CN101649340A - 人白细胞介素18的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人白细胞介素18的制备方法，属于白细胞介素。其是在pH至6.0发酵基础盐培养基中培养包含可复制表达载体的毕赤酵母菌株，28－30℃发酵扩增菌体后，将分泌表达重组人白细胞介素18的上清液超滤浓缩，分离纯化、回收人白细胞介素18。本发明所制备人白细胞介素18，其结构和生物学特性同国外大肠杆菌表达的rhIL－18相同；而且产品质量稳定，纯度达到97％左右，发酵液中rhIL－18含量可达202mg/L，产率高，适合于产业化，为实现工业化生产奠定基础。

Description

人白细胞介素18的制备方法

技术领域

本发明涉及白细胞介素，具体地说，是一种应用DNA重组技术利用甲基营养酵母实现的人白细胞介素18的制备方法。

技术背景

白细胞介素18(IL-18)又称IFN-γ诱导因子(IGIF)，是新近发现的前炎症细胞因子(proinflammatory cytokine)，它在机体的免疫和免疫反应中起重要作用。

迄今为止，已有人、小鼠、大鼠、狗、猪、马、牛U个种系的8种IL-18被克隆。

人白细胞介素18基因编码193氨基酸前体蛋白，与鼠IL-18有65％同源性。氨基酸系列包括了IL-1信号肽系列。IL-18可诱导TNF、IL-12、Fas配体、某些激酶的基因表达及合成，参与非特异性免疫及特异性免疫。试验证明IL-18通过细胞毒作用抑制肿瘤生长。实验还提示在脑胶质瘤患者的肿瘤中直接注入IL-18以控制肿瘤生长不失为一潜在的治疗途径。IL-18结合蛋白能降低恶性肿瘤细胞与肝内血管内皮的粘附，可有助于肝转移的辅助治疗，并在肿瘤免疫监测中起重要作用。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统是近十余年来发展很快的极具潜力的一种真核表达系统，现已被普遍用于表达许多有活性的蛋白质。由于毕赤酵母表达系统是真核表达系统，所以完成真核生物特异的蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程，并且具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌、以及表达效率高、表达产物易于纯化等优点，非常适合于大规模发酵生产重组蛋白，展现了其在生物制药领域的广阔应用前景。

毕赤酵母乙醇氧化酶基因(aoxI)是一个甲醇诱导表达的严格调控基因，启动活性高，加入甲醇后可以迅速启动转录，而且N-糖基化方式更接近高等真核生物。α-交配因子信号肽部分已被广泛用于酵母中合成和分泌异源蛋白质。

J Immunol.156(1996)4274-4279报道了“在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达了人白介素18及变异体”，人白介素18以包涵体的形式表达，其纯化方法依次采用疏水层析(phenyl-Sepharose)，阴离子交换层析(DEAE-Sepharose)，凝胶层析(Superdex 75)，反相疏水层析(C4)等方法，经纯化后SDS-PAGE检测纯度达到90％左右。

《重组人IL-18在大肠杆菌中的表达及其抗肿瘤作用》，中国免疫学杂志，2006，22，141-144，报道了人白介素18以包涵体的形式在大肠杆菌胞内表达。表达产物经冰浴后离心，将重组hIL-18包涵体沉淀经充分洗涤后用8mol/L尿素溶解，经复性、透析和G50层析柱分离纯化后蛋白的纯度达到90％左右。

中国专利101177454公开了“IL-18突变体多肽及制备及用途”，其是利用PCR定点突变技术，构建人白介素18突变体(hIL-18)，克隆入含P_R-P_L启动子的温控载体，

并在大肠杆菌中高效表达。利用表达的hIL-18突变体D134R治疗由IL-18造成损伤的疾病。

中国专利1634569公开了一种“动物干扰素基因工程生物活性制剂”，是以基因工程干扰素及其诱导因子白介素18和包被调节因子为原料制成，各成分按生物活性效价所占比例如下：基因工程干扰素5×10⁵活性单位/ml，白介素18×10²活性单位/ml，包被调节因子10活性单位/ml。本发明能够显著增强动物机体免疫机能，快速、有效地消灭、净化侵入动物体内的病毒，提高动物群的生物安全性，减少病毒性传染病的发生及其给养殖户造成的经济损失，保障畜产品的卫生安全，促进动物养殖业的高效稳定发展。

