CN103468595B - 表达重组人血白蛋白的酵母菌、其构建方法及应用和表达重组人血白蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达重组人血白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌、所述巴斯德毕赤酵母菌的构建方法和应用，以及利用该巴斯德毕赤酵母菌表达重组人血白蛋白的方法。本发明利用交配单倍体酵母菌获得二倍体巴斯德毕赤酵母菌，所述二倍体菌含有两个染色体组，两个染色体组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列，但分别包含不同的筛选标记。利用二倍体菌株具有两个染色体组的性质高效表达重组人血白蛋白，本发明有效地解决了现有技术中表达菌株构建周期长、重组人血白蛋白表达量偏低等问题。

Description

表达重组人血白蛋白的酵母菌、其构建方法及应用和表达重组人血白蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达重组人血白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌，所述巴斯德毕赤酵母菌的构建方法和应用，以及利用所述巴斯德毕赤酵母菌表达重组人血白蛋白的方法。

背景技术

人血白蛋白（HSA）是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的40%～60%，在体内起着维持血浆胶体渗透压、运输营养等重要作用。人血白蛋白临床上主要用于失血创伤、烧伤引起的休克、脑水肿及损伤引起的颅压升高、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；在心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗及成人呼吸窘迫综合征中也有广泛应用，是医院临床急救或重症手术的必备药品，在医院市场一直占据举足轻重的地位。人血白蛋白通常由血浆提取。由于浆站改制及血液制品安全监管力度的加强等诸多因素的影响，国内市场以人血白蛋白为代表的血液制品供应严重短缺，供需矛盾问题突出。采用基因工程方法生产重组人血白蛋白具有原料来源丰富、质量可控、可形成规模化生产等优点，同时可以彻底消除病毒污染危险，对于缓解国内人血白蛋白供不应求的局面、消除血源产品的安全风险具有十分重要的社会意义和经济意义，具有广阔的发展空间和市场前景。

目前，重组人血白蛋白已经在巴斯德毕赤酵母（日本三菱制药株式会社）的表达系统获得成功表达及生产，相关药物已上市销售（商品名）。巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，而且培养成本低，产物易分离，现已广泛用于外源蛋白的表达。

巴斯德毕赤酵母通常是以单倍体形式存在，当环境营养限制时，2个单倍体细胞通过交配融合成二倍体，但是在营养贫瘠时，二倍体倾向于以有性生殖方式进行减数分裂，产生单倍体的子囊孢子。基于目前大部分产品剂量较小，单倍体巴斯德毕赤酵母已经具有较好的表达效率，可以满足大部分产品的生产需求。而二倍体巴斯德毕赤酵母的构建成本可能比较高、构建过程可能比较复杂，目前对于二倍体巴斯德毕赤酵母菌的研究仅限于遗传学研究，几乎没有采用其进行外源蛋白表达的研究报道。

现有技术中，通常采用增加插入酵母基因组中目的蛋白表达盒拷贝数的方法提高表达量，如对表达菌株进行多次电击转化或是不断提高表达菌株的抗性筛选浓度（无抗性标记的菌株不适用）等。但此类方法需要耗费大量的时间来对大量的重组子进行鉴定和筛选，同时结果具有不可预测性，操作复杂，成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达重组人血白蛋白的二倍体巴斯德毕赤酵母菌及其制备方法，所述方法能够低成本、便捷地制备二倍体巴斯德毕赤酵母菌，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌能够高效表达重组人血白蛋白，有效解决现有技术中表达菌株构建周期长、表达量偏低等问题。

在第一个方面，本发明提供一种二倍体巴斯德毕赤酵母菌，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌含有两个染色体组，两个染色体组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列但分别包含不同的筛选标记。

在第二个方面，本发明提供一种构建表达重组人血白蛋白的二倍体巴斯德毕赤酵母菌的方法，所述方法使用两种均含有人血白蛋白成熟肽编码序列但具有不同筛选标记的单倍体巴斯德毕赤酵母菌，通过将两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

在第三个方面，本发明提供本发明的二倍体巴斯德毕赤酵母在表达重组人血白蛋白中的应用。

在第四个方面，本发明提供一种表达重组人血白蛋白的方法，所述方法包括发酵本发明的二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

利用交配方法进行二倍体巴斯德毕赤酵母菌株的选育，在短期内便可得到拷贝数不低于2的二倍体巴斯德毕赤酵母菌株，这无论是从筛选时间上还是工作量上都要少于上述常规方法。选育的二倍体菌株可以稳定存在并且高效表达重组人血白蛋白，所表达的蛋白结构正确。本发明大幅度的提高了表达效率，与现有的常规生产菌株相比，表达量大幅度提高；且本发明操作简单，成本低廉，易于实现产业化生产。

附图说明

图1为实施例1中载体pUC57-Alb结构示意图。

图2为实施例2中重组表达载体pPIC9K-AlbN结构示意图。

图3为实施例3中重组表达载体pPIC9-AlbN结构示意图。

图4为实施例4中重组表达载体pPIC9-AlbA结构示意图。

图5为实施例5中重组表达载体pPICZα-AlbA结构示意图。

图6为实施例8中各二倍体菌株、单倍体对照菌株GS115-AlbN及阴性对照菌株GS115的摇瓶表达量分析结果图，其中纵坐标代表重组人血白蛋白的表达量（mg/L）。

