CN113637598A

CN113637598A - 一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法

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Publication number: CN113637598A
Application number: CN202110292418.4A
Authority: CN
Inventors: 喻恒锋; 喻致远; 曹立环; 周正; 龚文伟
Original assignee: Yiwu Ouya Cosmetics Co ltd; Shanghai Fuhuagen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yiwu Ouya Cosmetics Co ltd; Shanghai Fuhuagen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2021-11-12

Abstract

本发明提供了一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法，所述重组毕赤酵母工程菌命名为FHX‑LYC71；其保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2021181。所述毕赤酵母工程菌是将人源溶菌酶基因的人工合成序列以BamH I和EcoR I位点装载于pPIC9K载体上，再高拷贝整合于毕赤酵母基因组，能高表达人源溶菌酶蛋白。

Description

一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法

技术领域

本发明涉及一种含高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌及构建方法，该重组毕赤酵母工程菌同时具有高拷贝高表达的特征。

技术背景

溶菌酶首次于1922年被英国的细菌学家佛莱明发现，直到1937年，Abraham 与Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体，人们才开始对溶菌酶进行研究。1965 年，Blake等人用x射线晶体结构分析法阐明了鸡蛋白溶菌酶的三维结构,证实了溶菌酶含有4对二硫键，其分子近椭圆形。研究还发现溶菌酶的内部几乎全部为非极性，疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用，并发现在溶菌酶分子的表面有一个裂缝，该裂缝的大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖，即为溶菌酶的活性部位。2001年，Vavid等人证实了NAM和NAG之间的β-1，4-糖苷键的水解是通过一个双置换反应完成的。溶菌酶能水解肽聚糖中的N一乙酰葡萄糖和N一乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，以此破坏细菌的细胞壁，具有较强的抑菌抗菌活性。溶菌酶在自然界中来源广泛，可分为微生物、噬菌体、植物和动物四种类型的溶菌酶，其中动物溶菌酶活性高，应用广泛。在人体内，溶菌酶分布相当广泛，主要存在于体液、细胞和组织器官中。报道的主要有眼泪、唾液、鼻涕、汗液、尿液、血清、胸水、淋巴液、脑脊液体液中，白细胞、巨噬细胞、单核细胞中，组织器官有心、肺、肝、脾、肾、胎盘，其中在肾和肺中含量最高。

1992年FAO/WTO的食品添加剂协会公布：溶菌酶应用于食品工业中是安全的，我国卫生部2010年第23号公告批准溶菌酶等物质为食品添加剂。溶菌酶的化学本质为蛋白质，在人及动物的胃肠内可以被消化、吸收。因此不会在体内残留，无毒性，安全性很高，在药品、饲料和食品等行业具有广泛的应用前景。在食品工业中可应用于水产品、乳制品、果蔬、肉类、酒及饮料的防腐保鲜。在畜牧业溶菌酶可用作饲料防腐剂和杀菌剂。在医学上溶菌酶可以代替抗生素作为抗菌消炎的药物。

如今抗生素耐药问题日趋严重，寻找抗生素物质的补充或可替代产品刻不容缓，临床上由于抗生素药物的长期使用，致使很多致病菌产生了广泛的耐药性。因此科研工作人员对原始的抗生素物质进行了各种修饰，得到了很多抗生素药物的衍生物，然而尽管如此，仍难以弥补抗生素及其衍生物的缺陷。并且作为一种人体外源药物，某些人群会对抗生素产生过敏反应，而人溶菌酶作为人体自身存在的一种蛋白，可以很好地弥补这一缺陷。人溶菌酶是一种通过水解细菌细胞壁中肽聚糖而发生溶菌的胞壁质酶。除了溶菌酶的杀菌，控肿、消炎的作用，溶菌酶在人体内部环境中还具有改善局部血液循环、组织修复和分解脓液等功效。因此人溶菌酶药物的应用可直接减少抗生素物质等的使用，具有广阔的市场前景和重要的商业价值。目前市场上的溶菌酶产品大多以蛋清溶菌酶为主要原料，我国 SFDA已下达13个鸡溶菌酶肠溶片生产文号、16个含片生产文号。除了应用在医药行业，鸡溶菌酶在日化行业也得到了应用，如口腔护理产品牙膏、漱口液、喷剂，化妆品等。目前，溶菌酶主要从鸡蛋清和蛋壳膜中提取。但这种直接提取的生产方式，其规模小、成本高，不利于大规模化生产与应用。同时，鸡蛋清溶菌酶对于人体而言是一种异源蛋白，在蛋白质一级结构上与人溶菌酶有较大差异，因此，它具有明显的局限性。鸡溶菌酶用于过敏体质人群时，可引发过敏反应，严重者可导致死亡。另外，鸡溶菌酶在人体内会产生免疫原性与毒副作用，无法用于静脉用药。由于鸡溶菌酶的局限性，人们开始更加关注人溶菌酶的研究和开发。

