CN111926031A

CN111926031A - 一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法

Info

Publication number: CN111926031A
Application number: CN202010762914.7A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 付建华; 张志清
Original assignee: Guangdong Hinabiotech Co ltd
Current assignee: Guangdong Hinabiotech Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-11-13

Abstract

本发明公开了一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，包括如下步骤：S1.优化猪γ干扰素基因序列；S2.构建表达载体pPICZαA‑pIFNg；S3.构建表达载体pPIC9K‑pIFNg；S4.构建分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌；S5.诱导表达重组猪γ干扰素；通过在毕赤酵母基因组的醇氧化酶‑1基因位点和三功能组氨酸脱氢酶基因位点分步整合带有博来霉素和遗传霉素抗性基因的猪γ干扰素表达盒；通过多位点整合和不同抗生素标记加压筛选，提高猪γ干扰素的表达量，使猪γ干扰素的分泌表达量提高到1.33g/L，比现有技术提高了30％，而且重组毕赤酵母菌株稳定性高。

Description

一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程的技术领域，特别涉及一种提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法。

背景技术

干扰素(Interferon)是动物机体在病毒等的刺激下产生的一种具有抗病毒活性的细胞因子,动物机体内的干扰素是经过糖基化的蛋白质。根据其来源、结构及其受体不同可分为I型、II型和III型，每种类型又包含不同的亚型。目前只有I型中的α和β干扰素以及II型中的γ干扰素被批准应用于预防和治疗病毒感染。I型干扰素抗病毒活性较强，II型干扰素具有较强的免疫调节活性(包括刺激抗原特异性免疫和先天细胞免疫等)。Lefevre等人(Lefevre,F.,La Bonnardiere,C.,1986.Molecular cloning andsequencing of agene encoding biologically active porcinealpha-interferon.J.Interferon.Res.6,349–360.)(Lefevre,F.,L’Haridon,R.,Borras-Cuesta,F.,La Bonnardiere,C.,1990.Production,purification and biological properties of anEscherichia coli-derived recombinant porcine alpha interferon.J.Gen.Virol.71(Pt 5),1057–1063.)先后于1986和1990年克隆了猪的α和γ干扰素，他们还最早在大肠杆菌中表达了猪的α和γ干扰素，证明了重组猪α干扰素对伪狂犬病毒(PRV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、流感病毒(SIV)、繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和口蹄疫病毒(FMDV)都有较强的抗病毒活性，而重组猪γ干扰素除对VSV、TGEV、PRRSV和FMDV有明显的抗病毒活性外，对经典猪瘟病毒(CSFV)也有活性。

毕赤酵母表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一，毕赤酵母遗传背景清晰、基因操作简便、重组蛋白质表达水平高、具有翻译后修饰并能够分泌到细胞外等优点。中国专利号CN106319001A提供了一种重组干扰素γ的产业化制备方法与应用，将猪干扰素γ在大肠杆菌中以包涵体的形式进行表达，并经复性提纯成功制备了有活性的猪干扰素γ。中国专利号CN106676151A提供了一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法，将干扰素γ与硫氧化还原蛋白融合在大肠杆菌中以可溶性形式进行了表达。用大肠杆菌做宿主表达干扰素的优点是发酵周期短，缺点是包涵体形式的干扰素没有活性，需要进行复性，而以融合蛋白形式表达的干扰素也只是有一部分以有活性的可溶性蛋白形式表达，同时有一部分形成无活性的包涵体。此外，大肠杆菌表达的干扰素不能分泌到细胞外，需要收集菌体破碎细胞才能进行提纯，而大肠杆菌细胞壁中的脂多糖(内毒素)对动物机体是致热源，在纯化过程中必须完全去除。利用毕赤酵母生产的分泌型干扰素是活性形式，而且由于毕赤酵母分泌到胞外的杂蛋白较少，纯化比较容易。

可见，现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，旨在解决现有技术中以包涵体形式表达的重组猪γ干扰素没有活性，以融合蛋白形式表达的猪γ干扰素活性低，提纯步骤复杂，以及毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素表达量低，菌株稳定性差的技术问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，包括如下步骤：