图7为实施例9中二倍体菌株MFD2和单倍体对照菌株GS115-AlbN在100L发酵规模上的重组人血白蛋白表达量增长曲线图。其中，横坐标代表发酵周期（小时），纵坐标代表表达量（g/L），“—●—”代表MFD2菌株表达量，“—■—”代表GS115-AlbN菌株表达量。

图8为实施例10中所得样品的HPLC纯度结果图。

具体实施方式

在本申请文件中，单倍体巴斯德毕赤酵母菌是指含有一个染色体组的巴斯德毕赤酵母细胞，二倍体巴斯德毕赤酵母菌是指含有两个染色体组的巴斯德毕赤酵母细胞。

本发明中的人血白蛋白编码序列（SEQIDNO:1）具体信息来自于GenBank公开的序列（登录号：AY728024.1），所述人血白蛋白编码序列包括5’酶切位点、人血白蛋白信号肽编码序列（SEQIDNO:2）和人血白蛋白成熟肽编码序列（SEQIDNO:3）和3’酶切位点。本文中所称的人血白蛋白成熟肽编码序列即为SEQIDNO:3所示序列。

在第一个方面，本发明的二倍体巴斯德毕赤酵母菌含有两个染色体组，两个染色体组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列但包含不同的筛选标记。

所述筛选标记可以均选自营养缺陷型筛选标记或均选自抗生素筛选标记。在一种实施方式中，其中一个染色体组含有营养缺陷型筛选标记和/或抗生素筛选标记，另一个染色体组含有与第一个染色体组不同的营养缺陷型筛选标记和/或抗生素筛选标记。或者，在另一种实施方式中，其中一个染色体组同时含有营养缺陷型筛选标记和抗生素筛选标记，另一个染色体组不含任何筛选标记。

优选地，所述营养缺陷型筛选标记选自磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰羧胺合成酶基因ADE系列，磷酸乳清酸脱羧酶基因URA3，乳清酸磷酸核糖基转移酶基因URA5，精氨酸合成途径基因ARG系列，组氨酸合成途径基因HIS系列，赖氨酸合成途径基因LYS系列，蛋氨酸合成途径基因MET系列或脯氨酸合成途径基因PRO系列。

优选地，所述抗生素筛选标记选自印度斯坦异壁链霉菌（Streptoalloteichushindustanus）的Shble基因（Zeocin抗性），土曲霉（Aspergillusterrus）的杀稻瘟素-S-脱氨酶基因（杀稻瘟素抗性），转座子Tn903的卡那霉素抗性基因（G418抗性）或吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的Hph基因（潮霉素抗性）。

优选地，所述两个染色体组分别来自于两种均含有人血白蛋白成熟肽编码序列、但具有不同的筛选标记的单倍体巴斯德毕赤酵母菌；进一步优选地，通过两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌的交配获得所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

优选地，所述人血白蛋白成熟肽编码序列以包含在基因表达盒中的形式存在于表达载体中，所述表达载体还包括营养缺陷型筛选标记和/或抗生素筛选标记基因，将所述表达载体转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞后通过筛选获得单倍体巴斯德毕赤酵母菌。所述表达载体选自pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pAO815、pGAPZα、pPICZα或它们的衍生载体，优选地所述表达载体为pPIC9、pPIC9K或pPICZα。

进一步优选地，所述包含人血白蛋白成熟肽编码序列的基因表达盒的结构从5’到3’依次包括：启动子序列、信号肽序列、人血白蛋白成熟肽编码序列和终止子序列。这些序列可操作性地相连。所述启动子选自AOX1启动子、AOX2启动子、GAP启动子、FLD1启动子、PEX8启动子或YPT1启动子，优选AOX1启动子。所述信号肽序列选自α因子信号肽序列或人血白蛋白信号肽序列。所述终止子序列可以是本领域技术人员已知的任何适用的终止子序列。

进一步优选地，所述巴斯德毕赤酵母宿主细胞是GS115（his4，Mut+）或X33。但本领域技术人员已知，很多其它已知的巴斯德毕赤酵母宿主细胞都可以应用于本发明，而不影响本发明的实质内容。

在优选的实施方式中，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌是本发明的MFD1-7菌株。

在第二个方面，本发明提供构建表达重组人血白蛋白的二倍体巴斯德毕赤酵母菌的方法。

在优选的实施方式中，该方法中使用的单倍体巴斯德毕赤酵母菌通过以下方法构建：

（1）获得人血白蛋白成熟肽编码序列，如可以通过全基因合成法或通过PCR法获得；

（2）将获得的编码序列插入到一种或多种表达载体中，得到含有人血白蛋白基因表达盒的载体；优选地，所述表达载体包含一种或多种筛选标记；进一步优选地，所述筛选标记选自如上文第一方面所述的营养缺陷型筛选标记或抗生素筛选标记；所述表达载体是如上文第一方面所述的具体表达载体；

（3）将步骤（2）得到的载体线性化，如通过限制性内切酶酶切，电击转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞，经过筛选获得单倍体巴斯德毕赤酵母菌；优选地，所述巴斯德毕赤酵母宿主细胞是GS115（his4，Mut+）或X33。

