CN114836495A - 利用烟酰胺发酵生产nmn的基因工程菌的构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用烟酰胺发酵生产NMN的基因工程菌的构建与应用。通过基因重组技术在酵母工程菌中引入了外源的Nampt基因，获得可生产NMN的酵母工程菌。并通过异源表达NiaP和PnuC蛋白提升了底物摄取和NMN产物外排。所述酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可利用烟酰胺发酵生产NMN等特征，为工业化生产NMN提供了新思路。

Description

利用烟酰胺发酵生产NMN的基因工程菌的构建与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及生产烟酰胺单核苷酸(NMN)的基因工程菌的构建与应用。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(NMN)是人体内自然存在的物质，在细胞内可转化为与人体新陈代谢相关的重要辅酶NAD⁺。研究证实细胞内NAD⁺含量会随着年龄的增加而减少，外源性补充NMN被认为具有强化人体细胞功能的作用。

目前NMN原料的生产方法主要有如下三种：

一是化学合成法。该法工艺简单、成本低，主要是通过化合物之间的反应来完成，需要用到多种有机溶剂作为媒介。对于化学合成工艺获得较纯的化合物在中国申请新食品原料原则上一般不予批准，因此不推荐使用化学合成法生产的NMN原料。

二是生物酶催化法。该工艺不借助微生物，而是通过特定的工程酶，以酶催化合成的方式来进行生产。此法产出的NMN原料纯度高、生产方式相对温和，整个过程缓慢、持久。生物酶催化法是目前比较通行的生产方式，但是门槛较高，几个关键催化酶价格不菲，约占整个生产过程成本的80％。

三是发酵法。借助微生物进行全细胞发酵生产。该法生成过程温和、绿色环保，不会引入重金属离子等，但目前生产效率低下、发酵过程复杂，原料成本较高，使高效率的工业规模化生产受限。在一些表达体系中，由于表达效率的限制，表达酶之后还需要进行细胞收集浓缩、之后再添加底物进行催化合成(发酵和酶催化相结合的生产方法)，导致生产过程复杂、易受污染。

尽管毕赤酵母已经被应用于一些目标产物的生产发酵，但鉴于不同工程细胞的胞内机理机制的不同，对于NMN这一产物而言，其生产需要胞内多种蛋白/酶的作用，毕赤酵母的胞内体系中是否存在兼容/配合其成功生产的途径尚未知晓，在本领域中还没有成功实现NMN的毕赤酵母细胞生产。

综上，本领域还需要丰富NMN的生产方法，优化NMN的生产工艺，以期提高生产效率以及降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供利用烟酰胺作为底物发酵生产NMN的基因工程菌的构建与应用。

在本发明的第一方面，提供一种生产烟酰胺单核苷酸(NMN)的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有下组基因的表达盒：NiaP，PnuC以及Nampt；所述Nampt选自Nampt3、Nampt2或Nampt1；(2)培养(1)的酵母工程菌，添加烟酰胺(Nam)作为底物生成烟酰胺单核苷酸产物，收获产物。

在一种或多种实施方式中，所述酵母工程菌中，所述Nampt优选Nampt3，从而提高烟酰胺单核苷酸(NMN)的产量。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，培养(1)的酵母工程菌后，直接添加烟酰胺作为底物生成烟酰胺单核苷酸产物。

在一种或多种实施方式中，培养(1)的酵母工程菌后，不包括进行细胞收集和/或浓缩的步骤，直接添加底物和进行产物的生产。

在一种或多种实施方式中，所述的表达盒中还包括启动子，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子或甲醇诱导型启动子；较佳地，所述的组成型启动子包括(但不限于)GAP启动子；较佳地，所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于)：AOX1启动。

在一种或多种实施方式中，所述的培养酵母工程菌所用的培养基包括(但不限于)：YPD、YPG、YPM培养基。

在一种或多种实施方式中，在培养过程中，补加葡萄糖；较佳地，间隔补加或流加葡萄糖；更佳地，所述间隔补加包括：发酵过程中每12～36h(如15、18、20、22、24、28、32h)向液体培养基中添加1～5％(如1.5％、2％、2.5％、3％、4％)(m/v)的葡萄糖。

在一种或多种实施方式中，底物的添加量为5～20g/L，较佳地7～15g/L，更佳地8～12g/L(如9、10、11g/L)。

在一种或多种实施方式中，培养基pH 5.8～6.6，较佳地pH6.0～6.4，更佳地pH6.1～6.3(如pH6.2)。

在一种或多种实施方式中，于30±2℃(如28、29、30、31、32℃)、转速200±50r/min(如200±40r/min、200±30r/min、200±20r/min或200±10r/min)培养；较佳地培养1.5～10天(如2、3、4、5、6、8天)。

在一种或多种实施方式中，所述的酵母工程菌是毕赤酵母(Pichia pastoris)；较佳地，所述的毕赤酵母是毕赤酵母GS115或Δku70。

在本发明的另一方面，提供一种利用烟酰胺生产烟酰胺单核苷酸的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：NiaP，PnuC以及Nampt；所述Nampt选自Nampt3、Nampt2或Nampt1。

在本发明的另一方面，提供所述的酵母工程菌的应用，用于以烟酰胺为底物生产烟酰胺单核苷酸。

在一种或多种实施方式中，所述的NiaP基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:2序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一种或多种实施方式中，所述的PnuC基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:3序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一种或多种实施方式中，所述的Nampt3基因具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一种或多种实施方式中，所述的Nampt2基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在一种或多种实施方式中，所述的Nampt1基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种基因组合的用途，所述的基因组合包括下组基因：NiaP，PnuC以及Nampt；所述Nampt选自Nampt3、Nampt2或Nampt1；该基因组合用于转化酵母工程菌，以烟酰胺为底物生产烟酰胺单核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产烟酰胺单核苷酸的试剂盒，所述的试剂盒中包括所述的酵母工程菌。

在一种或多种实施方式中，所述的用于生产烟酰胺单核苷酸的试剂盒中，所述的试剂盒中还包含：培养酵母工程菌所用的培养基；较佳地包括(但不限于)：YPD、YPG、YPM培养基；葡萄糖；和/或烟酰胺。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、烟酰胺(Niacinamide，Nam)和NMN标品液相图。

图2、Δku70、Δku70-Nampt1、Δku70-Nampt2、Δku70-Nampt3、Δku70-Nampt1-NiaP-PnuC、Δku70-Nampt2-NiaP-PnuC、Δku70-Nampt3-NiaP-PnuC七个菌株在添加烟酰胺为底物的条件下，在发酵48h后检测发酵液中的NMN产量。

