CN115992117B

CN115992117B - 一种重组人溶菌酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115992117B
Application number: CN202211660926.4A
Authority: CN
Inventors: 刘小海; 王丽萍; 钱晨明; 程鹏飞; 王昊; 豆荣昆; 凡孝菊
Original assignee: Jiangsu Chuangjian Medical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Chuangjian Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2042-12-23
Also published as: CN115992117A

Abstract

本发明提供了一种重组人溶菌酶及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域，本发明提供的重组人溶菌酶，通过对现有氨基酸序列进行优化，在不改变溶菌酶性质的条件下，减少毕赤酵母在表达过程中对其的降解，以提高溶菌酶在发酵纯化工艺的收率；所述重组人溶菌酶优选SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；本发明的重组溶菌酶，在纯化后的酶活与天然人重组溶菌酶酶活相当；与天然序列相似度高，其免疫原性低，与传统蛋清纯化获得的溶菌酶相比更适合于医药行业。

Description

一种重组人溶菌酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组人溶菌酶及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

溶菌酶普遍存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、乳汁等液体，以及微生物也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能够溶解革兰氏阳性细菌细胞壁的酶，水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复合体，使病毒失活。溶菌酶是一种天然、安全性能良好的杀菌剂和防腐剂，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，可广泛应用于食品生物防腐、医药、日用化工等行业。目前研究表明，鸡蛋蛋清是溶菌酶生产的主要原料，其溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%~3.5%。然而，蛋清中含有多种蛋白质，分离纯化难度较大，且应用于医药行业有面临免疫原性的问题。

目前随着毕赤酵母表达系统的兴起，越来越多的重组蛋白得到成功表达。但是天然的溶菌酶序列在毕赤酵母表达过程中会被毕赤酵母自身的酶进行降解，这使得后期纯化工作难度加大，并减少了其收率。

现有以毕赤酵母来实现重组表达溶菌酶的专利申请或者文章，如：申请号202010106516.X，名称为《基因工程改造的人溶菌酶》的专利申请，以重组实现溶菌酶的成功表达或者改变中心活性位点以得到总体酶活的提高；申请号为202010127139.8，名称为《一种比活提高的溶菌酶突变体》的专利申请，对溶菌酶进行其它序列的融合表达，在C端添加疏水短肽，或者和其它具有抗菌性的短肽进行融合表达。此外，目前关于溶菌酶的研究更多在于对其的使用场景，以及其在蛋清中的提取纯化方法的研究，并未见解决溶菌酶在表达过程中的降解所导致的纯化回收率低的问题的相关研究，也就是对减少溶菌酶重组表达降解的研究目前尚未有发现。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于，克服现有技术中存在的一些技术问题，提供一种重组人溶菌酶、制备方法及其应用。

本发明旨在通过对现有氨基酸序列进行优化，在不改变溶菌酶性质的条件下，减少毕赤酵母在表达过程中对其的降解，以提高溶菌酶在发酵纯化工艺的收率。

为此，本发明首先提供一种重组人溶菌酶，所述重组人溶菌酶包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性并维持溶菌酶活性的氨基酸序列。。

进一步优选地，所述重组人溶菌酶包括SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明还提供多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的重组人溶菌酶。

进一步的，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列、或其简并序列。

本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包括所述多核苷酸。

本发明还提供一种工程菌或细胞，所述工程菌或细胞包括所述的多核苷酸，或所述的重组载体或表达所述重组人溶菌酶；优选地，所述工程菌或细胞为真核细胞、原核细胞或动物细胞，更优选地，为毕赤酵母。

进一步的，所述的工程菌或细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，表达LH1的工程菌保藏编号为CGMCC No.26122，表达LH1-1的工程菌保藏编号为CGMCC No.26123，表达LH1-3的工程菌保藏编号为CGMCC No.26124；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2022年11月11日；分类命名：巴斯德毕赤酵母Komagataella phaffii。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包括所述的重组人溶菌酶，或所述的多核苷酸，或所述的重组载体，或所述的工程菌或细胞。

本发明还提供一种制品，所述制品包括所述的重组人溶菌酶，或所述的多核苷酸，或所述的重组载体，或所述的工程菌或细胞，或所述的组合物；优选地，所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。

