CN104263707A - 一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在重组透明质酸酶基因前段融合一段信号肽序列，解决了原重组菌株产量较低的问题，实现了重组透明质酸酶在毕赤酵母中产量的显著提高。本发明中工程菌的成功构建，为进一步降低水蛭透明质酸酶的生产成本和扩大应用范围奠定了一定的基础，适合于工业化生产。

Description

一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法
技术领域
本发明涉及一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法，尤其是一种在透明质酸酶N端融合信号肽信号肽提高了透明质酸酶的表达产量的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸酶(Hyaluronidase，HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，于1928年被Duran Reynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，水蛭透明质酸酶属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。因此，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。
本发明采用毕赤酵母重组生产透明质酸酶具有无法比拟的优势，通过改变信号肽，实现透明质酸酶的高效表达，进一步推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。本发明通过人为在N端融合一段分泌信号肽显著提高了透明质酸酶的表达产量，在N端融合的信号肽对后加工成熟分泌都有重要影响。而这些因素也显著影响着外源蛋白在宿主菌中的正确折叠、后加工修饰和顺利分泌。
本发明构建的新型重组工程菌显著提高了重组透明质酸酶的产量，将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大。
发明内容
针对重组毕赤酵母发酵生产透明质酸酶的表达量较低的问题，本发明提供一种提高透明质酸酶在毕赤酵母中重组表达的方法，获得了透明质酸酶产量提高的重组毕赤酵母菌株。
所述方法，是在水蛭透明质酸酶N端融合信号肽nsB，然后将融合基因片段连接表达载体在毕赤酵母中进行表达；编码所述nsB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸酶基因的上游首先融合有6×his-tag序列，然后再与信号肽nsB融合。
在本发明的一种实施方式中，编码所述水蛭透明质酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的另一种实施方式中，是以毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为宿主，在透明质酸酶基因的上游融合6×his-tag序列、nsB信号肽，连接表达载体pPIC9K，转化P.pastorisGS115进行表达。
在本发明的另一种实施方式中，PCR合成融合了6×his-tag序列和信号肽nsB的透明质酸酶基因，是以SEQ ID NO.2所示序列为模版，在上游引物引入信号肽nsB和6×his-tag的一段序列，下游引物引入Not I酶切位点，PCR获得基因片段nsB-His-tag-HaseA3887，连接表达pPIC9K，构建的重组质粒nsB-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his经SalI线性化后电转入P.pastoris GS115中并确认nsB-HaseA3887基因重组P.pastoris GS115成功。
本发明的第二个目的在于提供一种产透明质酸酶能力提高的重组毕赤酵母，是以毕赤酵母为宿主重组表达了N端融合了nsB信号肽的透明质酸酶。
在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母是以P.pastoris GS115为宿主，在透明质酸酶基因HaseA3887的上游先后融合了6×his-tag序列和nsB信号肽，然后连接表达载体pPIC9K，转化P.pastoris GS115，筛选得到。编码所述nsB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述透明质酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的在于提供一种应用所述重组毕赤酵母发酵产透明质酸酶的方法，是以BSM培养基为发酵培养基，培养至OD600为70-80，指数流加含12mL/LPTM1的甘油，培养菌体OD600至220-240，再流加含12mL/LPTM1的甲醇诱导培养，控制培养基中甲醇的浓度为17.5-18g/L，诱导培养90-96h。
在本发明的一种实施方式中，采用的发酵条件为：将种子培养液按10％的接种量接种到含800mLBSM培养基3L发酵罐中，温度为30℃、转速为200rpm，pH为5.5，培养至OD600为80，开始按指数流加方式补料培养，向罐内流加含12mL/LPTM1的甘油，流加速率F按如下公式：
F＝μ(VX)0exp(μt)/YX/S(SF-S)
式中，X和S分别为细胞和底物浓度(g/L)，μ为比生长速率(h-1)，V为发酵液体积(L)，SF为补加底物的浓度(g/L)，YX/S为细胞对底物的得率系数(g/g)，(VX)0为培养体系的初始细胞量(g)，t为流加时间(h)。式中，μ＝0.176h-1，SF-S＝0.435g/L，SF＝0.500g/L，S＝0.2g/L。补料结束后，继续培养OD600至220，开始流加含12mL/L PTM1的甲醇进行诱导培养，甲醇的浓度控制在18g/L，诱导培养96h。
采用本发明方案中在上游融合一段信号肽序列菌株，在发酵液酶比活上要比ɑ-factor信号肽分泌的酶比活力提高了22％，发酵液酶活由842000U/mL提高到1026630U/mL。利用本发明获得透明质酸酶产量提高的方法，具有直接的目的性透明质可以直接从分子生物学水平上进一步挖掘重组菌株产透明质酸酶的潜能，在工业上具潜在的应用价值。
附图说明
图1所示为含不同信号肽菌株产透明质酸酶发酵液酶比活；1：原重组菌株ɑ-factor-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his摇瓶发酵诱导96h产透明质酸酶的粗酶液比活；2：重组菌株nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his摇瓶发酵诱导96h产透明质酸酶的粗酶液比活；3：重组菌株SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his摇瓶发酵诱导96h产透明质酸酶的粗酶液比活；4：重组菌株YTP1-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastorisGS115/NT-his摇瓶发酵诱导96h产透明质酸酶的粗酶液比活；5：重组菌株HKR1-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his摇瓶发酵诱导96h产透明质酸酶的粗酶液比活。
图2所示为透明质酸酶发酵液酶比活；1：原重组菌株ɑ-factor-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his上罐发酵诱导90h产透明质酸酶的粗酶液比活；2：本发明重组nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his菌株上罐发酵诱导90h产透明质酸酶的粗酶液比活。