图3、烟酰胺Nam经NiaP蛋白转运进入细胞，然后在Nampt酶的催化下生成NMN，最后生成的NMN经PnuC蛋白转运至胞外；整个反应过程为全细胞合成终产物。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过基因重组技术在酵母工程菌株中引入了外源基因，获得可利用烟酰胺为底物发酵生产NMN的酵母工程菌。本发明制备的酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可全细胞合成终产物以及终产物易分离且副产物少等特征，为工业化生产NMN提供了新思路。

术语

如本文所用，所述的“全细胞合成终产物”是指产物的生产过程与发酵过程同时进行、或前后紧密连接；其不同于发酵后需进行细胞收集和/或浓缩(发酵液)、继而进行酶催化底物及生产产物的过程(为发酵和酶催化相结合的生产方法)。

如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“表达构建物”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

基因及其表达系统

本发明中，通过在酵母工程菌中引入外源基因、结合运用酵母细胞的胞内体系来实现利用烟酰胺在酵母工程菌中高效生产NMN。在优选的方式中，以毕赤酵母为底盘细胞，通过菌株的代谢工程改造，实现酵母细胞高效发酵合成NMN。

本发明中，引入的外源基因包括：NiaP(SEQ ID NO:2)，PnuC(SEQ ID NO:3)以及Nampt；所述Nampt选自Nampt3(SEQ ID NO:5)、Nampt2(SEQ ID NO:4)或Nampt1(SEQ ID NO:1)。在最为优选的方式中，所述Nampt为Nampt3，其生产效率相对最高。

在本发明中，上述的基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来获得所述的基因，或者通过人工合成的方法来获得所述的基因。

上述的基因的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1～5所示的相应序列相同，也可以是它们的简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有同功能的蛋白质，但与选自SEQ ID NO:1～5所示的相应序列有差别的核酸序列。

所述的基因可以包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及所述的基因的变异体，其编码的多肽与其相应的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的片段、类似物或衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与相应的野生型多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，虽然本发明的各基因优选获自酿酒酵母和毕赤酵母，但是获自其它微生物的与酿酒酵母和毕赤酵母中相应的基因高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的各基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，各基因的序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

各基因的序列可以分别插入到重组表达载体中，多个重组表达载体共转宿主细胞；多个基因的表达盒也可以以串联的方式插入到同一重组表达载体中，转入宿主细胞。所述的重组表达载体还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。应理解，在本领域人员了解了本发明的技术内容后，可以方便地构建重组表达载体。获得的重组表达载体也包含在本发明中。

表达调控序列或表达盒中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。

作为本发明的优选方式，提供了一种表达载体(表达构建物)其包括以下基因的表达盒：Nampt1；还提供了一种表达载体(表达构建物)其包括以下基因的表达盒：NiaP；并且还提供了一种表达载体(表达构建物)其包括以下基因的表达盒：PnuC；还提供了一种表达载体(表达构建物)其包括以下基因的表达盒：Nampt2；还提供了一种表达载体(表达构建物)其包括以下基因的表达盒：Nampt3。

表达载体(表达构建物)的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此，在得知了所需选择的基因之后，本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达构建物中，只要在转入到细胞后其编码的多肽能够被有效地表达和发挥活性即可。作为本发明的优选方式，所述的表达载体是pGAPZB，pPIC 3.5K和pAG32。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明中，所述的宿主细胞优选的是酵母工程菌，更优选的是毕赤酵母，如毕赤酵母Δku70、GS115。其中，最优选的毕赤酵母为Δku70。对于本发明所表达的外源基因而言，Δku70工程菌是非常适用的，同源重组效率高，菌株的构建效率高。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，培养中所用的培养基可以是本领域熟知的酵母培养基。在适于酵母细胞生长的条件下进行培养。

本发明通过基因重组技术获得的重组毕赤酵母菌株具有代谢背景低、异源表达能力强，可全细胞合成终产物以及终产物易分离且副产物少等特征，将在很大程度上解决传统生物、化学方法合成存在的问题，为工业化生产NMN药物提供新思路。

合成NMN的方法

本发明公开一种利用毕赤酵母合成生产NMN的方法。所述方法包括：将三种基因(Nampt1，NiaP，PnuC)转化酵母工程菌，从而生产NMN。或者，将三种基因(Nampt2，NiaP，PnuC)转化酵母工程菌，从而生产NMN。或者，将三种基因(Nampt3，NiaP，PnuC)转化酵母工程菌，从而生产NMN。具体方法如图3所示，烟酰胺Nam经NiaP蛋白转运进入细胞；然后在Nampt酶的催化下生成NMN；最后生成的NMN经PnuC蛋白转运至胞外；整个反应过程为全细胞合成终产物。

重组酵母工程菌的发酵培养可以采用本领域已知的酵母发酵方法，一种较为优选的方法是：于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体1OD接种至含有烟酰胺的YPD培养基，于30℃、转速200r/min培养48h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％的葡萄糖。

在获得了发酵产物后，从发酵产物中提取NMN可以采用本发明已知的技术。可以采用高效液相色谱来对产物进行分析检测，以确定获得了所需的化合物及产物的量。

本发明运用重组毕赤酵母生产NMN，不仅解决了生物发酵法底物难以转运到细胞内，酶法不稳定等问题，也避免了化学合成法中副产物多、纯化困难、环境污染大等不利因素，为工业生产NMN开辟了新途径。因此，本发明的重组毕赤酵母菌株具备工业化生产NMN的能力。

本发明实现了利用重组酵母菌以烟酰胺为底物进行全细胞生物合成NMN的技术突破，为生产NMN提供了新途径。

毕赤酵母作为FDA认可的GRAS菌株，可被应用于医药和食品领域等，具有安全性高的优点。本发明所建立的重组酵母工程菌具有发酵密度高、表达量高、调控严格的优点；同时，本发明的生产方法操作简单、效率高、酶表达量高，外源基因得到正确翻译和翻译后加工与修饰。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

质粒构建方法应用诺唯赞生物科技公司的无缝克隆试剂盒。

所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达：质粒pGAPZB、大肠杆菌Top10，均购自Invitrogen公司。Nampt1、Nampt2、Nampt3、NiaP和PnuC基因由金唯智生物科技有限公司合成。Δku70、pDGG-PFg1、pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1参见Liu Q,Shi X,Song L,Liu H,Zhou X,Wang Q,Zhang Y,Cai M.CRISPR-Cas9-mediated genomic multilociintegration in Pichia pastoris.Microbial Cell Factories.2019,18:144。本发明所用到的引物序列如表1所示。

