CN104278005A - 一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。本发明通过选取不同的枯草芽孢杆菌分泌信号肽，融合在透明质酸酶N端，同时在信号肽与透明质酸酶之间融合6个组氨酸序列，在组成型强启动子控制下，以无机盐培养基培养发酵，在30℃培养60h的最高酶活可达到17164U/ml。本发明通过采用食品级枯草芽孢杆菌表达系统成功实现了对水蛭透明质酸酶的分泌表达，为实现水蛭来源的透明质酸酶的工业化制备生产奠定了基础。

Description

一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸酶是一类特异性水解透明质酸的水解酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明质酸，是一种重要的生理活性物质。在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生。许多病理变化过程往往伴随着透明质酸酶和透明质酸的变化，暗示它们可能起着重要的作用。同时透明质酸酶也可以改变机体内一些药物和生理活性物质的分布状况。
透明质酸酶于1928年被Duran Reynals发现并称为扩散因子，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，将其分为三类。第一类是来源于哺乳动物的透明质酸4-糖基水解酶家族，这类透明质酸酶(EC3.2.1.35)是具有水解和转糖苷活性的糖苷酶，通过水解透明质酸(HA)的β-1、4-糖苷键，产物以四糖透明质酸分子为主。也可作用于硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素产生硫酸皮肤素产物。第一类中比较常见的有来自于哺乳动物的睾丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌体的透明质酸酶。第二类为微生物透明质酸酶，这类透明质酸酶(EC4.2.2.1)通过β-消除反应裂解HA的β-糖苷键，产生以不饱和的双糖分子为主要产物。这类透明质酸裂解酶来源于包括Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,and Streptomyces等微生物，并且它们的底物特异性也不同。第三类代表性的透明质酸酶主要来源于水蛭，这类水蛭来源的透明质酸酶(EC3.2.1.36)属于透明质酸3-糖基水解酶家族，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性。
透明质酸水解酶作为一种药理活性物质在临床上具有比较广泛的用途。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。水蛭透明质酸酶能溶解体内和体外细菌被膜并形成抗体，从而使宿主获得很好的药物治疗效果。透明质酸酶能够降解心肌透明质酸，显著减少间隙体积，阻止由缺血引起的动脉阻力增大，增加血流量。相关研究实验也证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。另外，透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。如它可以加强阿霉素对乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的复发率等。此外，透明质酸酶在临床上也作为药物扩散助剂，眼科手术后用于降低眼内压，与麻醉剂利多卡因盐酸盐配合使用，可加快进入麻醉状态和延长麻醉时间。虽然哺乳动物透明质酸酶作为“扩散因子”被广泛应用于药物扩散助剂，然而这类透明质酸酶活性易受肝素抑制。相比水蛭透明质酸酶活性不受肝素影响，在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。水蛭来源的透明质酸酶由于其底物专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它不能降解软骨素或硫酸软骨素，活性不受肝素影响。因此，理论上来讲，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。
目前市场供应的透明质酸酶来源于动物组织提取，成本较高，酶活单位低(102-103U/mg)，而且具有动物病毒交叉感染的风险。然而，尚无水蛭来源的透明质酸酶基因的相关报道。水蛭来源的透明质酸酶是以活体水蛭组织进行提取为主获得，且每个水蛭提取所获得透明质酸酶仅约为230U。水蛭原料的来源和提取分离步骤的繁琐等因素都极大的限制了水蛭透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。基于医疗卫生安全考虑，本发明以食品级工程菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重组发酵生产水蛭透明质酸酶。枯草芽孢杆菌由于具有诸多优势，例如安全、好氧生长、营养条件低、遗传操作工具完善等。本发明提供的重组微生物工程菌株高效生产制备水蛭透明质酸酶的方法，打破了水蛭透明质酸酶的活体水蛭提取纯化的瓶颈。对实现工业化生产和医疗科研应用水蛭透明质酸酶奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明提供了一种高效分泌表达活性水蛭透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，进一步融合编码6个组氨酸的核苷酸序列，使编码的透明质酸酶的N端融合6个组氨酸。
在本发明的一种实施方式中，以载体pMA5为出发载体，以来源于枯草芽孢杆菌的wapA-SP、yvgO-SP、yweA-SP信号肽，构建重组表达载体，转化枯草芽孢杆菌。所述信号肽是wapA-SP、yvgO-SP或yweA-SP，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。
本发明提供了一种应用所述重组枯草芽孢杆菌表达透明质酸酶的方法，使用以蔗糖为碳源的无机盐培养基为发酵培养基，发酵生产透明质酸酶。将发酵上清液采用葡聚糖-镍柱进行特异性纯化，可获得纯化的透明质酸酶。
所述发酵培养基含有0.5-2％酵母粉，1-5％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L。
在本发明的另一种实施方式中，所述无机盐培养基：酵母粉20g/L，蔗糖20g/L，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L。