进一步优选地，本发明的构建二倍体巴斯德毕赤酵母菌的方法包括将两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌作为亲本在平板上进行交配实验。

在利用本发明的二倍体巴斯德毕赤酵母菌表达重组人血白蛋白时，可以利用本领域公知的方法培养本发明的酵母菌。在工业大规模生产时，为保证二倍体毕赤酵母能够稳定表达重组人血白蛋白，优选地，在发酵后期补加蛋白胨。

下面结合实施例对本发明进行进一步说明，但本发明不限于以下具体实施例和实验内容。

本发明所用的原材料及来源如下所示。如未特别说明，使用的原材料、试剂、仪器均是可以从常规化学或生物试剂生产商处可购买的。

DNA聚合酶、DNA连接酶和限制性内切酶均为NEB公司产品。

质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒为Axygen公司产品。

单倍体巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115（his4，Mut+）和X33，表达载体pPIC9K、pPIC9和pPICZαA为Invitrogen公司产品。

双营养缺陷型宿主菌MF14（his4，arg1::CYC1TT）和MF54（his4，met2::CYC1TT）根据JunjieYANG,WeihongJIANG,ShengYANG.mazFasacounter-selectablemarkerforunmarkedgeneticmodificationofPichiapastoris.FEMSYeastRes.2009,9(4):600-609构建。

基因序列的合成、引物合成以及基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成；pUC57载体由上海生工生物工程有限公司提供。

质谱分子量检测、N末端序列分析、C末端序列分析及圆二色谱分析均由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

实施例1：人血白蛋白编码序列的获得

参考GenBank公开的“Homosapiensserumalbuminprecursor,mRNA,completecds”序列（登录号：AY728024.1），委托上海生工生物工程有限公司合成本发明的人血白蛋白编码序列（合成序列见SEQIDNO：1）。其中，该编码序列的5’端包括有BamHI酶切位点GGATCC，然后连接人血白蛋白信号肽编码序列（SEQIDNO：2），再连接人血白蛋白成熟肽编码序列（SEQIDNO：3），在人血白蛋白成熟肽编码序列的3’末端有EcoRI酶切位点GAATTC。将合成的DNA序列插入到pUC57载体上，命名为pUC57-Alb（载体结构图如附图1所示）。

实施例2：重组表达载体pPIC9K-AlbN的构建

用BamHI和EcoRI内切酶将pUC57-Alb中带有人血白蛋白信号肽编码序列及人血白蛋白成熟肽编码序列的核酸片段切下，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收1800bp左右的核酸片段。用BamHI和EcoRI内切酶将pPIC9K表达载体（Invitrogen，自带α因子信号肽编码序列、his4基因筛选标记、卡那霉素抗性基因）中α因子信号肽编码序列及多克隆位点序列切除，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收9000bp的载体骨架。将上述回收的载体骨架及核酸片段连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有100μg/ml氨苄青霉素抗性（Amp）的LB平板（10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，10g/l氯化钠，15g/L琼脂）筛选阳性克隆。采用质粒小量抽提试剂盒制备质粒，所得质粒用BamHI和EcoRI进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行序列测定。测序结果显示质粒中含有序列正确的人血白蛋白信号肽编码序列及人血白蛋白成熟肽编码序列。将此载体命名为pPIC9K-AlbN（载体结构示意图见附图2）。该载体所包含的人血白蛋白基因表达盒由AOX1启动子-人血白蛋白信号肽编码序列-人血白蛋白成熟肽编码序列-AOX1终止子组成，该载体同时含有his4基因筛选标记及卡那霉素抗性筛选基因（G418）。

实施例3：重组表达载体pPIC9-AlbN的构建

用BamHI和EcoRI内切酶将pUC57-Alb中带有人血白蛋白信号肽编码序列及人血白蛋白成熟肽编码序列的核酸片段切下，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收1800bp左右的核酸片段。用BamHI和EcoRI内切酶将pPIC9表达载体（Invitrogen，自带α因子信号肽序列、his4基因筛选标记）中α因子信号肽编码序列及多克隆位点序列切除，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收9000bp的载体骨架。将上述回收的载体骨架及核酸片段连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有100μg/ml氨苄青霉素抗性（Amp）的LB平板筛选阳性克隆。采用质粒小量抽提试剂盒制备质粒，所得质粒用BamHI和EcoRI进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行序列测定。测序结果显示质粒中含有序列正确的人血白蛋白信号肽编码序列及人血白蛋白成熟肽编码序列。将此载体命名为pPIC9-AlbN（载体结构示意图见附图3），该载体所包含的人血白蛋白基因表达盒由AOX1启动子-人血白蛋白信号肽编码序列-人血白蛋白成熟肽编码序列-AOX1终止子组成，同时该载体含有his4基因筛选标记。