人源溶菌酶相对于鸡溶菌酶在医药行业有明显的优势，利用基因工程技术构建溶菌酶外源表达系统，可对溶菌酶进行异源表达和微生物发酵生产，已成为溶菌酶生产技术研究的热点。早期的专利号为ZL01132373.6的中国专利以pPIC9 框架表达人源溶菌酶，但pPIC9没有Kan抗性基因，没法进行多拷贝转化子的筛选，这样难以得到高表达人源溶菌酶的毕赤酵母菌株，后面也有多个研究表达人源溶菌酶，但建立高表达的人源溶菌酶菌株一直是科研和工业界的目标，因为高表达意味着相对的低成本，在溶菌酶发酵生产应用上十分重要。

本发明构建了一种重组毕赤酵母菌株能表达天然N端人源溶菌酶成熟肽。重组毕赤酵母菌株能高表达人源溶菌酶，这将有利于我国溶菌酶蛋白的大规模工业化生产，有较大经济效益和社会效益。

发明内容

本发明目的是提供种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法，实现发酵法高效生产人源溶菌酶。

本发明构建了含高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌，并进行了相应的发酵试验。根据本发明的第一方面，本发明采用的技术方案是：

一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，命名为FHX-LYC71，按相关标准保存重组菌株于-80℃低温冰箱中。其保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2021181，保藏时间为2021年2月4日，中国典型培养物保藏中心的地址是湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编430072。分类命名为Pichia sp.。

本发明的高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌是将人工合成序列SEQ ID NO.1以BamHI和EcoRI位点装载于pPIC9K 以上，构建pPIC9K-LYC71，以SalI线性化上pPIC9K-LYC71后，以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得，所述高拷贝是指人溶菌酶基因的拷贝数为大于等于8。所述毕赤酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，所述的毕赤酵母工程菌命名为重组毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)FHX-LYC71。所涉及人溶菌酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，对应人源溶菌酶(NCBI数据库登入号GenBank Protein ID：NP_000230)的成熟肽。

根据本发明的上述技术方案，本发明利用pPIC9K载体，构建了一种含高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌，其具体特点说明如下：

在针对人源溶菌酶一些专利中，经常利用XhoI、EcoRI位点在Ppic9载体上进行构建，但pPIC9没有Kan抗性基因，没法进行多拷贝转化子的筛选，这样难以得到高表达人源溶菌酶的毕赤酵母菌株。因为在pPIC9K有两个XhoI位点，分别位于1193和5710位，故该方法不便在pPIC9K上进行操作。而若利用pPIC9K 框架上的多克隆位点SnaBI、EcoRI、AvrII和NotI插入编码人溶菌酶的DNA都会不可避免的在合成人源溶菌酶成熟肽的N端中引入外源的氨基酸，这会导致发酵所得到的人源溶菌酶蛋白和天然人源溶菌酶蛋白在性质上有差异。而本发明利用pPIC9K上939位的BamHI和1223位的EcoRI位点插入人工合成的SEQ IDNO.1，其SEQ ID NO.1，前半部分对应分泌信号肽alpha-factor，后半段在双EAEA序列后无间隙地连接具天然N端人源溶菌酶成熟肽，其合成蛋白在KR位点被内切蛋白酶Kex2p切割,最后2个EA重复序列被二肽氨基肽酶a修剪，故能生成具天然成熟肽N端的人源溶菌酶。Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约 0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。Ppic9k载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5mg/ml(1-2拷贝)到4mg/ml(7-12拷贝)。本发明在高溶度遗传霉素 (4mg/ml)压力下，使含人源溶菌酶重组质粒在毕赤酵母基因组进行多拷贝整合，以增加所需蛋白的表达量。本发明利用pPIC9K构建的生成具天然成熟肽N端的人源溶菌酶重组pPIC9K毕赤酵母在高浓度遗传霉素(4mg/ml)压力下，使含人源溶菌酶重组质粒在毕赤酵母基因组进行多拷贝整合，以增加所需蛋白的表达量。

并经定量PCR分析表明该重组毕赤酵母工程菌人溶菌酶基因的拷贝数在该重组毕赤酵母工程菌为大于等于8。最后在15升的发酵罐中证实了该重组毕赤酵母工程菌中发酵液溶菌酶活性达到56000单位每毫升以上，产量可达到每升发酵液 2.8克人源溶菌酶蛋白(纯度为95％)，高于当前报道的人源溶菌酶发酵生产的产量。