S1.优化猪γ干扰素基因序列；

S2.构建表达载体pPICZαA-pIFNg：双酶切pPICZαA表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPICZαA-pIFNg；

S3.构建表达载体pPIC9K-pIFNg：双酶切pPIC9K表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPIC9K-pIFNg；

S4.构建分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌：单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合博来霉素加压筛选，筛选出菌株pIFNg-01；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合遗传霉素加压筛选，筛选出表达量最高的菌株pIFNg-02；

S5.诱导表达重组猪γ干扰素：挑取步骤S4中的表达猪γ干扰素的毕赤酵母菌株pIFNg-02，制备种子液，种子液发酵培养，饲喂碳源，甲醇诱导表达。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述优化后猪γ干扰素基因序列包括如SEQ ID No.1所示的DNA序列。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S2中使用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用XhoI和XbaI双酶切鉴定阳性重组质粒。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S3中使用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用EcoRI和NotI双酶切鉴定阳性重组质粒。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中还包括将单菌落接种培养后，用甲醇诱导表达，取发酵液上清电泳并染色，比较猪γ干扰素表达量。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中博来霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中遗传霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体的酶为PmeI限制性内切酶；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体的酶为SalI限制性内切酶。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中感受态细胞为X33毕赤酵母、GS115毕赤酵母或KM71毕赤酵母中的一种。

所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述的表达猪γ干扰素的毕赤酵母的保藏编号为：GDMCCNO.60827。

有益效果：

本发明提供了一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，通过在毕赤酵母基因组的醇氧化酶-1(Alcohol oxidase1,AOX1)基因位点和三功能组氨酸脱氢酶(Trifunctional histidinol dehydrogenase,His4)基因位点分步整合带有博来霉素和遗传霉素(Geneticin,G418)抗性基因的猪γ干扰素表达盒；通过多位点整合和不同抗生素标记加压筛选，提高猪γ干扰素的表达量，使猪γ干扰素的分泌表达量提高到1.33g/L，比现有技术提高了30％；而且通过不同的整合位点，提高了多拷贝菌株中基因组的猪γ干扰素表达盒的分散性，一定程度上减少了猪γ干扰素表达盒拷贝数的丢失，使菌株的稳定性得到提高。

附图说明

图1为本发明提供的猪γ干扰素表达载体pPICZαA-pIFNg的示意图。

图2为所述猪γ干扰素表达载体pPIC9K-pIFNg的示意图。

图3为摇瓶培养上清液中猪γ干扰素表达水平的电泳验证图；其中，M：DNAMarker；IFN1：pIFNg-01；IFN2：pIFNg-01；IFN3：pIFNg-02；IFN4：pIFNg-02。

具体实施方式

本发明提供一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

表达猪γ干扰素的毕赤酵母菌株Komagataella phaffii HNC-pIFNg，分类学名称Komagataella phaffii，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070,保藏日期2019年12月4日，保藏编号GDMCC No.60827。

下列实施例中未注明具体条件的实验操作，均参照《DNA克隆2：一种实用方法》(DNA Cloning 2：A Practical Approach，Oxford University Press,1992)中所述的条件进行。

DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶购于NewEnglandBiolabs公司，毕赤酵母表达载体购于Invitrogen公司。

实施例1猪γ干扰素表达载体的构建

1.1基于毕赤酵母密码子偏好性优化猪干扰素-γ表达基因编码序列

根据毕赤酵母密码子偏好性(https://sg.idtdna.com/site/account/login？returnurl＝％2FCodonOpt)设计猪干扰素-γ基因序列，基因序列由江苏金斯瑞生物科技公司合成，其对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：

优化后的pIFNg(重组猪γ干扰素)序列如下(SEQ ID No.1)：

1.2表达载体pPICZαA-pIFNg的构建

用XhoI和XbaI双酶切pPICZaA表达质粒,琼脂糖电泳并切胶回收线性化载体，用T4DNA连接酶连接同样经过XhoI和XbaI双酶切处理的合成猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态。提取质粒用XhoI和XbaI双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPICZαA-pIFNg(如图1所示)。

