CN103897057A - 多价抗体片段与其三聚复合物 - Google Patents
多价抗体片段与其三聚复合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103897057A CN103897057A CN201310731249.5A CN201310731249A CN103897057A CN 103897057 A CN103897057 A CN 103897057A CN 201310731249 A CN201310731249 A CN 201310731249A CN 103897057 A CN103897057 A CN 103897057A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igg
- cell
- multivalent antibody
- antibody fragment
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title claims description 107
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title claims description 107
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 100
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 67
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 67
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 6
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 2
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 2
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 122
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 71
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 69
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 68
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 53
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 48
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 40
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 25
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 24
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 16
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 16
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 13
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 13
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 12
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 10
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 10
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 10
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 10
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 8
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 8
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 7
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 6
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 6
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 6
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 6
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 6
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 5
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 5
- -1 carboxyl (carboxy) Chemical class 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 5
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 5
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 5
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052775 Thulium Inorganic materials 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 229940029358 orthoclone okt3 Drugs 0.000 description 4
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 229910052702 rhenium Inorganic materials 0.000 description 4
- WUAPFZMCVAUBPE-UHFFFAOYSA-N rhenium atom Chemical compound [Re] WUAPFZMCVAUBPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 3
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- HVIBGVJOBJJPFB-OFQRNFBNSA-N Gly-Pro-Hyp Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)C(O)CC1 HVIBGVJOBJJPFB-OFQRNFBNSA-N 0.000 description 3
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 3
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 3
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N UNPD55612 Natural products N1C(O)C2CC(C=CC(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 3
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 3
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 3
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 3
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 3
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 3
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 3
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 3
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 3
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 3
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005532 CC-1065 Drugs 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000004405 Collectins Human genes 0.000 description 2
- 108090000909 Collectins Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 2
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 2
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- LPGWZGMPDKDHEP-HLTPFJCJSA-N Leurosine Chemical compound C([C@]1([C@@H]2O1)CC)N(CCC=1C3=CC=CC=C3NC=11)C[C@H]2C[C@]1(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC LPGWZGMPDKDHEP-HLTPFJCJSA-N 0.000 description 2
