CN117025432A - 一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母及其应用。本发明在保持人透明质酸酶PH‑20核心功能序列的基础上，首先对其信号肽序列进行替换，使rhPH‑20分泌表达水平提升20％；进一步对共翻译内质网转运途径进行针对性强化，使分泌表达提升48％；之后，通过强化内质网未折叠蛋白响应使分泌表达进一步提升31％。最终，经5‑L发酵罐培养，三步改造后的重组菌OE54‑ScHAC1分泌表达rhPH‑20产量达到19.82U·mL‑1，相较出发总共提升约9.38倍，为目前酵母体系组成型表达最高水平。

Description

一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母及其应用，属于工业微生物技术领域。
背景技术
透明质酸酶是一类对透明质酸具有主要降解活性的糖胺聚糖降解酶，在透明质酸加工、医药研究等领域有广泛应用。近年来，重组人透明质酸酶PH-20
(Recombinant human PH-20,rhPH-20)的医学应用被广泛关注，被认为是动物组织来源透明质酸酶的更安全替代品。相较于其他人来源透明质酸，其在中性条件下的较高活性使其被选择用于医疗制剂的开发。针对rhPH-20的研究表明，将rhPH-20与局部注射药物联用时，皮下透明质酸被部分降解，能够有效提升药物的扩散效率和生物利用度。在相关研究领域，rhPH-20在胰岛素、单克隆抗体、抗癌药物递送以及医美手术方面得到了广泛关注，已被应用于增强多种皮下注射药物的递送。
基于rhPH-20的重要应用价值，有多项研究报道了其在不同表达体系中的重组表达，包括哺乳动物细胞、植物细胞与微生物细胞。根据已有文献报道，在动物、植物细胞中表达rhPH-20时，表达活性较低。同时，目前商业化的rhPH-20普遍为CHO细胞表达，存在生产周期较长，生产成本较高等问题。相较之下，重组毕赤酵母表达rhPH-20的报道中rhPH-20分泌表达酶活性更高，且相较之下培养周期更短，生产成本更低，更适合大规模工业化生产，在近年被广泛研究。
目前国内外已有研究报道了rhPH-20在毕赤酵母中的甲醇诱导型表达，但诱导剂甲醇的流加可能在大规模工业化操作中带来安全隐患，组成型表达相较之下条件更温和，操作更简便，是更理想的工业化蛋白的生产方式。然而，目前的毕赤酵母组成型表达rhPH-20的研究中，仍然存在酶活较低的问题，多数低于2U·mL-1。同时，通过针对性地改造毕赤酵母宿主的分泌途径以提升rhPH-20分泌表达的策略仍有待探索。
发明内容
为解决上述问题，本发明首先对pGAPZαA质粒进行改造，提供一种能在毕赤酵母宿主中组成型表达rhPH-20的重组表达载体，并进一步通过改造重组蛋白向内质网的转运过程，以及内质网未折叠蛋白响应，提升重组菌rhPH-20的表达效率，为强化重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达提供新思路。最终，通过发酵条件优化与5-L发酵罐放大培养提高rhPH-20的表达水平。
本发明的第一个目的是提供一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母，所述毕赤酵母包括以下改造：过表达了人透明质酸酶，所述人透明质酸酶由PGCW14启动子启动表达，且由核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的信号肽调控表达。
进一步地，所述人透明质酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PGCW14启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述毕赤酵母过表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.6-8任一项所示的信号识别颗粒亚基。
进一步地，所述信号识别颗粒亚基由PGAP启动子启动表达。
进一步地，所述毕赤酵母过表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.9-11任一项所示的转录因子HAC1。
进一步地，所述转录因子HAC1由PGAP启动子启动表达。
进一步地，上述重组菌以毕赤酵母GS115、毕赤酵母KM71、毕赤酵母X33或毕赤酵母SMD116为出发菌株。
本发明的第二个目的是提供一种制备人透明质酸酶的方法，包括采用上述重组毕赤酵母进行发酵生产的步骤。
进一步地，所述的发酵为补料分批发酵。