本发明构建了一种含高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌能表达具成熟肽天然N端的人源溶菌酶。这种重组表达的具成熟肽天然N端的人源溶菌酶，相比在成熟肽N端引入外在的氨基酸的人源溶菌酶，有多方面的优势：1. 避免N端引入外在的氨基酸引入可能导致的在医学应用上可能存在的功能改变； 2.避免N端引入外在的氨基酸引入可能导致溶菌酶活性改变，降低；3.避免N端引入外在的氨基酸引入可能导致溶菌酶蛋白稳定性下降，因为细胞内蛋白的稳定性受到N端氨基酸重大影响。

本发明所述发酵生产人源溶菌酶的重组毕赤酵母工程菌被命名为 FHX-LYC71，进行保藏，本工程菌可直接高效发酵生产人源溶菌酶，发酵制备的人溶菌酶适合用于医药、日化、食品和饲料行业。

本发明所述重组毕赤酵母工程菌(FHX-LYC71)的构建方法，包括以下步骤：

1)通过基因合成公司合成人工合成序列SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.1中包含alpha-factor序列和密码子优化的人溶菌酶成熟肽序列，并将SEQ ID NO.1以 BamHI和EcoRI位点克隆到分泌型表达质pPIC9K上，获得重组质粒pPic9K-LYC71，图3所示。

2)将重组质粒pPIC9K-LYC71用Sal I单酶切，在His4位点进行线性化, 然化将上述线性化质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，再将转化的毕赤酵母 GS115感受态细胞涂布于MD平板，培养后，挑取MD平板上的His+转化子500个, 将MD平板上的His+转化子500个，接种至含有250μL YPD的96孔板中，30℃，培养24小时。每孔取1μL菌液点样于MM和MD平板上(注意：克隆编号一致)。 30℃，培养至白色菌落出现。对比观察，若在MD和MM平板上生长均良好的克隆即Mut+表型；若MD平板上生长良好而在MM平板上生长不良或不长的克隆即为 Muts表型。挑选MD和MM平板均生长均良好的克隆即Mut+表型200个；

3)G418抗性筛选：用灭菌牙签在MD平板上挑取Mut+表型的克隆200个，接种至含为2.0，3.0,4.0mg/mL遗传霉素G418的YPD平板上，30℃培养72～96 小时。挑选遗传霉素G418的YPD平板上的克隆多个，

4)上面遗传霉素G418的YPD平板上的克隆多个，先经PCR验证，然后经定量PCR分析，挑选在4.0mg/mL遗传霉素G418的YPD平板上生长，经定量PCR 分析验证人溶菌酶基因的拷贝数在该重组毕赤酵母工程菌为大于等于8的20个转化子，用于下面的小量表达试验。

5)，重组菌株小量表达试验，对在4.0mg/mL遗传霉素G418的YPD平板生长，并且经定量PCR分析表明人溶菌酶基因的拷贝数在酵母基因组为大于等于8 的转化子20个，进行小量表达试验，(1)挑取单菌落，接种3ml YPD培养基于试管中，28～30℃，250rpm，震荡培养至OD600＝2～6(16～18h)；(2)取1ml上述菌液，接种30ml BMGY培养基于250ml的三角瓶，进行摇瓶培养，于28～30℃， 250rpm，震荡培养24h；(3)用50ml无菌离心管室温1500×g离心5min，收集菌体，用等体积的BMMY培养基重悬菌体，转入摇瓶，开始诱导，于28～30℃，250rpm 摇床继续培养；(4)此后每24小时向培养基中添加甲醇1％，72小时后结束培养，将发酵液经12000rpm离心1min，收集上清液，于-20℃保存，分析目的蛋白的表达量和酶活性。所述YPD平板组成如下：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖 10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水；所述培养基终浓度组成：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；最后挑选其中高表达的 5株，以应用于下面的摇瓶表达

6)重组毕赤酵母的摇瓶表达

将上面挑选高表达菌株的5株，进行小量表达试验，(1)挑取单菌落，接种 3ml YPD培养基于试管中，28～30℃，250rpm，震荡培养至OD600＝2～6(16～18h)； (2)取1ml上述菌液，接种30ml BMGY培养基于250ml的三角瓶，进行摇瓶培养，于28～30℃，250rpm，震荡培养24h；(3)用50ml无菌离心管室温1500×g离心 5min，收集菌体，用等体积的BMMY培养基重悬菌体，转入摇瓶，开始诱导，于 28～30℃，250rpm摇床继续培养；(4)此后每24小时向培养基中添加甲醇1％，72 小时后结束培养，将发酵液经12000rpm离心1min，收集上清液，于-20℃保存，分析目的蛋白的表达量和酶活性。所述YPD平板组成如下：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水；所述培养基终浓度组成：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；最后挑选其中高表达的2株用于下面的发酵罐表达试验。