本发明还提供所述的重组人溶菌酶，或所述的多核苷酸，或所述的重组载体，或所述的工程菌或细胞，或所述的组合物在制备药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品中的用途。

本发明还提供一种重组人溶菌酶的制备方法，所述方法包括：

将所述的工程菌高密度发酵，对发酵上清液进行纯化，获得重组人溶菌酶。

本发明还提供一种抗降解的重组人溶菌酶的方法，所述方法包括：将SEQ ID NO.1所示天然人溶菌酶氨基酸序列第13位氨基酸赖氨酸替换为谷氨酸；或将SEQ ID NO.1所示天然人溶菌酶氨基酸序列第13位氨基酸赖氨酸替换为精氨酸，第14位精氨R替换为赖氨酸。

进一步的，所述重组表达为采用毕赤酵母表达。

本发明的有益效果：

（1）本发明的重组溶菌酶，在整体的理化性质上没有变化，没有改变溶菌酶结构的形成，因为没有结构变化或者结构错误，所以得到的溶菌酶没有发生失活，或活性降低，且本发明涉及的溶菌酶在纯化后酶活于天然人重组溶菌酶酶活相当。

（2）本发明涉及的重组溶菌酶序列主要在于人源性或者高度人源性，与天然序列相似度高，其免疫原性低，与传统蛋清纯化获得的溶菌酶相比更适合于医药行业。

（3）本发明涉及的重组溶菌酶选择毕赤酵母表达系统，比植物表达系统周期短、成本低，比人胎盘或其他组织提取的人溶菌酶同样在免疫原性、成本、周期上具有优势；更重要的是，本发明的表达方法能够大大降低重组溶菌酶的表达降解水平，在发酵后检测结果中，其主带占比比原始溶菌酶大幅提高，降低了后续纯化工艺难度，提高了收率。

（4）本发明的重组溶菌酶表达选择毕赤酵母，以其建立的表达系统拥有可高密度发酵生产、极低的培养成本、短周期、高表达等规模化工业生产的优点。

附图说明

图1为LH1、LH1-1、LH1-3诱导表达24h后的摇瓶上清的SDS-PAGE检测结果，其中各泳道从左至右依次为Marker、3个LH1的平行试验、LH1-1、LH1-3、Marker。

图2为LH1、LH1-1、LH1-3诱导表达24h后的摇瓶上清的Western Blot检测结果，其中各泳道从左至右依次为Marker、LH1、LH1-1的2个平行试验、LH1-3的2个平行试验。

图3为LH1纯化过程洗脱样以及LH1的2个平行试验、LH1-1、LH1-3冻干粉的SDS-PAGE检测结果。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。

本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。

本发明中所涉及的各培养基，如MD平板、YPD平板、BMGY培养基等，如无特殊说明均为常规配制或购买得到。

对本发明中涉及的序列利用不同的质粒载体，以及不同的工程菌株也能达到相同的效果；对本发明涉及的突变位点进行相似氨基酸替，也可产生与本发明类似的效果；对本发明涉及的突变位点数量进行缩减也有可能达到本发明类似的效果，均属本发明的保护范围。

实施例1：重组人溶菌酶氨基酸序列的设计、合成及重组表达载体的构建

（1）重组人溶菌酶氨基酸序列的设计

原序列以天然人溶菌酶序列（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P61626/entry）中第19-148为目的序列，并命名为LH1，其序列如SEQ ID NO.1：

KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV

以LH1为出发序列进行优化，将其第13位氨基酸赖氨酸K改为谷氨酸E，并命名为LH1-1，其序列如SEQ ID NO.2：

KVFERCELARTLERLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV

以LH1为出发序列进行优化，将其13位氨基酸赖氨酸K改为精氨酸R，14位精氨酸R改为赖氨酸K，并命名为LH1-3，其序列如SEQ ID NO.3：

KVFERCELARTLRKLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV

（2）DNA序列的合成与重组表达载体的构建

委托南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成：合成表达LH1、LH1-1、LH1-3的DNA片段，将合成后的基因片段克隆至pPIC9K空载体（购自赛默飞世尔科技公司）中，使目的片段准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，获得表达LH1、LH1-1、LH1-3的重组质粒。