中国专利1777807公开了一种“利用角质形成细胞产生白介素18诱导现象阻碍剂的筛选方法、特异性皮炎样症状的诱导方法及利用”，利用由角质形成细胞(KC)产生白介素18(IL-18)的诱导现象，并可以适用于特异性皮炎(AD)及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发的各种方法及其利用方法。例如通过将来自于金黄色葡萄球菌的蛋白质A(SpA)涂敷于小鼠等的皮肤，或将产生AD样的炎症性皮肤病变的皮肤片移植至小鼠等，从而可以再现AD样的病变中形成的血清中高水平的IgE表达。由此，例如可以筛选诱导KC所导致的IL-18的产生的阻碍剂。

目前，IL-18的制备主要在原核表达体系，但是，由于存在原核表达体系产量低和复性得率低等一些问题，使其成本较高。

发明内容

本发明就是为了解决IL-18的制备产量低和复性得率低、成本较高等问题，而提供一种在真核表达体系毕赤酵母中表达的人白细胞介素18的制备方法。

一种人白细胞介素18的制备方法，其是在发酵基础盐培养基中培养包含可复制真核表达载体的毕赤酵母菌株，发酵扩增菌体后，将分泌表达重组人白细胞介素18的上清液超滤浓缩，分离纯化、回收人白细胞介素18。

所述的人白细胞介素18的制备方法，其表达载体携带编码人白细胞介素18的基因。

所述的人白细胞介素18的制备方法，其表达载体携带编码人白细胞介素18的基因，是将PCR扩增得到含hIL-18成熟肽基因片段，酶切后得到质粒pPICZaC/hIL18，经电转化至新鲜制备的甲基营养型巴斯德毕赤酵母感受态细胞X-33中；重组阳性克隆pPICZaC/IL18/X-33接种于BMGY中培养，离心、弃上清，复用BMMY培养基悬浮细胞，加100％甲醇至终浓度为5mL/L诱导重组蛋白表达获得的。

所述的人白细胞介素18的制备方法，其发酵基础盐培养基pH6.0，28-30℃中发酵扩增菌体密度达220g/L左右时甲醇诱导表达，甲醇最终的流加速度在18ml/h，调节通气量和转速维持溶解氧(DO值)在30-35％，发酵时间为48h。

所述的人白细胞介素18的制备方法，其发酵基础盐培养基中包含有微量元素PTM1 4.35ml/L，生物素0.6mg/L。

所述的人白细胞介素18的制备方法，其发酵基础盐培养基中包含有微量元素PTM1 4.35ml/L，生物素0.6mg/L，蛋白胨0.5％。

所述的人白细胞介素18的制备方法，其发酵扩增菌体过程中，DO值在30-32％。

本发明把hIL-18成熟肽连在α-交配因子信号肽的C-端，AOXI启动子控制下α-交配因子信号肽引导hIL-18成熟肽在毕赤酵母中分泌表达。设计时，为了得到不带有His-tag的蛋白，在扩增hIL-18片段时在其下游引物引入终止密码子，这使得纯化相对困难，但得到的hIL-18由于没有多余的氨基酸，也便于以后的动物实验研究。

发明选择适合真核表达体系巴斯德毕赤酵母来表达hIL-18。此表达体系既具备易于操作，遗传背景清楚，生产成本低等原核生物的特点，又具有真核生物的折叠、分泌机制，可以且生长速度快，培养成分简单，稳定、高产率、能适应工业化生产的需要，并为以后开展其体内或体外生物学活性奠定了良好的基础。本发明经过两步层析纯化纯度达到97％以上，其产量约为202mg/L。

附图说明

图1是PCR产物和重组质粒pPICZaC/hIL18的酶切鉴定；

图2是rhIL-18的SDS-PAGE检测培养上清中总蛋白的表达；

图3是rhIL-18的Western blot分析；

图4是经过各步纯化的rhIL-18 SDS-PAGE分析；

图5是rIL18协同I1-2诱导PBMCs分泌IFN-γ；

图6rIL-18和IL-2诱协同促进NK细胞的细胞毒活性。

具体实施方式

一、方法：

1、hIL-18基因的克隆及载体构建

提取胎儿肝脏组织RNA，以其为模板，根据GenBank公布序列(Accession No.BC007007.)设计引物，上游引物为5’-CCG CTC GAG AAGAGA TAC TTT GGC AAG，下游引物为5’-GCC GCT CTA GAT TAG TCT TCGTTT TGA ACA G(XhoI and XbaI划线所示)，PCR扩增得到含hIL-18成熟肽基因片段。为了终止C-端His-tag的表达，下游引物中Xba I的前面加入终止密码子。PCR扩增产物用XhoI和XbaI酶切后，连于用同样酶切的载体pPICZaC得到质粒pPICZaC/hIL18。连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂于含25mg/L Zeocin LB平板上，酶切鉴定转化产物并测序，提取鉴定正确的阳性克隆质粒用于表达。