实施例4：重组表达载体pPIC9-AlbA的构建

用上游引物HsaUP1（SEQIDNO：6，含有EcoRI酶切位点）和下游引物HsaDN1（SEQIDNO：7，含有NotI酶切位点）对pUC57-Alb质粒进行PCR扩增反应，获得人血白蛋白成熟肽编码序列的核酸片段。将此核酸片段用EcoRI和NotI进行双酶切，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收1800bp左右的核酸片段。然后与采用同样酶切的pPIC9表达载体（Invitrogen，自带α因子信号肽编码序列、his4基因筛选标记）连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有100μg/ml氨苄青霉素抗性（Amp）的LB平板筛选阳性克隆。采用质粒小量抽提试剂盒制备质粒，所得质粒用EcoRI和NotI进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行序列测定。测序结果显示质粒中含有序列正确的α因子信号肽编码序列及人血白蛋白成熟肽编码序列，将此载体命名为pPIC9-AlbA（载体结构示意图见附图4），该载体所包含的人血白蛋白基因表达盒由AOX1启动子-α因子信号肽编码序列-人血白蛋白成熟肽编码序列-AOX1终止子组成，同时该载体含有his4基因筛选标记。

实施例5：重组表达载体pPICZα-AlbA的构建

用上游引物HsaUP1（SEQIDNO：6，含有EcoRI酶切位点）和下游引物HsaDN1（SEQIDNO：7，含有NotI酶切位点）对pUC57-Alb质粒进行PCR扩增反应，获得人血白蛋白成熟肽编码序列核酸片段。将此核酸片段用EcoRI和NotI进行双酶切，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收1800bp左右的核酸片段，然后与采用同样酶切的pPICZαA表达载体（Invitrogen，自带α因子信号肽编码序列及Zeocin抗性筛选标记）连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有20μg/mlZeocin抗性的LB平板筛选阳性克隆。采用质粒小量抽提试剂盒制备质粒，所得质粒用EcoRI和NotI进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行序列测定。测序结果显示质粒中含有序列正确的α因子信号肽编码序列及人血白蛋白成熟肽编码序列，将此载体命名为pPICZα-AlbA（载体结构示意图见附图5），该载体所包含的人血白蛋白基因表达盒由AOX1启动子-α因子信号肽编码序列-人血白蛋白成熟肽编码序列-AOX1终止子组成，同时该载体含有Zeocin抗性筛选标记。

实施例6：含有人血白蛋白基因表达盒的单倍体巴斯德毕赤酵母工程菌的构建

将含有pPIC9K-AlbN表达载体的大肠杆菌DH5α阳性克隆菌接种于含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基中，37℃培养过夜。离心收集菌体，用质粒小量抽提试剂盒制备质粒。取15μlpPIC9K-AlbN质粒，用PmeI进行酶切线性化。线性化的质粒采用DNA纯化试剂盒进行纯化后置于-20℃保存备用。另取巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115（his4，Mut+）接种至含有3mlYPD液体培养基（10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖）的试管中，30℃培养过夜。取100μl的培养物接种至含有50ml新鲜YPD培养基的250ml三角摇瓶中，30℃培养至OD540达到1.5。将巴斯德毕赤酵母GS115细胞培养物于4℃，3000rpm离心5min，弃上清，加入30ml的冰预冷的无菌水清洗菌体，4℃，3000rpm离心5min，重复一次。加入1ml的冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，取100μl分装至无菌离心管中，置冰上备用。取10μl线性化的pPIC9K-AlbN载体加入到上述100μlGS115感受态细胞中混匀，转至冰预冷的电转化杯中冰浴5min，用吸水纸吸干电转化杯表面水分，转移至电转化仪中，进行电击，电击条件：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，电击时间10ms。电击完毕后，迅速加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，将菌液涂布于MD平板（13.4g/L酵母氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂）上，置于30℃倒置培养至单菌落克隆出现。挑取单菌落用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行PCR法扩增人血白蛋白成熟肽编码序列，所获得的核酸片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收，并送至上海生工生物工程有限公司进行基因序列测定。经测序鉴定正确的阳性克隆命名为GS115-AlbN（G418^R）。由于GS115-AlbN（G418^R）单倍体菌株的基因组完整，不含营养缺陷型基因，因此可以在工业用基本盐培养基（85%磷酸26.7ml/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L）中培养，选用此菌株作为单倍体菌株进行对照研究。

采用上述相同的方法将pPIC9K-AlbN质粒线性化后电击转化宿主菌MF14（his4，arg1::CYC1TT），经MDR平板（13.4g/L酵母氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，40mg/L精氨酸，15g/L琼脂）筛选获得阳性克隆，将测序正确（针对人血白蛋白成熟肽编码序列测序）的阳性克隆命名为MF14K-AlbN（arg1,G418^R）。

采用上述相同的方法将pPIC9-AlbA质粒线性化后电击转化宿主菌GS115（his4,Mut+），经MD平板筛选获得阳性克隆，将测序正确的阳性克隆命名为GS115-AlbA。

采用上述相同的方法将pPIC9-AlbN质粒线性化后电击转化宿主菌MF14（his4，arg1::CYC1TT），经MDR平板筛选获得阳性克隆，将测序正确的阳性克隆命名为MF14-AlbN（arg1）。

采用上述相同的方法将pPIC9-AlbN质粒线性化后电击转化宿主菌MF54（his4，met2::CYC1TT），经MDM平板（13.4g/L酵母氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，40mg/L蛋氨酸，15g/L琼脂）筛选获得阳性克隆，将测序正确的阳性克隆命名为MF54-AlbN（met2）。