进一步地，补料分批发酵时，发酵至20-24h时流加甘油直至发酵结束。
进一步地，甘油补料培养基为：甘油30％～80％(w/v)。
进一步地，甘油流加速度为1-5mL·L-1·h-1。
进一步地，所用发酵培养基包括以下组分：甘油10～40g·L-1，蛋白胨10～20g·L-1，酵母粉5～15g·L-1，K2HPO4·3H2O 4～10g·L-1，KH2PO4 5～15g·L-1，pH5～8。
本发明的第三个目的是提供上述重组毕赤酵母或其生产的人透明质酸酶在降解透明质酸中的应用，如制备成降解透明质酸的产品。
本发明的第四个目的是提供一种毕赤酵母组成型表达系统，所述表达系统包含携带PGCW14启动子与ost1-proα信号肽的目的基因、信号识别颗粒亚基Srp54p以及转录因子ScHAC1的一个或多个载体；其中，ost1-proα信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，信号识别颗粒亚基Srp54p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，转录因子ScHAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。该表达系统组成型表达目的基因，且能实现目的基因的高表达。
本发明的有益效果：
本发明中的重组载体PGCZα-rhPH20与pGCZoproα-rhPH-20在毕赤酵母宿主中成功实现rhPH-20活性分泌组成型表达。经过分泌途径改造的重组菌株OE54-ScHAC1相较对照重组菌GS115/PGCZα-rhPH20表达效率提升约1.1倍。该菌株在20～30℃条件下利用1.0～40％(v/v)甘油培养70～100h，摇瓶水平表达量为4.06U·mL-1，进一步在5-L发酵罐中扩大培养，培养96～120h，rhPH-20最高产量为19.82U·mL-1。且该表达为组成型，发酵产酶过程中无需添加诱导剂，既降低了生产成本，又避免了传统使用甲醇诱导剂所带来的的生产安全风险。
附图说明
图1为分泌表达优化重组菌株OE54-ScHAC1的构建流程与原理示意图；
图2为GS115/PGCZα-rhPH20重组菌株在摇瓶水平发酵的SDS-PAGE(a)及WB(b)分析；M：三色预染蛋白Marker，1：GS115阴性对照菌株发酵上清；2：GS115/PGCZα-rhPH20菌株发酵上清；
图3为产rhPH-20重组菌的信号肽优化流程图(a)及对应菌株的生长、分泌表达酶活情况(b)；
图4为用于共翻译转运途径强化的重组质粒结构示意图(a)及对应菌株的生长、分泌表达酶活情况(b)；
图5为在前一步改造基础上，进一步过表达不同来源的HAC1基因的重组表达载体结构示意图；
图6为过表达不同来源HAC1基因后对应重组菌的生长、分泌表达酶活情况(a)及产量最高菌株与改造前菌株的WB分析(b)；M：三色预染蛋白Marker，1：GS115/PGCZα-rhPH20菌株发酵上清；2：OE54-ScHAC1菌株发酵上清；
图7为过表达酿酒酵母HAC1基因后，重组菌未折叠蛋白响应与细胞压力相关基因(a)与rhPH-20编码基因(b)的表达强度变化；
图8为过表达酿酒酵母HAC1基因后，重组菌细胞内氧自由基水平(a)与氧化应激相关基因表达(b)的变化，以及外源添加氧自由基前体H2O2并培养72h后，重组菌OE54-ScHAC1细胞内氧自由基水平(c)以及其生长、分泌表达酶活水平(d)的变化；
图9为重组菌OE54-ScHAC1在5-L发酵罐补料分批发酵实验中的生长与产酶情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所涉及的材料与方法如下：
用于摇瓶发酵的培养基为：酵母粉10g·L-1，蛋白胨20g·L-1，YNB 13.4g·L-1，甘油10g·L-1，KH2PO4 11.8g·L-1，K2HPO4·3H2O 4g·L-1，生物素4×10-4g·L-1；
用于5-L发酵罐补料分批发酵的培养基为：酵母粉10g·L-1，蛋白胨20g·L-1，YNB13.4g·L-1，甘油40g·L-1，KH2PO4 11.8g·L-1，K2HPO4·3H2O 4g·L-1，生物素4×10-4g·L-1，调节pH 6.0；
甘油补料培养基：甘油50％(w/v)。
人透明质酸酶的酶活性测定方法：