2、质粒pPICZaC/IL18的转化及鉴定

将重组表达质粒pPICZaC/hIL18以PmeI线性化，纯化回收。将15μg线性pPICZaC/hIL18电转化至新鲜制备的酵母感受态细胞X-33中，并同时转化空质粒pPICZaC和空酵母菌作对照，转化产物涂布于YPD平板(Zeocin的浓度为100mg/L)。28℃培养2～3d至长出菌落。在YPD平板(Zeocin抗性)上挑取20个克隆，提取转化的毕赤酵母菌基因组DNA，以其为模板，以上面提到的特异引物进行PCR鉴定，并以未转化的酵母菌基因组DNA和空质粒pPICZaC转化的酵母菌基因组DNA作对照，PCR鉴定质粒pPICZaC/hIL18是否稳定转化。

3、摇瓶环境rhIL-18的表达

经鉴定的重组阳性克隆pPICZaC/IL18/X-33接种于10mL BMGY中，28℃、250r/min空气摇床培养至对数生长期(A₆₀₀＝2～6)，3000r/min离心5min，弃上清，用10mL BMMY培养基悬浮细胞，28℃、250r/min诱导rhIL-18表达，培养过程中保持良好的通气。每24h补加100％甲醇诱导重组蛋白表达，至甲醇终浓度为5mL/L。分别在诱导24、48、72、96、120h取1mL培养物离心分离上清，SDS-PAGE分析目的蛋白表达。

BMGY培养基(Buffered Glycerol Complex Medium)，配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液(PH6.0)，1.34％酵母氮源，0.00004％Biotin，1％甘油。均购自美国Invitrogen公司。

BMMY培养基(诱导表达培养基，buffered methanol-complexmedium)配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液(PH6.0)，1.34％酵母氮源，0.00004％Biotin，0.5％甲醇。购自美国Invitrogen公司。

酵母氮源(yeast nitrogen base，YNB)购自美国Invitrogen公司。

4、重组hIL-18的大规模表达

在筛选出高表达菌株后，重组hIL-18在3.7L发酵罐进一步表达。挑取筛选出的阳性转化子于10mL BMGY培养基，28℃、250r/min振摇培养24h，然后接种到200mL的BMGY培养中，28℃、250r/min振摇培养24h至A₆₀₀到6左右。2L发酵基础盐培养基(BSM)添加8.7mL PTM1微量元素和6mL 0.2g/L生物素。28mL/L氨水调整培养基的pH至6.0。首先扩增菌体，培养至菌体湿重达到220g/L，待碳源完全消耗尽，开始补加100％甲醇诱导rhIL-18的表达，甲醇补加速度为6mL/h 2h，10mL/h2h，最后18mL/h维持至发酵结束。发酵过程中，调节通气量和转速维持溶解氧(DO值)30-32％，通过NH₄OH或H₃PO₄的泵入维持pH的稳定，通过循环冷凝水维持温度的稳定，发酵每隔6h取样进行分析A₆₀₀和细胞湿重，留上清用于蛋白分析。

发酵基础盐培养基(basal salt medium，BSM)购自美国Invitrogen公司，上海杰美基因医药科技有限公司经销。

5、rhIL-18的纯化

hIL-18的分子量是18kDa，分子量介于10kDa和30kDa之间的蛋白用超滤浓缩装置分离。发酵结束后，首先选择30kDa的超滤浓缩装置离心样品，收集超滤液，此超滤液为分子量小于30kDa的蛋白。然后将此超滤液用10kDa的超滤浓缩装置离心收集浓缩液，分子量小于10kDa的蛋白被超滤掉，因此，浓缩液中的蛋白分子量大小介于10kDa和30kDa之间。浓缩液中缓慢加入(NH₄)₂SO₄粉末至终浓度达到20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，80％，放置4℃过夜，离心后SDS-PAGE分析发现50％以上饱和度的(NH₄)₂SO₄沉淀中含有rhIL-18。然后用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)配制的20％、25％、30％、35％、40％、45％饱和度的(NH₄)₂SO₄溶液平衡Phenyl Sepharose 6FF疏水层析树脂。分别加入相同(NH₄)₂SO₄饱和度的发酵上清液于疏水柱，用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗脱蛋白，紫外监测下分部收集洗脱液，用于蛋白分析。将上述疏水层析洗脱的蛋白溶液调节至pH 8.0，加入500mmol/LTris-HCl(pH8.0)使其浓度达到50mmol/L。加样于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡好Q Sepharose HP阴离子层析柱，用50mmol/LTris-HCl(pH8.0)/1M NaCl进行梯度洗脱，紫外监测下分部收集洗脱液，用于蛋白分析。用Bradford试剂盒测定蛋白含量。HPLC和SDS-PAGE分析蛋白的纯度。