在本发明的一种实施方式中，将种子培养液按10％的接种量接种到发酵培养基中，温度为25-37℃、pH为6.0-7.0培养24-60h。
所述重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168为宿主，以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pMA5载体重组表达已融合编码信号肽wapA-SP、yvgO-SP或yweA-SP和6个组氨酸的水蛭透明质酸酶基因。
本发明采用原核表达系统成功实现真核动物来源的透明质酸酶异源高效活性表达，表达透明质酸酶操作及其纯化制备方法简单。在未对水蛭透明质酸酶基因做任何修饰的情况下，直接重组表达或采用lipA信号肽表达，均未能获得透明质酸酶的活性表达。而本发明通过在透明质酸酶序列的前段添加一段序列，结合不同信号肽，最终获得了三株重组分泌表达活性高的透明质酸酶生产菌株。与真核系统毕赤酵母表达相比，枯草芽孢杆菌为“食品级”工业菌株，培养条件简单，发酵时间短，生产强度大。本发明为实现水蛭来源的透明质酸酶的工业化制备生产奠定了基础。
附图说明
图1为含有pMA5-LHyal和pMA5-lipA-sp-LHyal重组酶的菌株发酵液上清进行平板法透明质酸酶的活性的检测分析。
图2为SDS-PAGE蛋白电泳分析重组菌株pMA5-LHyal和pMA5-lipA-sp-LHyal的透明质酸酶蛋白表达：两株重组菌株都显示，目标蛋白(箭头所示)都以包涵体的无活性形式表达。
图3为SDS-PAGE蛋白电泳分析重组菌株发酵液上清中透明质酸酶的分泌表达：pMA5-wapA-SP-H6LHyal(wapA)、pMA5-yvgO-SP-H6LHyal(yvgO)、pMA5-yweA-SP-H6LHyal(yweA)，黑色箭头标示处为目标条带。
图4为平板法鉴定发酵液产透明质酸酶的活性：pMA5-wapA-SP-H6LHyal(wapA)、pMA5-yvgO-SP-H6LHyal(yvgO)、pMA5-yweA-SP-H6LHyal(yweA)分别有两株菌透明质酸酶发酵液，对照为不含重组基因的枯草芽孢杆菌对照发酵液。
图5为重组pMA5-wapA-SP-H6LHyal(wapA)、pMA5-yvgO-SP-H6LHyal(yvgO)、pMA5-yweA-SP-H6LHyal(yweA)摇瓶发酵产透明质酸酶的粗酶液比活。
具体实施方式
表1信号肽序列
名称 信号肽序列
LipA MKFVKRRIIALVTILMLSVTSLFALQPSAKA
wapA MKKRKRRNFKRFIAAFLVLALMISLVPA
yvgO MKRIRIPMTLALGAALTIAPLSFASA
yweA MLKRTSFVSSLFISSAVLLSILLPSGQAHA
实施例1重组透明质酸酶LHyal的表达载体构建
引物信息如下：
LHyal-P1F：GGAATTCCATATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTGAC
LHyal-P1R：CGCGGATCCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACG
LHyal-P2F：CCGGAATTCATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTGAC
构建表达载体pMA5-LHyal，将编码透明质酸酶的基因LHyal直接与pMA5载体重组。具体构建方法如下：设计引物LHyal-P1F/P1R，在上下游引物两端分别引入NdeI和BamHI限制性酶切位点，采用2x super pfu Master Mix(杭州宝赛生物科技有限公司)，加入无菌水21μl、LHyal-P1F/P1R引物各1μl、LHyal基因模板0.5μl和25μl混匀后置于PCR仪，按如下程序运行：94℃3min，[94℃30s，58℃30s，72℃1min]×32,72℃5min。PCR产物切胶回收后，采用NdeI和BamHI对LHyal产物进行双酶切，同时对pMA5载体也进行NdeI和BamHI双切，两个片段进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlSolution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子pMA5-LHyal进行测序，结果比对正确。
构建表达载体pMA5-lipA-sp-LHyal，将编码透明质酸酶的基因LHyal与已重组了枯草芽孢杆菌信号肽lipA-sp的pMA5载体pMA5-lipA-sp进行重组。具体构建方法如下：在枯草芽孢杆菌信号肽lipA-sp已通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点重组至pMA5的基础上，进行pMA5-lipA-sp-LHyal的构建，设计引物LHyal-P2F，在LHyal-P2F的上游引入EcoRI限制性酶切位点，以引物LHyal-P2F和LHyal-P1R扩增目标基因LHyal，扩增、连接等具体操作同上。成功获得重组载体pMA5-lipA-sp-LHyal。
将pMA5-LHyal和pMA5-lipA-sp-LHyal分别转化枯草芽孢杆菌，进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的LB培养基，37℃、200rpm培养16h。按10％的接种量转接于25ml的表达无机盐培养基(2％酵母粉，2％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L)，30℃200rpm培养，发酵培养60h。重组透明质酸酶发酵液与对照菌(不含重组基因的枯草芽孢杆菌)发酵液进行SDS-PAGE电泳分析，结果图1所示，重组菌株pMA5-LHyal的胞内破碎液和pMA5-lipA-sp-LHyal的发酵液上清在透明质酸酶活性检测平板上都未能见到水解HA的透明圈，与对照孔一样，说明这两个重组菌都未能实现LHyal的活性表达。同样，进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，如图2所示，箭头所指处产生的目标蛋白都出现在包涵体沉淀中，说明表达的目标蛋白透明质酸酶都以包涵体的形式存在。
实施例2重组透明质酸酶基因H6LHyal的分泌表达载体的构建