溶菌酶天然DNA未经优化前的序列如SEQ ID NO.4：

aaggtctttgaaaggtgtgagttggccagaactctgaaaagattgggaatggatggctacaggggaatcagcctagcaaactggatgtgtttggccaaatgggagagtggttacaacacacgagctacaaactacaatgctggagacagaagcactgattatgggatatttcagatcaatagccgctactggtgtaatgatggcaaaaccccaggagcagttaatgcctgtcatttatcctgcagtgctttgctgcaagataacatcgctgatgctgtagcttgtgcaaagagggttgtccgtgatccacaaggcattagagcatgggtggcatggagaaatcgttgtcaaaacagagatgtccgtcagtatgttcaaggttgtggagtg

LH1的DNA序列如SEQ ID NO.5：

aaggtgttcgaacgctgtgagcttgcgcgcacactaaaacgattgggtatggatggctatagggggatttcgctcgctaattggatgtgtttagccaaatgggaatctggctataatacgagagccaccaattacaacgcgggagaccgtagcactgattacggaatttttcagatcaactcccggtattggtgcaatgacgggaagactccaggcgcggttaatgcatgccatttgagttgttcagctctgctccaagataacatagcagacgccgttgcatgcgctaaacgtgtggtacgagacccccagggtatccgggcctgggtagcgtggagaaacaggtgccaaaaccgggatgtcagacaatacgtccagggttgtggggta

LH1-1的DNA序列如SEQ ID NO.6：

aaggtgttcgaacgctgtgagcttgcgcgcacactagaacgattgggtatggatggctatagggggatttcgctcgctaattggatgtgtttagccaaatgggaatctggctataatacgagagccaccaattacaacgcgggagaccgtagcactgattacggaatttttcagatcaactcccggtattggtgcaatgacgggaagactccaggcgcggttaatgcatgccatttgagttgttcagctctgctccaagataacatagcagacgccgttgcatgcgctaaacgtgtggtacgagacccccagggtatccgggcctgggtagcgtggagaaacaggtgccaaaaccgggatgtcagacaatacgtccagggttgtggggtataa

LH1-3的DNA序列如SEQ ID NO.7：

aaggtgttcgaacgctgtgagcttgcgcgcacactacgaaaattgggtatggatggctatagggggatttcgctcgctaattggatgtgtttagccaaatgggaatctggctataatacgagagccaccaattacaacgcgggagaccgtagcactgattacggaatttttcagatcaactcccggtattggtgcaatgacgggaagactccaggcgcggttaatgcatgccatttgagttgttcagctctgctccaagataacatagcagacgccgttgcatgcgctaaacgtgtggtacgagacccccagggtatccgggcctgggtagcgtggagaaacaggtgccaaaaccgggatgtcagacaatacgtccagggttgtggggtataa

实施例2：重组工程菌株的构建、菌种筛选、表达鉴定

（1）重组工程菌株的构建、菌种筛选

将实施例1中得到的重组表达质粒10μg用SalⅠ（购自大连TaKaRa公司，具体操作按试剂盒说明书进行）37℃酶切消化过夜，使其线性化，再使用PCR产物纯化试剂盒（购自生工生物工程(上海)股份有限公司）回收线性化质粒，控制体积在10μL左右。

将线性化质粒电转化入宿主菌种毕赤酵母GS115（购自赛默飞世尔科技公司）感受态细胞，将电转后的菌液涂布于MD平板上，每100μL～200μL涂布一块平板，室温静置10min，于30℃倒置培养2-5天，直至单菌落（阳性转化子）出现。

向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中。以无菌双蒸水稀释菌悬液，105个细胞涂布于含有0.5mg/mLG418的YPD平板上，倒置，30℃培养3～4d后至单菌落出现。从YPD平板上挑取菌落至无菌96孔板中（200μLYPD/孔），混匀，于30℃培养48h；混匀孔中菌液，各取10μL接入至一块新的无菌96孔板，于30℃培养24h后再重复一次此操作；24h后，从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4mg/mLG418的YPD平板上，于30℃继续培养96h～120h。毕赤酵母转化子若能在含高浓度G418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个重组片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达的重组酵母工程菌种。