采用上述相同的方法将pPIC9-AlbA质粒线性化后电击转化宿主菌MF14（his4，arg1::CYC1TT），经MDR平板筛选获得阳性克隆，将测序正确的阳性克隆命名为MF14-AlbA（arg1）。

采用上述相同的方法将pPIC9-AlbA质粒线性化后电击转化宿主菌MF54（his4，met2::CYC1TT），经MDM平板筛选获得阳性克隆，将测序正确的阳性克隆命名为MF54-AlbA（met2）。

采用上述相同的方法将pPICZα-AlbA质粒线性化后电击转化宿主菌X33，用含有50μg/mlZeocin抗生素的YPD平板筛选获得阳性克隆，将测序正确的阳性克隆命名为X33-AlbZ（Zeocin^R）。

采用上述相同的方法将pPICZα-AlbA质粒线性化后电击转化宿主菌GS115（his4,Mut+），用含有50μg/mlZeocin抗生素的YPD平板筛选获得阳性克隆，将测序正确的阳性克隆命名为GS115-AlbZ（his4，Zeocin^R）。

实施例7：含有人血白蛋白基因表达盒的二倍体巴斯德毕赤酵母工程菌的构建

单倍体菌株MF14-AlbN（arg1）由于arg1基因缺失，导致自身无法合成精氨酸，同理MF54-AlbN（met2）由于met2基因缺失，导致自身无法合成蛋氨酸，因此这两种含有人血白蛋白基因表达盒的单倍体营养缺陷型菌株无法在MD固体培养基中生长。而两种单倍体菌株一旦交配形成二倍体，由于染色体互补，自身缺陷部分在另一套染色体中得到弥补，这便使得新的二倍体菌株可以在MD固体培养基上生长。本发明的发明人正是利用这一原理进行两种单倍体缺陷型菌株的交配实验，方法步骤如下：取上述两种单倍体缺陷型菌株涂于YPD固体培养基上活化，30℃培养至单菌落形成。将活化的两种单倍体缺陷型菌株于MD固体培养基上相互垂直交叉划线，置于30℃培养至两种单倍体菌株交叉点长出单克隆。挑取单克隆划线到新的MD固体培养基上30℃扩增培养。挑取单菌落进行显微镜观察并与单倍体菌落培养物进行比较，以确定形成二倍体菌株，其中二倍体菌落的形态明显大于单倍体菌落。通过PCR的方法进一步对二倍体菌落进行验证，确定所述二倍体菌落包含两套基因组，每套基因组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列。挑取二倍体阳性克隆用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行PCR法扩增人血白蛋白成熟肽编码序列，所得片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收并送至上海生工生物工程有限公司进行基因序列测定。经测序鉴定（针对HSA序列测序）正确的二倍体阳性克隆命名为MFD1。

采用上述相同原理及方法将MF14-AlbA（arg1）和MF54-AlbA（met2）进行交配，经鉴定后获得二倍体阳性克隆命名为MFD2。

采用上述相同原理及方法将MF14-AlbA（arg1）和MF54-AlbN（met2）进行交配，经鉴定后获得二倍体阳性克隆命名为MFD3。

采用上述相同原理及方法将MF14-AlbN（arg1）和MF54-AlbA（met2）进行交配，经鉴定后获得二倍体阳性克隆命名为MFD4。

单倍体菌株GS115-AlbN（G418^R）具有G418抗性，因此可以在含有G418的培养基中生长，但是不能在含有Zeocin的YPD培养基中生长，同理X33-AlbZ（Zeocin^R）具有Zeocin抗性，因此可在含有Zeocin的培养基中生长，但是不能在含有G418的培养基中生长。两种菌在含有50μg/mlZeocin和300μg/mlG418双抗的YPD培养基中均无法生长，但是通过选择压力交配后形成的二倍体菌株同时具有Zeocin和G418抗性，因此可以在筛选平板中生长。首先将上述两种单倍体菌株涂于YPD固体培养基上活化。将活化的两种单倍体缺陷型菌株于含有Zeocin和G418抗生素的YPD固体培养基上相互垂直交叉划线，置于30℃培养至两种单倍体菌株交叉点长出单克隆。挑取单克隆划线到新的含有Zeocin和G418抗生素的固体培养基上30℃扩增培养。挑取单菌落进行显微镜观察并于单倍体菌落培养物进行比较，以确定形成二倍体菌株，其中二倍体菌落的形态明显大于单倍体菌落。通过PCR的方法进一步对二倍体菌落进行验证，确定所述二倍体菌落包含两套基因组，每套基因组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列。挑取二倍体阳性克隆用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行PCR法扩增人血白蛋白成熟肽编码序列，所获得的片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收并送至上海生工生物工程有限公司进行基因序列测定。经测序鉴定正确的二倍体阳性克隆命名为MFD5。