6、rhIL-18的鉴定

利用15％SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及纯化结果。将rhIL-18转移到PVDF膜上，用山羊抗人IL-18抗体为一抗，以HRP标记的兔抗山羊IgG抗体为二抗进行分析。Bradford法检测rhIL-18培养上清中总蛋白含量。采用SDS-PAGE电泳凝胶扫描半定量分析目的蛋白表达量。

7、rhIL-18刺激PBMCs产生IFN-γ

用RPMI1640-10％FCS培养基稀释标准品rhIL-18和纯化的rhIL-18各两组，浓度分别为0.4nmol/ml，4nmol/ml，40nmol/ml分别加到96孔板，100μl/孔，每个稀释度3个平行孔。常规Ficoll法分离健康志愿者PBMCs，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，分成两份，其中一份加入IL-2(100U/ml)，分别接种96孔板，100μl/孔，对应稀释好的标准品rhIL-18和纯化的rhIL-18。37℃5％CO2孵箱培养48小时。收集细胞上清，用ELISA试剂盒测定IFN-γ含量。

8、NK细胞细胞毒活性

同样方法分离的PBMCs用含有或不含IL-2(100U/ml)完全RPMI1640-10％FCS培养基调整细胞浓度为1×10⁶/ml，分别加入终浓度为0.1ng/ml的标准品rhIL-18或rhIL-18后，37℃5％CO2孵箱培养24小时。收集细胞，用培养基洗后调整细胞浓度分别为2×10⁶/ml，4×10⁶/ml，8×10⁶/ml作为效应细胞。K562细胞用完全RPMI1640-10％FCS培养基配成4×10⁵/ml作为靶细胞，在96孔板上分别按不同的效应细胞/肿瘤细胞比例(20∶1，10∶1，5∶1)进行杀伤，同时设置效应细胞对照、靶细胞最大释放、靶细胞自然释放及本底对照孔。将96孔板置于37℃、5％CO2培养4小时后，最大释放孔加入裂解液20μl，继续孵育半小时，离心后将各孔上清液50μl至另一平底96孔板，加入反应底物50μl/孔，室温避光孵育20～30min后，加入终止液50μl/孔。将96孔板置于酶标仪检测492nm波长处的吸光度，测上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性。按下式计算自然杀伤活性：杀伤活性＝(实验孔-效应细胞自然释放孔-靶细胞自然释放孔)/(靶细胞最大释放孔-靶细胞自然释放孔)×100％。

二、结果

1.hIL-18表达载体的构建

PCR产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，在500bp左右见到特异扩增条带(图1)，与预测片段大小相同，初步确定为编码hIL-18的片段。重组质粒pPICZaC/hIL18经Xho I和Xba I双酶切得到约3600bp和500bp左右2条带，初步确定重组质粒中有目的基因片段的正向插入。重组质粒pPICZaC/hIL18序列测定结果证实目的基因碱基序列按照预期方向定向插入表达载体，且接口处序列正确，未改变读码框架。

参见图1，图中：1.编码hIL-18的PCR片段；2.D2000marker；3.Xho I and Xba I酶切鉴定质粒pPICZaC/hIL18(3600bp and 500bp)；4.D15000marker。

2.L-18的大规模表达及鉴定

重组质粒pPICZaC/hIL18转化酵母菌X-33后，在YPD平板(Zeocin抗性)上挑取20个克隆，PCR产物经电泳分析，对照组未见电泳条带，18个转化子出现预期500bp左右特异性扩增条带，说明hIL-18基因已经整合至酵母基因组中。筛选出高表达菌株后，在3.7升发酵罐表达rhI1-18。发酵基础盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)培养基可添加0.5％蛋白胨，pH6.0，温度28℃，在菌体密度达220g/L左右时诱导表达，甲醇最终的流加速度在18ml/h，DO值在30～35％之间，发酵时间为48h，Lowry法检测rhIL-18培养液上清中总蛋白含量为1.84g/L。SDS-PAGE电泳凝胶扫描半定量分析目的蛋白占培养液上清总蛋白量的11％，因此推算在发酵液中rhIL-18含量可达202mg/L。不同时间表达上清行SDS-PAGE(图2)和Western blot(图3)，结果表明，重组工程菌pPICZaC/hIL18/X-33在相对分子质量(Mr)约18000处出现考马斯染色条带，与预期hIL-18的Mr一致。图3中：1.rhIL-18的0h表达上清；2.rhIL-18的48h表达上清；3.Phenyl Sepharose 6FF纯化的rhIL-18；4.Q Sepharose HP纯化的rhIL-18；5.rhIL-18标准品；6.蛋白marker。