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N Mitobronitol Chemical compound BrC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CBr VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 208000003250 Mixed connective tissue disease Diseases 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 102100023302 Myelin-oligodendrocyte glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930189330 Streptothricin Natural products 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical group NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 description 2
- JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N bismuth atom Chemical compound [Bi] JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 108010017349 glycyl-prolyl-hydroxyproline Proteins 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 2
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 229910052743 krypton Inorganic materials 0.000 description 2
- DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N krypton atom Chemical compound [Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 2
- 229960005485 mitobronitol Drugs 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000263 nonmitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N rachelmycin Chemical compound C1([C@]23C[C@@H]2CN1C(=O)C=1NC=2C(OC)=C(O)C4=C(C=2C=1)CCN4C(=O)C1=CC=2C=4CCN(C=4C(O)=C(C=2N1)OC)C(N)=O)=CC(=O)C1=C3C(C)=CN1 UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N 0.000 description 2
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- NRAUADCLPJTGSF-VLSXYIQESA-N streptothricin F Chemical compound NCCC[C@H](N)CC(=O)N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](OC(N)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1\N=C/1N[C@H](C(=O)NC[C@H]2O)[C@@H]2N\1 NRAUADCLPJTGSF-VLSXYIQESA-N 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 2
- 229950010127 teplizumab Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 2
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 2
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000641 zorubicin Drugs 0.000 description 2
- FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N zorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(\C)=N\NC(=O)C=1C=CC=CC=1)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N (10e,12e)-86-chloro-12,14,4-trihydroxy-85,14-dimethoxy-33,2,7,10-tetramethyl-15,16-dihydro-14h-7-aza-1(6,4)-oxazina-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-benzenacyclotetradecaphane-10,12-dien-6-one Chemical compound CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N 0.000 description 1
- OOGFPFWTORZYAN-FDTMKXSCSA-N (2S)-4-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid (2S,4R)-4-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC1CN[C@H](C(O)=O)C1.O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 OOGFPFWTORZYAN-FDTMKXSCSA-N 0.000 description 1
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- MEGFZVZIOCKTCS-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetramethylbenzene Chemical compound CC1=CC=C(C)C(C)=C1C.CC1=CC=C(C)C(C)=C1C MEGFZVZIOCKTCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BICGOULMPJLRQV-MYINAIGISA-N 1-[(2s,4s,5r)-2-bromo-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(Br)N1C(=O)NC(=O)C=C1 BICGOULMPJLRQV-MYINAIGISA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- JMTCEFUSRHYJBF-DDJPMISGSA-N 149635-73-4 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JMTCEFUSRHYJBF-DDJPMISGSA-N 0.000 description 1
- ZYVAQZSGKALVEU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(2-hydroxy-2-oxoethyl)amino]ethyl-(2-hydroxy-2-oxoethyl)amino]ethanoic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O ZYVAQZSGKALVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHKHRDHBTUSGPY-UHFFFAOYSA-N 3,7-dihydropurine-6-thione;7h-purine Chemical compound C1=NC=C2NC=NC2=N1.S=C1N=CNC2=C1NC=N2 SHKHRDHBTUSGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWZAGCZUPZKTET-UHFFFAOYSA-N 3-(dibutylamino)propyl 4-aminobenzoate;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCN(CCCC)CCCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.CCCCN(CCCC)CCCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 VWZAGCZUPZKTET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 241001237754 Algia Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 102000010910 CD28 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062433 CD28 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010011830 CFY196 Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- QCDFBFJGMNKBDO-UHFFFAOYSA-N Clioquinol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=C(I)C=C(Cl)C2=C1 QCDFBFJGMNKBDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101100456569 Drosophila melanogaster kto gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N Emetamine Natural products O(C)c1c(OC)cc2c(c(C[C@@H]3[C@H](CC)CN4[C@H](c5c(cc(OC)c(OC)c5)CC4)C3)ncc2)c1 MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010018366 Glomerulonephritis acute Diseases 0.000 description 1