单倍体菌株GS115-AlbZ（his4，Zeocin^R）由于his4基因缺失，导致自身无法合成组氨酸，因此在MD平板中不能生长，但是该菌株含有Zeocin抗性基因，可以在含有Zeocin的培养基中生长。而单倍体菌株GS115-AlbA无Zeocin抗性基因，因此无法在含有Zeocin的培养基中生长。首先将上述两种单倍体菌株涂于YPD固体培养基上活化。将活化的两种单倍体菌株在含有Zeocin的MD固体培养基上相互垂直交叉划线，置于30℃培养至两种单倍体菌株交叉点长出单克隆。挑取单克隆划线到新的含有Zeocin的MD固体培养基上30℃扩增培养。挑取单菌落进行显微镜观察并于单倍体菌落培养物进行比较，以确定形成二倍体菌株，其中二倍体菌落的形态明显大于单倍体菌落。通过PCR的方法进一步对二倍体菌落进行验证，确定所述二倍体菌落包含两套基因组，每套基因组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列。挑取二倍体阳性克隆用5’AOX通用引物（SEQIDNO：4）和3’AOX通用引物（SEQIDNO：5）进行PCR法扩增人血白蛋白成熟肽编码序列，所获得的片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收并送至上海生工生物工程有限公司进行基因序列测定。经测序鉴定正确的二倍体阳性克隆命名为MFD6。

同理利用MF14K-AlbN（arg1,G418^R）的精氨酸营养缺陷型和G418抗性和X33-AlbZ（Zeocin^R）的无G418抗性基因，将活化后的两种单倍体菌株垂直交叉划线于含有G418的MD平板中，经过筛选和鉴定获得阳性二倍体菌株，命名为MFD7。由于X33-AlbZ（Zeocin^R）同时含有Zeocin基因，因此在扩增培养时使用含有G418和Zeocin双抗的MD平板进行筛选，以减少出现的假阳性。

实施例8：二倍体菌株摇瓶表达

为了验证二倍体菌株的重组人血白蛋白表达量比单倍体菌株高，将实施例7制备得到的七株二倍体菌株MFD1-7、单倍体对照菌GS115-AlbN及阴性对照菌株GS115在摇瓶上进行初步表达研究。首先将各菌株按0.5%的比例接种于BMGY培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，1.34%YNB4×10^-5%生物素，1%甘油），每株接种三瓶，30℃培养24h，OD₆₀₀达到15左右。将菌液3000rpm离心5min收集细胞，去除上清液，用BMMY培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，1.34%YNB4×10^-5%生物素，0.5%甲醇）重悬菌体，进行诱导表达。每24h加入终浓度1.5%的甲醇继续诱导。诱导至第5天（120h）结束培养。将发酵液12000rpm离心5min后收集上清液进行HPLC表达量分析。HPLC分析采用TosohG3000SWXL，流动相为含1%异丙醇的pH7.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.6ml/min，检测波长为280nm。各菌株表达量结果见附表1及附图6。结果表明7株二倍体菌株的表达量均达到420mg/L以上，最高可达513mg/ml，明显优于单倍体菌株的253mg/ml。因此二倍体菌株具有明显的表达量优势。

实施例9：二倍体菌株发酵罐表达

将MFD2菌株接种到600mlYPD培养基中，30℃250rpm培养24h，至OD₆₀₀达到10-20。配制30L含有50g/L甘油的基本盐培养基，转移至发酵罐中高压蒸汽灭菌30min。灭菌结束后将发酵罐温度降低至30℃，pH用28%氨水调节至6.0，设置转速300rpm，通气条件为0.2vvm。接种前在培养基中加入120mlPTM1微量元素，并调整溶解氧至100%。然后将600ml种子培养液接种至发酵罐中开始发酵，发酵过程中控制温度30℃，pH6.0，通过搅拌及通气量控制溶解氧不低于20%。培养约20-25h时发酵罐中甘油耗完，此时开始以500ml/hr补料速度流加50%甘油（含12ml/LPTM1），流加约4h后停止甘油补料，开始流加甲醇（含12ml/LPTM1）进行诱导表达。初始甲醇补料速度设置为60ml/hr，5小时后增加至180ml/hr，流加3小时后增加至270ml/hr，并以此速度补料至发酵结束。发酵至200h开始以200ml/hr速度补加90g/L的蛋白胨溶液，防止发酵后期因营养不足导致二倍体菌株单倍体化。整个发酵过程，甲醇补料期约为280h，发酵周期约为310h。发酵过程每天取样HPLC法检测重组人血白蛋白的表达量，检测结果表明（附图7），二倍体菌株MFD2的最高表达量能够达到8.8g/L，而对照单倍体菌株GS115-AlbN在同样发酵时间的表达量只有5.4g/L，二倍体菌株与单倍体菌株相比表达量提高了1.6倍。

将发酵液划线于YPD平板分离单菌落，然后挑取获得的单菌落涂于MD平板上进行二倍体稳定性验证。结果显示，涂布后的MD平板在30℃培养48h后，95%以上菌落均可以正常生长出单菌落，这说明大部分二倍体菌株在发酵结束时仍以二倍体形式稳定存在。

实施例10：二倍体菌株表达的重组人血白蛋白的纯化及结构分析

采用本公司自有纯化工艺（专利申请号：201010154987.4和201210322338.X）对实施例9中收获的发酵液进行纯化后，得到了高纯度的重组人血白蛋白，高压液相色谱法（HPLC）检测纯度可以达到99%以上（见附图8）。