图3所示为重组透明质酸酶的蛋白SDS-PAGE电泳结果；M：蛋白marker；1：原重组菌株ɑ-factor-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his菌株诱导90h发酵液上清；2：表示为本发明重组nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his菌株诱导90h发酵液上清。
具体实施方式
透明质酸酶活力单位定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
DNS还原糖测定方法：水蛭透明质酸酶水解HA，通过降解β-1、3-糖苷键，产生带有还原端羟基的还原糖产物。通过DNS还原糖法测定水解HA产生的相对于葡萄糖还原当量的还原糖产物的产生量，来计算酶比活力。
实施例1含信号肽透明质酸酶基因(nsB-HaseA3887)表达载体的构建
1、信号肽nsB
通过PCR，在核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的水蛭透明质酸酶上游融合6×His-tag标签，得到透明质酸酶基因HaseA3887，根据信号肽nsB基因序列与透明质酸酶HaseA3887全长基因序列设计融合引物，分为三段融合，逐步将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽nsB添加到HaseA3887基因序列的N端。设计引物如下：
nsB1：
ACTTGCGTTGCAGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTCACCACCACCACCACCACATGAAAGAnsB2：
TACTCTCTCTGACCGGTGTGGCTGGTGTGCTTGCGACTTGCGTTGCAGCCACTCCTTTGnsB3：
CGCGGATCCAAACGATGAAGCTACTCTCTCTGACCGGTGTGGCT
nsB1，nsB2，nsB3作为上游引物，在上游nsB3引物中含有限制性酶切位点BamHI，BYA3887R：
TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC作为下游引物含有限制性酶切位点NotI。使用上述引物扩增融合信号肽nsB的HaseA3887基因，对扩增获得的含信号肽nsB的透明质酸酶片段进行BamHI和NotI双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上(载体pPIC9K经BamH I，Not I双酶切)，转化至E.coil JM109中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒nsB-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。
2、信号肽ɑ-factor、YTP1、HKR1、SCS3
在透明质酸酶基因HaseA3887上游分别融合核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示的信号肽YTP1、HKR1、SCS3后，构建重组表达载体。
(1)ɑ-factor
ɑ-factor为载体pPIC9K自带的信号肽。将Hase A3887插入到载体pPIC9K，HaseA3887扩增引物如下：
BYA3887HF:CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC；
BYA3887R:TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC。
上下游引物分别引入限制性内切酶位点，上游酶切位点为EcoR I，下游为Not I，对扩增获得的透明质酸酶片段进行EcoR I和Not I双酶切，连接至经EcoR I、Not I双酶切的pPIC9K上，转化至E.coil JM109中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒ɑ-factor-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经Sal I线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。
(2)信号肽YTP1、HKR1、SCS3基因直接扩增，
信号肽YTP1、HKR1、SCS3扩增引物如下：
YTP1(F)：CGCGGATCCAAACGATGACAGCAGCTAATAAGAA
YTP1(R)：CCGGAATTCAGATTTCGACCCAGCCTGCACAATT
HKR1(F)：CGCGGATCCAAACGATGGTCTCATTGAAAATAAA
HKR1(R)：CCGGAATTCTTGCGTTGTCGTCGTCACACTAATA
SCS3(F)：CGCGGATCCAAACGATGTCTAGCAAATGGTTTAA
SCS3(R)：CCGGAATTCCCCTTTCTTTACCAACATAGC
在上下游引物分别引入限制性内切酶位点，上游引物中酶切位点为BamHI，下游引物中酶切位点为EcoRI。分别使用以上几对引物扩增信号肽YTP1、HKR1、SCS3基因，对扩增获得的信号肽片段进行BamHI和EcoR I双酶切，通过BamHI和EcoR I酶切位点连接至表达载体ɑ-factor-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，取代信号肽ɑ-factor，转化至E.coil JM109中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒YTP1-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his、HKR1-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his、SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。分别得到nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his、YTP1-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his、HKR1-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his、SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his这4株信号肽不同的重组菌株。
实施例2摇瓶发酵
以重组ɑ-factor-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his、nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his、YTP1-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastorisGS115/NT-his、HKR1-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his、SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his进行发酵。单克隆接种于分别接种于10mL YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养24h。按10％的接种量转接于50ml的诱导表达培养基BMGY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，10×YNB100ml/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL)，25℃200rpm培养至OD600值为4之间，离心收集菌体，更换至50ml诱导表达培养基BMMY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，100×YNB100mL/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL)。25℃200rpm培养，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％进行诱导表达，诱导表达96h。