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000878540 Homo sapiens Protein-tyrosine kinase 2-beta Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100033461 Interleukin-17A Human genes 0.000 description 1
- 108010032774 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000007351 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Human genes 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- WSTYNZDAOAEEKG-UHFFFAOYSA-N Mayol Natural products CC1=C(O)C(=O)C=C2C(CCC3(C4CC(C(CC4(CCC33C)C)=O)C)C)(C)C3=CC=C21 WSTYNZDAOAEEKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N Maytansinol Natural products CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSTYNZDAOAEEKG-QSPBTJQRSA-N Maytenin Natural products CC1=C(O)C(=O)C=C2[C@@](CC[C@@]3([C@@H]4C[C@H](C(C[C@@]4(CC[C@]33C)C)=O)C)C)(C)C3=CC=C21 WSTYNZDAOAEEKG-QSPBTJQRSA-N 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000123 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- NCFCYDRIHLWVEM-UHFFFAOYSA-N NCC(O)=O.NCCCNCCCCNCCCN Chemical compound NCC(O)=O.NCCCNCCCCNCCCN NCFCYDRIHLWVEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150037263 PIP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N Procaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100037787 Protein-tyrosine kinase 2-beta Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N SJ000285215 Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C1CC1CC2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2CC1CC AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100262439 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) UBA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 206010041591 Spinal osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- PPWHTZKZQNXVAE-UHFFFAOYSA-N Tetracaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 PPWHTZKZQNXVAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 102000018594 Tumour necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007852 Tumour necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAQHXGSHRMHVMU-UHFFFAOYSA-N [S].[S] Chemical compound [S].[S] XAQHXGSHRMHVMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 231100000851 acute glomerulonephritis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000002927 anti-mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 229920005601 base polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000037058 blood plasma level Effects 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000031709 bromination Effects 0.000 description 1
- 238000005893 bromination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 229960004598 butacaine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N chembl557217 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 1
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N emetine Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000004836 hexamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-UHFFFAOYSA-N methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 229960003816 muromonab-cd3 Drugs 0.000 description 1
- 229940087004 mustargen Drugs 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N nitrous oxide Inorganic materials [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000002732 pharmacokinetic assay Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940067626 phosphatidylinositols Drugs 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000005801 spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- FRNOGLGSGLTDKL-UHFFFAOYSA-N thulium atom Chemical compound [Tm] FRNOGLGSGLTDKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002287 time-lapse microscopy Methods 0.000 description 1
- WSTYNZDAOAEEKG-GWJSGULQSA-N tingenone Chemical compound CC1=C(O)C(=O)C=C2[C@@](CC[C@]3([C@@H]4C[C@H](C(C[C@@]4(CC[C@@]33C)C)=O)C)C)(C)C3=CC=C21 WSTYNZDAOAEEKG-GWJSGULQSA-N 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N vinblastine Chemical compound C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及产生多价Fab片段的方法。特别是,本发明涉及藉由在一哺乳动物细胞中共表达包含一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一基因构筑体以及由IgG的一轻链部分所组成的一基因构筑体的三聚体Fab片段的产生的方法。使用本发明方法所产生的分子的用途也被描述。