向透明质酸酶N端引入6个组氨酸，设计引物PCR获得编码N端有6个组氨酸的透明质酸酶基因H6LHyal。选择枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pMA5，分别将信号肽wapA、yvgO、yweA通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点重组至pMA5，信号肽序列表1。设计透明质酸酶重组引物H6LHyal-F/R，向透明质酸酶N端引入6个组氨酸，引物序列如下：
H6LHyal-F：CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGAC
H6LHyal-R：CGCGGATCCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAG
在引物上下游分别引入EcoRI、BamHI限制性酶切位点。pMA5系列信号肽载体分别采用EcoRI、BamHI限制性酶切位点双切，载体和目的片段分别采用琼脂糖凝胶电泳切胶回收，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确。挑选测序正确的重组克隆三株菌：pMA5-wapA-SP-H6LHyal、pMA5-yvgO-SP-H6LHyal、pMA5-yweA-SP-H6LHyal用于下一步实验。重组质粒分别电转入表达宿主Bacillus subtilis 168中，重组克隆子经PCR验证正确。
实施例3重组枯草芽孢杆菌异源活性分泌表达透明质酸酶
验证正确的重组枯草芽孢杆菌菌株pMA5-wapA-SP-H6LHyal、pMA5-yvgO-SP-H6LHyal、pMA5-yweA-SP-H6LHyal进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的LB培养基，37℃、200rpm培养16h。按10％的接种量转接于25ml的表达无机盐培养基(2％酵母粉，2％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L。)，30℃200rpm培养，发酵培养60h。重组透明质酸酶发酵上清液与对照菌(不含透明质酸酶基因的枯草芽孢杆菌)发酵上清液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如附图3所示，经比较分析，确定在箭头标示的位置为重组酶的表达蛋白，样品泳道中出现明显的重组酶条带，箭头指示处。
实施例4重组生产透明质酸酶的活性检测摇瓶发酵液酶活测定
根据平板透明圈法检测透明质酸酶活性。配置缓冲液(50mM的柠檬酸/柠檬酸钠pH5.3，150mM的NaCl，0.02％Na3N)，量取50ml缓冲液，加入1.5％的琼脂糖和1mg/ml的大分子HA(1×106Da)，融化后配制平板并挖井。将发酵液滴入孔径内部，平板置于37℃培养10h，在平板上覆盖适量的10％(w/v)的氯化十六烷吡啶(cetylpyridinium chloride)水溶液，约10-20min后出现透明圈，如附图4所示，与对照组相比，透明质酸酶活力非常明显。
透明质酸酶专一作用于透明质酸内的葡萄糖苷酸键，产生具有还原端为葡萄糖醛酸小分子多糖。采用3，5—二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量，用分析纯葡萄糖作标准曲线，用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，求出酶的比活力。反应体系为1ml，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/ml的HA，反应体系加入400μl的HA溶液、100μl的发酵上清液酶液，缓冲液补足至1ml；对照组采用不含透明质酸酶基因的枯草芽孢杆菌发酵上清液，DNS比色也证明含有编码N端有6个组氨酸的透明质酸酶基因H6LHyal的重组菌株发酵上清液中有明显的透明质酸酶水解HA的活性。在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算发酵液产生的酶活单位数。采用此方法测定的发酵液酶比活如图5所示，重组pMA5-wapA-SP-H6LHyal、pMA5-yvgO-SP-H6LHyal、pMA5-yweA-SP-H6LHyal的最高酶活分别为15915U/ml、14080U/ml和17164U/ml。
从上述表达结果可以看出，通过向透明质酸的N端引入6个组氨酸，结合信号肽能够实现透明质酸酶的活性分泌表达，不同的信号肽对水蛭透明质酸酶的分泌活性具有较大的影响。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种分泌表达活性透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌，是在编码透明质酸酶的基因中融合编码6个组氨酸的核苷酸序列，使编码的透明质酸酶的N端融合6个组氨酸；然后以pMA5为出发载体，结合信号肽WapA、YvgO或YweA，构建重组表达载体，转化枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述信号肽WapA、YvgO或YweA的氨基酸序列分别如SEQIDNO.3-5所示。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168。
4.一种应用权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌表达透明质酸酶的方法，其特征在于，使用以蔗糖为碳源的无机盐培养基为发酵培养基，发酵生产透明质酸酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将发酵上清液采用葡聚糖-镍柱进行特异性纯化，获得纯化的透明质酸酶。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有酵母粉5-20g/L，蔗糖10-50g/L，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将种子培养液按10％的接种量接种到发酵培养基中，温度为25-37℃、pH为6.0-7.0培养24-60h。
8.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌在透明质酸酶的生产中的应用。
9.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌在透明质酸的生产中的应用。
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