CN110079539A

CN110079539A - 前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子制备方法

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Publication number: CN110079539A
Application number: CN201810073775.XA
Authority: CN
Inventors: 陈国友
Original assignee: SHANGHAI HUIDUN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shanghai Huidun Yintai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN110079539B

Abstract

本发明涉及前列腺酸性磷酸酶/粒‑巨噬细胞集落刺激因子制备方法。具体地，本发明涉及一种用于编码前列腺酸性磷酸酶/粒‑巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM‑CSF的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。本发明还提供了高效表达PAP/GM‑CSF的表达载体、工程细胞及制备方法等。本发明构建的PAP/GM‑CSF表达工程细胞具有表达量高，表达稳定等优点，所采取的纯化工艺稳定可靠，得率高，利于大规模生产。

Description

前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组融合蛋白的制备，具体涉及一种前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)是人类前列腺组织中最丰富的酶，分子量为100kD，由两个催化活性的亚基通过非共价键结合形成一个活性酶二聚体。PAP的二级结构由44％的α-螺旋、12％的β-折叠，其余的都是β转角和环构成，人源前列腺酸性磷酸酶(human prostatic acid phosphatase,hPAP)的活性主要依赖其蛋白的二级结构。PAP在体内有两种存在形式：分泌型PAP(secreted prostatic acid phosphatase,S-PAP)和跨膜型PAP(transmembrane prostatic acid phosphatase,TM-PAP)。S-PAP为前列腺上皮细胞合成和分泌，贮存于精囊，参与精液液化与生殖，其产生和分泌受雄激素的调节，具有组织特异性。正常状态下，S-PAP在血中含量极低，只有在疾病状态(如前列腺癌)下才大量进入血液，并可产生抑癌作用。因此近五十年来，PAP一直被作为前列腺癌的肿瘤标志物及特异性免疫治疗的靶点用于临床诊断和治疗。TM-PAP分布于细胞膜上，其C端带有跨膜结构域，主要表达于非前列腺组织，如神经组织、肝脏等。TM-PAP位于胞外的N端部分结构与S-PAP完全相同，包含一个信号肽和酸性磷酸酶结构域。

目前，前列腺癌是危害男性健康常见的恶性肿瘤，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为危害男性健康第一位的肿瘤。中国的前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势。前列腺癌的治疗方法有很多中，但对于激素抵抗性前列腺癌的治疗目前仍没有有效的方法，化疗尽管对激素抵抗性前列腺癌的生存率有一定作用但其作用相当有限，故仍然需要更有效的治疗方法。肿瘤疫苗是目前一种新的肿瘤治疗方法，通过特异性抗原激活机体免疫系统，识别肿瘤细胞进而特异性杀伤肿瘤细胞。由于分泌型PAP是只在前列腺组织和95％的前列腺癌细胞中表达的抗原分子，PAP已成为转移性非雄激素依赖性前列腺癌特异性的免疫治疗的热门靶点，以其为中心的各项免疫治疗研究正在进行。Johnson等成功构建了编码人PAP的质粒DNA疫苗(pTVG.HP)和病毒载体疫苗(VV-HP)，并将其分别免疫Lewis大鼠，结果证实编码人PAP的质粒DNA疫苗能够诱导PAP特异性CD4和CD8细胞反应，主要是Thl型免疫反应，PAP特异性IgG抗体反应成剂量依赖性，抗体滴度随免疫的次数而增加(Johnson LE,Frye TP,Chinnasamy N,et al.Plasmid DNA vaccine encodingprostatic acid phosphatase is effective in eliciting autologous antigen-specific CD8+T cells.Cancer Immunol Immunother.2007Jun；56(6):885-95)。但是单独的PAP免疫原性很弱。

因此本领域亟需开发一种高效表达制备PAP疫苗的方法、表达载体和宿主细胞，对于前列腺癌疫苗的制备具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达制备PAP疫苗的方法、表达载体和宿主细胞。

本发明的第一方面，提供了一种用于编码前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。

在另一优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。

本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述载体为pSV2载体。优选地，所述载体为pSV2-GS载体。

本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第二方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第一方面所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述宿主细胞为CHO细胞株。优选地，所述宿主细胞为CHO-K1细胞株。

本发明的第四方面，提供了一种重组前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的制备方法，包括步骤：

(a)培养本发明第三方面所述的宿主细胞，从而表达重组融合蛋白前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF；和

(b)分离出表达的重组融合蛋白前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF。

在另一优选例中，步骤(a)中，培养所述宿主细胞的培养基为CD OptiCHO^TM培养基。

在另一优选例中，步骤(a)中，还包括将所述宿主细胞接种到培养基中，所述接种密度为2×10⁵-3×10⁵细胞/mL。

在另一优选例中，步骤(a)中，所述重组融合蛋白的表达量在150mg/L以上。

在另一优选例中，在步骤(a)中，利用含有葡萄糖的培养基培养所述宿主细胞，并且培养过程中维持培养基中的葡萄糖浓度为4.5-5.5mmol/L。优选地，培养过程中维持葡萄糖浓度5mmol/L。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(c)纯化所述重组融合蛋白，所述纯化包括：阴离子交换柱纯化、分子筛柱纯化、或其组合。

在另一优选例中，所述纯化包括通过Q Sepharose(HP)层析柱对所述重组融合蛋白进行纯化。

在另一优选例中，所述纯化还包括采用pH8.0 20mM Tris/HCl 1M的NaCl梯度线性洗脱。

在另一优选例中，所述纯化包括通过Superdex 200层析柱对所述重组融合蛋白进行纯化。

在另一优选例中，通过Q Sepharose(HP)层析柱进行初步纯化，再通过Superdex200层析柱进行精细纯化。

在另一优选例中，所述纯化后的融合蛋白的纯度在95％以上。

本发明的第五方面，提供了一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白是由本发明第四方面所述的制备方法获得的。

本发明的第六方面，提供了一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白的结构如下式I所示：

A-L-B (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

A为前列腺酸性磷酸酶或粒-巨噬细胞集落刺激因子，A和B两者中一个为前列腺酸性磷酸酶，另一个为粒-巨噬细胞集落刺激因子；

L为无或连接肽。

在另一优选例中，所述A为前列腺酸性磷酸酶。

在另一优选例中，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pSV2-GS-PAPGM质粒结构图。

图2显示了高表达细胞株CHO/pSV2-GS-PAPGM细胞培养上清的SDS-PAGE电泳图，其中箭头所示条带为PAP/GM-CSF融合蛋白。

图3显示了PAP/GM-CSF纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M：标准分子量；

泳道1：Q Sepharose(HP)层析柱的初步纯化的PAP/GM-CSF融合蛋白；

泳道2：Superdex 200层析柱的初步纯化的PAP/GM-CSF融合蛋白；

通过Q Sepharose(HP)层析柱进行PAP/GM-CSF融合蛋白的初步纯化，纯度可达75％-80％左右。通过Superdex 200层析柱进行PAP/GM-CSF融合蛋白的精细纯化，纯度可达95％左右。