1.3表达载体pPIC9K-pIFNg的构建

用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K表达质粒,琼脂糖电泳并切胶回收线性化载体，用T4DNA连接酶连接同样经过EcoRI和NotI双酶切处理的合成猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态。提取质粒用EcoRI和NotII双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPIC9K-pIFNg(如图2所示)。

实施例2分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌的构建

PmeI限制性内切酶单酶切pPICZaA-pIFNg表达载体，切胶回收线性化表达载体，用1.6kV的电压电转至X33毕赤酵母感受态细胞或其他毕赤酵母如GS115、KM71等，菌液涂布于YPG平板(酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖培养基)(含0.4mg/ml博来霉素)，30℃培养2-3天，直至长出单菌落。挑取单菌落，复制到含0.8mg/ml博来霉素的YPG平板上，30℃培养2-3天；待菌落长出，在深孔培养板中培养并用1.5％的甲醇诱导表达72小时，取20μL发酵液上清进行SDS电泳并染色，观察干扰素表达条带。同上将含0.8mg/mL博来霉素的YPG平板上长出的菌落，复制到含1.2mg/mL博来霉素的YPG平板，待长出菌落，同上培养诱导表达，比较与0.8mg/mL博来霉素筛选出菌株的干扰素表达条带的量。同上将含1.2mg/mL博来霉素的YPG平板上长出的菌落，复制到含1.6mg/mL博来霉素的YPG平板上，待长出菌落，进行培养诱导。并与前述梯度筛选出的菌株，干扰素的表达量用电泳进行比较。该轮筛选出的菌株命名为pIFNg-01(如图3所示)。

用博来霉素筛选出的工程菌pIFNg-01作为基础菌株，制备感受态。

SalI限制性内切酶单酶切pPIC9K-IFNg表达载体，用1.6kV的电压电转至X33毕赤酵母感受态细胞或其他毕赤酵母如GS115、KM71等，菌液涂布于YPG平板(含0.4mg/mlG418)，30℃培养2-3天，直至长出单菌落。将菌落复制到含0.8mg/mLG418的YPG平板上，30℃培养2-3天，直至长出单菌落。接种深孔板培养24h并用1.5％甲醇浓度诱导表达72h。取20μL发酵上清液，进行SDS-PAGE染色并比较与pIFNg-01诱导表达产生的干扰素产量进行比较，筛选出的表达量最高的菌株命名为pIFNg-02(如图3所示)。

实施例3重组猪γ干扰素的诱导表达

挑取实施例2中制备的表达猪γ干扰素的毕赤酵母菌株pIFNg-02，接种于25mLBMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备一级种子液。取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中制备二级种子液，30℃，220rpm培养24小时。二级种子液全部接种于5L发酵罐(2L BSM培养基)，控制温度30℃±0.5℃，溶氧20％±5％，pH＝5.0±0.5。基础甘油耗尽后，流加10％甘油，甘油耗尽后直至溶氧上升至100％，饥饿半小时，流加甲醇诱导猪γ干扰素的表达，共诱导72小时，离心(6000×g，5min)取发酵上清液进行检测。

实施例4重组猪γ干扰素蛋白浓度的检测和蛋白电泳

BCA法测定上清液总蛋白浓度，结果显示，pIFNg-02菌株诱导72小时发酵上清液的总蛋白浓度分别为：1.0g/L、1.33g/L。

SDS-PAGE蛋白电泳分析发酵上清液干扰素含量，蛋白电泳结果如图3所示，在15-20KD之间有目标大小的蛋白条带，蛋白条带的分子量大小与猪γ干扰素理论分子量16KD相近。通过软件分析，干扰素蛋白含量85％以上。基础菌株和辅助分泌的菌株干扰素产量大致为1.02g/L，1.33g/L。

