CN103614352B - 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 - Google Patents
一种高效重组表达透明质酸酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103614352B CN103614352B CN201310597818.1A CN201310597818A CN103614352B CN 103614352 B CN103614352 B CN 103614352B CN 201310597818 A CN201310597818 A CN 201310597818A CN 103614352 B CN103614352 B CN 103614352B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- unidasa
- hyaluronidase
- seq
- gene
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 title abstract description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 title abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 17
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 17
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 11
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 2
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 2
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940069078 citric acid / sodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效重组表达透明质酸酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过在重组透明质酸酶基因N端添加一段编码组氨酸的核苷酸序列，不仅简化了透明质酸酶的纯化步骤，同时实现了重组透明质酸酶的高活性分泌表达，活性达到了21333.33U/mL。本发明所构建的重组毕赤酵母工程菌株，具有非常大的应用前景。本发明所提出的提高透明质酸酶高效表达制备的方法，进一步降低了透明质酸酶的生产成本，为工业化生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效重组表达透明质酸酶的方法，具体地是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列以显著提高透明质酸酶表达产量，属于基因工程技术领域。
背景技术
透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。且于1928年被Duran Reynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，水蛭透明质酸酶属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC 3.2.1.36)，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。因此，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。相关研究实验已经证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。此外，透明质酸酶在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。
目前，水蛭来源的透明质酸酶基因尚未有相关报道。当前水蛭来源的透明质酸酶是以活体水蛭组织提取为主获得，且每个水蛭提取所获得透明质酸酶仅约为230U。本发明采用毕赤酵母重组生产透明质酸酶具有无法比拟的优势，突破了水蛭原料来源的限制和提取分离步骤的繁琐等因素的限制，能够推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。
外源蛋白在宿主中的活性表达与产量是构建工程菌最重要的两个指标，本发明在已获得水蛭透明质酸酶在毕赤酵母中活性分泌表达的基础上，通过人为在N端添加一段寡聚核苷酸序列，显著提高了透明质酸酶的表达产量。在N端添加的一段序列，对于mRNA的转录、稳定性和后翻译修饰，以及信号肽的后加工成熟分泌都有重要影响。而这些因素也显著影响着外源蛋白在宿主菌中的正确折叠、后加工修饰和顺利分泌。
鉴于此，本发明中构建的新型重组工程菌显著提高了重组透明质酸酶的产量，该方法将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列，构建透明质酸酶产量显著提高的基因工程菌。
所述在透明质酸酶基因N端添加的一段寡聚核苷酸序列，其核苷酸序列如(a)或(b)所示：
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(b)与(a)中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。
所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在其N端添加SEQ ID NO.1所述序列后所得重组透明质酸酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
具体地，是在透明质酸酶基因HaseA3887(SEQ ID NO.2)的N端添加一段核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达。包括以下步骤：基于透明质酸酶基因HaseA3887，合成引物时，在上游引物BYA3887HF引入限制性酶切位点EcoRI和18个核苷酸(6×his-tag序列)，下游引物BYA3887R引入NotI酶切位点；构建的重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887经SalI线性化后电转入P.pastoris GS115中并确认HaseA3887基因重组P.pastoris GS115成功。
所述上游引物BYA3887HF:5’-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC-3’；下游引物BYA3887R:5’-TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC-3’。
本发明还提供了一种利用上述方法构建得到的重组毕赤酵母发酵生产透明质酸酶的方法，具体步骤如下：以含有重组透明质酸酶基因的重组毕赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-His-HaseA3887为生产菌株，将种子培养液按10%的接种量接种到25mL(摇瓶容量250mL)BMGY培养基中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD600为4，离心菌体接种到诱导表达培养基BMMY，每隔24h补加1%(v/v)甲醇，诱导表达96h。
本发明方案中还包括一种特异性纯化重组表达的透明质酸酶的方法，重组透明质酸酶基因(SEQ ID NO.3)所编码的重组蛋白在N端形成6个连续的组氨酸标签，能与葡聚糖镍特异性结合。采用葡聚糖镍与发酵液混合孵育后，分别用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脱杂质，再以500mM的咪唑缓冲液特异性洗脱目标蛋白，再进行梯度透析获得纯透明质酸酶蛋白。