表1、所用引物序列

培养基

YPD液体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

YPD固体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，琼脂20.0g/L；

YPM液体培养基：甲醇10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

MGY培养基：10.0g/L甘油，0.67％YNB，琼脂20.0g/L。

配制以上培养基时，葡萄糖115℃高压灭菌20min，甲醇在使用时添加。其它成分121℃高压灭菌20min。

序列信息

SEQ ID NO:1(Nampt1)

ATGGATAGCTTACTAAATCACTACTCTCGAGCAAGTGCCATTCCATCCCTATTGTGCGACTTTTATAAAACGTCGCATCGGATCATGTATCCCGAGGGATCCCAGATCATCTATAGTACGTTTACGCCTCGTAGTAACGAACAAGCACCGTATCTTACTCAAGTTGTCAGCTTCGGTTTTCAGGCTTTTATTATAAAATACCTTATCCATTATTTTAACGACAATTTTTTTTCACGCGATAAGCATGATGTCGTAACAGAATATTCGGCTTTTATCGAAAAGACATTACAACTGGAGGATACGGGAGAGCACATAGCAAAGCTCCACGAATTAGGATACCTCCCCATTCGCATTAAAGCCATACCGGAAGGGAAGACTGTAGCGATCAAAGTTCCGGTGATGACCATAGAGAACACTCACCCTGACTTTTGCTGGTTAACAAACTACCTGGAGACGCTTATAAATGTATCTCTTTGGCAACCAATGACTTCAGCCTCAATCGCCTTTGCGTATCGTACCGCTTTAATTAAATTCGCGAACGAGACTTGCGACAATCAGGAGCATGTCCCCTTCCAATCACATGACTTCTCCATGAGGGGCATGTCTAGCCTCGAATCGGCGGAAACCTCCGGGGCGGGCCATTTAACATCGTTTCTTGGTACTGATACGATCCCTGCATTGTCTTTCGTTGAGGCTTACTATGGGTCCTCAAGCCTAATTGGGACCAGTATACCTGCCTCGGAGCATTCCGTGATGAGTTCCCACGGTGTGGACGAACTGAGTACATTCAGGTACTTGATGGCTAAATTCCCAAACAGCATGCTCTCGATCGTCTCTGACACTACGGATTTCTGGCACAATATAACCGTGAACCTCCCTCTACTGAAGCAAGAGATTATAGCACGTCCAGAGAATGCGCGGCTAGTCATACGACCGGATTCTGGTAACTTTTTCGCCATCATCTGTGGCGATCCCACCGCTGACACGGAACACGAGAGGAAAGGCCTAATAGAATGTTTGTGGGACATTTTCGGTGGCACCGTGAACCAAAAGGGATACAAGGTGATAAATCCACACATTGGAGCAATATACGGGGATGGGGTAACATACGAAAAAATGGTTAAGATTTTAGAAGGTTTGAAAGCAAAAGGCTTTGCGAGTTCAAATATCGTATTCGGAGTTGGAGCCCAGACTTATCAGAGAAATACCCGAGATACGCTCGGTTTCGCATTAAAAGCTACTTCAATTACAATCAATGGGGAAGAGAAGGCGATTTTCAAAAATCCGAAAACTGACAATGGGCTTAAGAAGAGCCAAAAAGGAAGAGTCAAGTTACTCTCGTATGACACATACCTAGACGGTTTGACCGCTAAGGACGATTTCTCTGATGATTTGTTGGAACTTCTGTTTGAGAACGGCAAGCTACTGAGACGGACAGACTTTGATCAGATTCGCCAGAACCTGGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA

SEQ ID NO:2(NiaP)

ATGCCGGCAGCAACCGCCCCGGCGTCGGCTGCGGCGCGCCTGGAGCGCCTGCCTTTCTCTGGCTACCATAAACGAATATTTTTCATCATAGCCATTGCGTTCTTCTTCGACTCGGTTGATTTAGGTACTATGACCTTTGTGCTAGGTAGCATACGGAAGGAGTTTGGTTTATCAACAGCCGCAGCCGGCCTTGTTGCGTCTGCTTCCTTTTTCGGAATGGTGCTAGGAGCTGCCGTGGCCGGTCTCCTAGCTGATAGATTTGGTCGCAGACCAGTATTCCAATGGTCGATGGTCCTGTGGGGCGCCGCGTCCTATCTTTGCAGTACTGCCCAATCGGTTGATGCTTTGATCGTTTATCGAGTGTTATTGGGTATTGGCATGGGGATGGAGTTTCCCGTAGCACAAACCCTTCTATCCGAATTTGTTCCAACCGAGAAGCGTGGACGATTAATAGCTCTTATGGATGGGTTCTGGCCCCTGGGTTTTATCACCGCGGGGATCGTCGCGTATTTTGTACTGCCGCAGTTCGGGTGGCGGACTGTATTTGCTTTATTGGCGATACCAGCCGTCTTTGTACTTGTGGTGCGACGAATTGTCCCAGAGAGTCCTCGTTGGCTAGAACATGCCGGCCGTCACGCCGAAGCAGACACTGTAATGCACACCATTGAAGCAAAAGTGATGCGTAGCGCAGGAGTAACTACTTTGCCGCCACCTTCAAGGCTAGCAGAGCCTGCTGCTGCAAGAGGCAGAGGGGCGCTCAGGGAAATCTGGAGCGGAGTATACCGTAGGCGGACAGTCATGGTGTGGCTGTTGTGGTTTTTCGCTCTCTTAGGTTTTTATGGTCTTACGAGTTGGCTCGGGGCCCTCTTACAACAGGCCGGGTTCGAAGTCACAAAGTCAGTCTTCTATACGGTACTTATCAGTCTAGGCGGTGTTCCTGGGTTCCTCTGTGCGGCTTGGCTAGTTGAGAGATGGGGACGGAAACCCACGTGCATTGCTTCTCTCATCGGTGGCGGGGCAATGGCATACGCCTACGGTCAGAGCGCGCTTTACGGAGGCAGTACTACATTGTTAATAGTGACGGGTTTGGCTATGCAGTTTTTTTTATTCGGGATGTGGGCGGCCCTGTACACATACACGCCCGAGCTGTATGGGACAGGGGCCAGGGCGACCGGATCTGGGTTTGCGTCAGCTATTGGTCGGGTTGGATCACTGATTGGACCCTACGTTGTCGGCGTAGTGTTGCCAGTTTTCGGCCAAGGAGGGGTCTTTACGTTAGGAGCACTGTCCTTCGTCGCAGCGGCAATCGCTGTGTGGACCCTCGGCATAGAAACAAAGGGCTTGGCGCTCGAACAGCTTGCTGCGGGTGACGATGCCGGCGGGAACGGACGCTATCCGGCAACGGCAGCAGATAAAGCTAGCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA

SEQ ID NO:3(PnuC)

ATGGTGCGCTCACCCCTTTTTTTGTTAATATCCTCGATCATATGCATCCTAGTGGGCTTTTATATCCGCAGCTCATATATTGAAATTTTTGCGAGTGTAATGGGAATCATAAACGTCTGGCTATTAGCACGGGAGAAGGTTTCGAACTTTCTCTTCGGGATGATTACTGTTGCAGTCTTCCTATATATCTTCACGACACAAGGTTTATATGCTATGGCTGTACTGGCGGCTTTTCAGTTCATATTTAATGTTTATGGTTGGTACTACTGGATAGCCCGTTCCGGTGAGGAAAAGGTTAAACCTACGGTCCGGCTTGATCTTAAGGGGTGGATAATTTACATACTCTTCATTCTAGTAGCCTGGATTGGGTGGGGCTACTATCAAGTGAGATACCTCGAAAGCACCAATCCGTATCTCGACGCATTAAACGCAGTTTTGGGATTGGTGGCCCAGTTCATGCTTAGTCGAAAAATTTTAGAAAACTGGCACCTTTGGATATTGTACAACATCGTCTCTATTGTCATTTACATTTCTACCGGCCTGTACGTAATGCTGGTGCTAGCGATCATCAATCTGTTTCTCTGTATAGACGGATTGCTGGAGTGGAAGAAAAATCATAAAGAAAGGGAGAGGGTAAATAACTATATCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA

SEQ ID NO:4(Nampt2)

ATGACAAAGGAGAACCTCATACTGCTGGCTGATGCCTATAAGTACTCACATCACAAATTGTACATCCCCGGAACTGAATATATTTACTCCTATTTTGAGTCGAGGGGGGGGAAATTCAATGAAACGGTCTTCTACGGTCTTCAATACTTTTTAATGGAATATCTCCAAGGAGCAGTGATTACCAAGGAGAAGCTTGATGAGGCGGAGGCAACTTTGTTGGAGGTTTTTGGCCGAAATGACGTGTTTGATCGCACGAGGTTTGAATATATTATCGAAAAGCATGGGGGACGCCTGCCGGTGCGCATTAAAGCTGTCCCCGAGGGGACCGTTACAGGTGTCCGCAACGTGCTGATGACTATAGAAAATACTGACCCTAACTGTTACTGGGTGACCAACTTCCTCGAGACGCTTTTAATGCAAATCTGGTACCCCTGCACGGTGGCGACGTTGAGCCGTGAGATCAAAAAAACTGTAAAACAATACTATAACGAGACAGCTTCGGAGGCCGCTTTCGCGGGCATTGACTTTGTTCTAAACGATTTTGGCTTCCGTGGCGCGTCCTCTGTAGAATCCGCCGGTATCGGCGGCTCGGCACACCTAATAAATTTCTCAGGGAGCGACACGCTAATCGGAAGTACCTTCGCTAAGCGTTACTATCAGGCCCCGGTGGCGCCTGGTCTGAGTATCCCCGCGACCGAACATTCTATTGTAACAATGCTCGGAGAGGAAGGCGAATTAGAAATTTTCCGGCACATTCTAAACGCTTTTCCTACTGGAACAATAGCTTGTGTCAGTGATTCATATAACATCTTACGGGCCTGCAGAGAGTATTGGGGTACCGAACTCAAAGAACAGATACTCAGCCGACAAGGAACCCTCGTCATAAGGCCAGACTCGGGGGATGCTATTCAGACATTGTTAAAGGTTTTCGAGATACTGATGGAGACGTTTGGGTATACTGTTAACGAGAAAGGTTACAAAGTACTACCTCCACAAGTTCGAGTCATCCAGGGGGACGGTATATCTTACTCAAGTATACCACCGATCTTTGAGGCATTGAAACAGGCCGGAATATCAGCAGAGAATCTTGTACTTGGGATGGGAGGTGCGCTACTTCAGAGGGTGAATCGGGATACGCAGGAATATGCCCTAAAGTGTAGTTTCGCACAGGTAAACGGCAAGGCAATTAATGTCCAAAAGAACCCGTTAGAACTTGACGCAAACGGGAATACTAGAGTATCTTTTAAGAAAAGCAAATCTGGTAAACAAAAGCTAGTAGTTGAAAATGGTATCTACACCTCGTTGCCAGAAAATGAGGCGCCTGCCCTGGCGGATCAACTGGTCACAGTTTTTGAAGACGGCGAGATTAAAAAGGCTTATAGCTTCGAACAGATAAGAAAAAATGCAACAATTGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA

SEQ ID NO:5(Nampt3)

ATGAATGCTGCGGCAGAAGCTGAATTTAATATACTTTTAGCTACAGACTCATACAAAGTAACACACTACAAACAATATCCACCTAACACGAGTAAAGTTTATTCATATTTCGAATGCCGAGAGAAAAAAACAGAGAACAGCAAGGTACGTAAGGTCAAATATGAAGAGACAGTTTTCTATGGTCTGCAATACATACTGAACAAGTACCTTAAAGGTAAGGTAGTTACTAAAGAGAAGATTCAAGAGGCTAAAGAAGTCTATAGAGAGCACTTTCAGGACGACGTTTTCAATGAACGGGGGTGGAATTATATTCTCGAAAAGTATGACGGACACCTGCCGATAGAGGTCAAAGCCGTACCCGAAGGAAGTGTCATCCCTCGTGGTAACGTTCTCTTCACAGTAGAAAACACAGACCCTGAATGTTATTGGCTCACTAATTGGATAGAAACGATTCTCGTCCAATCGTGGTATCCTATTACAGTCGCGACCAATAGCAGAGAACAAAAGAAGATTCTTGCCAAATACTTACTGGAGACTTCCGGCAATTTAGATGGTCTAGAGTACAAACTACATGATTTCGGCTACCGCGGCGTGAGTTCTCAGGAAACTGCAGGGATCGGGGCCAGTGCACATCTAGTAAACTTCAAAGGGACGGACACCGTAGCAGGTATCGCCTTAATAAAGAAATATTACGGTACTAAGGACCCAGTTCCGGGTTACTCTGTGCCGGCTGCGGAGCACTCGACCATTACCGCGTGGGGAAAAGATCACGAAAAGGATGCGTTCGAGCACATTGTGACCCAGTTTTCATCTGTACCAGTTAGCGTAGTCAGTGATTCTTACGATATCTACAACGCTTGTGAGAAAATCTGGGGTGAGGATTTGAGGCATCTAATAGTGAGTCGCTCGACCGAAGCCCCGTTGATAATTCGTCCCGATTCCGGGAACCCTTTGGACACGGTTCTGAAGGTGTTAGACATTCTCGGAAAAAAATTTCCCGTGACGGAGAATAGCAAGGGGTATAAACTCTTACCGCCATACCTGCGAGTCATACAGGGAGATGGAGTCGATATAAACACGTTGCAAGAGATCCTAGAAGGCATGAAACAGAAGAAATGGTCCATCGAGAACGTATCATTTGGATCCGGCGGGGCCTTGTTACAGAAGCTAACTCGGGACCTGCTTAATTGTAGCTTCAAGTGCTCATACGTTGTGACCAATGGTTTAGGTGTGAATGTTTTTAAGGACCCAGTGGCTGACCCCAATAAGAGATCGAAAAAGGGACGACTCTCCCTTCATCGCACTCCCGCAGGCAATTTTGTGACCCTGGAAGAGGGCAAGGGCGATCTTGAAGAGTATGGTCATGATTTGCTTCATACGGTGTTTAAGAATGGTAAGGTCACTAAGTCGTATTCTTTTGATGAGGTCCGTAAAAACGCACAACTTAACATCGAACAGGACGTAGCGCCGCACAAATTGGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA

实施例1、表达质粒的构建

1、Nampt1基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以合成的Nampt1基因为模板、分别以HD-F和HD-R为引物扩增Nampt1基因片段，以SalI和EcoRI酶切pGAPZB质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为pGAPZB-Nampt1。

以pGAPZB-Nampt1质粒为模板、分别以Fg1up-F和Fg1do-R为引物扩增Nampt1表达盒(扩增产物含GAP启动子)，以SpeI和ApaI酶切pDGG-PFg1质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt1。

2、NiaP基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以合成的NiaP基因为模板、分别以NiaP-F和NiaP-R为引物扩增NiaP基因片段，以SalI和EcoRI酶切pGAPZB质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为pGAPZB-NiaP。

以pGAPZB-NiaP为模板、分别以AGAP-F和Fg1do-R为引物扩增NiaP表达盒(扩增产物含GAP启动子)，以ApaI酶切Fg1-Nampt1质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt1-NiaP。

3、PnuC基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以合成的PnuC基因为模板、分别以PnuC-F和PnuC-R为引物扩增PnuC基因片段，以SalI和EcoRI酶切pGAPZB质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为pGAPZB-PnuC。

以pGAPZB-PnuC为模板、分别以AGAP-F和Fg1do-R为引物扩增NiaP表达盒(扩增产物含GAP启动子)，以ApaI酶切Fg1-Nampt1-NiaP质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt1-NiaP-PnuC。

4、Nampt2基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以合成的Nampt2基因为模板、分别以CP-F和CP-R为引物扩增Nampt2基因片段，以SalI和EcoRI酶切pGAPZB质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为pGAPZB-Nampt2。

以pGAPZB-Nampt2为模板、分别以Fg1up-F和Fg1do-R为引物扩增Nampt2表达盒(扩增产物含GAP启动子)，以SpeI和ApaI酶切pDGG-PFg1质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt2。

以Fg1-Nampt2为模板、分别以AGAP-F和Fg1do-R为引物扩增NiaP表达盒，以ApaI酶切Fg1-Nampt2质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt2-NiaP。

以Fg1-Nampt2-NiaP为模板、分别以AGAP-F和Fg1do-R为引物扩增NiaP表达盒，以ApaI酶切Fg1-Nampt2-NiaP质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt2-NiaP-PnuC。

5、Nampt3基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以合成的Nampt3基因为模板、分别以MM-F和MM-R为引物扩增Nampt3基因片段，以SalI和EcoRI酶切pGAPZB质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为pGAPZB-Nampt3。

以pGAPZB-Nampt3为模板、分别以Fg1up-F和Fg1do-R为引物扩增Nampt-MM表达盒，以SpeI和ApaI酶切pDGG-PFg1质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt3。

以Fg1-Nampt3为模板、分别以AGAP-F和Fg1do-R为引物扩增NiaP表达盒，以ApaI酶切Fg1-Nampt3质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt3-NiaP。

以Fg1-Nampt3-NiaP为模板、分别以AGAP-F和Fg1do-R为引物扩增NiaP表达盒，以ApaI酶切Fg1-Nampt3-NiaP质粒，通过无缝克隆试剂盒将两个片段进行组装，得到的重组质粒为Fg1-Nampt3-NiaP-PnuC。

实施例2、电转毕赤酵母及菌株的构建

本发明人发现，对于所需表达的外源基因而言，Δku70工程菌是非常适用的，其同源重组效率高，菌株的构建效率高。故以下运用该工程菌进行构建。

1、Δku70-Nampt1菌株构建

以Fg1-Nampt1质粒模板，使用引物HAPFg1UP-F和HAPFg1DO-R扩增得到供体片段，然后将扩增得到的供体片段和pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒共转入Δku70感受态细胞。涂布YND平板进行转化子的筛选，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后涂布于YND平板，在YND平板上不能生长即证明pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒已经丢失，得到的菌株即为Δku70-Nampt1。

2、Δku70-Nampt1-NiaP-PnuC菌株构建

以Fg1-Nampt1-NiaP-PnuC质粒模板，使用引物HAPFg1UP-F和HAPFg1DO-R扩增得到供体片段，然后将扩增得到的供体片段和pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒共转入Δku70感受态细胞。涂布YND平板进行转化子的筛选，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后涂布于YND平板，在YND平板上不能生长即证明pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒已经丢失，得到的菌株即为Δku70-Nampt1-NiaP-PnuC。

3、Δku70-Nampt2菌株构建

以Fg1-Nampt2质粒模板，使用引物HAPFg1UP-F和HAPFg1DO-R扩增得到供体片段，然后将扩增得到的供体片段和pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒共转入Δku70感受态细胞。涂布YND平板进行转化子的筛选，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后涂布于YND平板，在YND平板上不能生长即证明pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒已经丢失，得到的菌株即为Δku70-Nampt2。

4、Δku70-Nampt2-NiaP-PnuC菌株构建

以Fg1-Nampt2-NiaP-PnuC质粒模板，使用引物HAPFg1UP-F和HAPFg1DO-R扩增得到供体片段，然后将扩增得到的供体片段和pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒共转入Δku70感受态细胞。涂布YND平板进行转化子的筛选，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后涂布于YND平板，在YND平板上不能生长即证明pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒已经丢失，得到的菌株即为Δku70-Nampt2-NiaP-PnuC。

5、Δku70-Nampt3菌株构建

以Fg1-Nampt3质粒模板，使用引物HAPFg1UP-F和HAPFg1DO-R扩增得到供体片段，然后将扩增得到的供体片段和pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒共转入Δku70感受态细胞。涂布YND平板进行转化子的筛选，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后涂布于YND平板，在YND平板上不能生长即证明pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒已经丢失，得到的菌株即为Δku70-Nampt3。

6、Δku70-Nampt3-NiaP-PnuC菌株构建

以Fg1-Nampt3-NiaP-PnuC质粒模板，使用引物HAPFg1UP-F和HAPFg1DO-R扩增得到供体片段，然后将扩增得到的供体片段和pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒共转入Δku70感受态细胞。涂布YND平板进行转化子的筛选，筛选到基因缺失的正确转化子后，将正确转化子在YPD液体培养基培养两天进行pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒丢失，然后在YPD平板上划线并挑取单菌落。将挑选的单菌落在YPD液体培养基培养后涂布于YND平板，在YND平板上不能生长即证明pPIC3.5K-PFLDup-gRNA1质粒已经丢失，得到的菌株即为Δku70-Nampt3-NiaP-PnuC。

实施例3、重组工程菌发酵及产物鉴定

1、重组工程菌摇瓶发酵工艺及产物定量分析

于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体重悬后1OD/mL接种至装有100mL YPD液体培养基(添加烟酰胺10g/L、pH6.2磷酸盐缓冲对)的250mL锥形瓶中(OD值为酵母菌浓单位，1OD约为5x10⁷个酵母细胞。OD值由紫外分光光度计于600nm波长测得)，于30℃、转速200r/min培养48h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％(m/v)的葡萄糖。

2、重组菌株发酵产物的鉴定

经发酵培养后的发酵液，取1mL发酵液12000rpm离心5min，取上清并用0.22μm的滤膜过滤后用于高效液相色谱(HPLC)分析。

高效液相色谱法分析，由反向高效液相色谱Agilent 1100完成，色谱柱使用C18柱，柱温：30℃。流动相：A，50mM磷酸二氢钾；B，乙腈。流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：10μL。洗脱条件如表2。

表2、液相洗脱条件

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	96	4
4	80	20
			5	80	20
6	96	4
			15	96	4

烟酰胺和NMN标品峰如图1。

实施例4、工程菌株以烟酰胺为底物发酵生产的产物产量

根据实施例3的方法进行发酵。由图2可知Δku70-Nampt1、Δku70-Nampt2、Δku70-Nampt3菌株相对于Δku70菌株产量明显增加，可知在Δku70菌株中过表达Nampt1、Nampt2、Nampt3可以促进烟酰胺碱向产物的转化。而Δku70-Nampt1-NiaP-PnuC、Δku70-Nampt2-NiaP-PnuC、Δku70-Nampt3-NiaP-PnuC菌株相对于Δku70-Nampt1、Δku70-Nampt2、Δku70-Nampt3菌株产量进一步提升。

上述结果说明，在Δku70-Nampt1、Δku70-Nampt2、Δku70-Nampt3菌株中过表达NiaP和PnuC促进了烟酰胺向细胞内的转运以及产物NMN向胞外的转运。

同时，根据图2也可知，在ku70菌株中，Nampt3的作用效果最为理想，其与Nampt1或Nampt2相比，产量高出约5％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

序列表

<110> 蓝色光钥(上海)智能科技有限公司

<120> 利用烟酰胺发酵生产NMN的基因工程菌的构建与应用

<130> 223517

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggatagct tactaaatca ctactctcga gcaagtgcca ttccatccct attgtgcgac 60

ttttataaaa cgtcgcatcg gatcatgtat cccgagggat cccagatcat ctatagtacg 120

tttacgcctc gtagtaacga acaagcaccg tatcttactc aagttgtcag cttcggtttt 180

caggctttta ttataaaata ccttatccat tattttaacg acaatttttt ttcacgcgat 240

aagcatgatg tcgtaacaga atattcggct tttatcgaaa agacattaca actggaggat 300

acgggagagc acatagcaaa gctccacgaa ttaggatacc tccccattcg cattaaagcc 360

ataccggaag ggaagactgt agcgatcaaa gttccggtga tgaccataga gaacactcac 420

cctgactttt gctggttaac aaactacctg gagacgctta taaatgtatc tctttggcaa 480

ccaatgactt cagcctcaat cgcctttgcg tatcgtaccg ctttaattaa attcgcgaac 540

gagacttgcg acaatcagga gcatgtcccc ttccaatcac atgacttctc catgaggggc 600

atgtctagcc tcgaatcggc ggaaacctcc ggggcgggcc atttaacatc gtttcttggt 660

actgatacga tccctgcatt gtctttcgtt gaggcttact atgggtcctc aagcctaatt 720

gggaccagta tacctgcctc ggagcattcc gtgatgagtt cccacggtgt ggacgaactg 780

agtacattca ggtacttgat ggctaaattc ccaaacagca tgctctcgat cgtctctgac 840

actacggatt tctggcacaa tataaccgtg aacctccctc tactgaagca agagattata 900

gcacgtccag agaatgcgcg gctagtcata cgaccggatt ctggtaactt tttcgccatc 960

atctgtggcg atcccaccgc tgacacggaa cacgagagga aaggcctaat agaatgtttg 1020

tgggacattt tcggtggcac cgtgaaccaa aagggataca aggtgataaa tccacacatt 1080

ggagcaatat acggggatgg ggtaacatac gaaaaaatgg ttaagatttt agaaggtttg 1140

aaagcaaaag gctttgcgag ttcaaatatc gtattcggag ttggagccca gacttatcag 1200

agaaataccc gagatacgct cggtttcgca ttaaaagcta cttcaattac aatcaatggg 1260

gaagagaagg cgattttcaa aaatccgaaa actgacaatg ggcttaagaa gagccaaaaa 1320

ggaagagtca agttactctc gtatgacaca tacctagacg gtttgaccgc taaggacgat 1380

ttctctgatg atttgttgga acttctgttt gagaacggca agctactgag acggacagac 1440

tttgatcaga ttcgccagaa cctggtcgac catcatcatc atcatcattg a 1491

<210> 2

<211> 1449

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgccggcag caaccgcccc ggcgtcggct gcggcgcgcc tggagcgcct gcctttctct 60

ggctaccata aacgaatatt tttcatcata gccattgcgt tcttcttcga ctcggttgat 120

ttaggtacta tgacctttgt gctaggtagc atacggaagg agtttggttt atcaacagcc 180

gcagccggcc ttgttgcgtc tgcttccttt ttcggaatgg tgctaggagc tgccgtggcc 240

ggtctcctag ctgatagatt tggtcgcaga ccagtattcc aatggtcgat ggtcctgtgg 300

ggcgccgcgt cctatctttg cagtactgcc caatcggttg atgctttgat cgtttatcga 360

gtgttattgg gtattggcat ggggatggag tttcccgtag cacaaaccct tctatccgaa 420

tttgttccaa ccgagaagcg tggacgatta atagctctta tggatgggtt ctggcccctg 480

ggttttatca ccgcggggat cgtcgcgtat tttgtactgc cgcagttcgg gtggcggact 540

gtatttgctt tattggcgat accagccgtc tttgtacttg tggtgcgacg aattgtccca 600

gagagtcctc gttggctaga acatgccggc cgtcacgccg aagcagacac tgtaatgcac 660

accattgaag caaaagtgat gcgtagcgca ggagtaacta ctttgccgcc accttcaagg 720

ctagcagagc ctgctgctgc aagaggcaga ggggcgctca gggaaatctg gagcggagta 780

taccgtaggc ggacagtcat ggtgtggctg ttgtggtttt tcgctctctt aggtttttat 840

ggtcttacga gttggctcgg ggccctctta caacaggccg ggttcgaagt cacaaagtca 900

gtcttctata cggtacttat cagtctaggc ggtgttcctg ggttcctctg tgcggcttgg 960

ctagttgaga gatggggacg gaaacccacg tgcattgctt ctctcatcgg tggcggggca 1020

atggcatacg cctacggtca gagcgcgctt tacggaggca gtactacatt gttaatagtg 1080

acgggtttgg ctatgcagtt ttttttattc gggatgtggg cggccctgta cacatacacg 1140

cccgagctgt atgggacagg ggccagggcg accggatctg ggtttgcgtc agctattggt 1200

cgggttggat cactgattgg accctacgtt gtcggcgtag tgttgccagt tttcggccaa 1260

ggaggggtct ttacgttagg agcactgtcc ttcgtcgcag cggcaatcgc tgtgtggacc 1320

ctcggcatag aaacaaaggg cttggcgctc gaacagcttg ctgcgggtga cgatgccggc 1380

gggaacggac gctatccggc aacggcagca gataaagcta gcgtcgacca tcatcatcat 1440

catcattga 1449

<210> 3

<211> 675

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggtgcgct cacccctttt tttgttaata tcctcgatca tatgcatcct agtgggcttt 60

tatatccgca gctcatatat tgaaattttt gcgagtgtaa tgggaatcat aaacgtctgg 120

ctattagcac gggagaaggt ttcgaacttt ctcttcggga tgattactgt tgcagtcttc 180

ctatatatct tcacgacaca aggtttatat gctatggctg tactggcggc ttttcagttc 240

atatttaatg tttatggttg gtactactgg atagcccgtt ccggtgagga aaaggttaaa 300

cctacggtcc ggcttgatct taaggggtgg ataatttaca tactcttcat tctagtagcc 360

tggattgggt ggggctacta tcaagtgaga tacctcgaaa gcaccaatcc gtatctcgac 420

gcattaaacg cagttttggg attggtggcc cagttcatgc ttagtcgaaa aattttagaa 480

aactggcacc tttggatatt gtacaacatc gtctctattg tcatttacat ttctaccggc 540

ctgtacgtaa tgctggtgct agcgatcatc aatctgtttc tctgtataga cggattgctg 600

gagtggaaga aaaatcataa agaaagggag agggtaaata actatatcgt cgaccatcat 660

catcatcatc attga 675

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgacaaagg agaacctcat actgctggct gatgcctata agtactcaca tcacaaattg 60

tacatccccg gaactgaata tatttactcc tattttgagt cgaggggggg gaaattcaat 120

gaaacggtct tctacggtct tcaatacttt ttaatggaat atctccaagg agcagtgatt 180

accaaggaga agcttgatga ggcggaggca actttgttgg aggtttttgg ccgaaatgac 240

gtgtttgatc gcacgaggtt tgaatatatt atcgaaaagc atgggggacg cctgccggtg 300

cgcattaaag ctgtccccga ggggaccgtt acaggtgtcc gcaacgtgct gatgactata 360

gaaaatactg accctaactg ttactgggtg accaacttcc tcgagacgct tttaatgcaa 420

atctggtacc cctgcacggt ggcgacgttg agccgtgaga tcaaaaaaac tgtaaaacaa 480

tactataacg agacagcttc ggaggccgct ttcgcgggca ttgactttgt tctaaacgat 540

tttggcttcc gtggcgcgtc ctctgtagaa tccgccggta tcggcggctc ggcacaccta 600

ataaatttct cagggagcga cacgctaatc ggaagtacct tcgctaagcg ttactatcag 660

gccccggtgg cgcctggtct gagtatcccc gcgaccgaac attctattgt aacaatgctc 720

ggagaggaag gcgaattaga aattttccgg cacattctaa acgcttttcc tactggaaca 780

atagcttgtg tcagtgattc atataacatc ttacgggcct gcagagagta ttggggtacc 840

gaactcaaag aacagatact cagccgacaa ggaaccctcg tcataaggcc agactcgggg 900

gatgctattc agacattgtt aaaggttttc gagatactga tggagacgtt tgggtatact 960

gttaacgaga aaggttacaa agtactacct ccacaagttc gagtcatcca gggggacggt 1020

atatcttact caagtatacc accgatcttt gaggcattga aacaggccgg aatatcagca 1080

gagaatcttg tacttgggat gggaggtgcg ctacttcaga gggtgaatcg ggatacgcag 1140

gaatatgccc taaagtgtag tttcgcacag gtaaacggca aggcaattaa tgtccaaaag 1200

aacccgttag aacttgacgc aaacgggaat actagagtat cttttaagaa aagcaaatct 1260

ggtaaacaaa agctagtagt tgaaaatggt atctacacct cgttgccaga aaatgaggcg 1320

cctgccctgg cggatcaact ggtcacagtt tttgaagacg gcgagattaa aaaggcttat 1380

agcttcgaac agataagaaa aaatgcaaca attgtcgacc atcatcatca tcatcattga 1440

<210> 5

<211> 1506

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgaatgctg cggcagaagc tgaatttaat atacttttag ctacagactc atacaaagta 60