实施例5重组猪γ干扰素的质谱检测

将实施例4中蛋白电泳胶的目标条带切下,用测序级的胰蛋白酶酶解后用液质联用来进行酶解肽段的串联质谱分析，结果找到5个肽段，覆盖率占表达猪γ干扰素序列全长的79.72％。

重组猪γ干扰素电泳条带的质谱鉴定

利用液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)方法鉴定到的肽段如下(SEQ ID No.3)：

匹配肽段如下划线部分所示：

QAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQR SMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRSQTMFQGQRASK(覆盖率79.72％)。

实施例6pIFNg-02菌株稳定性评价

通过连续传代培养评价菌株稳定性。

挑取实施例2中所制备的表达干扰素的毕赤酵母细胞菌落接种于3mLBMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备种子液。取0.5mL种子液接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时。菌液转移到50mL离心管中，离心(6000×g，5min)弃上清，用25mL甲醇浓度为1％的BMMY培养基重悬菌体，菌液转移到250mL三角瓶中，30℃，220rpm培养72小时，每24小时添加甲醇至1％浓度。离心(6000×g，5min)取发酵上清液进行猪γ干扰素蛋白质电泳检测。

挑取筛选菌株，连续传代培养10代，检测发酵上清液猪γ干扰素蛋白浓度，结果显示每一代菌株的摇瓶发酵上清液的干扰素蛋白浓度为1.3-1.4g/L，说明菌株稳定性良好。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 广东海纳川生物科技股份有限公司

<120> 一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caagctcctt tcttcaaaga gatcacaatt cttaaagact attttaacgc cagtacatcc 60

gatgttccaa atggtggacc tctatttctt gagatactga agaactggaa agaggaaagt 120

gacaagaaaa tcatccaatc tcagatcgtt tccttctatt tcaagttttt cgagatattt 180

aaggataacc aagctatcca acgttccatg gacgtgataa aacaggatat gttccaaagg 240

tttctgaacg gttcttctgg taagttgaac gatttcgaga aactgatcaa aataccagta 300

gacaatctgc aaatccagag gaaagcaatt agtgagctga taaaagtcat gaacgatcta 360

tccccacgta gtaacttgag gaaaagaaaa cgttcccaga ccatgttcca aggacaaaga 420

gcttctaagt ga 432

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Ala Ser Thr Ser Asp Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile

20 25 30

Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln

35 40 45

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln

50 55 60

Ala Ile Gln Arg Ser Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg

65 70 75 80

Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile

85 90 95

Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu

100 105 110

Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys

115 120 125

Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser Lys

130 135 140

<210> 3

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ser Met Asp Val Ile Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Leu Asn Asp Phe

1 5 10 15

Glu Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly

20 25 30

Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln

35 40 45

Ala Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp

50 55 60

Leu Ser Pro Arg Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Ser Gln Thr Met

65 70 75 80

Phe Gln Gly Gln Arg Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Ile

85 90 95

Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Ser Met Asp Val Ile

100 105 110

Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Leu Ile Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu

115 120 125

Gln Ile Gln Arg Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe

130 135 140

Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln Arg

145 150 155

Claims

1.一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.优化猪γ干扰素基因序列；

2.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述优化后猪γ干扰素基因序列包括如SEQ ID No.1所示的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S2中使用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用XhoI和XbaI双酶切鉴定阳性重组质粒。

4.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S3中使用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用EcoRI和NotI双酶切鉴定阳性重组质粒。

5.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中还包括将单菌落接种培养后，用甲醇诱导表达，取发酵液上清电泳并染色，比较猪γ干扰素表达量。

6.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中博来霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml。

7.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中遗传霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml。

8.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体的酶为PmeI限制性内切酶；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体的酶为Sal I限制性内切酶。

9.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中感受态细胞为X33毕赤酵母、GS115毕赤酵母或KM71毕赤酵母中的一种。

10.根据权利要求1～9任一项所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述的表达猪γ干扰素的毕赤酵母的保藏编号为：GDMCCNO.60827。