本发明方案在透明质酸基因上游添加一段核苷酸序列、构建了高效表达重组透明质酸基因的毕赤酵母菌，同时解决了透明质酸酶基因高效表达及透明质酸酶亲和纯化的问题。所得重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵上清酶活是对照重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887发酵上清酶活的5倍以上；所得酶通过特异性亲和纯化即可得到。本发明通过在透明质酸基因上游添加一段核苷酸序列。本发明将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大，在工业上具有巨大的应用价值。
附图说明
图1所示为平板法检测发酵上清液透明质酸酶的活性(1，A3887HF重组透明质酸酶发酵上清液水解HA反应产生透明圈；2，pPIC9k-GS115对照发酵上清液作对照)。
图2所示为摇瓶发酵产透明质酸酶的粗酶液酶活力；1，对照重组菌株GS115/pPIC9K-HaseA3887；2，本发明重组菌株GS115/pPIC9K-His-HaseA3887。
图3所示为重组透明质酸酶的蛋白SDS-PAGE电泳结果(M，蛋白marker；1，GS115/pPIC9k菌株发酵液上清；2，对照重组菌株GS115/pPIC9K-HaseA388发酵液上清；3，重组GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵液上清；4，NTA-Ni纯化的重组透明质酸酶蛋白)。
具体实施方式
材料与方法：
透明质酸酶活力单位定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
平板透明圈法检测透明质酸酶活性：透明质酸为大分子聚多糖，在一定浓度的表面活性剂水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不会被沉淀析出。利用这一原理可以快速简便的鉴定透明质酸酶活性。
DNS还原糖测定方法：水蛭透明质酸酶水解HA，通过降解β-1、3-糖苷键，产生带有还原端羟基的还原糖产物。通过DNS还原糖法测定水解HA产生的相对于葡萄糖还原当量的还原糖产物的产生量，来计算酶比活力。
实施例1：含透明质酸酶基因(HaseA3887)表达载体的构建
全化学合成透明质酸酶HaseA3887全长基因序列(SEQ ID NO.2)，以此为模版，设计表达引物，上游引物BYA3887HF:CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC;下游引物BYA3887R:TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC，在上下游引物分别引入限制性内切酶位点(本发明中所述表达载体为pPIC9K，根据此载体选取上游酶切位点为EcoRI，下游为NotI)。使用该对引物扩增HaseA3887基因，对扩增获得的透明质酸酶片段进行EcoRI和NotI双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上(载体pPIC9K经EcoRI、NotI双酶切)，转化至E.coil DH5α中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPIC9K-His-HaseA3887，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。
实施例2：重组毕赤酵母异源表达透明质酸酶
重组P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887克隆子进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养16h。按10%的接种量转接于100ml的诱导表达培养基BMGY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，10×YNB 100ml/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL)，30℃200rpm培养至OD600值为4之间。离心收集菌体，更换至100mL诱导表达培养基BMMY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，100×YNB 100mL/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL)，30℃200rpm培养，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0%(v/v)进行诱导表达，诱导表达96h。发酵上清液经SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果见附图3中泳道3所示，与对照重组菌株(透明质酸酶基因N端未添加SEQ ID NO.1所示序列，其余相同)表达量(泳道2)相比，具有一条比较明显的目标条带。
实施例3：重组生产透明质酸酶的活性检测及摇瓶发酵上清液酶活测定
根据平板透明圈法检测透明质酸酶活性。配置缓冲液(50mM的柠檬酸/柠檬酸钠pH5.3，150mM的NaCl，0.02%Na3N)，量取50ml缓冲液，加入1.5%的琼脂糖和1mg/ml的HA，加热融化后配置平板。将发酵上清液滴入孔径内部，平板置于37℃培养10h，在平板上覆盖适量的10%(w/v)的氯化十六烷吡啶(cetylpyridinium chloride)水溶液，约10min出现透明圈，结果如图1所示，重组P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵上清液(图例1)形成直径约2cm的透明圈，而对照(图例2)未出现透明圈，说明该重组酶实现了活性表达。
采用3，5—二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量。反应体系为1mL，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/mL的HA，反应体系加入400μL的HA溶液、100μL的发酵上清液酶液，缓冲液补足至1mL；对照组采用pPIC9K-GS115发酵上清液。在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算发酵液产生的酶活单位数。结果如附图2所示，本发明中的重组菌株(P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887)的发酵上清液酶活高达201333.33U/mL，是透明质酸酶基因未经修饰的对照重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887发酵上清液透明质酸酶活的5倍多。
实施例4：重组透明质酸酶的纯化制备
在HaseA3887基因前端添加的一段寡聚核苷酸序列，能显著提高透明质酸酶的表达量，同时，经转录翻译后在透明质酸酶N端融合了6个连续组氨酸标签，根据亲和层析原理，该标签能特异性与葡聚糖镍结合。葡聚糖镍先用pH6.0、50mM的磷酸盐缓冲液平衡30min，再加入经过0.45μm过滤的发酵液，在4℃孵育2h，依次用相同缓冲液配置的0、10、20、30、40、50mM的咪唑缓冲液进行洗脱杂质。最后用500mM的咪唑缓冲液洗脱目标蛋白。高浓度咪唑洗脱的目标蛋白进行过夜透析。获得单一条带的透明质酸酶纯蛋白，SDS-PAGE电泳结果如附图3中泳道4所示。所得透明质酸酶纯蛋白，经测定，具有透明质酸酶活力。
Claims (3)