结果如图1所示，nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his菌株发酵液酶比活最高，而其他均比ɑ-factor信号肽酶比活要低。
实施例3重组菌nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his在3L发酵罐上的诱导表达
重组nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-hiss克隆子进行发酵培养表达。单克隆接种于分别接种于50mL YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养24h。按10％的接种量接于含800mL BSM培养基(85％磷酸26.7mL/L，CaSO4·H2O0.93g/L，K2SO418.2g/L，MgSO4·7H2O14.9g/L，KOH4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.35mL/L)的3L发酵罐，发酵条件为：温度为30℃、200rpm，pH为5.5培养至OD600为80，开始补料培养，按指数流加方式向罐内流加含12mL/LPTM1(CuSO4 5H2O 6g/L，KI0.09g/L，MnSO4H2O 3g/L，H3BO3 0.02g/L，MoNa2O4 2H2O 0.2g/L，CoCl2 0.5g/L，ZnCl2 20g/L，FeSO4 7H2O 65g/L，Biotin0.2g/L，H2SO4 5.0mL/L)的甘油，补料体积(mL)如下表1：
表1
补料结束后，继续培养OD600至220，开始诱导培养，流加含12mL/L PTM1的甲醇，控制培养基中甲醇的浓度控制在18g/L，甲醇浓度用甲醇在线检测器控制流加，诱导培养96h。在上游融合一段信号肽nsB序列的菌株，在发酵液酶比活上要比ɑ-factor信号肽分泌的酶比活力提高了22％。发酵液经SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果见附图2中泳道2所示，与原重组菌株表达量(泳道1)相比，具有一条比较明显的目标条带。
实施例3重组生产透明质酸酶的活性检测发酵液酶比活测定
采用3，5—二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量。反应体系为1mL，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/mL的HA(2.45x106Da)，反应体系加入800μl的HA溶液、10μl稀释10倍后的发酵上清液酶液，pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液补足至1mL；对照组采用pPIC9K-GS115发酵上清液。在38℃反应15min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算发酵液产生的酶活单位数。结果如附图1所示，与原信号肽ɑ-factor-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his重组菌株(842000U/mL)相比，本发明中的重组菌株nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his)发酵液酶比活高达1026630U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高透明质酸酶在毕赤酵母中重组表达的方法，是在水蛭透明质酸酶N端融合信号肽nsB，然后将融合基因片段在毕赤酵母中进行表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸酶基因的上游首先融合有6×his-tag序列，然后再与信号肽nsB融合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，编码所述nsB信号肽的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，编码所述水蛭透明质酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是以P.pastoris GS115为宿主，在透明质酸酶基因的上游融合6×his-tag序列和信号肽nsB，连接表达载体pPIC9K，转化P.pastoris GS115进行表达。
6.一种产透明质酸酶能力提高的重组毕赤酵母，其特征在于，是以毕赤酵母为宿主重组表达了N端融合了nsB信号肽的透明质酸酶。
7.根据权利要求6所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以P.pastoris GS115为宿主，在透明质酸酶基因的上游融合6×his-tag序列和nsB信号肽，获得基因片段nsB-His-tag-HaseA3887，然后连接表达载体pPIC9K，转化P.pastoris GS115，筛选得到。
8.根据权利要求6或7所述的重组毕赤酵母，其特征在于，编码所述nsB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述水蛭透明质酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.一种应用权利要求6所述重组毕赤酵母发酵产透明质酸酶的方法，是以BSM培养基为发酵培养基，培养至OD600为70-80，开始指数流加含12mL/LPTM1的甘油，继续培养菌体OD600至220-240，流加含12mL/LPTM1的甲醇，控制培养基中甲醇的浓度为17.5～18g/L，诱导培养90～96h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用的发酵条件为：将种子培养液按10％的接种量接种到含800mLBSM培养基3L发酵罐中，温度为30℃、转速为200rpm，pH为5.5，培养至OD600为80，开始补料培养，按指数流加方式向罐内流加含12mL/LPTM1的甘油，补料结束后，继续培养OD600至220，开始诱导培养，流加含12mL/LPTM1的甲醇，甲醇的浓度控制在18g/L，诱导培养96h。
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Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148265A (zh) * 2016-07-15 2016-11-23 江南大学 一种产硫酸软骨素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN107227284A (zh) * 2017-05-27 2017-10-03 江南大学 一种发酵小分子透明质酸的重组兽疫链球菌