构建的3种工程菌样本均送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号分别是：表达LH1的工程菌保藏编号为CGMCC No.26122，表达LH1-1的工程菌保藏编号为CGMCC No.26123，表达LH1-3的工程菌保藏编号为CGMCC No.26124，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2022年11月11日。分类命名：巴斯德毕赤酵母Komagataella phaffii（也有命名为Pichia pastoris）。

（2）摇瓶表达鉴定

分别取表达LH1、LH1-1、LH1-3的毕赤酵母工程菌种，置于装有10mLBMGY培养基的100mL三角瓶中，于28-30℃、220rpm培养至OD600为2~6(16-18h)。室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为2左右，放置于28-30℃、220rpm的摇床上继续生长3天，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0%。加甲醇诱导16h以上，就可收取菌液样品，取样量为1mL，置于1.5mLEP管中，4℃下以12000g离心5min，收集表达上清，待检测样品于-80℃保存备用。

分别收取LH1、LH1-1、LH1-3诱导表达24h后的上清，加入5×上样缓冲液（250mMTris-HCl、pH6.8，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇），置于100℃金属浴加热10min，将各个上清样进行SDS-PAGE检测，检测结果见图1，图1中可见，胶图主条带大小符合天然人溶菌酶理论值，经灰度分析显示，经修改后的LH1-1、LH1-3溶菌酶表达菌株所分泌表达的溶菌酶主条带占上清的90%以上，而未做修改的天然人溶菌酶在表达上清中主带占比不足30%，可见，在表达过程中，本发明的重组人源溶菌酶LH1-1、LH1-3抗降解效果很好，极大地减少了被酵母自身的酶所降解，酶的稳定性很好。同时对上清样做WesternBlot检测，所用一抗为人溶菌酶抗体（Lysozyme Antibody），采购自Affinity公司，货号为DF7890，二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，采购自碧云天公司，货号为A0208，Western Blot检测结果见图2，结果显示LH1、LH1-1、LH1-3的毕赤酵母工程菌种均能成功分泌人天然溶菌酶，并且条带大小符合理论值，同时也证明本发明得到预期重组人源溶菌酶。

实施例3：高密度发酵与纯化试验

（1）对实施例2中构建得到的基因工程菌进行高密度发酵试验，重组LH1、LH1-1、LH1-3溶菌酶规模化表达生产，获取含有重组溶菌酶的发酵液。

种子培养基YPG（酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、甘油10g/L）。

发酵培养基（NH₄H₂PO₄190.4g/L、KH₂PO₄ 10.06g/L、CaSO₄•2H₂O1.18g/L、K₂SO₄18.2g/L、MgSO₄•7H₂O14.9g/L、甘油40g/L）。

补料培养基（50%W/V甘油，每升加12mLPTM1微量元素）。

诱导培养基（100%甲醇，每升加入12mLPTM1微量元素）。

PTM1：用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存。

发酵培养基高温灭菌后待温度降至室温加入PTM1，用氨水调节pH至5.0。

工程菌株分批培养条件和诱导表达条件为：

采用分批补料培养方法，培养温度30℃。工程菌接入含200ml种子培养基YPG的1L摇瓶，220rpm、30℃，培养18-20h，至OD600=2~10。使用5L发酵罐（保兴生物），装液量2L发酵培养基，2%甘油分开灭菌，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min，温度30℃，用浓氨水配制好的碱液调pH，设置pH为4.5。然后先接入0.9mLPTM1，再将制备好的200ml种子液接入罐内（火焰圈接种），然后点击溶氧电极校百，校百后开始发酵。待生长溶氧第一次掉至30%，采用溶氧串级转速功能，保持30%；等待甘油耗完，溶氧反弹、溶氧大于70%（OD₆₀₀值约20），取消溶氧串级转速，调高搅拌650rpm，甘油采用30%联动补料，补料80ml。停止补甘油，溶氧反弹至70%以上后，设置pH4、温度29℃，以甲醇、甘油混合碳源（甲醇：50%甘油=7：3）进行诱导培养。手动补加5ml，待溶氧反弹至70%以上后，设定补料速度为8ml/h，一小时后提高到为10ml/h，一小时后再次提高设定到20ml/h。待溶氧值低于30%，停止补料，等待溶氧反弹，溶氧回升至30%后联动补料。诱导40~60h，UV测量蛋白浓度增长幅度不明显或下降即可放罐。UV蛋白定量公式：C(mg/mL)＝0.144*(A215-A225)，A215<1.5。