1.一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段核苷酸，构建基因工程菌进行表达；所述添加的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，是在SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因的N端添加一段SEQ ID NO.1所示的核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达；所述构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，是全化学合成SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因，以此为模版，设计引物，在上下游引物分别引入限制性内切酶位点，选取上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为NotI，使用该对引物扩增SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因，对扩增获得的透明质酸酶基因片段进行EcoRI和NotI双酶切，连接至经EcoRI、NotI双酶切后的表达载体上pPIC9K上；所述上游引物的核苷酸序列为:5’-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC-3’；下游引物的核苷酸序列为:5’-TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将种子培养液按10％的接种量接种到含25mLBMGY培养基的容量为250mL的摇瓶中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD600为4，离心收集菌体接种至诱导表达培养基BMMY，每隔24h补加1％甲醇，诱导表达96h；将发酵液经亲和层析纯化得到透明质酸酶蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，透明质酸酶的纯化条件为：采用葡聚糖镍进行亲和层析纯化透明质酸酶蛋白，分别用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脱杂质，再以500mM的咪唑缓冲液特异性洗脱目标蛋白，再进行梯度透析获得纯透明质酸酶蛋白。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310597818.1A CN103614352B (zh) | 2013-08-15 | 2013-11-22 | 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 |
| US14/251,579 US9279111B2 (en) | 2013-07-29 | 2014-04-12 | Leech hyaluronidase and its application |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013103585737 | 2013-08-15 | ||
| CN201310358573.7 | 2013-08-15 | ||
| CN2013103585737A CN103436508A (zh) | 2013-08-15 | 2013-08-15 | 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 |
| CN201310597818.1A CN103614352B (zh) | 2013-08-15 | 2013-11-22 | 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103614352A CN103614352A (zh) | 2014-03-05 |
| CN103614352B true CN103614352B (zh) | 2015-07-08 |
Family
ID=49690225
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013103585737A Pending CN103436508A (zh) | 2013-07-29 | 2013-08-15 | 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 |
| CN201310597818.1A Active CN103614352B (zh) | 2013-07-29 | 2013-11-22 | 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013103585737A Pending CN103436508A (zh) | 2013-07-29 | 2013-08-15 | 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN103436508A (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103695448B (zh) * | 2013-07-29 | 2016-08-17 | 江南大学 | 一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法 |
| CN103484513B (zh) * | 2013-10-22 | 2015-02-11 | 江南大学 | 一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法 |
| CN104178539B (zh) * | 2014-08-19 | 2017-11-21 | 江南大学 | 一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法 |
| CN104212732A (zh) * | 2014-09-12 | 2014-12-17 | 江南大学 | 一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法 |
| CN104232804B (zh) * | 2014-10-08 | 2016-03-23 | 江南大学 | 一种梯度变温诱导提高透明质酸酶表达量的方法 |
| CN104278005A (zh) * | 2014-10-17 | 2015-01-14 | 江南大学 | 一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌 |
| CN107988184A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-04 | 广州白云山拜迪生物医药有限公司 | 一种重组人透明质酸酶的纯化方法 |
| CN108355618B (zh) * | 2018-02-27 | 2020-09-08 | 江南大学 | 牛来源透明质酸酶亲和介质及其吸附方法 |
| CN114350691B (zh) * | 2021-03-05 | 2023-12-08 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法 |
| CN114350535B (zh) * | 2021-10-09 | 2024-06-21 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用 |
| CN117165558B (zh) * | 2023-09-27 | 2024-07-09 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种透明质酸酶的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101633931A (zh) * | 2008-07-25 | 2010-01-27 | 山东省生物药物研究院 | 一种透明质酸酶表达载体及其应用 |
-
2013
- 2013-08-15 CN CN2013103585737A patent/CN103436508A/zh active Pending
- 2013-11-22 CN CN201310597818.1A patent/CN103614352B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101633931A (zh) * | 2008-07-25 | 2010-01-27 | 山东省生物药物研究院 | 一种透明质酸酶表达载体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 透明质酸制备方法及应用研究的进展;朱广华等;《中国医药工业杂志》;19961231;第2卷(第8期);第382-384页 * |