acacactaca aacaatatcc acctaacacg agtaaagttt attcatattt cgaatgccga 120

gagaaaaaaa cagagaacag caaggtacgt aaggtcaaat atgaagagac agttttctat 180

ggtctgcaat acatactgaa caagtacctt aaaggtaagg tagttactaa agagaagatt 240

caagaggcta aagaagtcta tagagagcac tttcaggacg acgttttcaa tgaacggggg 300

tggaattata ttctcgaaaa gtatgacgga cacctgccga tagaggtcaa agccgtaccc 360

gaaggaagtg tcatccctcg tggtaacgtt ctcttcacag tagaaaacac agaccctgaa 420

tgttattggc tcactaattg gatagaaacg attctcgtcc aatcgtggta tcctattaca 480

gtcgcgacca atagcagaga acaaaagaag attcttgcca aatacttact ggagacttcc 540

ggcaatttag atggtctaga gtacaaacta catgatttcg gctaccgcgg cgtgagttct 600

caggaaactg cagggatcgg ggccagtgca catctagtaa acttcaaagg gacggacacc 660

gtagcaggta tcgccttaat aaagaaatat tacggtacta aggacccagt tccgggttac 720

tctgtgccgg ctgcggagca ctcgaccatt accgcgtggg gaaaagatca cgaaaaggat 780

gcgttcgagc acattgtgac ccagttttca tctgtaccag ttagcgtagt cagtgattct 840

tacgatatct acaacgcttg tgagaaaatc tggggtgagg atttgaggca tctaatagtg 900

agtcgctcga ccgaagcccc gttgataatt cgtcccgatt ccgggaaccc tttggacacg 960

gttctgaagg tgttagacat tctcggaaaa aaatttcccg tgacggagaa tagcaagggg 1020

tataaactct taccgccata cctgcgagtc atacagggag atggagtcga tataaacacg 1080

ttgcaagaga tcctagaagg catgaaacag aagaaatggt ccatcgagaa cgtatcattt 1140

ggatccggcg gggccttgtt acagaagcta actcgggacc tgcttaattg tagcttcaag 1200

tgctcatacg ttgtgaccaa tggtttaggt gtgaatgttt ttaaggaccc agtggctgac 1260

cccaataaga gatcgaaaaa gggacgactc tcccttcatc gcactcccgc aggcaatttt 1320

gtgaccctgg aagagggcaa gggcgatctt gaagagtatg gtcatgattt gcttcatacg 1380

gtgtttaaga atggtaaggt cactaagtcg tattcttttg atgaggtccg taaaaacgca 1440

caacttaaca tcgaacagga cgtagcgccg cacaaattgg tcgaccatca tcatcatcat 1500

cattga 1506

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ctatttcgaa acgaggaatt caccatgggt atggatagct tac 43

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gatgatgatg atgatggtcg accaggttct ggcgaatct 39

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctatttcgaa acgaggaatt caccatgggt atgccggcag ca 42

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gatgatgatg atgatggtcg acgctagctt tatctgctgc cgttg 45

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ctatttcgaa acgaggaatt caccatgggt atggtgcgct cacc 44

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

atgatgatga tgatggtcga cgatatagtt atttaccctc tcc 43

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ctatttcgaa acgaggaatt caccatgggt atgacaaagg agaac 45

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gatgatgatg atgatggtcg acaattgttg cattttttct tatc 44

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ctatttcgaa acgaggaatt caccatgggt atgaatgctg cg 42

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gatgatgatg atgatggtcg accaatttgt gcggcgctac g 41

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ggcagtaatt gatatactag tctcgatttt ggtcatgcat gag 43

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gacctaccct acgacgggcc cctcgattga agctatggtg tg 42

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

atagcttcaa tcgaggggcc agatcttttt tgtagaaatg tc 42

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ataactcttg tcgatacgta tacttgc 27

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

acggactcaa caccttctcc 20

Claims (10)

1.一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有下组基因的表达盒：NiaP，PnuC以及Nampt；所述Nampt选自Nampt3、Nampt2或Nampt1；

(2)培养(1)的酵母工程菌，添加烟酰胺作为底物生成烟酰胺单核苷酸产物，收获产物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养(1)的酵母工程菌后，直接添加烟酰胺作为底物生成烟酰胺单核苷酸产物；

较佳地，培养(1)的酵母工程菌后，不包括进行细胞收集和/或浓缩的步骤，直接添加底物和进行产物的生产。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达盒中还包括启动子，所述的启动子包括：组成型启动子或甲醇诱导型启动子；

较佳地，所述的组成型启动子包括GAP启动子；

较佳地，所述的甲醇诱导型启动子包括：AOX1启动。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养酵母工程菌所用的培养基包括：YPD、YPG、YPM培养基；和/或

在培养过程中，补加葡萄糖；较佳地，间隔补加或流加葡萄糖；更佳地，所述间隔补加包括：发酵过程中每12～36h向液体培养基中添加1～5％(m/v)的葡萄糖；和/或

底物的添加量为5～20g/L，较佳地7～15g/L，更佳地8～12g/L；和/或

培养基pH 5.8～6.6，较佳地pH6.0～6.4，更佳地pH6.1～6.3；

于30±2℃、转速200±50r/min培养；较佳地培养1.5～10天。

5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的酵母工程菌是毕赤酵母(Pichia pastoris)；较佳地，所述的毕赤酵母是毕赤酵母GS115或Δku70。

6.一种利用烟酰胺生产烟酰胺单核苷酸的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：NiaP，PnuC以及Nampt；所述Nampt选自Nampt3、Nampt2或Nampt1。

7.权利要求6所述的酵母工程菌的应用，用于以烟酰胺为底物生产烟酰胺单核苷酸。

8.一种基因组合的用途，所述的基因组合包括下组基因：NiaP，PnuC以及Nampt；所述Nampt选自Nampt3、Nampt2或Nampt1；该基因组合用于转化酵母工程菌，以烟酰胺为底物生产烟酰胺单核苷酸。

9.一种用于生产烟酰胺单核苷酸的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：权利要求6所述的酵母工程菌。

10.如权利要求9所述的用于生产烟酰胺单核苷酸的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含：

培养酵母工程菌所用的培养基；较佳地包括：YPD、YPG、YPM培养基；

葡萄糖；和/或

烟酰胺。

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