7)表达菌株的发酵罐表达

将高表达的2株重组毕赤酵母工程菌分别接种到YPD平板上，分别进行试验，具体如下：重组毕赤酵母工程菌分别接种到YPD平板上，28℃培养45h；挑取平板单菌落接种到500ml YPD培养基中，28℃，210r/min培养24小时，当 OD600＝3～5时，可准备接种于发酵罐。得到种子培养液；

发酵罐里BSM发酵培养基灭菌，冷却后用20％氨水调节pH5.4，将培养好的 YPD种子培养液通过火圈法接入含7.5L BSM发酵培养基的15L全自动发酵罐，接种量5％，初始搅拌转速为230r/min，通气量为2vvm，生长阶段温度为28℃，

设置溶氧(DO)-转速联动。通过调节搅拌转速和通气量以维持DO在20-30％左右。当发酵罐中的甘油耗尽后，可观察到DO值上升，表明甘油已经耗尽；此时开始流加50％甘油溶液；当菌体达到一定浓度后，停止补料。停止补加甘油后，菌体维持饥饿状态45分钟，待甘油彻底耗尽，开始甲醇诱导。开始以变速流加的方式限制性的流加补料诱导培养基，诱导人源溶菌表达；诱导阶段温度为 25℃，pH5.5-6.0。控制甲醇补料培养的补料速率为2.8-3.4mL/h/L起始发酵培养基，维持溶解氧DO大于10％，诱导后78小时结束发酵；最后挑选1株表达量最高的工程菌命名为FHX-LYC71，该FHX-LYC71工程菌的78小时发酵后，发酵液溶菌酶活性达到56000单位每毫升以上；产量可达到每升发酵液2.8克人源溶菌酶蛋白。

8)将FHX-LYC71工程菌在-80℃低温冰箱中进行保藏。

附图说明

图1为质粒pPIC9K图谱。

图2为质粒pPIC9K在多克隆位点和alpha-factor附近的图谱。

图3为重组质粒pPIC9K-LYC71的图谱；

BamH1 and EcoR之间利用双酶切位点插入了人工合成序列SEQ ID NO.1，其人工合成序列前半段表达alpha-factor，后半段在双EAEA序列后无间隙地连接具天然N端人源溶菌酶成熟肽。

图4是pPIC9K-LYC71克隆鉴定图；

泳道M为DNA marker DL2000，1、3为pPIC9K-LYC阳性克隆，2、4为PIC9K- 空载体。

图5是pPIC9K-LYC71重组质粒线性化后电转入毕赤酵母的PCR验证图；

MW为DNA marker DL2000，2、3为阳性克隆，1、4、5为阴性克隆。

图6是SDS-PAGE检测发酵上清液蛋白表达量图；

MW，蛋白Marker，1，发酵上清液蛋白(15L发酵罐，78小时)2，发酵上清液超滤浓缩蛋白液，3，发酵上清液超滤浓缩蛋白液。

具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

LB培养基：酵母粉5.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水， pH7.0。

YPD培养基：酵母粉10.0g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为去离子水，pH自然。

MD培养基：1.34g/L酵母氮源碱(YNB)，0.4mg/L生物素，10g/L葡萄糖，溶剂为去离子水。

MM固体培养基组成：1.34g/L酵母氮源碱YNB，0.4mg/L生物素，5mL/L甲醇，100mMpH6.0磷酸钾缓冲液，15g/L琼脂粉。

BMGY培养基：l0g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，1.34g/L YNB，0.4mg/L生物素， 10g/L甘油，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0。

BMMY培养基：酵母粉l0g/L，蛋白胨20g/L，1.34g/L YNB，0.4mg/L生物素， 5mL/L甲醇，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液。

发酵培养基质量终浓度组成：26.7ml/L的85％磷酸，0.93g/L的硫酸钙， 18.2g/L的硫酸钾，14.9g/L的MgSO4·7H2O，4.13g/L的氢氧化钾，40g/L的甘油，4.35ml/LPTM1缓冲液，溶剂为去离子水，pH5.0。

甘油补料培养基是向质量浓度25％甘油中添加12ml/L PTM1缓冲液。

甲醇补料培养基是向无水甲醇中添加12ml/L PTM1缓冲液。

PTM1缓冲液：6.0g/L CuSO4·5H2O，0.08g/L的碘化钠，3.0g/L MnSO4·H2O，0.2g/LNa2MoO4·2H2O，0.02g/L硼酸，0.5g/L氯化钴，20.0g/L氯化锌，65.0g/L FeSO4·7H2O，0.2g/L生物素，5.0ml/L硫酸，溶剂为去离子水，过滤消毒。

实施例1

根据NCBI数据库GenBank Protein ID为NP_000230.1的人源溶菌酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，结合本公司(上海复华兴生物技术有限公司)拥有专利(专利号：ZL01132373.6)涉及的密码子优化编码人源溶菌酶的DNA序列，人工合成其核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，并将片段克隆到pPIC9K的BamH1与EcoR1之间，得到重组质粒，命名为pPIC9K-LYC71，如图3所示，将其转化到E.coli DH5α 菌株中，得到E.coli DH5α(pPIC9K-LYC71)重组菌株。