将纯化后的重组人血白蛋白进行质谱分子量检测（上海中科新生命生物科技有限公司），发现与天然人血白蛋白分子量一致。目的蛋白N末端测序结果为：DAHKSEVAHRFKDLG（SEQIDNO：8），C末端测序结果为KLVAASQAALGL（SEQIDNO：9），两端序列与天然人血白蛋白完全相同。圆二色谱检测结果显示，纯化后的重组人血白蛋白与天然人血白蛋白二级结构一致。这说明本发明表达出的重组人血白蛋白的结构与天然人血白蛋白完全一致。

附表1

Claims (24)

1.一种二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述酵母菌含有两个染色体组，两个染色体组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列，但分别包含不同的筛选标记，所述人血白蛋白成熟肽编码序列如SEQIDNO.3所示。

2.根据权利要求1所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述筛选标记选自营养缺陷型筛选标记或抗生素筛选标记。

3.根据权利要求2所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，其中一个染色体组含有营养缺陷型筛选标记和/或抗生素筛选标记，另一个染色体组含有与第一个染色体组不同的营养缺陷型筛选标记和/或抗生素筛选标记。

4.根据权利要求2或3所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述营养缺陷型筛选标记选自磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰羧胺合成酶基因ADE系列、磷酸乳清酸脱羧酶基因URA3、乳清酸磷酸核糖基转移酶基因URA5、精氨酸合成途径基因ARG系列、组氨酸合成途径基因HIS系列、赖氨酸合成途径基因LYS系列、蛋氨酸合成途径基因MET系列或脯氨酸合成途径基因PRO系列；所述抗生素筛选标记选自Shble基因、杀稻瘟素-S-脱氨酶基因、卡那霉素抗性基因或Hph基因。

5.根据权利要求1-3任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述两个染色体组分别来自于两种含有人血白蛋白成熟肽编码序列、具有不同的筛选标记的单倍体巴斯德毕赤酵母菌，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌通过所述两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌的交配获得。

6.根据权利要求1-3任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌是MFD1-MFD5和MFD7菌；

所述MFD1菌是将MF14-AlbN(arg1)和MF54-AlbN(met2)两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得的二倍体巴斯德毕赤酵母菌；

所述MFD2菌是将MF14-AlbA(arg1)和MF54-AlbA(met2)两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得的二倍体巴斯德毕赤酵母菌；

所述MFD3菌是将MF14-AlbA(arg1)和MF54-AlbN(met2)两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得的二倍体巴斯德毕赤酵母菌；

所述MFD4菌是将MF14-AlbN(arg1)和MF54-AlbA(met2)两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得的二倍体巴斯德毕赤酵母菌；

所述MFD5菌是将GS115-AlbN(G418^R)和X33-AlbZ(Zeocin^R)两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得的二倍体巴斯德毕赤酵母菌；

所述MFD7菌是将MF14K-AlbN(arg1,G418^R)和X33-AlbZ(Zeocin^R)两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得的二倍体巴斯德毕赤酵母菌；

所述MF54-AlbA(met2)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPIC9-AlbA质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到双营养缺陷型宿主菌MF54(his4，met2::CYC1TT)的染色体中得到的酵母菌；

所述MF14-AlbA(arg1)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPIC9-AlbA质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到双营养缺陷型宿主菌MF14(his4，arg1::CYC1TT)的染色体中得到的酵母菌；

所述MF54-AlbN(met2)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPIC9-AlbN质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到双营养缺陷型宿主菌MF54(his4，met2::CYC1TT)的染色体中得到的酵母菌；

所述MF14-AlbN(arg1)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPIC9-AlbN质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到双营养缺陷型宿主菌MF14(his4，arg1::CYC1TT)的染色体中得到的酵母菌；

所述GS115-AlbN(G418^R)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPIC9K-AlbN质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到单倍体巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(his4，Mut+)的染色体中得到的酵母菌；

所述X33-AlbZ(Zeocin^R)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPICZα-AlbA质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到单倍体巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的染色体中得到的酵母菌；

所述MF14K-AlbN(arg1,G418^R)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPIC9K-AlbN质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到双营养缺陷型宿主菌MF14(his4，arg1::CYC1TT)的染色体中得到的酵母菌；

所述pPIC9K-AlbN质粒是将SEQIDNO：1所示的DNA分子替换pPIC9K表达载体的BamHI和EcoRI酶切位点间序列，pPIC9K表达载体的其余序列保持不变得到的，所述pPIC9K-AlbN质粒表达人血白蛋白成熟肽；

所述pPIC9-AlbN质粒是将SEQIDNO：1所示的DNA分子替换pPIC9表达载体的BamHI和EcoRI酶切位点间序列，pPIC9表达载体的其余序列保持不变得到的，所述pPIC9-AlbN质粒表达人血白蛋白成熟肽；

所述pPIC9-AlbA质粒的构建包括如下步骤：以pUC57-Alb质粒为模板，以SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增得到基因片段；将所述基因片段替换pPIC9表达载体的EcoRI和NotI酶切位点间序列，pPIC9表达载体的其余序列保持不变即得；所述pPIC9-AlbA质粒表达人血白蛋白成熟肽；

所述pPICZα-AlbA质粒的构建包括如下步骤：将所述基因片段替换pPICZαA表达载体的EcoRI和NotI酶切位点间序列，pPIC9表达载体的其余序列保持不变即得；所述pPICZα-AlbA质粒表达人血白蛋白成熟肽；