酶活测定的反应体系由100μL反应缓冲液、50μL的2g·L-1透明质酸溶液以及50μL细菌培养上清液组成，在37℃下反应1h后，加入40μL的0.8M K2B4O7溶液，沸水浴3min并冰浴冷却。之后加入1.2mL冰醋酸稀释的DMAB溶液，37℃孵育20min。将孵育后的反应液转移至96孔细胞培养板，在585nm处测定吸光度，并将其代入乙酰氨基葡萄糖标准曲线计算酶活。1个酶活力单位(1U)的定义为：在37℃下，一分钟催化生成1nmol乙酰氨基葡萄糖当量所需要的酶量。
序列信息：
rhPH20的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，rhPH20的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子PGCW14的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
信号肽ost1-proα,msp的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-5所示；
Srp14p，Srp54p，Srp68p的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6-8所示；
ScHAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，PpHAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，hHAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
实施例1：重组载体pGCZα-rhPH20的构建
(1)重组载体pGAPZα-rhPH20的构建：以人基因组中编码的PH-20精子顶体蛋白的氨基酸序列为研究对象，根据PH-20的结构特点，选取截去N-端信号肽、C-端疏水锚定序列的第36-490位氨基酸序列，根据毕赤酵母宿主的密码子偏好性合成全长rhPH-20基因。该基因交由无锡天霖公司合成至pPIC9k载体中，以构建得到的pPIC9k-rhPH20为模板，带有同源臂的rhPH20-IF/R为上下游引物进行基因扩增；在EcoRⅠ/SalⅠ限制性内切酶作用下对表达载体pGAPZαA双酶切。对酶切与扩增产物进行纯化、回收，使用Gibson组装技术连接插入片段与线性化载体，并导入大肠杆菌JM109感受态细胞中，用带有Zeocin抗性的LB平板进行阳性转化子筛选，挑选菌落PCR、测序验证均正确的转化子进行培养并抽提重组质粒，得到pGAPZα-rhPH20。
其中扩增所用的上游和下游引物为：
rhPH20-IF：
5’-aggatcgagatctcgatcccgcgaaattggttttcaaatagatagacatatatttacatctaatatcgga-3’；
rhPH20-IR：
5’-tctagagggaaaccgttgtggtctcaggtctgctcaagccgtaat-3’
(2)重组载体pGCZα-rhPH20的构建：上述重组载体pGAPZα-rhPH20利用Promoter-VF/R引物进行扩增线性化，同时以GCW14-IF/R为引物，以P.pastoris GS115基因组为扩增模板，扩增内源启动子序列PGCW14。利用基于Gibson组装的同源重组酶ClonExpressⅡ将回收后的线性化载体与启动子序列扩增产物连接。
其中扩增所用的上游和下游引物为：
Promoter-VF:5’-atgaaattcttcctgctgcttctcc-3’；
Promoter-VR:5’-gagctccaatcaagcccaataactg-3’；
GCW14-IF:5’-attgggcttgattggagctctcaggtgaacccacctaactatttttaactgg-3’；
GCW14-IR:5’-cgacgatagagaattgcatttttgttgttgagtgaagcgagtgac-3’；
连接产物转化进入大肠杆菌JM109中克隆，经菌落PCR、测序等验证正确后进行培养并抽提重组质粒，得到pGCZα-rhPH20重组载体。
实施例2：重组菌GS115/pGCZα-rhPH20的构建及其发酵培养
(1)重组菌GS115/pGCZα-rhPH20的构建：重组质粒pGCZα-rhPH20经引物GCW14-XF/R扩增线性化，纯化回收后转移至电击杯，以2000mv，5ms电击一次，迅速加入1M D-山梨醇溶液重悬菌体，转移至离心管中。在30℃、220rpm复苏90min后涂布于含Zeocin的抗性YPD平板上筛选阳性转化子。将筛选平板上长出的阳性转化子转移至浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg·mL-1的Zeocin抗性平板上，挑选在各个浓度平板上长势均良好的菌株进行培养，提取基因组后进行PCR验证及测序验证，得到GS115/pGCZα-rhPH20重组菌。
其中扩增所用的上下游引物为：
GCW14-XF:5’-tcgcatcgagagcttcaggaaaaa-3’；
GCW14-XR:5’-tcgtatccgcgacaacttaaaacc-3’；
(2)重组菌摇瓶水平发酵：将上述重组菌划线活化后，挑取单菌落接种至10mL/50mL YPD培养基中，30℃、220rpm培养18h，以5％接种量接种至30mL/250mL摇瓶发酵培养基中培养24h，收集菌体并于4℃，5000rpm条件下离心10min，弃上清，将菌体重悬于新鲜的30mL/250mL摇瓶发酵培养基中，30℃、220rpm发酵培养72h。发酵过程中无需添加甲醇等诱导剂。
对发酵液上清取样浓缩并进行SDS-PAGE与western blot分析。SDS-PAGE结果表明在发酵72h后，GS115/pGCZα-rhPH20重组菌发酵上清中，在72kDa以上区域相较空白对照有明显蛋白积累(图2a)，提示目的蛋白存在糖基化导致的分子量迁移。利用western blot实验对目的蛋白进行验证，实验组100kDa以上区域出现目的条带显影(图2b)，验证了rhPH-20成功表达且糖基化修饰对蛋白表观分子量产生了影响。酶活检测表明重组菌GS115/pGCZα-rhPH20发酵上清中透明质酸酶活力为1.91U·mL-1。
实施例3：rhPH-20在毕赤酵母中分泌表达的信号肽优化
为提升rhPH-20在毕赤酵母GS115宿主中分泌表达的效率，在pGCZα-rhPH20基础上对信号肽进行适配性优化。选用不同来源或不同改造策略的9条信号肽(分别为ost1-proα，αΔ57-70，msp，dan4，dddk，nsB，PH-20自带的信号肽，hcrt，has)替换原有的MFα信号肽。按照实施例1中菌种方法分别构建9株信号肽替换重组菌(图3a)，摇瓶发酵72h。结果显示，9个信号肽替换菌株中，2个展现出了较出发菌株更高的产酶效率，其中ost1-proα信号肽(对应重组载体为pGCZoproα-rhPH-20)引导的rhPH-20分泌活性提升最高，约20％(图3b)。
实施例4：rhPH-20在毕赤酵母中分泌表达的分泌途径强化
(1)共翻译内质网转运途径的强化：这一途径由三个主要功能单位组成，分别是信号识别颗粒(Signal recognition particle,SRP)，SRP受体(SRP receptor，SR)与易位子(Translocon，又称Sec61复合体)，因此分别构建SR、易位子以及SRP中三个关键亚基(Srp14p，Srp54p，Srp68p)的过表达载体(图4a)，并在携带ost1-proα信号肽引导的rhPH-20表达重组菌(即携带实施例3构建的重组质粒pGCZoproα-rhPH-20，命名为Oproα)基础上进行过表达。
根据结果发现，过表达共翻译转运途径中不同蛋白的重组菌生长与分泌表达酶活情况有一定差异(图4b)。单独过表达SRP的三个关键亚基对分泌表达均有一定提升作用，其中过表达Srp54p效果最好，将分泌酶活水平提升约48％，达到约3.14U·mL-1；过表达Srp14p和Srp68p分别使分泌酶活提升29.7％与15.3％。过表达SR与易位子并没有明显促进rhPH-20的分泌表达。
(2)内质网未折叠蛋白响应的强化：为进一步强化宿主细胞分泌途径中对重组蛋白的翻译后修饰过程，在强化共翻译转运途径的Srp54p蛋白基础上，进一步过表达内质网未折叠蛋白响应(UPR)的转录因子Hac1p。分别选取来自毕赤酵母、酿酒酵母和人来源的HAC1基因构建过表达载体(图5)，转化至Oproα重组菌，通过摇瓶发酵测定生长与产酶情况。
结果表明，相较于仅过表达Srp54p的重组菌OE54，分别过表达毕赤酵母、酿酒酵母与人来源的HAC1基因均对rhPH-20的分泌表达有一定程度的促进作用，相较对照分别提升23％、31％与21％，其中过表达酿酒酵母来源ScHAC1的菌株分泌酶活达到约4.06U·mL-1(图6a)。通过western blot检测发现，分泌途径强化后的重组菌(命名为OE54-ScHAC1)发酵上清中的rhPH-20蛋白含量较改造前菌株明显提升，与酶活提升趋势一致。
(3)过表达酿酒酵母HAC1前后重组菌的表征：为了验证过表达转录因子ScHac1p对重组菌的影响，提取了过表达前后菌株的总RNA，以野生型P.pastoris GS115菌株为对照，检测UPR相关基因的激活情况(图7a)。结果表明，包括KAR2，PDI1，ERO1，HrD1在内的多个伴侣蛋白编码基因在表达ScHAC1后表达水平显著提升，同时反映内质网压力的HAC1基因与反映细胞压力的MSN2基因表达下调。与此同时，rhPH-20编码基因的表达水平没有明显变化(图7b)，推测过表达ScHAC1能够通过增强翻译后修饰相关基因的表达提升rhPH-20的分泌表达效率。