实施例2构建多拷贝高表达人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌

多拷贝高表达人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，将线性化 pPIC9K-LYC71质粒转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115后，通过先筛选Mut+ 和Muts转化子，再在不同溶度遗传霉素(G418)的YPD平板上筛选，最后挑选在4.0mg/mL遗传霉素(G418)的YPD平板上的阳性克隆，经常规PCR鉴定阳性克隆，再经定量PCR鉴定拷贝数，最后通过三角瓶摇瓶实验，和发酵罐实验，鉴定得到高表达人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌

实施例1和2的具体实施方案如下：

1.pPIC9K-LYC71质粒的构建

1)，以LYC71-all-F：5’-CGAAGGATCCAAACGATGAGATTTCC-3’，LYC71-all-RF: 5’-TAGGGAATTCCTAGACACCGCAAC-3’为引物，其中，LYC71-all-F的序列号为SEQ ID NO.3，LYC71-all-RF序列号为SEQ ID NO.4，以人工合成的序列SEQ ID NO.1 为模板，进行PCR扩增，在LYC71-all-F的含BamHI位点，在LYC71-all-RF含 EcoRI位点。PCR反应体系：

PCR反应条件：95℃，5min→(95℃，30s；63℃，30s；72℃，1min)×33 →72℃，5min→4℃，5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳并回收，回收 DNA片段命名为LYC71-all

2).分别用限制性内切酶BamHI,EcoRI对上面的目的片段的PCR回收产物 LYC71-all和表达载体pPIC9K进行双酶切，酶切反应体系如下：

37℃酶切4小时后，将酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后用GenClean 柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。

回收的目的片段和pPIC9K载体进行连接，连接反应体系如下：

16℃连接过夜。

取上面的连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

用pPIC9K载体的通用引物用：5'-AOX：'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'； 3'-AOX：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，其中，5'-AOX的序列号为SEQ ID NO.5， 3'-AOX的序列号为SEQ ID NO.6；进行PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆的大小约890 bp，空载体约460bp，具体结果如图4所示。，鉴定出的阳性克隆菌液进行测序。比对结果正确的阳性克隆，命名为pPIC9K-LYC71，甘油进行保菌，用于后续实验。

2.线性化pPIC9K-LYC71质粒和电转化DNA样品的制备

将菌株E.coli DH5α(pPIC9K-LYC71)接种到含有100μg/mL的氨苄青霉素的 LB培养基，37℃过夜培养后，采用质粒提取试剂盒提取pPIC9K-LYC71质粒；将重组表达质粒pPIC9k-LYC71(238ng/μl)，用Sal I进行线性化酶切反应。采用 50μl反应体系，共3管，酶切反应体系如下：

将以上溶液依次加入0.5ml Eppendorf管中，37℃酶切过夜。取2μl酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，若反应完全，将各管合并，用苯酚/氯仿抽提法进行线性化质粒的纯化，最后将线性质粒溶于20μl ddH2O中，-20℃冻存备用。

3.巴斯德毕赤酵母菌株GS115感受态细胞的制备

(1)挑取一个毕赤酵母单菌落接种于3mlYPD培养液中，于30℃摇床，250rpm 振荡培养，约12h，取1ml菌液接种于100ml培养液中，于30℃摇床，250rpm振荡培养至OD600为1.0～2.0(6h左右)；

(2)室温1500×g，离心10min，收集菌体。8×108的细胞重悬于8ml溶液 A(100mMLiCl，10mM DTT，0.6M Sorbitol，and 10mM Tris-HCl，pH7.5)中，室温30min，4℃，1500×g，离心5min，收集菌体；

(3)用1.5ml预冷的1M sorbitol重悬，4℃，1500×g，离心5min，收集菌体；

(4)重复步骤三3次，然后用200～500μl预冷的1M sorbitol重悬，止冰上备用。

4.巴斯德毕赤酵母菌株GS115感受态细胞的电转化

在Bio-Rad GenePluser电转仪上进行电转化反应。电转化条件为：电压2000V，电容25μF，电阻200Ω，电转时间5ms左右。

(1)将巴斯德毕赤酵母感受态细胞，重组表达质粒pPIC9k-LYC71的线性化 DNA样品及0.2cm电转化杯置于冰上，预冷10min；

(2)将80μl 1M sorbitol重悬的巴斯德毕赤酵母感受态细胞和10μl线性 DNA混合均匀，冰上放置5min后，将混合物加入0.2cm的电转杯中，擦干电转化杯外壁，并迅速置于电转仪上点击1次，然后立即加入0.5ml预冷的1M sorbitol 溶液，混匀后，转入1.5ml的Eppendorf管中，30℃静置1小时。