图4显示了pSV2-GS-rPAPGM质粒结构图。

图5显示了pSV2-GS-sPAPGM质粒结构图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对现有的前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF基因序列进行了针对性优化设计，构建了PAP/GM-CSF的重组表达载体，将优化后的PAP/GM-CSF编码序列(如SEQ ID NO:2)转入合适的宿主细胞(如CHO)以分泌形式表达，目的蛋白PAP/GM-CSF表达量高(150mg/L)，且易于纯化，回收率高，适合于大规模工业化生产。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

人粒-巨噬细胞集落刺激因子

人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，GM-CSF)为造血生长因子家族成员，含144个氨基酸残基，有17个氨基酸残基的信号肽，故成熟GM-CSF蛋白是由127个氨基酸残基组成的酸性糖蛋白。hGM-CSF的分子量从14kD至32kD不等，分子量差异是糖基化程度的差别所致。其二级结构由两个反向平行的β折叠和4个反向平行的α螺旋组成，N端第一螺旋是GM-CSF受体β亚基的识别区。四个半胱氨酸残基形成两个链内二硫键，对GM-CSF的稳定性和生物活性起重要作用。GM-CSF主要来源于活化的T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。它是一种多效的细胞因子，可以刺激髓性祖细胞的增殖和成熟并维持髓性细胞的功能特性，诱导粒-单核细胞功能、促进粒细胞系统和单核-巨噬细胞的增殖及其抗原递呈、激活成熟粒细胞和单核-巨噬细胞的功能，使外周血粒细胞和单核-巨噬细胞明显增加，提高抗感染和免疫功能、抗肿瘤和杀伤及细胞毒作用，因此GM-CSF是一个极具潜力的免疫佐剂。单独的PAP免疫原性很弱，GM-CSF能作为一靶向分子促进PAP抗原的递呈。

PAP：来源自Human prostatic acid phosphatase mRNA,complete cds；GenBank:M34840.1；是人属。

GM-CSF：来源自Homo sapiens colony stimulating factor 2(granulocyte-macrophage)(CSF2),mRNA；NCBI Reference Sequence:NM_000758.3；是人属。

融合蛋白

如本文所用，“本发明融合蛋白”、“重组融合蛋白”或“多肽”均指本发明第五方面所述的融合蛋白。本发明重组融合蛋白的结构如下式I所示：

A-L-B (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为无或连接肽。

在另一优选例中，所述A为前列腺酸性磷酸酶。

本发明融合蛋白能够非常有效地激活机体免疫系统，识别肿瘤细胞进而特异性杀伤肿瘤细胞，免疫源性强。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式Ia或式Ib的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

MRAAPLLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSVLAKELKFVTLVFRHGDRSPIDTFPTDPIKESSWPQGFGQLTQLGMEQHYELGEYIRKRYRKFLNESYKHEQVYIRSTDVDRTLMSAMTNLAALFPPEGVSIWNPILLWQPIPVHTVPLSEDQLLYLPFRNCPRFQELESETLKSEEFQKRLHPYKDFIATLGKLSGLHGQDLFGIWSKVYDPLYCESVHNFTLPSWATEDTMTKLRELSELSLLSLYGIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMYSAHDTTVSGLQMALDVYNGLLPPYASCHLTELYFEKGEYFVEMYYRNETQHEPYPLMLPGCSPSCPLERFAELVGPVIPQDWSTECMTTNSHQGTEDSTDGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO.:1)

核酸编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

在本发明的一个优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:1所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:1所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述CHO细胞表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的CHO细胞。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的载体转导入CHO细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择CHO-K1细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

序列优化

在本发明中，提供了优化的、特别适合在CHO中表达的PAP/GM-CSF融合蛋白的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，所述“优化的编码序列”、“优化编码基因”均指一种用于编码PAP/GM-CSF融合蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述天然的人PAP/GM-CSF融合蛋白的DNA编码序列如SEQ ID NO.:3所示。所述未优化的天然DNA编码序列转染CHO细胞后不能表达PAP/GM-CSF融合蛋白。

ATGAGAGCTGCACCCCTCCTCCTGGCCAGGGCAGCAAGCCTTAGCCTTGGCTTCTTGTTTCTGCTTTTTTTCTGGCTAGACCGAAGTGTACTAGCCAAGGAGTTGAAGTTTGTGACTTTGGTGTTTCGGCATGGAGACCGAAGTCCCATTGACACCTTTCCCACTGACCCCATAAAGGAATCCTCATGGCCACAAGGATTTGGCCAACTCACCCAGCTGGGCATGGAGCAGCATTATGAACTTGGAGAGTATATAAGAAAGAGATATAGAAAATTCTTGAATGAGTCCTATAAACATGAACAGGTTTATATTCGAAGCACAGACGTTGACCGGACTTTGATGAGTGCTATGACAAACCTGGCAGCCCTGTTTCCCCCAGAAGGTGTCAGCATCTGGAATCCTATCCTACTCTGGCAGCCCATCCCGGTGCACACAGTTCCTCTTTCTGAAGATCAGTTGCTATACCTGCCTTTCAGGAACTGCCCTCGTTTTCAAGAACTTGAGAGTGAGACTTTGAAATCAGAGGAATTCCAGAAGAGGCTGCACCCTTATAAGGATTTTATAGCTACCTTGGGAAAACTTTCAGGATTACATGGCCAGGACCTTTTTGGAATTTGGAGTAAAGTCTACGACCCTTTATATTGTGAGAGTGTTCACAATTTCACTTTACCCTCCTGGGCCACTGAGGACACCATGACTAAGTTGAGAGAATTGTCAGAATTGTCCCTCCTGTCCCTCTATGGAATTCACAAGCAGAAAGAGAAATCTAGGCTCCAAGGGGGTGTCCTGGTCAATGAAATCCTCAATCACATGAAGAGAGCAACTCAGATACCAAGCTACAAAAAACTTATCATGTATTCTGCGCATGACACTACTGTGAGTGGCCTACAGATGGCGCTAGATGTTTACAACGGACTCCTTCCTCCCTATGCTTCTTGCCACTTGACGGAATTGTACTTTGAGAAGGGGGAGTACTTTGTGGAGATGTACTATCGGAATGAGACGCAGCACGAGCCGTATCCCCTCATGCTACCTGGCTGCAGCCCTAGCTGTCCTCTGGAGAGGTTTGCTGAGCTGGTTGGCCCTGTGATCCCTCAAGACTGGTCCACGGAGTGTATGACCACAAACAGCCATCAAGGTACTGAGGACAGTACAGATGGATCCGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGA(SEQ ID NO.:3)

本发明人先依据密码子偏好性，在不改变其氨基酸序列的前提下进行了优化，得到了如SEQ ID NO.:4所示的DNA编码序列。然而，本发明人发现，仅依据密码子偏好性而获得优化序列并不适合在CHO细胞中表达，该优化序列转染CHO细胞后PAP/GM-CSF融合蛋白的表达量很低。

ATGAGGGCTGCTCCTCTGCTGCTGGCCAGGGCCGCTTCTCTGTCCCTGGGCTTCTTGTTTCTGCTGTTCTTTTGGCTGGATCGCTCTGTGCTGGCTAAGGAGCTGAAGTTTGTGACCCTGGTGTTTCGGCACGGCGACAGATCCCCTATCGATACCTTCCCCACAGACCCTATCAAGGAATCCAGCTGGCCACAGGGCTTTGGCCAGCTGACCCAGCTGGGCATGGAGCAGCACTACGAGCTGGGCGAGTATATCAGAAAGAGGTACAGGAAGTTCCTGAATGAGTCTTATAAGCATGAGCAGGTGTACATCCGGAGCACAGACGTGGATAGAACACTGATGTCTGCCATGACCAATCTGGCAGCCCTGTTTCCCCCTGAGGGCGTGAGCATCTGGAACCCAATCCTGCTGTGGCAGCCCATCCGGGTGCATACAGTGCCCCTGTCTGAGGATCAGCTGCTGTATCTGCCCTTCCGCAATTGCCCTAGGTTTCAGGAGCTGGAGTCTGAGACCCTGAAGTCCGAGGAGTTCCAGAAGCGGCTGCACCCTTATAAGGATTTTATAGCTACCTTGGGAAAACTTTCAGGATTACATGGCCAGGACCTTTTTGGAATTTGGAGTAAAGTCTACGACCCTTTATATTGTGAGAGTGTTCACAATTTCACTTTACCCTCCTGGGCCACTGAGGACACCATGACTAAGTTGAGAGAATTGTCAGAACTGAGCCTGCTGTCTCTGTATGGCATCCATAAGCAGAAGGAGAAGTCCAGGCTGCAGGGAGGCGTGCTGGTGAACGAGATCCTGAATCACATGAAGAGGGCCACCCAGATCCCAAGCTATAAGAAGCTGATCATGTACAGCGCCCATGATACCACAGTGTCTGGCCTGCAGATGGCTCTGGATGTTTACAACGGACTCCTTCCTCCCTATGCTTCTTGCCACTTGACGGAATTGTACTTTGAGAAGGGCGAGTACTTTGTGGAGATGTACTATCGGAACGAGACACAGCATGAGCCATACCCCCTCATGCTACCTGGCTGCAGCCCTAGCTGTCCTCTGGAGAGGTTTGCTGAGCTGGTTGGCCCTGTGATCCCACAGGACTGGTCTACCGAGTGTATGACCACAAATTCCCACCAGGGCACTGAGGACAGTACAGATGGATCCGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAACGCCATCCAGGAGGCTAGGCGGCTGCTGAATCTGTCCAGGGATACCGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTGAAGGGCCCCCTGACAATGATGGCCTCTCACTACAAGCAGCATTGCCCTCCAACCCCTGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTGGTCATCCCATTTGACTGTTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGA(SEQ ID NO.:4)

因此，本发明人还根据其他因素进行了而针对性的二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点，得到如SEQ ID NO.:2所示的特别优化的DNA编码序列。SEQ ID NO.:2所示的编码序列与SEQ ID NO.:4所示的编码序列相似度低于95％。

ATGAGGGCTGCTCCTCTGCTGCTGGCCAGGGCCGCTTCTCTGTCCCTGGGCTTCCTGTTTCTGCTGTTCTTTTGGCTGGATCGCTCTGTGCTGGCTAAGGAGCTGAAGTTCGTGACCCTGGTGTTTCGGCACGGCGACAGATCCCCTATCGATACCTTCCCCACAGACCCTATCAAGGAGTCCAGCTGGCCACAGGGCTTTGGCCAGCTGACCCAGCTGGGCATGGAGCAGCACTACGAGCTGGGCGAGTATATCAGAAAGAGGTACAGGAAGTTCCTGAATGAGTCTTATAAGCATGAGCAGGTGTACATCCGGAGCACCGACGTGGATAGAACACTGATGTCTGCCATGACCAATCTGGCCGCTCTGTTTCCCCCTGAGGGCGTGAGCATCTGGAACCCAATCCTGCTGTGGCAGCCCATCCCTGTGCATACAGTGCCCCTGTCTGAGGATCAGCTGCTGTATCTGCCCTTCCGCAATTGCCCTAGGTTTCAGGAGCTGGAGTCTGAGACCCTGAAGTCCGAGGAGTTCCAGAAGCGGCTGCACCCATACAAGGACTTTATCGCCACACTGGGCAAGCTGTCTGGCCTGCATGGCCAGGATCTGTTCGGCATCTGGTCCAAGGTGTACGACCCCCTGTATTGTGAGTCCGTGCACAACTTTACCCTGCCTAGCTGGGCTACAGAGGATACCATGACAAAGCTGAGAGAGCTGTCCGAGCTGAGCCTGCTGTCTCTGTATGGCATCCATAAGCAGAAGGAGAAGTCCAGGCTGCAGGGAGGCGTGCTGGTGAACGAGATCCTGAATCACATGAAGAGGGCCACCCAGATCCCAAGCTATAAGAAGCTGATCATGTACAGCGCCCATGATACCACAGTGTCTGGCCTGCAGATGGCTCTGGACGTGTATAATGGCCTGCTGCCACCCTACGCTTCCTGCCACCTGACCGAGCTGTATTTCGAGAAGGGCGAGTACTTTGTGGAGATGTACTATCGGAACGAGACACAGCATGAGCCATACCCACTGATGCTGCCAGGATGCAGCCCATCTTGTCCCCTGGAGAGATTCGCTGAGCTGGTGGGCCCTGTGATCCCACAGGACTGGTCTACCGAGTGTATGACCACAAATTCCCACCAGGGCACCGAGGACTCCACAGATGGAAGCGCCCCTGCTCGCTCCCCTAGCCCATCTACACAGCCATGGGAGCATGTGAACGCCATCCAGGAGGCTAGGCGGCTGCTGAATCTGTCCAGGGATACCGCCGCTGAGATGAACGAGACAGTGGAAGTGATCAGCGAGATGTTTGACCTGCAGGAGCCCACCTGCCTGCAGACACGGCTGGAGCTGTATAAGCAGGGCCTGAGAGGCAGCCTGACCAAGCTGAAGGGCCCCCTGACAATGATGGCCTCTCACTACAAGCAGCATTGCCCTCCAACCCCTGAGACATCCTGTGCTACCCAGATCATCACATTCGAGAGCTTTAAGGAGAACCTGAAGGATTTCCTGCTGGTCATCCCATTTGACTGTTGGGAGCCCGTGCAGGAGTGA(SEQ ID NO.:2)

与天然的人PAP/GM-CSF的DNA序列SEQ ID NO.3相比，优化编码序列的密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)由0.76提高至0.96，从而改变了密码子的偏好性，提高了转化效率，同时还进行了针对性的二次优化(包括GC的含量、CpG二核苷酸含量、mRNA的二级结构等也得到了优化)。

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于重组人PAP/GM-CSF融合蛋白的表达载体，它含有本发明的优化编码序列。

优选地，所述表达载体为CHO分泌表达载体。PAP/GM-CSF融合蛋白的长度符合CHO分泌表达的适用长度范围，并且没有跨膜区，适宜于CHO分泌表达。

许多表达载体可应用PAP/GM-CSF的CHO分泌表达，包括pSV2系列载体。本发明优选用pSV2-GS作为表达载体。pSV2-GS质粒包含质粒复制起始子ori，卡那霉素抗性基因Kana，SV40启动子序列SV40E，优化的谷氨酰胺合成酶基因cDNA序列，CMV启动子hCMV-MIE序列，优化的PAP-GM序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于重组表达人PAP/GM-CSF融合蛋白。

优选地，所述宿主细胞为CHO-k1，以提高PAP/GM-CSF的表达量。

许多CHO可应用PAP/GM-CSF的真核表达CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44等，本发明优选用CHO-K1作为表达细胞株。CHO-K1是源自成年中国仓鼠卵巢深入活体组织切片的CHO细胞的亚克隆，其基因型为野生型，未敲除任何基因。

制备方法

本发明提供了一种优选的PAP/GM-CSF融合蛋白的制备方法，具体包括步骤：

(1)克隆编码PAP/GM-CSF融合蛋白的基因：

通过用化学合成的方法，合成一系列相互叠加的引物，并在上游引物和下游引物分别引入HindⅢ和XhoI酶切位点，经PCR扩增，可得到优化后PAP/GM-CSF的DNA序列的编码序列。

(2)构建表达PAP/GM-CSF融合蛋白的重组表达载体：

将PAP/GM-CSF序列与表达载体序列进行酶切、纯化、连接、转化；筛选及鉴定含目的基因的阳性重组质粒。

许多表达载体可应用PAP/GM-CSF的真核表达，包括pSV2系列载体。本发明优选用pSV2-GS作为表达载体。pSV2-GS质粒包含质粒复制起始子ori，卡那霉素抗性基因Kana，SV40启动子序列SV40E，优化的谷氨酰胺合成酶基因cDNA序列，CMV启动子hCMV-MIE序列，优化的PAP/GM-CSF序列。

(3)构建PAP/GM-CSF融合蛋白的高表达细胞株：

将步骤(2)中鉴定正确的阳性重组质粒线性化后转染CHO-K1细胞，进行筛选、鉴定及表达，具体包括阳性细胞株的筛选、目的蛋白的表达量鉴定、目的蛋白聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳分析。

(4)PAP/GM-CSF融合蛋白的发酵：

本发明的针对已筛选出步骤(3)中PAP/GM-CSF融合蛋白高表达细胞株CHO/PAP-GM，通过对培养基的优化、发酵参数的优化，建立一套完整合适的高密度发酵工艺，使最终发酵的工程菌中PAP/GM-CSF表达量可达到150mg/L，发酵终产物中目的蛋白PAP/GM-CSF分泌在细胞培养上清中。

发酵工艺研究的目的是建立一套完整合适的发酵工艺，基本思想是在终产物产率、操作的简便性和投入的经济性之间寻求最适的方案，其中终产物的产率是考虑的首要因素。本发明研究了CD OptiCHO^TM无血清培养基生产前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的问题。

CD OptiCHO^TM无血清培养基支持并最大限度提高悬浮培养物中重组CHO细胞的生长和蛋白质表达，经过特殊设计，能够在化学成分确定的环境中以高性能和高产量进行重组CHO细胞培养。培养基是化学成分确定的无蛋白质配方，不含水解产物；也不含动物来源成分。

研究表明，PAP/GM-CSF融合蛋白高表达细胞株CHO/PAP-GM在CD OptiCHO^TM无血清培养基中生长迅速，表达量高，故本发明优选CD OptiCHO^TM作为培养基。

(5)PAP/GM-CSF融合蛋白的纯化：

优选包括培养基上清的浓缩、阴离子交换柱纯化以及分子筛柱纯化，经聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白的纯度可以达到95％以上。

步骤(5)中，所述的阴离子交换柱为Q Sepharose(HP)，分子筛柱为Superdex 200凝胶层析柱。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1.将PAP蛋白与GM-CSF蛋白融合表达，增强了PAP抗原的免疫源性。

2.对PAP/GM-CSF融合蛋白基因序列进行了优化，基因序列不同于现有技术。与天然的人PAP/GM-CSF的DNA序列SEQ ID NO.3相比，优化编码序列的密码子适应指数(CodonAdaptation Index，CAI)由0.76提高至0.96，从而改变了密码子的偏好性，提高了转化效率，同时还进行了针对性的二次优化(包括GC的含量、CpG二核苷酸含量、mRNA的二级结构等也得到了优化)。优化后的序列PAP/GM-CSF融合蛋白表达量显著提高、活性高、免疫源性强。

3.采用优化筛选后的特定的宿主细胞CHO和发酵工艺(包括培养条件和培养基)，在含有优化的PAP/GM-CSF融合蛋白基因的宿主细胞中，PAP/GM-CSF融合蛋白表达量高，细胞上清中可达150mg/L，且易于纯化，纯度达到95％以上，目的蛋白回收率高。同时，本发明的宿主细胞CHO表达PAP/GM-CSF融合蛋白后可直接分泌到细胞外，并且不是包涵体的形式，易于后续的分离和纯化。

4.制备PAP/GM-CSF融合蛋白工艺简单，操作性强，制备成本低，适宜于大规模工业化制备。

5.经过筛选，采用阴离子交换柱为Q Sepharose(HP)、分子筛柱为Superdex 200凝胶层析柱，以及特定的纯化方式进行纯化，纯化后的融合蛋白纯度在95％以上。

6.通过本发明优化后的编码序列和制备方法制备的PAP/GM-CSF融合蛋白活性高、免疫源性强，非常适合用于制备前列腺癌疫苗，对于前列腺癌疫苗的制备具有重要的意义。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1高表达细胞株CHO/pSV2-GS-PAPGM的构建与筛选

本发明对天然的人PAP/GM-CSF的DNA编码序列(如SEQ ID NO.:3所示)进行改进，依据密码子偏好性，在不改变其氨基酸序列的前提下进行了优化，得到了如SEQ ID NO.:4所示的DNA编码序列。然而，本发明人发现，仅依据密码子偏好性而获得优化序列并不适合在CHO细胞中表达。

因此，本发明人还根据其他因素进行了针对性的二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点，得到如SEQ ID NO.:2所示的特别优化的DNA编码序列。具体地，该人PAP/GM-CSF的优化DNA编码序列可通过如下实施例得。

1.1优化DNA序列的扩增

根据SEQ ID NO.:2所示的人PAP/GM-CSF的优化DNA编码序列(作为目的优化序列)，通过用化学合成的方法合成该优化序列并在上游引物和下游引物分别引入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)和XhoI酶切位点(CTCGAG)，经PCR扩增，得到优化后PAP/GM-CSF的DNA序列的编码序列。

上游引物：

5’-AAGCTTGCCACCATGAGAGCTGCACC-3’

下游引物：

5’-CTCGAGTTATCACTCCTGGACTGGCTCCC-3’

扩增条件如下：

循环数：30个循环

实验结果：

人PAP/GM-CSF融合蛋白序列包含515个氨基酸(如SEQ ID NO.:1所示)，其中PAP长386个氨基酸，连接序列长2个氨基酸，GM-CSF长127个氨基酸。包含终止码的核苷酸序列全长为1548bp。

PCR扩增的人PAP/GM-CSF基因片段克隆入pUC57载体后测序鉴定。测序结果显示得到的DNA序列和目的优化序列完全一致。

1.2质粒的构建和筛选

将步骤(1.1)扩增的PAP/GM-CSF的DNA编码序列以HindⅢ和XhoI双酶切，并插入用HindⅢ和XhoI酶切的pSV2-GS载体，构建成pSV2-GS-PAPGM质粒。

建立如下双酶切体系：

HindⅢ 1μL

XhoI 1μL

10x酶切缓冲液 5μL

DNA(扩增产物或pSV2-GS载体) 2μg

dd H₂O 补足至50μL

此体系于37℃水浴中反应3小时。反应产物分别由AxyPrep PCR清洁试剂盒和AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

建立如下连接反应体系：

T4DNA连接酶 1μL

10×DNA连接酶缓冲液 1μL

PAP/GM-CSF优化序列酶切产物 0.3pmol

pSV2-GS载体酶切产物 0.03pmol

dd H₂O 补足至20μL

此体系于16℃水浴中反应过夜，反应产物用于后续转化反应。

实验结果：经测序证实连接反应的产物序列是正确的。pSV2-GS-PAPGM质粒的结构图谱见图1。

1.3高表达细胞株CHO/pSV2-GS-PAPGM的构建与筛选

将步骤(1.2)得到的序列正确表达的质粒线性化，转染CHO-K1细胞株。

建立如下酶切体系：

NotI 10μL

10×酶切缓冲液 40μL

pSV2-GS-PAPGM 20μg

dd H₂O 补足至400μL

此体系于37℃水浴中反应3小时。反应产物分别由AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

建立如下转化体系：

15μg线性化pSV2-GS-PAPGM质粒片段

3×10⁷CHO-K1细胞

孵育10分钟，设置电转条件300V，900uF，22.5ms。电转后静置15min，用37℃的含谷氨酰胺的CD OptiCHO^TM无血清培养基重悬电转细胞，37℃、5％CO₂培养。3天后，更换含蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的CD OptiCHOTM培养基进行加压筛选，筛选时间约为8-12周。之后，使用无限稀释法分离单克隆细胞株，鉴定细胞培养上清中目的蛋白的表达量，建立CHO/pSV2-GS-PAPGM高表达细胞株。

实验结果：最终筛选的CHO/pSV2-GS-PAPGM细胞株细胞上清中，PAP/GM-CSF的表达量显著提高，如图2所示。

实施例2高表达细胞株CHO/pSV2-GS-PAPGM的大规模培养

经研究表明，CHO细胞株在CD OptiCHO^TM培养基中生长迅速，表达量高，且考虑到CDOptiCHO^TM培养基是化学成分确定的无蛋白质配方，不含水解产物，也不含动物来源成分。故选择CD OptiCHO^TM作为培养基。

从细胞库中复苏实施例1中的CHO/pSV2-GS-PAPGM细胞株种子细胞，以2×10⁵～3×10⁵cells/mL活细胞密度接种，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，作为实验用的种子细胞。

取对数生长期的GS-CHO细胞，经800r/min离心5min，弃去上清，用新鲜的基础培养基悬浮细胞。以约3×10⁵cells/mL的活细胞密度接种至反应器，培养体积为1.5L。反应器操作条件：pH(7.0±0.1)，50％空气饱和度，温度为37℃，搅拌转速为80r/min。培养过程中每隔约12h取样，测定葡萄糖浓度，维持葡萄糖浓度5mmol/L。经过8天培养，最大细胞密度达到8.3×10⁶cells/mL，细胞培养上清中目的蛋白的表达量为150mg/L。

实施例3采用阴离子交换层析Q Sepharose(HP)初步分离PAP/GM-CSF

实验方法：

将实施例2中的培养物上清用10KD的超滤膜2次超滤换液4倍体积的10mM TrisHClpH8.0，直至蛋白溶液电导小于2ms/cm，将超滤换液后的培养物上清浓缩液上样至已经用20mM TrisHCl pH8.0平衡的Q Sepharose(HP)层析柱上，线性增加20mM TrisHCl，1M NaClpH8.0的浓度直至40％，收集最大的洗脱组分即为PAP/GM-CSF融合蛋白初步纯化产物。

实验结果：

通过Q Sepharose(HP)层析柱进行PAP/GM-CSF融合蛋白的初步纯化，纯度可达75％-80％左右。

讨论：

生物分子根据它们自身的特殊性质不同，可以通过色谱的方法纯化，离子交换(IEX)就是根据生物分子表面净电荷的不同而将其分离。由于PAP/GM-CSF的等电点为4.96，因此在pH8.0的Tris/HCl缓冲液中带负电荷而被阴离子交换介质所吸附，通过比较选择Source 15Q，Source 30Q，DEAE，Q Sepharose(HP)等不同阴离子介质，发现Q Sepharose(HP)的选择性和吸附性最佳，因此选择其为初步纯化用填料。

经过观察，发现选用不同pH值缓冲液进行阴离子交换时，会对PAP/GM-CSF的最终得率产生较大的影响。pH值过低，可能导致蛋白质在填料上吸附过弱，pH值过高，可能会使目的蛋白离子交换填料上吸附力变强。

通过比较，采用pH8.0 20mM Tris/HCl 1M的NaCl梯度线性洗脱可将PAP/GM-CSF洗下。

实施例4采用凝胶过滤层析Superdex 200精细纯化PAP/GM-CSF

实验方法：

将实施例3中的收集物上样至已经用20mM PBS pH7.4平衡的Superdex 200层析柱上，收集最大的洗脱组分即为PAP/GM-CSF融合蛋白精细纯化产物。

实验结果：

通过Superdex 200层析柱进行PAP/GM-CSF融合蛋白的精细纯化，纯度可达95％左右。

讨论：

凝胶过滤层析主要是根据生物分子大小进行纯化分离，不像离子交换或者亲和层析，分子不与层析介质结合，其原理为生物大分子不进入介质孔径内，而小分子进入因此其停留时间更长。通过该方法可以将Q Sepharose(HP)纯化后的收集物按照分子大小的不同进行精细纯化，去除与PAP/GM-CSF分子量相差较大的不同分子，以达到更高的纯度。

通过对不同的凝胶过滤层析介质Sephacryl和Superdex的筛选发现，Superdex200具有更高的分辨率，且其分离获得的蛋白纯度更佳，因此选择其为PAP/GM-CSF精细纯化的介质。

结果如图3所示，经过以上各步分离后的PAP/GM-CSF样品，经用电泳鉴定其纯度在95％以上。

对比例1细胞株CHO/pSV2-GS-rPAPGM的构建与筛选

本对比例使用PAP/GM-CSF未优化编码序列(如SEQ ID NO.:3所示)构建PAP/GM-CSF表达细胞株CHO/pSV2-GS-rPAPGM。

1.1未优化PAP/GM-CSF序列的扩增

根据SEQ ID NO.:3所示的人PAP/GM-CSF的编码序列(作为目的序列)，通过用化学合成的方法合成该序列并在上游引物和下游引物分别引入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)和XhoI酶切位点(CTCGAG)，经PCR扩增，得到PAP/GM-CSF的DNA序列的编码序列。

上游引物：

5’-AAGCTTGCCACCATGAGGGCTGCTCCT-3’

下游引物：

5’-CTCGAGTCACTCCTGCACGGGCTC-3’

扩增条件如下：

循环数：30个循环

实验结果：

1.2质粒的构建和筛选

将步骤(1.1)扩增的PAP/GM-CSF的DNA编码序列以HindⅢ和XhoI双酶切，并插入用HindⅢ和XhoI酶切的pSV2-GS载体，构建成pSV2-GS-rPAPGM质粒。

建立如下双酶切体系：

HindⅢ 1μL

XhoI 1μL

10x酶切缓冲液 5μL

DNA(扩增产物或pSV2-GS载体) 2μg

dd H₂O 补足至50μL

建立如下连接反应体系：

T4DNA连接酶 1μL

10×DNA连接酶缓冲液 1μL

PAP/GM-CSF优化序列酶切产物 0.3pmol

pSV2-GS载体酶切产物 0.03pmol

dd H₂O 补足至20μL

实验结果：经测序证实连接反应的产物序列是正确的。pSV2-GS-rPAPGM质粒的结构图谱见图4。

1.3高表达细胞株CHO/pSV2-GS-rPAPGM的构建与筛选

建立如下酶切体系：

NotI 10μL

10×酶切缓冲液 40μL

pSV2-GS-rPAPGM 20μg

dd H₂O 补足至400μL

建立如下转化体系：

15μg线性化pSV2-GS-rPAPGM质粒片段

3×10⁷CHO-K1细胞

孵育10分钟，设置电转条件300V，900uF，22.5ms。电转后静置15min，用37℃的含谷氨酰胺的CD OptiCHO^TM无血清培养基重悬电转细胞，37℃、5％CO₂培养。3天后，更换含蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的CD OptiCHOTM培养基进行加压筛选，筛选时间约为8-12周。之后，使用无限稀释法分离单克隆细胞株，鉴定细胞培养上清中目的蛋白的表达量，建立CHO/pSV2-GS-rPAPGM高表达细胞株。

实验结果：最终未能筛选出CHO/pSV2-GS-rPAPGM细胞株，电转后分离的CHO/pSV2-GS-rPAPGM单克隆细胞株中均未有PAP/GM-CSF的表达。

对比例2细胞株CHO/pSV2-GS-sPAPGM的构建与筛选

本对比例对天然的人PAP/GM-CSF的DNA编码序列(如SEQ ID NO.:3所示)进行改进，依据密码子偏好性，在不改变其氨基酸序列的前提下进行了优化，得到如SEQ ID NO.:4所示的优化DNA编码序列。具体地，该人PAP/GM-CSF的优化DNA编码序列可通过如下实施例得。

2.1优化DNA序列的扩增

根据SEQ ID NO.:4所示的人PAP/GM-CSF的优化DNA编码序列(作为目的优化序列)，通过用化学合成的方法合成该优化序列并在上游引物和下游引物分别引入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)和XhoI酶切位点(CTCGAG)，经PCR扩增，得到优化后PAP/GM-CSF的DNA序列的编码序列。

上游引物：

5’-AAGCTTGCCACCATGAGAGCTGCACC-3’

下游引物：

5’-CTCGAGTTATCACTCCTGGACTGGCTCCCA-3’

扩增条件如下：

循环数：30个循环

实验结果：

2.2质粒的构建和筛选

将步骤(1.1)扩增的PAP/GM-CSF的DNA编码序列以HindⅢ和XhoI双酶切，并插入用HindⅢ和XhoI酶切的pSV2-GS载体，构建成pSV2-GS-sPAPGM质粒。

建立如下双酶切体系：

HindⅢ 1μL

XhoI 1μL

10x酶切缓冲液 5μL

DNA(扩增产物或pSV2-GS载体) 2μg

dd H₂O 补足至50μL

建立如下连接反应体系：

T4DNA连接酶 1μL

10×DNA连接酶缓冲液 1μL

sPAP/GM-CSF优化序列酶切产物 0.3pmol

pSV2-GS载体酶切产物 0.03pmol

dd H₂O 补足至20μL

实验结果：经测序证实连接反应的产物序列是正确的。pSV2-GS-sPAPGM质粒的结构图谱见图5。

2.3细胞株CHO/pSV2-GS-sPAPGM的构建与筛选

建立如下酶切体系：

NotI 10μL

10×酶切缓冲液 40μL

pSV2-GS-sPAPGM 20μg

dd H₂O 补足至400μL

建立如下转化体系：

15μg线性化pSV2-GS-sPAPGM质粒片段

3×10⁷CHO-K1细胞

孵育10分钟，设置电转条件300V，900uF，22.5ms。电转后静置15min，用37℃的含谷氨酰胺的CD OptiCHO^TM无血清培养基重悬电转细胞，37℃、5％CO₂培养。3天后，更换含蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)的CD OptiCHOTM培养基进行加压筛选，筛选时间约为8-12周。之后，使用无限稀释法分离单克隆细胞株，鉴定细胞培养上清中目的蛋白的表达量，建立CHO/pSV2-GS-sPAPGM表达细胞株。

实验结果：最终筛选出的CHO/pSV2-GS-sPAPGM细胞株，PAP/GM-CSF的表达量非常低。

讨论

本发明将PAP蛋白与GM-CSF蛋白融合表达，增强了PAP抗原的免疫源性。同时本发明还对PAP/GM-CSF融合蛋白基因序列进行了优化，与天然的人PAP/GM-CSF的DNA序列SEQID NO.3相比，优化编码序列的密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)由0.76提高至0.96，从而改变了密码子的偏好性，提高了转化效率，同时还进行了针对性的二次优化(包括GC的含量、CpG二核苷酸含量、mRNA的二级结构等也得到了优化)。优化后的编码序列PAP/GM-CSF融合蛋白表达量显著提高。

发明人还将构建好的含有优化后编码序列的pSV2-GS-PAPGM质粒分别导入到大肠杆菌(如BL21)、酵母、CHO细胞以及其他宿主细胞中。结果发现，在含有优化的PAP/GM-CSF融合蛋白编码序列的大肠杆菌、酵母或其他宿主细胞中，PAP/GM-CSF融合蛋白或表达在包涵体中不能复性纯化、或未表达、或表达量极低，远远低于本发明CHO/pSV2-GS-PAPGM细胞株(不足CHO/pSV2-GS-PAPGM细胞株PAP/GM-CSF融合蛋白表达量的十分之一)。

本发明采用优化筛选后的特定的宿主细胞(CHO细胞株)和发酵工艺(包括培养条件和培养基)，在含有优化的PAP/GM-CSF融合蛋白基因的宿主细胞中，PAP/GM-CSF融合蛋白表达量高，细胞上清中可达150mg/L，且易于纯化，纯度达到95％以上，目的蛋白回收率高。同时经过大量的实验筛选，发现采用阴离子交换柱为Q Sepharose(HP)、分子筛柱为Superdex 200凝胶层析柱，以及特定的纯化方式进行纯化，纯化后的融合蛋白纯度在95％以上。本发明制备PAP/GM-CSF融合蛋白工艺简单，操作性强，制备成本低，适宜于工业化制备。

序列表

<110> 上海惠盾生物技术有限公司

<120> 前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子制备方法

<130> P2013-0442

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Ala Ala Pro Leu Leu Leu Ala Arg Ala Ala Ser Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gly Phe Leu Phe Leu Leu Phe Phe Trp Leu Asp Arg Ser Val Leu Ala

20 25 30

Lys Glu Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ser

35 40 45

Pro Ile Asp Thr Phe Pro Thr Asp Pro Ile Lys Glu Ser Ser Trp Pro

50 55 60

Gln Gly Phe Gly Gln Leu Thr Gln Leu Gly Met Glu Gln His Tyr Glu

65 70 75 80

Leu Gly Glu Tyr Ile Arg Lys Arg Tyr Arg Lys Phe Leu Asn Glu Ser

85 90 95

Tyr Lys His Glu Gln Val Tyr Ile Arg Ser Thr Asp Val Asp Arg Thr

100 105 110

Leu Met Ser Ala Met Thr Asn Leu Ala Ala Leu Phe Pro Pro Glu Gly

115 120 125

Val Ser Ile Trp Asn Pro Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val His

130 135 140

Thr Val Pro Leu Ser Glu Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Pro Phe Arg Asn

145 150 155 160

Cys Pro Arg Phe Gln Glu Leu Glu Ser Glu Thr Leu Lys Ser Glu Glu

165 170 175

Phe Gln Lys Arg Leu His Pro Tyr Lys Asp Phe Ile Ala Thr Leu Gly

180 185 190

Lys Leu Ser Gly Leu His Gly Gln Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys

195 200 205

Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Cys Glu Ser Val His Asn Phe Thr Leu Pro

210 215 220

Ser Trp Ala Thr Glu Asp Thr Met Thr Lys Leu Arg Glu Leu Ser Glu

225 230 235 240

Leu Ser Leu Leu Ser Leu Tyr Gly Ile His Lys Gln Lys Glu Lys Ser

245 250 255

Arg Leu Gln Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Ile Leu Asn His Met Lys

260 265 270

Arg Ala Thr Gln Ile Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Met Tyr Ser Ala

275 280 285

His Asp Thr Thr Val Ser Gly Leu Gln Met Ala Leu Asp Val Tyr Asn

290 295 300

Gly Leu Leu Pro Pro Tyr Ala Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe

305 310 315 320

Glu Lys Gly Glu Tyr Phe Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln

325 330 335

His Glu Pro Tyr Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Ser Pro Ser Cys Pro

340 345 350

Leu Glu Arg Phe Ala Glu Leu Val Gly Pro Val Ile Pro Gln Asp Trp

355 360 365

Ser Thr Glu Cys Met Thr Thr Asn Ser His Gln Gly Thr Glu Asp Ser

370 375 380

Thr Asp Gly Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro

385 390 395 400

Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu

405 410 415

Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser

420 425 430

Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu

435 440 445

Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro

450 455 460

Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro

465 470 475 480

Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu

485 490 495

Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro

500 505 510

Val Gln Glu

515

<210> 2

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagggctg ctcctctgct gctggccagg gccgcttctc tgtccctggg cttcctgttt 60

ctgctgttct tttggctgga tcgctctgtg ctggctaagg agctgaagtt cgtgaccctg 120

gtgtttcggc acggcgacag atcccctatc gataccttcc ccacagaccc tatcaaggag 180

tccagctggc cacagggctt tggccagctg acccagctgg gcatggagca gcactacgag 240

ctgggcgagt atatcagaaa gaggtacagg aagttcctga atgagtctta taagcatgag 300

caggtgtaca tccggagcac cgacgtggat agaacactga tgtctgccat gaccaatctg 360

gccgctctgt ttccccctga gggcgtgagc atctggaacc caatcctgct gtggcagccc 420

atccctgtgc atacagtgcc cctgtctgag gatcagctgc tgtatctgcc cttccgcaat 480

tgccctaggt ttcaggagct ggagtctgag accctgaagt ccgaggagtt ccagaagcgg 540

ctgcacccat acaaggactt tatcgccaca ctgggcaagc tgtctggcct gcatggccag 600

gatctgttcg gcatctggtc caaggtgtac gaccccctgt attgtgagtc cgtgcacaac 660

tttaccctgc ctagctgggc tacagaggat accatgacaa agctgagaga gctgtccgag 720

ctgagcctgc tgtctctgta tggcatccat aagcagaagg agaagtccag gctgcaggga 780

ggcgtgctgg tgaacgagat cctgaatcac atgaagaggg ccacccagat cccaagctat 840

aagaagctga tcatgtacag cgcccatgat accacagtgt ctggcctgca gatggctctg 900

gacgtgtata atggcctgct gccaccctac gcttcctgcc acctgaccga gctgtatttc 960

gagaagggcg agtactttgt ggagatgtac tatcggaacg agacacagca tgagccatac 1020

ccactgatgc tgccaggatg cagcccatct tgtcccctgg agagattcgc tgagctggtg 1080

ggccctgtga tcccacagga ctggtctacc gagtgtatga ccacaaattc ccaccagggc 1140

accgaggact ccacagatgg aagcgcccct gctcgctccc ctagcccatc tacacagcca 1200

tgggagcatg tgaacgccat ccaggaggct aggcggctgc tgaatctgtc cagggatacc 1260

gccgctgaga tgaacgagac agtggaagtg atcagcgaga tgtttgacct gcaggagccc 1320

acctgcctgc agacacggct ggagctgtat aagcagggcc tgagaggcag cctgaccaag 1380

ctgaagggcc ccctgacaat gatggcctct cactacaagc agcattgccc tccaacccct 1440

gagacatcct gtgctaccca gatcatcaca ttcgagagct ttaaggagaa cctgaaggat 1500

ttcctgctgg tcatcccatt tgactgttgg gagcccgtgc aggagtga 1548

<210> 3

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagagctg cacccctcct cctggccagg gcagcaagcc ttagccttgg cttcttgttt 60

ctgctttttt tctggctaga ccgaagtgta ctagccaagg agttgaagtt tgtgactttg 120

gtgtttcggc atggagaccg aagtcccatt gacacctttc ccactgaccc cataaaggaa 180

tcctcatggc cacaaggatt tggccaactc acccagctgg gcatggagca gcattatgaa 240

cttggagagt atataagaaa gagatataga aaattcttga atgagtccta taaacatgaa 300

caggtttata ttcgaagcac agacgttgac cggactttga tgagtgctat gacaaacctg 360

gcagccctgt ttcccccaga aggtgtcagc atctggaatc ctatcctact ctggcagccc 420

atcccggtgc acacagttcc tctttctgaa gatcagttgc tatacctgcc tttcaggaac 480

tgccctcgtt ttcaagaact tgagagtgag actttgaaat cagaggaatt ccagaagagg 540

ctgcaccctt ataaggattt tatagctacc ttgggaaaac tttcaggatt acatggccag 600

gacctttttg gaatttggag taaagtctac gaccctttat attgtgagag tgttcacaat 660

ttcactttac cctcctgggc cactgaggac accatgacta agttgagaga attgtcagaa 720

ttgtccctcc tgtccctcta tggaattcac aagcagaaag agaaatctag gctccaaggg 780

ggtgtcctgg tcaatgaaat cctcaatcac atgaagagag caactcagat accaagctac 840

aaaaaactta tcatgtattc tgcgcatgac actactgtga gtggcctaca gatggcgcta 900

gatgtttaca acggactcct tcctccctat gcttcttgcc acttgacgga attgtacttt 960

gagaaggggg agtactttgt ggagatgtac tatcggaatg agacgcagca cgagccgtat 1020

cccctcatgc tacctggctg cagccctagc tgtcctctgg agaggtttgc tgagctggtt 1080

ggccctgtga tccctcaaga ctggtccacg gagtgtatga ccacaaacag ccatcaaggt 1140

actgaggaca gtacagatgg atccgcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc 1200

tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact 1260

gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg 1320

acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag 1380

ctcaagggcc ccttgaccat gatggccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg 1440

gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1500

tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagtga 1548

<210> 4

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagggctg ctcctctgct gctggccagg gccgcttctc tgtccctggg cttcttgttt 60

ctgctgttct tttggctgga tcgctctgtg ctggctaagg agctgaagtt tgtgaccctg 120

gtgtttcggc acggcgacag atcccctatc gataccttcc ccacagaccc tatcaaggaa 180

tccagctggc cacagggctt tggccagctg acccagctgg gcatggagca gcactacgag 240

ctgggcgagt atatcagaaa gaggtacagg aagttcctga atgagtctta taagcatgag 300

caggtgtaca tccggagcac agacgtggat agaacactga tgtctgccat gaccaatctg 360

gcagccctgt ttccccctga gggcgtgagc atctggaacc caatcctgct gtggcagccc 420

atccgggtgc atacagtgcc cctgtctgag gatcagctgc tgtatctgcc cttccgcaat 480

tgccctaggt ttcaggagct ggagtctgag accctgaagt ccgaggagtt ccagaagcgg 540

ctgcaccctt ataaggattt tatagctacc ttgggaaaac tttcaggatt acatggccag 600

gacctttttg gaatttggag taaagtctac gaccctttat attgtgagag tgttcacaat 660

ttcactttac cctcctgggc cactgaggac accatgacta agttgagaga attgtcagaa 720

ctgagcctgc tgtctctgta tggcatccat aagcagaagg agaagtccag gctgcaggga 780

ggcgtgctgg tgaacgagat cctgaatcac atgaagaggg ccacccagat cccaagctat 840

aagaagctga tcatgtacag cgcccatgat accacagtgt ctggcctgca gatggctctg 900

gatgtttaca acggactcct tcctccctat gcttcttgcc acttgacgga attgtacttt 960

gagaagggcg agtactttgt ggagatgtac tatcggaacg agacacagca tgagccatac 1020

cccctcatgc tacctggctg cagccctagc tgtcctctgg agaggtttgc tgagctggtt 1080

ggccctgtga tcccacagga ctggtctacc gagtgtatga ccacaaattc ccaccagggc 1140

actgaggaca gtacagatgg atccgcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc 1200

tgggagcatg tgaacgccat ccaggaggct aggcggctgc tgaatctgtc cagggatacc 1260

gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg 1320

acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag 1380

ctgaagggcc ccctgacaat gatggcctct cactacaagc agcattgccc tccaacccct 1440

gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1500

tttctgctgg tcatcccatt tgactgttgg gagccagtcc aggagtga 1548

Claims

1.一种用于编码前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1或2所述的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体或其染色体中整合有外源的权利要求1或2所述的核苷酸序列。

5.一种重组前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达重组融合蛋白前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF；和

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，利用含有葡萄糖的培养基培养所述宿主细胞，并且培养过程中维持培养基中的葡萄糖浓度为4.5-5.5mmol/L。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：(c)纯化所述重组融合蛋白，所述纯化包括：阴离子交换柱纯化、分子筛柱纯化、或其组合。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括通过Q Sepharose(HP)层析柱对所述重组融合蛋白进行纯化。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括通过Superdex200层析柱对所述重组融合蛋白进行纯化。

10.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白的结构如下式I所示：

A-L-B(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为无或连接肽。