同时检测过表达ScHAC1前后，宿主细胞中ROS的变化。结果表明，过表达rhPH-20和Srp54p导致了细胞内ROS的显著积累，在此基础上共表达ScHAC1可将ROS水平显著降低至阴性对照的2倍左右(图8a)。通过RT-PCR对氧化应激下游基因的表达进行检测，发现三种与ROS分解代谢有关的蛋白SOD1、SOD2和过氧化氢酶的转录水平相较OE54菌株明显下调(图8b)。设计ROS回补实验，以OE54-ScHAC1为研究对象，向培养基中分别加入1mM，3mM，5mM终浓度的ROS前体H2O2并摇瓶培养72h使细胞内ROS水平回升(图8c)，检测发现随着H2O2浓度的提升，分泌表达酶活不断下降(图8d)。结果表明rhPH-20对ROS较为敏感，活性表达受外源加入ROS的影响较大，依此推测过表达ScHAC1造成的ROS水平下调可能在rhPH-20分泌效率提升中起到了一定保护作用。
实施例5：重组菌OE54-ScHAC1的补料分批发酵
通过补料分批发酵进一步提升重组菌OE54-ScHAC1的rhPH-20产量。在补料分批发酵策略中，重组菌在发酵的前24h内快速消耗培养基中碳源并快速生长，导致溶氧水平持续下降。在约20-24h时，由于碳源耗尽，溶氧出现迅速反弹，此时开始以2mL·L-1·h-1的流加速度补加碳源。补料分批发酵结果见图9。通过流加甘油，发酵罐内菌体干重在整个发酵周期内持续上升，细胞干重于136h达到51.15g·L-1。分泌表达的rhPH-20酶活也随菌体积累逐渐上升，直至120h达到峰值，约19.82U·mL-1。相较于摇瓶发酵最高水平，该策略下重组菌分泌表达酶活提升约4倍。该产量为截至目前文献报道酵母组成型表达rhPH-20的最高产量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母包括以下改造：过表达了人透明质酸酶，所述人透明质酸酶由PGCW14启动子启动表达，且由核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的信号肽调控表达。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母，其特征在于：所述毕赤酵母过表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.6-8任一项所示的信号识别颗粒亚基。
3.根据权利要求1所述的毕赤酵母，其特征在于：所述毕赤酵母过表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.9-11任一项所示的转录因子HAC1。
4.根据权利要求3或4所述的毕赤酵母，其特征在于：所述信号识别颗粒亚基或转录因子HAC1由PGAP启动子启动表达。
5.根据权利要求1所述的毕赤酵母，其特征在于：以毕赤酵母GS115、毕赤酵母KM71、毕赤酵母X33或毕赤酵母SMD116为出发菌株。
6.一种制备人透明质酸酶的方法，其特征在于：包括采用权利要求1-5任一项所述的毕赤酵母进行发酵生产的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的发酵为补料分批发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：补料分批发酵时，发酵至20-24h时流加甘油直至发酵结束。
9.权利要求1-5任一项所述的毕赤酵母或权利要求6-8任一项所述的方法制备的人透明质酸酶在降解透明质酸中的应用。
10.一种毕赤酵母组成型表达系统，其特征在于：所述表达系统包含携带PGCW14启动子与ost1-proα信号肽的目的基因、信号识别颗粒亚基Srp54p以及转录因子ScHAC1的一个或多个载体；其中，ost1-proα信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，信号识别颗粒亚基Srp54p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，转录因子ScHAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
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