(3)加入0.8ml YPD培养基，30℃，250rpm震荡培养1小时后涂布于MD平板。

4.Mut+表型转化子的筛选

用无菌牙签挑取MD平板上生长的单克隆500个，接种至每孔加入120μl YPD 培养液的96孔中，每个孔一个单克隆。30℃培养24小时后，用枪头将每孔的菌液混匀，并分别取1μl菌液点样于MD及MM板上，注意使MD/MM板上的克隆编号对应，30℃培养24～48小时，长出白色菌落。在MD和MM平板上都生长良好的克隆即Mut+表型；在MD平板上生长良好但在MM平板上生长很小或不长的克隆为 Muts表型。

5.利用G418抗性筛选多拷贝克隆

用灭菌牙签在MD帮上挑取Mut+表型的克隆200个，接种至含G418 2mg/ml， 3mg/ml，4mg/ml的YPD平板，30℃培养72～96小时。Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5mg/ml(1-2拷贝)到4mg/ml(7-12拷贝)

6.酵母转化子的PCR鉴定

采用菌液直接PCR的方法，用枪头轻轻蘸取少量平板上(选取含G418 4mg/ml的YPD平板的转化子克隆为主，因为其多拷贝)，溶解于20μl无菌水中，取1μl 作为PCR模板，以人源溶菌酶编码片段引物，LYC71-F:AAGGTCTTCGAGAGATGTGAG

；LYC71-R：GACACCGCAACCTTGGACGT进行PCR扩增，其中，LYC71-F的序列号为SEQID NO.7，LYC71-R序列号为SEQ ID NO.8。

PCR反应体系：

PCR反应条件：95℃，5min→(95℃，30s；63℃，30s；72℃,1min)×30cycs →72℃，5min→4℃，5min。反应结束后，相应的鉴定结果见，用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图5)。相应菌株在-80℃冰箱中保存。

7.重组菌株中人溶菌酶基因拷贝数荧光定量PCR的鉴定

参照郭晋霞，等发表于重庆理工大学学报(自然科学)《荧光定量PCR法检测重组毕赤酵母工程茵的外源基因拷贝数》一文，采用荧光定量PCR的双标准曲线法检测相应重组菌株中的人溶菌酶基因拷贝数：①构建含毕赤酵母内参基因 GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因)的标准质粒pUC18-GAPDH。②RT-PCR双标准曲线的制作：用微量核酸定量仪检测pUC18-GAPDH质粒和pPIC9k-LYC71质粒的质量浓度，以 RT-gap-F(TTGTCGGTGTCAACGAGGAG)/RT-gap-R(GGTCTTTTGAGTGGCGGTC)、 RT-Lyc71-F(AGGTCTTCGAGAGATGTGAG)/RT-lyc71-R(GACACCGCAACCTTGGACG)为引物，进行荧光定量PCR分析，构建RT-PCR双标准曲线，其中，RT-gap-F的序列号为SEQ ID NO.9，RT-gap-R的序列号为SEQ ID NO.10，RT-Lyc71-F的序列号为SEQ ID NO.11，RT-Lyc71-R的序列号为SEQ IDNO.12。③以重组菌株EWC91 基因组DNA1μL为模板，分别以RT-gap-F/RT-gap-R和RT-lyc71F/RT-lyc71-R 为引物，进行荧光定量PCR，将得到的Ct值分别代入双标准曲线中，求出基因组 DNA样品中GAPDH基因和lyc71基因的起始模板拷贝数。GAPDH基因在毕赤酵母基因组中以单拷贝的形式存在，故溶菌酶基因拷贝数＝蛋清溶菌酶基因的起始模板拷贝数/GDPDH基因起始模板拷贝数。分析结果表明，重组菌株基因组中含有8 个人溶菌酶的基因。

8.三角瓶摇瓶发酵筛选高产人溶菌酶的菌株。摇瓶发酵实验分为两个阶段，即在BMGY培养基中的细胞生长阶段和在BMMY中的诱导产酶阶段。挑取重组菌株平板上的单菌落，接种到装有5ml BMGY培养基的50mL离心管中，30℃摇床培养 20h；发酵液OD600在2.0时，将离心管取出并2000×g离心10min，倒掉上清；用5mL的BMMY培养基重悬菌体，加入装有20ml BMMY培养基的250mL三角瓶中，总计25ml的BMMY培养基，在30℃、200rpm摇床中进行诱导培养。每24h后从中取出200μL发酵液，同时补加200μL的无水甲醇，连续诱导发酵3d。取出的发酵液，样品用于溶菌酶酶活测定，将挑选的高表达菌株命名为重组人源溶菌酶毕赤酵母工程菌FHX-LYC71，于在-80℃低温冰箱中保存。并以此进行微生物保藏，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2021181，保藏时间为 2021年2月4日，中国典型培养物保藏中心的地址是湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编430072。

9.将重组人源溶菌酶毕赤酵母工程菌FHX-LYC71接种到YPD平板上，28℃培养45h；个单克隆菌落到一级种子YPD培养基(500ml三角瓶装50mlYPD，121℃高压灭菌20min)中培养24小时左右；菌体浓度OD600达到5.8以上，得到种子培养液；再将上述培养液倒入含有体积比为50％发酵罐培养基(BSM)的YPD二级种子培养基中培养18-20小时左右至菌体浓度OD600达到40.0以上，即得发酵工作种子液。然后以5％的接种量将上面发酵工作种子液接种于15L自动控制发酵罐中，培养基装量为7.5L；培养温度为28℃，搅拌转速为230rpm/min，自动流加氨水控制pH值为5.8-6.1，通气量为3L/min/L，生长阶段温度为28℃，设置溶氧(DO)-转速联动。通过调节搅拌转速和通气量以维持DO在20-30％左右。当发酵罐中的甘油耗尽后，可观察到DO值上升，表明甘油已经耗尽；此时开始流加50％甘油溶液；当菌体达到一定浓度后，停止补料。停止补加甘油后，菌体维持饥饿状态45分钟，待甘油彻底耗尽，开始甲醇诱导。开始以变速流加的方式限制性的流加补料诱导培养基，诱导人源溶菌表达；诱导阶段温度为25℃， pH5.5-6.0。控制甲醇补料培养的补料速率为2.8-3.4mL/h/L起始发酵培养基，维持溶解氧DO大于10％，诱导后78小时结束发酵；发酵液溶菌酶活性达到 56000单位每毫升以上。产量可达到每升发酵液2.8克人源溶菌酶蛋白(纯度为95％)，明显高于常规发酵生产的产量。附发酵液的SDS-PAGE图(见图6)

10.溶菌酶酶活的测定方法，参考国家食品安全标准GB 1886.257-2016的检测方法。酶活单位定义：将一个酶活单位(U)定义为25℃，pH 6.2条件下，使溶壁微球菌菌悬液在450nm处每分钟引起吸光度变化为0.001所需溶菌酶的量。

溶壁微球菌菌悬液的制备：取0.5g溶壁微球菌ATCC4698细胞用含 0.372g/LEDTANa2的pH6.2、0.1mol/L磷酸钠缓冲液制备50ml溶壁微球菌菌悬液，在使用前，将此菌悬液置于28℃恒温摇床中培养30min。此菌悬液在室温下可稳定2h，以含0.372g/LEDTANa2的pH6.2磷酸钠缓冲液调节分光光度计零点，测定溶壁微球菌菌悬液吸光值，450nm处的读数应为0.70±0.1。

酶活力测定方法：精密量取室温下的底物(溶壁微球菌)悬液2mL，置1cm 比色皿中，然后迅速量取供试品溶液0.1mL，加入上述比色皿中，盖下紫外分光光度装置盖子，开始计时，记下反应15s和75s时的光吸收度A₄₅₀，计算二者差值即每分钟吸光度下降数△A₄₅₀。以空白培养基作为空白对照，同法操作，记下反应 15s和75s时的光吸收度A₄₅₀＇，二者差值记为△A₄₅₀＇。

酶活力计算公式：酶活(U/mL)＝[(△A₄₅₀－△A₄₅₀＇)]×D×10⁴

D为稀释倍数。

序列表

<110> 上海复华兴生物技术有限公司义乌市欧雅化妆品有限公司

<120> 一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 685

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgaaggatcc aaacgatgag atttccttca atttttactg cagttttatt cgcagcatcc 60

tccgcattag ctgctccagt caacactaca acagaagatg aaacggcaca aattccggct 120

gaagctgtca tcggttactc agatttagaa ggggatttcg atgttgctgt tttgccattt 180

tccaacagca caaataacgg gttattgttt ataaatacta ctattgccag cattgctgct 240

aaagaagaag gggtatctct cgagaaaaga gaggctgaag ctaaggtctt cgagagatgt 300

gagttggcta gaaccttgaa gagacttggt atggacggtt acagaggtat ttccttggct 360

aattggatgt gcttggctaa gtgggagtct ggctacaata ccagagctac taactacaac 420

gctggtgaca gatccactga ctacggtatt ttccagatca attcccgtta ctggtgcaac 480

gacggtaaga ccccaggcgc tgtcaatgct tgtcacttgt cctgttccgc tttgctgcaa 540

gacaatatcg ctgacgccgt cgcctgtgcc aagagagttg ttagagaccc acaaggtatt 600

agagcttggg tcgcttggag aaatagatgt caaaatagag acgttagaca atacgtccaa 660

ggttgcggtg tctaggaatt cccta 685

<210> 2

<211> 130

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly

1 5 10 15

Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala

20 25 30

Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp

50 55 60

Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser

65 70 75 80

Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala

85 90 95

Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp

100 105 110

Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys

115 120 125

Gly Val

130

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaaggatcc aaacgatgag atttcc 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagggaattc ctagacaccg caac 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaggtcttcg agagatgtga g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacaccgcaa ccttggacgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgtcggtgt caacgaggag 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtcttttga gtggcggtc 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggtcttcga gagatgtgag 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacaccgcaa ccttggacg 19

Claims

1.一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，命名为FHX-LYC71；

其保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2021181。

2.一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示人工合成序列中所涉及特有的编码人源溶菌酶基因序列装载于pPIC9K载体，而不是pPIC9载体。

3.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述毕赤酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

4.如权利要求2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于SEQ ID NO.1序列中以BamH I和EcoR I位点装载于pPIC9K载体上，再整合于毕赤酵母基因组。

5.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于该重组毕赤酵母工程菌能在4.0mg/mL遗传霉素(G418)的YPD平板上生长。

6.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于经定量PCR分析表明该重组毕赤酵母工程菌人溶菌酶基因的拷贝数在该重组毕赤酵母工程菌为大于等于8。

7.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法包括以下步骤：

1)将SEQ ID NO.1所示人工合成序列以BamH I和EcoR I位点装载于分泌型表达质粒pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-LYC71；

2)将重组质粒pPIC9K-LYC71用Sal I单酶切，在His4位点进行线性化,然化将上述线性化质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，再将转化的毕赤酵母GS115感受态细胞涂布于MD平板，培养后，挑取MD平板上的His+转化子500个,然后经在MD和MM平板筛选，挑选MD和MM平板均生长均良好的克隆即Mut+表型200个；

3)将200个Mut+表型转化子接种于在浓度为2.0，3.0,4.0mg/mL遗传霉素G418的YPD平板上，筛选多拷贝转化子；

4)上面筛选得到多拷贝转化子，先经PCR验证，然后经定量PCR分析，挑选在4.0mg/mL遗传霉素G418的YPD平板上生长，经定量PCR分析验证人溶菌酶基因的拷贝数在该重组毕赤酵母工程菌为大于等于8的20个转化子；

5)将步骤4)挑选的转化子进行小量表达溶菌酶试验，然后挑选其中高表达的5株，进行摇瓶诱导表达实验，

6)将上面挑选的5株高表达工程菌摇瓶诱导表达实验，5株高表达工程菌分别接种到YPD平板上，分别进行摇瓶甲醇诱导表达实验，72小时后结束培养，将发酵液经12000rpm离心1min，收集上清液，于-20℃保存，分析目的蛋白的表达量和酶活性；最后挑选其中高表达的2株，保存，用于下面的发酵罐发酵检验

7)发酵罐发酵检验，具体如下，将上面2株重组毕赤酵母工程菌分别接种到YPD平板上28℃培养45h；挑取平板单菌落接种到500ml YPD培养基中，28℃，210r/min培养24小时，当OD600＝3～5时，可准备接种于发酵罐；得到种子培养液；

然后以5％的接种量将所述种子培养液接种于含7.5L培养基的15L自动控制发酵罐中，培养温度为28℃，搅拌转速为230rpm/min，自动流加氨水控制pH值为5.8-6.1，通气量为3L/min/L，生长阶段温度为28℃，设置溶氧DO-转速联动；通过调节搅拌转速和通气量以维持溶氧在20-30％左右；当发酵罐中的甘油耗尽后，可观察到DO值上升，表明甘油已经耗尽；此时开始流加50％甘油溶液；当菌体达到一定浓度后，停止补料；停止补加甘油后，菌体维持饥饿状态45分钟，待甘油彻底耗尽，开始甲醇诱导；开始以变速流加的方式限制性的流加补料诱导培养基，诱导人源溶菌表达；诱导阶段温度为25℃，pH5.5-6.0；控制甲醇补料培养的补料速率为2.8-3.4mL/h/L起始发酵培养基，维持溶解氧DO大于10％，诱导后78小时结束发酵；

在上面的2株中，最后挑选一株表达量最高的工程菌命名为FHX-LYC71，发酵液溶菌酶活性达到56000单位每毫升以上；产量可达到每升发酵液2.8克人源溶菌酶蛋白；

8)将FHX-LYC71工程菌进行保藏。

8.一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌构建方法，其特征在于所述毕赤酵母工程菌是将人源溶菌酶基因的人工合成序列以BamH I和EcoR I位点装载于pPIC9K载体上，再高拷贝整合于毕赤酵母基因组，能高表达人源溶菌酶蛋白，将此工程菌命名为FHX-LYC71，其保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2021181。