所述pUC57-Alb质粒是将SEQIDNO：1所示的DNA分子替换pUC57的BamHI和EcoRI酶切位点间序列，pUC57的其余序列保持不变得到的。

7.一种构建权利要求1-6任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌的方法，其特征在于，所述方法使用两种均含有人血白蛋白成熟肽编码序列但具有不同筛选标记的单倍体巴斯德毕赤酵母菌，通过将两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)获得人血白蛋白成熟肽编码序列；

(2)将获得的人血白蛋白成熟肽编码序列插入到一种或多种表达载体中，得到含有人血白蛋白基因表达盒的载体，所述表达载体包含一种或多种筛选标记；

(3)将步骤(2)得到的表达载体线性化，电击转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞，经过筛选获得单倍体巴斯德毕赤酵母菌；

(4)将两种由步骤(3)获得的单倍体巴斯德毕赤酵母菌作为亲本在平板上进行交配实验，获得二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述表达载体选自pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pAO815、pGAPZα、pPICZα中的至少一种。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母宿主细胞是GS115(his4，Mut+)或X33。

11.根据权利要求1-6任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌在表达重组人血白蛋白中的应用。

12.一种表达重组人血白蛋白的方法，包括培养权利要求1-6任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法用于工业生产，在发酵培养二倍体巴斯德毕赤酵母菌的后期补加蛋白胨。

14.一种二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述酵母菌含有两个染色体组，两个染色体组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列，其中一个染色体组同时含有营养缺陷型筛选标记和抗生素筛选标记，另一个染色体组不含任何筛选标记，所述人血白蛋白成熟肽编码序列如SEQIDNO.3所示。

15.根据权利要求14所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述营养缺陷型筛选标记选自磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰羧胺合成酶基因ADE系列、磷酸乳清酸脱羧酶基因URA3、乳清酸磷酸核糖基转移酶基因URA5、精氨酸合成途径基因ARG系列、组氨酸合成途径基因HIS系列、赖氨酸合成途径基因LYS系列、蛋氨酸合成途径基因MET系列或脯氨酸合成途径基因PRO系列；所述抗生素筛选标记选自Shble基因、杀稻瘟素-S-脱氨酶基因、卡那霉素抗性基因或Hph基因。

16.根据权利要求14所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述两个染色体组分别来自于两种含有人血白蛋白成熟肽编码序列、其中一种同时含有营养缺陷型筛选标记和抗生素筛选标记、另一种不含任何筛选标记的单倍体巴斯德毕赤酵母菌，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌通过所述两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌的交配获得。

17.根据权利要求14-16任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌是MFD6菌；

所述MFD6菌是将GS115-AlbZ(his4，Zeocin^R)和GS115-AlbA两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得的二倍体巴斯德毕赤酵母菌；

所述GS115-AlbZ(his4，Zeocin^R)单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPICZα-AlbA质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到单倍体巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(his4,Mut+)的染色体中得到的酵母菌；

所述GS115-AlbA单倍体巴斯德毕赤酵母菌为将pPIC9-AlbA质粒用PmeI进行酶切线性化后得到的线性化的质粒整合到单倍体巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115(his4,Mut+)的染色体中得到的酵母菌；

所述pPIC9-AlbA质粒的构建包括如下步骤：以pUC57-Alb质粒为模板，以SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增得到基因片段；将所述基因片段替换pPIC9表达载体的EcoRI和NotI酶切位点间序列，pPIC9表达载体的其余序列保持不变即得；所述pPIC9-AlbA质粒表达人血白蛋白成熟肽；

所述pPICZα-AlbA质粒的构建包括如下步骤：将所述基因片段替换pPICZαA表达载体的EcoRI和NotI酶切位点间序列，pPIC9表达载体的其余序列保持不变即得；所述pPICZα-AlbA质粒表达人血白蛋白成熟肽；

所述pUC57-Alb质粒是将SEQIDNO：1所示的DNA分子替换pUC57的BamHI和EcoRI酶切位点间序列，pUC57的其余序列保持不变得到的。

18.一种构建权利要求14-17任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌的方法，其特征在于，所述方法使用两种均含有人血白蛋白成熟肽编码序列、其中一种同时含有营养缺陷型筛选标记和抗生素筛选标记、另一种不含任何筛选标记的单倍体巴斯德毕赤酵母菌，通过将两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)获得人血白蛋白成熟肽编码序列；

(2)将获得的人血白蛋白成熟肽编码序列插入到一种或多种表达载体中，得到含有人血白蛋白基因表达盒的载体，所述表达载体包含一种或多种筛选标记；

(3)将步骤(2)得到的表达载体线性化，电击转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞，经过筛选获得单倍体巴斯德毕赤酵母菌；

(4)将两种由步骤(3)获得的单倍体巴斯德毕赤酵母菌作为亲本在平板上进行交配实验，获得二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述表达载体选自pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pAO815、pGAPZα、pPICZα中的至少一种。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母宿主细胞是GS115(his4，Mut+)或X33。

22.根据权利要求14-17任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌在表达重组人血白蛋白中的应用。

23.一种表达重组人血白蛋白的方法，包括培养权利要求14-17任一项所述的二倍体巴斯德毕赤酵母菌。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述方法用于工业生产，在发酵培养二倍体巴斯德毕赤酵母菌的后期补加蛋白胨。