| 透明质酸合成酶的研究进展;葛昊等;《药学进展》;20081231;第32卷(第7期);第297页左栏第2段-第298页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103614352A (zh) | 2014-03-05 |
| CN103436508A (zh) | 2013-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103614352B (zh) | 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 | |
| CN104263707A (zh) | 一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法 | |
| CN103695448B (zh) | 一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法 | |
| CN104278005A (zh) | 一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌 | |
| CN109912700B (zh) | 一种利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法 | |
| CN103484513B (zh) | 一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法 | |
| CN104263666B (zh) | 一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法 | |
| CN114350691A (zh) | 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法 | |
| CN110093331A (zh) | 一种高产的耐高温宽pH稳定性的甘露聚糖酶ManGold及基因与应用 | |
| CN106995811A (zh) | 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 | |
| CN104745553A (zh) | 重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法 | |
| CN105441464A (zh) | 一种葡聚糖外切酶ii基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系统 | |
| CN107893061A (zh) | 一种米黑根毛霉来源的β‑1,3‑葡聚糖酶及其应用 | |
| CN114350639A (zh) | 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达 | |
| CN104178539B (zh) | 一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法 | |
| CN105039371A (zh) | 海藻糖合成酶-海藻糖水解酶融合酶及其表达基因与应用 | |
| CN101139556B (zh) | 重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体和菌株 | |
| CN103952326B (zh) | 一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用 | |
| CN109652437A (zh) | 一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用 | |
| CN105567779A (zh) | 一种高产低分子量热凝胶的发酵方法 | |
| CN103146726B (zh) | 一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法 | |
| CN110093326B (zh) | 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用 | |
| CN108865913B (zh) | 一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法 | |
| CN107418941A (zh) | 一种重组黄曲霉壳聚糖酶和编码基因及制备和应用 | |
| CN113862240B (zh) | 一种密码子优化的糖苷酶swmu-f2-2及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Chen Jian Inventor after: Du Guocheng Inventor after: Kang Zhen Inventor after: Li Jianghua Inventor after: Jin Peng Inventor before: Chen Jian Inventor before: Du Guocheng Inventor before: Kang Zhen Inventor before: Jin Peng |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: CHEN JIAN DU GUOCHENG KANG ZHEN JIN PENG TO: CHEN JIAN DU GUOCHENG KANG ZHEN LI JIANGHUA JIN PENG |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140305 Assignee: NANJING HANXIN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2020320000330 Denomination of invention: An efficient method for recombinant expression of hyaluronidase Granted publication date: 20150708 License type: Common License Record date: 20201212 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140305 Assignee: Nanjing letao Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2023980034160 Denomination of invention: A highly efficient method for recombinant expression of hyaluronidase Granted publication date: 20150708 License type: Common License Record date: 20230328 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20140305 Assignee: Shuiyang Cosmetics Manufacturing Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2024980001575 Denomination of invention: An efficient method for recombinant expression of hyaluronidase Granted publication date: 20150708 License type: Common License Record date: 20240130 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |