CN102850458B - 新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途。具体地，该融合蛋白包括以下结构：I型穿膜蛋白的膜外区和II型穿膜蛋白的膜外区，二者通过免疫球蛋白串联在一起，该双功能蛋白可以同时阻断两种配体与相应内源性受体的结合，从而抑制配体的生物学活性。本发明还提供了新型重组双功能融合蛋白药在疾病治疗中的作用。通过本发明的基因工程技术平台，可以生产新型重组双功能融合蛋白药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途。本发明还涉及一种生产新型重组双功能融合蛋白药的基因工程技术平台及其应用。
背景技术
肿瘤、肝纤维化、风湿病、艾滋病等每年夺走几千万人的生命，造成数亿美元的经济损失。细胞膜表面的受体和相应配体的结合，是此类疾病产生和发展的重要原因，因此开发相应的蛋白配体药物具有良好的应用前景。
目前公知的蛋白药包括生长因子、激素类蛋白、酶类蛋白、细胞因子、干扰素、促红细胞生成素、以及融合蛋白等。除融合蛋白以外，其它蛋白药均属于均质蛋白，即只含有一种蛋白成分。而现有的融合蛋白药(如依那西普Etanercept、列洛西普rilonacept)由受体蛋白的膜外区与人IgG Fc段融合而成，虽然含有两种蛋白成分，但仍然只发挥一种功能，即阻断细胞膜内源性受体与相应配体的结合。如依那西普可以阻断肿瘤坏死因子(TNF-α)与二型肿瘤坏死因子受体(TNFRII)结合，从而发挥对类风湿病的治疗作用。列洛西普则可以阻断细胞因子白介素1(IL-1)的生物学活性，用以治疗家族性寒冷型自身炎症综合征和穆-韦(Muckle-Wells)两氏综合征。
然而，迄今为止尚没有重组双功能融合蛋白药治疗此类疾病的报道。因此，开发具有双功能融合蛋白药对延长患者的生存时间、改善患者的生存质量、降低死亡率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一个基因工程技术平台，利用该平台可生产重组双功能融合蛋白类药物如TβRII-Fc-CLEC2，并阐明其用途。
在本发明的第一方面，提供了一种蛋白单体，所述蛋白单体具有式Ia或式Ib所述结构：
A-B-C (Ia)，或
C-B-A (Ib)
其中，
A为I型穿膜蛋白膜外区元件；
B为免疫球蛋白元件；
C为II型穿膜蛋白膜外区元件；
“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头。
在另一优选例中。所述的蛋白单体具有选自下组的一个或多个特征：
所述的I型穿膜蛋白选自下组：TGF-βRI、TGF-βRII、SIRP1a、RANK、VEGFR1、VEGFR2、CTLA4或其组合。
在另一优选例中，所述的I型穿膜蛋白具有抑制免疫功能、促进肿瘤细胞的转移和侵袭、促进肿瘤组织的血管发生、促进肿瘤转移等功能。
所述的II型穿膜蛋白选自下组：CLEC-2、DECTIN-1、NKG2D、DC-SIGN、Mincle。
在另一优选例中，所述的II型穿膜蛋白具有激活血小板、促进血小板凝集、促进HIV对树突状细胞(DC)感染等功能。
在另一优选例中，A为TGF-βII型受体(TβRII)膜外区元件。
在另一优选例中，B为人免疫球蛋白IgG1的Fc片段。
在另一优选例中，C为CLEC2膜外区元件。
在另一优选例中，上述的肽接头的长度为1-30个氨基酸，较佳地2-15个氨基酸。
在另一优选例中，所述单体具有以下多种功能：
a)可以同时与两种配体结合；
b)可抑制TGF-β所诱导的Smad2的磷酸化；
c)可抑制单克隆抗体18H5与podoplanin阳性肿瘤细胞的结合；
d)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
在本发明的第二方面，提供了一种双功能蛋白二聚体，所述二聚体由两个本发明第一方面所述的蛋白单体构成。
在另一优选例中，所述二聚体具有式IIa或式IIb所述结构：
其中，
A为I型穿膜蛋白膜外区，
B为免疫球蛋白元件，
C为II型穿膜蛋白膜外区，
“||”表示二硫键。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的蛋白单体。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述载体或基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞为CHO细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种产生融合蛋白的方法，它包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的蛋白单体；和
分离所述蛋白单体或由所述单体形成的二聚体。
在本发明的第七方面，提供一种药物组合物，所述组合物含有本发明第一方面所述的蛋白单体和/或本发明第二方面所述的双功能蛋白二聚体，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的蛋白单体和/或本发明第二方面所述的双功能蛋白二聚体的用途，所述单体或二聚体用于制备治疗疾病的药物。
在另一优选例中，所述的疾病选自：肿瘤、肝脏纤维化或艾滋病。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了重组双功能融合蛋白TβRII-Fc-CLEC2构造。
图2显示了重组双功能融合蛋白的工作原理，一方面，TβRII与TGF-β结合，阻断其与细胞膜表面TGF-β受体的结合，抑制TGF-β的生物学活性；另一方面，CLEC-2与肿瘤细胞膜上的podoplanin结合，阻断其与血小板表面的CLEC-2结合，从而抑制肿瘤细胞诱导的血小板凝集。
图3显示了重组双功能蛋白TβRII-Fc-CLEC2表达载体的结构。TβRII位于氨基端，CLEC2位于羧基端，Fc片段处于二者之间。
图4A显示了TβRII-Fc-CLEC2包含三种蛋白成分：如果用抗Fc的抗体进行杂交，双功能融合蛋白TβRII-Fc-CLEC2与单功能融合蛋白TβRII-Fc均出现杂交带，如果用抗CLEC2的抗体检测，只有TRII-Fc-CLEC2出现杂交带，如果用抗TβRII的抗体检测，两种蛋白均出现杂交带。
图4B显示了TβRII-Fc-CLEC2单体和二聚体SDS-PAGE电泳图。
图5A显示了重组双功能蛋白可以与TGF-β1结合，50％的有效结合浓度(ED50)为3nM。
图5B为流式细胞仪检测结果，表明重组双功能蛋白可以与表达podoplanin的肿瘤细胞结合，结合程度与抗podoplanin的单克隆抗体(18H5)类似。
图6显示了TβRII-Fc-CLEC2可抑制TGF-β所诱导的Smad2的磷酸化。
图7显示了TβRII-Fc-CLEC2可抑制TGF-β所诱导的肿瘤细胞的迁移。
图8显示了TβRII-Fc-CLEC2可抑制TGF-β所诱导的肿瘤细胞的侵袭。
图8A显示了在没有TGF-β1存在的条件下，PC-3细胞没有侵袭能力，因此基底膜下层几乎没有细胞，加入TGF-β1以后则显著诱导PC-3细胞从基底膜上层向下层侵袭。如果在基底膜上层加入TβRII-Fc-CLEC2，由于其可以与TGF-β1结合，阻断了TGF-β1与PC-3细胞膜表面TGF-β受体的结合，所以则抑制了TGF-β1所诱导的PC-3细胞的侵袭能力，hIgG与TGF-β1结合能力很弱。
图8B显示了各处理组的侵袭细胞数计数结果。
图9显示了不同浓度TβRII-Fc-CLEC2处理组流式细胞结果。
图10显示了不同浓度的TβRII-Fc-CLEC2处理后细胞表面podoplanin强度结果。
具体实施方式
为了克服现有融合蛋白类药物功能单一的缺陷，本发明人经过广泛而深入的研究，首次建立了一个基因工程技术平台，利用该平台可生产重组双功能融合蛋白类药物，例如TβRII-Fc-CLEC2。在此基础上完成了本发明。
以TβRII-Fc-CLEC2为例，它具有以下功能：1)可以同时与TGF-β和podoplanin(CLEC-2的配体)结合；2)可抑制TGF-β所诱导的Smad2的磷酸化；3)可抑制单克隆抗体18H5与podoplanin阳性肿瘤细胞的结合；4)可剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
在一个实施例中，本发明人改良pIg-Fc载体，分别PCR扩增二型TGF-β受体的膜外区和CLEC-2的膜外区，形成新载体pIg-TβRII-Fc-CLEC2。本发明人通过试验证实，表达的TβRII-Fc-CLEC2可以同时与两种靶点(TGF-β和podoplanin)结合。由于TGF-β可以促进肿瘤的转移、刺激肿瘤内血管生成、促进肿瘤的骨转移、激活肝脏的星状细胞，诱导产生各种细胞外基质、细胞骨架蛋白、细胞因子及膜表面受体，因此TβRII-Fc-CLEC2可以用以治疗肿瘤和肝脏纤维化。由于CLEC-2是结合HIV附件因子，可以介导血小板对HIV的捕获以及HIV向T细胞的传播，所以TβRII-Fc-CLEC2有望用于治疗艾滋病。
此外，除了诱导肿瘤转移以外，TGF-β还抑制机体的免疫功能，所以通过抑制TGF-β的活性，TβRII-Fc-CLEC2还可以增强机体的免疫功能。
I型穿膜蛋白及其膜外区
I型穿膜蛋白的特点是蛋白质序列的氨基端在细胞膜外，羧基端在细胞膜内。I型穿膜蛋白通常包括免疫球蛋白超级家族成员(CD4、CD8、CD28、CTLA4、CD80、CD86、SIRP1a等)、激酶样受体(TGF-β受体、EGFR、VEGFR、PDGFR、HGF受体等)、细胞因子受体(TNF受体、RANK、IL-6受体、CSF1受体、c-kit等)。当与其相应配体结合以后，根据其相应的受体特性，I型穿膜蛋白可诱导一系列不同的生物学功能反应。
可用于本发明的I型穿膜蛋白没有特别限制，可以是所有具有生物学功能的I型穿膜蛋白。
一类优选的I型穿膜蛋白包括(但并不限于)：TGF-βRII、TNF-αR、SIRP1a、RANK、VEGFR1、VEGFR2、CTLA4或其组合。
II型穿膜蛋白及其膜外区
II型穿膜蛋白的特点是蛋白质序列的羧基端在细胞膜外，氨基端在细胞膜内。通常II型穿膜蛋白多为C型凝集素、或C型凝集素样受体。该类受体的膜外区含有糖结合域(Carbohydrate-binding domain)，也称作C型凝集素样区域(C-TypeLectin Domain，CTLD)。具有糖结合域的蛋白往往有多种功能，可参与细胞间的粘附、参与激活血小板、参与对致病菌的免疫功能、以及诱导细胞凋亡等。
可用于本发明的II型穿膜蛋白没有特别限制，可以是所有具有生物学功能的II型穿膜蛋白。
一类优选的II型穿膜蛋白包括(但并不限于)：CLEC-2、DECTIN-1、NKG2D、DC-SIGN、Mincle或其组合。
免疫球蛋白G元件
在本发明中，适用的免疫球蛋白G元件没有特别限制，可以是来自人或其他哺乳动物的免疫球蛋白元件，或其突变物和衍生物。优选来自人的免疫球蛋白的元件。
人免疫球蛋白G包括四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。这四个亚类的蛋白结构有很大的相似性，都有四个区域：一个可变区(VH)，三个恒定区(CH1、CH2、CH3)。Fc片段由两个恒定区(CH2-CH3)所组成，其中在CH2区域有一个二硫键，使得两个Fc片段单体组成共价结合的同源二聚体。正常生理条件下，人体血浆内IgG的浓度以IgG1最高，IgG2次之，IgG3和IgG4浓度较低。
一种优选的G元件是人IgG1 Fc片段，或其突变物、衍生物。
双功能蛋白及其制备
在本发明中，“重组双功能蛋白”、“本发明双功能蛋白”、“本发明蛋白”、“双功能蛋白”可互换使用，指具有式Ia或Ib所述结构，含有I型穿膜蛋白膜外区元件、免疫球蛋白元件、和II型穿膜蛋白膜外区元件的融合蛋白。一个代表性的例子是TβRII-Fc-CLEC2。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括重组双功能蛋白的活性片段和衍生物。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的重组双功能蛋白”是指重组双功能蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化重组双功能蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
本发明融合蛋白的各元件(如TβRII和CLEC2)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体
本发明中，“抗体”、“配体”可互换使用，是指对本发明蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能分别结合于本发明蛋白或其片段。较佳地，指那些能与本发明蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
肽接头
本发明提供了一种双功能融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
过短的肽接头可在融合蛋白内部造成空间位阻，影响蛋白的正确折叠，过长的肽接头可能增加融合蛋白的免疫原性，还可能影响融合蛋白的活性和功能。连接肽的长度一般为4-44个氨基酸，较佳地6-27个氨基酸，更佳地2-15个氨基酸。
药物组合物及施用方法
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.000001-90wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的融合蛋白单体及其二聚体或多聚体的主要优点包括：
1)可以同时与TGF-β和podoplanin(CLEC-2的配体)结合；
2)可抑制TGF-β所诱导的Smad2的磷酸化；
3)可抑制单克隆抗体18H5与podoplanin阳性肿瘤细胞的结合；
4)可剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭；
5)可阻止HIV与树突状细胞(DC)的结合；
6)可阻断TGF-β的免疫抑制活性，从而增强免疫功能；
7)可阻断TGF-β诱导肝脏纤维化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
构建pIg-TβRII-Fc-CLEC2载体
1.改良pIg-Fc载体，去除Fc羧基端的终止密码。
利用引物1(SEQ ID NO：1)和2(SEQ ID NO：2)(见表1)扩增Fc编码基因，扩增产物克隆至原始pIg-Fc载体(购自CLONETECH公司)的EcoRI和XhoI克隆位点。
2.PCR扩增II型TGF-β受体的膜外区。
利用引物3(SEQ ID NO：3)和4(SEQ ID NO：4)，以乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)(中科院细胞库)来源的cDNA为模板，PCR扩增II型TGF-β受体的膜外区，扩增产物克隆至改良的pIg-Fc载体的HindIII和EcoRI克隆位点，形成pIg-TβRII-Fc。
3.PCR扩增CLEC-2的膜外区
利用引物5(SEQ ID NO：5)和6(SEQ ID NO：6)，以人外周血单个核细胞(PBMC)来源的cDNA为模板，PCR扩增CLEC-2的膜外区，扩增产物克隆至pIg-TβRII-Fc载体的XhoI和XbaI克隆位点，形成pIg-TβRII-Fc-CLEC2。
表1
序列SEQ ID NO：7为编码重组双功能融合蛋白的核苷酸序列，全长1779bp，其中1-552bp为TβRII，553-558bp为EcoRI的酶切位点GAATTC，559-1254bp为Fc片段，1255-1260bp为XhoI的酶切位点CTCGAG，1261-1776bp为CLEC-2，TAA为终止密码。
图1为重组双功能融合蛋白TβRII-Fc-CLEC2构造。
图2为重组双功能融合蛋白的工作原理，一方面，TβRII与TGF-β结合，阻断其与细胞膜表面TGF-β受体的结合，抑制TGF-β的生物学活性；另一方面，CLEC-2与肿瘤细胞膜上的podoplanin结合，阻断其与血小板表面的CLEC-2结合，从而抑制肿瘤细胞诱导的血小板凝集。
图3为重组双功能融合蛋白结构示意图，SEQ ID NO：8为编码重组双功能融合蛋白的氨基酸序列，全长592个氨基酸，分子量约为65Kd。其中1-184位氨基酸为TβRII，185-186位为EcoRI酶切位点的2个氨基酸，187-418位氨基酸为Fc片段、419-420位氨基酸为XhoI酶切位点的2个氨基酸，421-592位氨基酸为CLEC-2。
实施例2
TβRII-Fc-CLEC2的表达
利用小规模瞬时转染的方法，检测pIg-TβRII-Fc-CLEC2表达载体是否表达重组蛋白：将5x104个CHO细胞铺在含有0.5毫升DMEM培养液的24孔板的每一孔内，在摄氏37℃、含5％CO2的培养相中培养24小时。转染时，将一定量的载体DNA和转染试剂(Lipofactamine2000，Invitrogen)均匀混合在一起(具体方法可遵照厂家所提供的步骤进行)并在室温放置20min以后加入到每一孔内，继续培养24小时。此时取出一定量培养上清用酶联免疫法检测蛋白的表达。
如果用抗Fc的抗体进行杂交，双功能融合蛋白TβRII-Fc-CLEC2与单功能融合蛋白TβRII-Fc均出现杂交带，如果用抗CLEC2的抗体检测，只有TRII-Fc-CLEC2出现杂交带，如果用抗TβRII的抗体检测，两种蛋白均出现杂交带。如图4A所示，培养上清中含有三种蛋白成分：II型TGF-β受体的膜外区、人IgG Fc片段、和CLEC-2的膜外区。
通过稳定转染，第一批生产了10毫克TβRII-Fc-CLEC2。图4B表明，经蛋白电泳分析，发现存在有两条带，大小分别为大约85kDa和170kDa，小带属于单体，大带属于双聚体。
实施例3
TβRII-Fc-CLEC2可同时与两种靶点(配体)结合
利用酶联免疫吸附检测(ELISA)方法和流式细胞仪检测法，测定融合蛋白与两种靶点(配体)结合特性。
检测方法：用TGF-β1于4℃包被ELISA板过夜，将倍比稀释(从200nM到0.1nM的TβRII-Fc-CLEC2加入到包被有TGF-β1的ELISA板内，室温培养一小时，经洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的抗Fc片段的抗体继续培养一小时，再次洗涤。加入适量用辣根过氧化物酶的底物进行显色并用酶标仪检测结果。
图5A表明，ELISA试验证实了TβRII-Fc-CLEC2可与人TGF-β1结合，50％的有效结合浓度(ED50)大约为3nM。
图5B表明，流式细胞仪检测结果证实了，TβRII-Fc-CLEC2可与表达podoplanin的卵巢细胞癌细胞株(OVCAR-8)结合。结合程度与podoplanin特异性单克隆抗体18H5与该细胞的结合程度类似。
实施例4
TβRII-Fc-CLEC2可抑制TNF-β1所诱导的Smad2的磷酸化
TGF-β的生物学活性是通过诱导细胞内Smad2的磷酸化而启动的，所以阻断TGF-β所诱导的Smad2的磷酸化即可抑制TGF-β的生物学活性。
将MDA-MB-231细胞与TGF-β1(5ng/ml)一起培养30分钟，在培养的开始，加入不同剂量的TβRII-Fc-CLEC2或最高剂量(200nM)对照蛋白(人IgG)，然后收集细胞、裂解、离心、获取裂解物。用ELISA试剂盒(Cat#7348S，Cell Signaling)检测Smad2的磷酸化。如图6所示，TβRII-Fc-CLEC2在最小使用剂量(0.78nM)仍可显著抑制Smad2的磷酸化。
实施例5
TβRII-Fc-CLEC2可剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的迁移
肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移的重要步骤之一。TGF-β通过激活Smad2信号传导通路可诱导肿瘤细胞由上皮样向间质样细胞的转化，从而失去细胞与细胞之间的接触，并拥有成纤维细胞的特征，变成具有转移能力的细胞。如果能抑制TGF-β1的活性，即可抑制肿瘤细胞的转移。
如图7所示，将长满细胞培养空的单层前列腺癌(PC-3)细胞株人为的制造一个疮口，此时如果加入TGF-β1，那么24小时以后可发现疮口完全愈合。如果在加入TGF-β1的同时再加入TβRII-Fc-CLEC2，则发现本发明双功能蛋白可抑制疮口的愈合，且抑制效果呈剂量依赖性。
实施例6
TβRII-Fc-CLEC2可剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的侵袭
PC-3细胞表达TGF-β受体并可分泌大量TGF-β，在每一个基底膜(Ca#354480，BD Bioscience)的下层加入不含血清的培养液，培养液中加入TGF-β1(5ng/ml)。将悬浮于含有1％血清培养液中的细胞(PC-3)(2x105/ml)加入到基底膜的上层，每孔1x105个细胞。同时在含有细胞的基底膜上层加入10μg/ml TβRII-Fc-CLEC2或对照蛋白(人IgG)。然后培养相中培养24小时，取出基底膜，用棉签去除粘附在基底膜上层的细胞，用4％的福尔马林固定基底膜，然后用0.5％的亚甲基蓝染色，显微镜下计数基底膜下层的细胞，并与对照组比较。如图8A所示，在没有TGF-β1存在的条件下，PC-3细胞没有侵袭能力，因此基底膜下层几乎没有细胞，加入TGF-β1以后则显著诱导PC-3细胞从基底膜上层向下层侵袭。如果在基底膜上层加入TβRII-Fc-CLEC2，由于其可以与TGF-β1结合，阻断了TGF-β1与PC-3细胞膜表面TGF-β受体的结合，所以则抑制了TGF-β1所诱导的PC-3细胞的侵袭能力。而对照蛋白hIgG则无此功能。图8B显示了各处理组侵袭细胞计数结果。
实施例7
TβRII-Fc-CLEC2可与podoplanin阳性肿瘤细胞结合
Podoplanin是一种粘液型穿膜蛋白，在不同肿瘤细胞均过高表达。而肿瘤细胞表面的podoplanin可通过与血小板表面的CLEC-2反应诱导血小板凝集。凝集的血小板可通过多种机制促进肿瘤细胞的转移。因此如果能抑制由肿瘤细胞诱导的血小板凝集，则可抑制肿瘤的转移。同理，如果TβRII-Fc-CLEC2能与肿瘤细胞表面的podoplanin结合，则阻断podoplanin与血小板表面CLEC-2的结合，从而抑制血小板凝集。图5B表明，TβRII-Fc-CLEC2可与表达podoplanin的卵巢癌细胞株OVCAR-8结合。
实施例8
TβRII-Fc-CLEC2可抑制单克隆抗体18H5与podoplanin阳性肿瘤细胞的结合
18H5是针对podoplanin的特异性单克隆抗体，可与OVCAR-8结合(见图5B)。先将OVCAR-8细胞与不同剂量的TβRII-Fc-CLEC2于4℃条件下一起培养30分钟，洗涤后再与单克隆抗体18H5同样条件下一起培养30分钟，洗涤后用PE-标记的二抗染色并用流式细胞仪检测。
结果如图9所示，TβRII-Fc-CLEC2可抑制18H5与OVCAR-8细胞的结合。
图10结果进一步证实了TβRII-Fc-CLEC2与podoplanin结合的具有剂量效应。
实施例9
药物组合物的制备
利用本领域技术人员熟知的常规技术，混合以下组分，制得终浓度为1wt％重组蛋白溶液，其配方如下：
重组蛋白 10mg
生理盐水 加至10ml
调节pH至6.8-7.1。
在裸鼠背部右侧接种OVCAR-8细胞，每只小鼠5×106个细胞，待肿瘤大小生长至200立方毫米，随机分为两组，每组十只小鼠。一组腹腔注射TβRII-Fc-CLEC2药物(10ml/kg)，每周两次，连续六周；另一组注射同样剂量的人IgG。在每次给药的同时检测肿瘤的大小，连续八周。实验终止以前，取出肺脏，观察记录肺部转移灶。整个实验结束以后，分析对比两组小鼠肿瘤大小的差异以及肺部肿瘤转移灶的多少。
结果表明，TβRII-Fc-CLEC2可显著抑制肿瘤细胞的生长(T/C％值可达40％左右)。经TβRII-Fc-CLEC2药物治疗的小鼠，肺部转移灶数量明显减少。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种蛋白单体，其特征在于，所述蛋白单体具有式Ia或式Ib所述结构：
A-B-C (Ia)，或
C-B-A (Ib)
其中，
A为I型穿膜蛋白膜外区元件；
B为免疫球蛋白元件；
C为II型穿膜蛋白膜外区元件；
“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头；
其中，所述的I型穿膜蛋白为TGF-βRII，所述的II型穿膜蛋白为CLEC-2，且所述的免疫球蛋白元件为免疫球蛋白G的Fc片段，所述的I型穿膜蛋白膜外区元件为I型穿膜蛋白膜外区，而所述II型穿膜蛋白膜外区元件为II型穿膜蛋白膜外区。
2.如权利要求1所述的蛋白单体，其特征在于，所述的蛋白单体的序列如SEQID NO:8所示。
3.如权利要求1所述蛋白单体，其特征在于，所述单体具有以下多种功能：
a)可以同时与两种配体结合，其中所述的配体分别为所述TGF-βRII的配体以及所述CLEC-2的配体；
b)可抑制TGF-β所诱导的Smad2的磷酸化；
c)可抑制单克隆抗体18H5与podoplanin阳性肿瘤细胞的结合；
d)可抑制podoplanin阳性肿瘤细胞的迁移和侵袭。
4.一种双功能蛋白二聚体，其特征在于，所述的二聚体由两个权利要求1-3中任一所述的蛋白单体构成，
其中，所述二聚体具有式IIa或式IIb所述结构：
或
其中，
A为I型穿膜蛋白膜外区，
B为免疫球蛋白元件，
C为II型穿膜蛋白膜外区，
“‖”表示二硫键。
5.如权利要求4所述的二聚体，其特征在于，所述二聚体由两个SEQ ID NO:8所示蛋白单体构成。
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的蛋白单体。
7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体或基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。
9.一种产生蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：
在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的蛋白单体；和
分离所述蛋白单体或由所述单体形成的二聚体。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的蛋白单体和/或权利要求4所述的双功能蛋白二聚体，以及药学上可接受的载体。
11.如权利要求1所述的蛋白单体和/或权利要求4所述的双功能蛋白二聚体的用途，其特征在于，用于制备治疗疾病的药物，所述疾病为肿瘤，且所述肿瘤的肿瘤细胞表达podoplanin。
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