（2）纯化

缓冲液A：20mM KH₂PO4，pH4.0；

缓冲液B：20mM KH₂PO4、0.5 MNaCl，pH4.0。

收集发酵液，7000g、30min、4℃离心分离菌体得到发酵上清。以缓冲液A平衡阳离子交换介质（层析填料为Cytiva SP Sepharose Fast Flow，装载于利穗科技产XK50/30层析柱，使用GE AKTA Pure150 M层析纯化系统）至A215吸光值和电导率值都保持不变后，设置20ml/min的流速上样，上样体积0.5L/次，检测紫外A215吸光值，当其上升时，并不收集。待上样结束后，再以缓冲液A洗杂阳离子层析介质，直至紫外和电导降至最低且不再变化。最后以缓冲液B洗脱阳离子层析介质上的目的物，当A215开始上升，打开接样口，分段收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测洗脱液，选取主带占比高的或者单一条带的洗脱液进行浓缩，透析（透析液为超纯水），冷冻干燥，收集溶菌酶冻干粉。以此方法依次纯化冻干获得LH1、LH1-1、LH1-3冻干粉，发酵液体积均为5L，最终获得溶菌酶为0.85g、1.71g、1.78g。结果显示，经改造后的序列LH1-1、LH1-3收率提升在90%以上，LH1-2无显著提升。将LH1、LH1-1、LH1-3冻干粉进行SDS-PAGE电泳实验，见图3。

实施例4：重组溶菌酶酶活实验

经5L罐发酵纯化冻干后分别获得LH1、LH1-1、LH1-3冻干粉，对3种样品进行酶活鉴定，并与Sigma-Aldrich的人源溶菌酶（货号为L1667-1G）进行酶活比较，Sigma-Aldrich的人源溶菌酶记为为LH1-0。将LH1、LH1-1、LH1-3冻干粉以及LH1-0用溶菌酶溶解液配制成0.15mg/mL的溶液，并用溶菌酶活性检测方法对4种溶菌酶液体进行酶活检测，具体方法详见国标《GB/T 30990-2014》。

最终测得LH1、LH1-1、LH1-3冻干粉以及LH1-0的酶活分别为85213U/mg、83028U/mg、82121U/mg、89021U/mg。可见，本发明的重组人源溶菌酶，在酶活上没有降低或失活，与对照样品酶活相当。

Claims

1.一种重组人溶菌酶，其特征在于，所述重组人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

2.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的重组人溶菌酶。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7及其简并序列所示。

4.重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求2或3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的重组载体，或表达权利要求1所述的重组人溶菌酶；所述细胞为非植物细胞。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为毕赤酵母。

7.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No.26123、CGMCC No.26124。

8.组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的重组人溶菌酶、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的重组载体、或权利要求5~7任一项所述的重组细胞。

9.制品，其特征在于，所述制品包括权利要求1所述的重组人溶菌酶、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的重组载体、或权利要求5~7任一项所述的重组细胞、或权利要求8所述的组合物。

10.根据权利要求9所述的制品，其特征在于，所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。

11.权利要求1所述的重组人溶菌酶、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的重组载体、或权利要求5~7任一项所述的重组细胞、或权利要求8所述的组合物在制备药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品中的用途。

12.一种重组人溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求5~7任一项所述的重组细胞高密度发酵，对发酵上清液进行纯化，获得重组人溶菌酶。

13. 一种减少人溶菌酶重组表达降解的方法，其特征在于，所述方法包括：将SEQ IDNO.1所示天然人溶菌酶氨基酸序列第13位氨基酸赖氨酸替换为谷氨酸；或将SEQ ID NO.1所示天然人溶菌酶氨基酸序列第13位氨基酸赖氨酸替换为精氨酸，第14位精氨酸替换为赖氨酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述重组表达为采用毕赤酵母表达。