CN108220272A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 江苏神华药业有限公司 一种透明质酸酶的制备方法
CN108753671A (zh) * 2018-06-05 2018-11-06 江南大学 一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌及其发酵工艺
CN108949603A (zh) * 2018-10-09 2018-12-07 江南大学 一种分泌表达海蠕虫透明质酸水解酶的重组酿酒酵母菌株
CN112522125A (zh) * 2020-12-28 2021-03-19 河北省微生物研究所 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用
WO2021213623A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 Pharmact Holding Ag A modified bacterial hyaluronidase polypeptide, production process, pharmaceutical compositions and their uses
CN114350535A (zh) * 2021-10-09 2022-04-15 华熙生物科技股份有限公司 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用
CN114350691A (zh) * 2021-03-05 2022-04-15 华熙生物科技股份有限公司 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法
CN115261361A (zh) * 2022-09-14 2022-11-01 水羊化妆品制造有限公司 一种重组毕赤酵母生成透明质酸酶的工业化发酵方法
WO2023067008A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 Pharmact Holding Ag A production of a purified modified bacterial hyaluronidase polypeptide, pharmaceutical compositions and their uses
CN116064617A (zh) * 2022-11-16 2023-05-05 美药星（南京）制药有限公司 一种提高欧洲牡蛎溶菌酶产量的方法
CN117025432A (zh) * 2023-08-16 2023-11-10 江南大学 一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母及其应用
CN117887691A (zh) * 2023-12-27 2024-04-16 山东福瑞达医药集团有限公司 一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148265A (zh) * 2016-07-15 2016-11-23 江南大学 一种产硫酸软骨素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN106148265B (zh) * 2016-07-15 2019-08-20 江南大学 一种产硫酸软骨素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN107227284A (zh) * 2017-05-27 2017-10-03 江南大学 一种发酵小分子透明质酸的重组兽疫链球菌
CN107227284B (zh) * 2017-05-27 2020-06-09 江南大学 一种发酵小分子透明质酸的重组兽疫链球菌
CN108220272A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 江苏神华药业有限公司 一种透明质酸酶的制备方法
CN108753671A (zh) * 2018-06-05 2018-11-06 江南大学 一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌及其发酵工艺
CN108949603A (zh) * 2018-10-09 2018-12-07 江南大学 一种分泌表达海蠕虫透明质酸水解酶的重组酿酒酵母菌株
WO2021213623A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 Pharmact Holding Ag A modified bacterial hyaluronidase polypeptide, production process, pharmaceutical compositions and their uses
CN112522125A (zh) * 2020-12-28 2021-03-19 河北省微生物研究所 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用
CN114350691A (zh) * 2021-03-05 2022-04-15 华熙生物科技股份有限公司 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法
CN114350691B (zh) * 2021-03-05 2023-12-08 华熙生物科技股份有限公司 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法
CN114350535A (zh) * 2021-10-09 2022-04-15 华熙生物科技股份有限公司 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用
WO2023056891A1 (zh) * 2021-10-09 2023-04-13 华熙生物科技股份有限公司 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用
CN114350535B (zh) * 2021-10-09 2024-06-21 华熙生物科技股份有限公司 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用
WO2023067008A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 Pharmact Holding Ag A production of a purified modified bacterial hyaluronidase polypeptide, pharmaceutical compositions and their uses
CN115261361A (zh) * 2022-09-14 2022-11-01 水羊化妆品制造有限公司 一种重组毕赤酵母生成透明质酸酶的工业化发酵方法
CN116064617A (zh) * 2022-11-16 2023-05-05 美药星（南京）制药有限公司 一种提高欧洲牡蛎溶菌酶产量的方法
CN117025432A (zh) * 2023-08-16 2023-11-10 江南大学 一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母及其应用
CN117887691A (zh) * 2023-12-27 2024-04-16 山东福瑞达医药集团有限公司 一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用

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