液中添加PTM1，PTM1的添加量为12mL/L甘油溶液，补料速率为18.15mL每小时每升初始发酵液体积，补料12h，结束后，继续培养至细胞产量达到200g/L湿细胞。
进入甲醇诱导阶段，开始诱导培养，终止甘油的补料，流加含有12mL/L PTM1的纯甲醇，甲醇在发酵液中的含量为1.8％(v/v)，设定最初的甲醇补料速率3.6mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持2h；然后补料速率增加至7.3mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持3h；最后，增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始发酵液体积至诱导结束，诱导时间96h，整个过程控制溶氧20～40％、温度30℃、pH 5.3～5.5。
BSM培养基配方：甘油40g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，85％H3PO4 26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，PTM1微量元素4.35mL/L。
PTM1的配方(g/L)：CuSO4·5H2O6，KI 0.09，MnSO4·H2O 3，H3BO3 0.02，MoNa2O4·2H2O0.2，CoCl20.5、ZnCl2 20、FeSO4·7H2O 65、生物素0.2、浓H2SO4 5.0mL。
发酵终点所需的产物如下：透明质酸酶酶活700580U/ml，菌体湿重464.5g/L。
实施例3
本实施例与实施例2的区别在于种子液接种量、培养时间不同。在本实施例中的接种量为10％，培养时间20h，此阶段结束时菌体湿重在60g/L左右。
发酵终点所需的产物如下：透明质酸酶酶活591800U/ml，菌体湿重362g/L。
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于甲醇诱导阶段甲醇的补加速率、诱导时间不同。在本实施例中的甲醇起始补加速率为4.0mL/h每升初始发酵液体积，补加3h；再增大补加速率至8.0mL/h每升初始发酵液体积，维持4h；最后以12.0mL/h每升初始发酵液体积的速率补加至诱导结束，诱导90h。
发酵终点所需的产物如下：透明质酸酶酶活461200U/ml，菌体湿重422.48g/L。
由此可见，实施例2具有较好的实施效果。
实施例5重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887菌株的构建方法(依据专利201310597818.1实施例1公开的方法制备)
全化学合成透明质酸酶HaseA3887全长基因序列，以此为模版，设计上下游引物，在上下游引物分别引入限制性内切酶位点(本发明中所述表达载体为pPIC9K，根据此载体选取上游酶切位点为EcoRI，下游为NotI)。使用该对引物扩增HaseA3887基因，对扩增获得的透明质酸酶片段进行EcoRI和NotI双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上(载体pPIC9K经EcoRI、NotI双酶切)，转化至E.coil DH5α中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPIC9K-His-HaseA3887，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确即为重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种透明质酸酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将透明质酸酶的生产菌种接入种子培养基中并培养至对数期；
(2)将步骤1)得到的种子液按10～15％的接种量接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧20～50％、pH为5.3～5.5，在温度为29.5～30.5℃的条件下进行发酵，细胞产量达到50～100g/L湿细胞；
(3)发酵结束后，开始流加浓度50％的甘油溶液，并在甘油溶液中添加PTM1，PTM1的添加量为10-15mL/L甘油；补料速度为16～20mL每小时每升初始发酵液体积，补料时间为10～14h，本阶段完成后细胞产量达到180～220g/L湿细胞；
(4)进入甲醇诱导阶段，终止甘油的补料并且开始用含10-15mL/L PTM1的甲醇进行诱导，设定补料速率为3.0～4.0mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持1～3h；然后补加速率增加至7.0～8.0mL/h每升初始发酵液体积，维持2～4h；最后，增大甲醇流加速率至10～12mL/h每升初始发酵液体积，并保持至发酵过程结束。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸酶的生产菌种为重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括酵母抽提物9～11g/L，蛋白胨19～21g/L，葡萄糖19～21g/L。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为甘油35～45g/L，K2SO4 18～19g/L，MgSO4·7H2O 14～15g/L，KOH 4～5g/L，85％H3PO4 26～27mL/L，CaSO4·2H2O 0.5～1.0g/L，PTM1微量元素4.35mL/L。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括甘油40g/L，K2SO418.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，85％H3PO4 26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，PTM1微量元素4.35mL/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的接种量为15％，溶氧控制在20～40％，pH为5.3～5.5、温度30℃，发酵24h，这个阶段所达到的细胞产量为70～80g/L湿细胞。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)甘油补料速率为18.15mL每小时每升初始发酵液体积，并维持12个小时。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)设定最初的甲醇补料速率3.6mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持2h；然后补料速率增加至7.3mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持3h；最后，增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始发酵液体积。
10.根据权利要求1～9任一项所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)挑取透明质酸酶生产菌单菌落于种子培养基中，在30℃、pH为6～8、200～220rpm的条件下培养24h；
(2)将步骤(1)得到的产物按15％接种量接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧20～40％、pH为5.3～5.5，在温度为29.5～30.5℃的条件下进行发酵，待甘油消耗殆尽，细胞产量达到70～80g/L湿细胞；
(3)发酵结束后，开始流加甘油溶液，并在甘油溶液中添加PTM1，PTM1的添加量为12mL/L甘油溶液；甘油补料速率为18.15mL每小时每升初始发酵液体积，并维持12个小时；本阶段完成后细胞产量达到180～220g/L湿细胞；
(4)进入甲醇诱导阶段，终止甘油溶液的补料，流加含有12mL/L PTM1的纯甲醇进行诱导，甲醇在发酵液中的含量为1.8％；设定最初的甲醇补料速率3.6mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持2h；然后补料速率增加至7.3mL/h每升初始发酵液体积，此补料速率维持3h；最后，增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始发酵液体积至诱导结束。
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