3.rhIL-18的纯化

首先，用30kDa和10kDa超滤浓缩装置分离浓缩发酵上清，然后用两步层析分离纯化蛋白。利用Phenyl Sepharose 6FF疏水层析纯化rhIL-18，分析确定rhIL-18疏水层析最佳(NH₄)₂SO₄饱和度为40％，20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗脱蛋白。经疏水层析后蛋白的纯度和产量分别为56.5％和63.3％。hIL-18的等电点为4.9，经疏水层析分离的样品再次经Q Sepharose HP阴离子交换层析分离，得到一个活性洗脱主峰，洗脱液NaCl的浓度为0.3mol/L。浓缩后rhIL-18在15％SDS-PAGE中显示一条考马斯亮蓝区带，参见图4，图中：1.蛋白marker；2.48h的培养上清；3.Phenly Sepharose 6 FF纯化的洗脱液；4.Q SepharoseHP纯化的洗脱液。经过各步纯化的rhIL-18SDS-PAGE分析，纯化后纯度可达97.6％左右，收率达45.1％左右。(见表1)

表1.rhIL-18的纯化

4.NK细胞细胞毒活性

分离的PBMCs在体外加入IL-2及rhIL-18培养24小时后，以K562为靶细胞测定NK细胞的细胞毒作用。单独应用rhIL-18或标准品rhIL-18对NK细胞的杀伤效率不明显，与空白对照无明显差别；单加IL-2的PBMCs对靶细胞的裂解率为25％左右，而同时受IL-2及rhIL-18或标准品rhIL-18刺激的PBMCs靶细胞裂解率可达80％左右，表明rhIL-18具有协同IL-2增强NK细胞细胞毒作用的能力，作用效果同标准品rhIL-18相当。

5.刺激PBMCs分泌IFN-γ

分离PBMCs，分析纯化的rIL18协同I1-2对淋巴细胞的刺激IFN-γ的能力。结果显示，单独加入rhIL-18或标准品rhIL-18刺激的细胞上清中检测不到IFN-γ，而同时加入亚适剂量IL-2后，细胞培养上清中IFN-γ含量升高，并且随rhIL-18及标准品IL-18浓度增加而提高(图4)，说明毕赤酵母制备的rhIL-18具有同标准品thIL-18一样的协同IL-2对PBMCs诱导IFN-γ的能力。

Claims (7)

1.一种人白细胞介素18的制备方法，其特征在于：在发酵基础盐培养基中培养包含可复制真核表达载体的毕赤酵母菌株，发酵扩增菌体后，将分泌表达重组人白细胞介素18的上清液超滤浓缩，分离纯化、回收人白细胞介素18。

2.根据权利要求1所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于：所述表达载体携带编码人白细胞介素18的基因。

3.根据权利要求2所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于：表达载体携带编码人白细胞介素18的基因，是将PCR扩增得到含hIL-18成熟肽基因片段，酶切后得到质粒pPICZaC/hIL18，经电转化至新鲜制备的甲基营养型巴斯德毕赤酵母感受态细胞X-33中；重组阳性克隆pPICZaC/IL18/X-33接种于BMGY中培养，离心、弃上清，复用BMMY培养基悬浮细胞，加100％甲醇至终浓度为5mL/L诱导重组蛋白表达获得的。

4.根据权利要求1所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于：发酵基础盐培养基pH 6.0，28-30℃发酵扩增菌体密度达220g/L左右时甲醇诱导表达，甲醇最终的流加速度在18ml/h，DO值在30-35％，发酵时间为48h。

5.根据权利要求1所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于：发酵基础盐培养基中包含有微量元素PTM1 4.35ml/L，生物素0.6mg/L。

6.根据权利要求1所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于：发酵基础盐培养基中包含有微量元素PTM1 4.35ml/L，生物素0.6mg/L，蛋白胨0.5％。

7.根据权利要求1所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于发酵扩增菌体过程中，DO值在30-32％。

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