Description
技术领域
本发明涉及产生多价Fab片段的方法。特别是,本发明涉及藉由在一哺乳动物细胞中共表达包含一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一基因构筑体以及由IgG的一轻链部分所组成的一基因构筑体的三聚体Fab片段的产生的方法。
背景技术
功能性亲和(力)(functional affinity(avidity))为一抗原与许多抗原决定因素(antigenic determinants)的整体结合能力的程度。对于结合至非常接近一目标细胞的一群组的特异相同配体而言,抗原结合伙伴的聚合大幅增加它们的效用(或价数(valency)),引起更大的目标结合效力、减缓的分离率与可延长配体的调节与促进生物潜力的交联作用。
一单链变异片段(single-chain variable fragment,scFv)为免疫球蛋白的重链(VH)与轻链(VL)的变异区的一融合蛋白,藉由一短的连结胜肽来连结。与双价免疫球蛋白G(IgG)对应物(counterpart)相较,scFv的主要缺点为产物的单价,其妨碍由于多价结合增加的亲和力。为了增加亲和力,已针对scFv的多聚化发展了许多策略。
藉由使用三聚体化区域的三价单链抗体片段(scFv)融合蛋白的重组产生已被报导,三价单链抗体片段(scFv)融合蛋白包括一型前胶原蛋白(procollagen)的C前胜肽(C-propeptide)、胶原凝集素(collectin)家族蛋白质的一卷曲螺旋颈域(coiled-coil neck domain)、FasL的一C端部分与一噬菌体(bacteriophage)T4弹力素(fibritin)折叠区(Hoppe,H.J.,P.N.Barlow,et al.(1994)."A parallel three stranded alpha-helical bundle at the nucleation site ofcollagen triple-helix formation."FEBS Lett344(2-3):191-195;Frank,Kammereret al.2001"Stabilization of short collagen-like triple helices by proteinengineering."J Mol Biol308(5):1081-1089;Holler,N.,A.Tardivel,et al.(2003)."Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formationof a death-inducing signaling complex."Mol Cell Biol23(4):1428-1440.)。具有自身三聚体化与来自C-或N-端方向的异源融合蛋白质的增殖能力的短α螺旋类胶原蛋白胜肽也已在EP1798240B1中被报导。于EP1798240B1中使用的异源融合区被呈现于scFv抗体片段中。然而,在治疗应用的多价形式中,scFv具有缺点。
不像免疫球白G(IgG)分子,其可藉由使用蛋白质A或G结合的树脂亲和层析(affinity chromatographies),经由与IgG的Fc片段结合而容易地被纯化,于纯化方案的第一步骤,产生于大于98%产物同构型,用于治疗应用的多聚scFV融合体的纯化为挑战的工作,由于并无可获得的市售亲和柱。多价的scFv依据建构它们的特异变异区具有明显差异的稳定度(Jung,S.,A.Honegger,et al.(1999)."Selection for improved protein stability by phagedisplay."J Mol Biol294(1):163-180;Worn,A.and A.Pluckthun(2001)."Stability engineering of antibody单链Fv fragments."J.Mol Biol305(5):989-1010)。已报导经由变异区交换来媒介嵌合抗CD20单链Fv-Fc融合蛋白的多聚体化,导致异源抗体变异体(Wu,A.M.,G.J.Tan,et al.(2001)."Multimerization of a chimeric anti-CD20single chain Fv-Fc fusion protein ismediated through variable domain exchange."Protein Eng14(12):1025-1033)。
CFY196由与源自人类免疫球蛋白D枢纽的一联结子融合的人源化变体的mAb1A616的一Fab片段以及源自人类转录因子ATFα的卷曲螺旋序列的四聚体化区域所组成(Charles,Luo et al.2003)。然而,ATFα并非一原生质取得的蛋白质(plasma-derived protein),其可能与一可严重限制潜在治疗应用的免疫反应的风险相关。
美国专利申请公开U.S.2008/0176247显示与包括GPP三连体(triplets)的一自身三聚体化类胶原蛋白支架N端融合的一抗-CD3scFv具有形成由三个单链胜肽构成的三聚体抗体片段的能力。然而,这些类胶原蛋白支架融合体的三聚体scFv变体的下游纯化是麻烦的,因为并无可获得的亲和树脂来有效地将其纯化。此外,所述三聚体scFv变体的低蛋白质表现程度与热不稳定性不具备用于生物治疗的条件。因此,需要设计一新形式的三聚体胶原蛋白支架抗体。
发明内容
本实施例包括一种在一真核细胞中产生一多价Fab片段的方法,包括在一真核细胞中共表达之步骤:
(1)一编码出包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列的基因构筑体;以及
(2)一编码出包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列的基因构筑体。
在一实施例中该(1)基因构筑体更包括编码出一来自人类IgG的枢纽区的一序列。
在一实施例中,该人类IgG系选自IgG1、IgG2、IgG3与IgG4所组成的群组。
在一实施例中,编码出该枢纽区的该序列在该基因构筑体中座落于该Fab片段与该类胶原蛋白胜肽之间。
在一实施例中,该(1)的基因构筑体更包括编码出一单链Fv的一序列。
在一实施例中,该(2)的基因构筑体包括一人类IgG1的kappa轻链。
本发明的实施例包括藉由上方所讨论的方法来产生的多价Fab片段。
另一实施例包括三聚的多价Fab片段,包括藉由至少它们的类胶原蛋白区来结合在一起的三个多价Fab片段。
一另外实施例包括一种多价抗体片段,包括:
(1)包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列;以及
(2)包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列。
在一实施例中,该抗体片段为双特异性。
上方讨论的实施例的多价抗体片段的配体,可为人类CD3或人类CD3与人类表皮生长因子受体。
另一实施例为编码该蛋白质实施例的一核酸、表现该蛋白质实施例的表达载体或包括该表达载体和/或该核酸的宿主细胞。
本发明提供藉由使用抗-CD3抗体片段来治疗、避免或改善T细胞居中心地位的免疫疾病的症状的方法,特别是自体免疫疾病。特别是,本发明的方法为了与人类CD3复合物内的epsilon次单元特异结合的抗体的投予作准备。此类抗体调节T细胞受体/同种异体抗原(alloantigen)相互作用,且因此调整与自体免疫失调相关的T细胞居中心地位的细胞毒性。另外,本发明为了抗-CD3抗体的修饰作准备以使它们相较于未修饰的抗-CD3抗体显出经减少或经消除的效用功能(effector function)与T细胞活化。细胞激素释放症候群(cytokine release syndrome)表现为,例如,头痛、恶心、呕吐、发烧、肌痛(algias)、关节痛(hralgias)与发抖,且可由其增加,例如IL-2、IL-6、IL-10,TNFα与IFNγ的血清水平所引起。
附图说明
图1示出了根据实施例的抗体片段分子的不同形式的一概要图式:形式A:FabCSA,其为一三聚体抗体片段,由一Fab片段所组成,于其中重链片段与一枢纽区及具自身三聚体化能力的类胶原蛋白支架融合;形式B:FabCSA-scFv,其为一三聚体双特异性抗体片段,是由分别位于一具自身三聚体化能力的类胶原蛋白支架的N-与C-端的一Fab片段与一单链抗体(scFv)所组成;形式C:FabCSA-sdAb,其为三聚体特双特异性抗体片段,系由分别位于一具自身三聚体化能力的类胶原蛋白支架的N-与C-端的一Fab片段与一单域抗体(single-domain antibody,sdAb)所组成。
图2示出了根据实施例,藉由使用KappaSelect与Superdex200柱子的顺序层析(sequential chromatographies),自培养基纯化的h145FabCSA分子的结构特性。(A)藉由凝胶过滤(gel filtration)的h145FabCSA种类(species)的分离。将洗脱自KappaSelect柱子的样本浓缩且载至以PBS(pH7.4)平衡的一Superdex200凝胶过滤柱;(B)藉由SDS-PAGE,不同峰值(peak fraction)(于A中编号为波峰1至3)与所加载样本在非还原状态(泳道(lane)2、4、6与8)与其中将样本于75℃用50mM的DTT处理10分钟的还原状态(泳道3、5、7与9)下分析。(C)对应于如在B中所示以箭头指出的蛋白质带状(band)结构的概要图式。虚线指出推定的双硫键。将具有等量蛋白质的所有样本用4~12%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)进行电泳,伴随MES为电泳缓冲液(running buffer)。将胶体用InstantBlue蛋白质染色溶液进行染色。
图3示出了根据实施例藉由使用KappaSelect与Superdex200柱子的顺序层析(sequential chromatographies),纯化自培养基的hOKT3FabCSA分子的结构特性。将洗脱自KappaSelect柱子的样本浓缩且载至用PBS(pH7.4)平衡的一Superdex200凝胶过滤柱。右上区块(panel):藉由SDS-PAGE在非还原状态下分析由Superdex200分离的不同峰值(编号波峰1至3)。藉由箭头分别指出对应于hOKT3FabCSA三聚体与单体的蛋白质条带。将所有样本用4~12%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,伴随MES为电泳缓冲液。将胶体用InstantBlue蛋白质染色溶液进行染色。
图4示出了三聚体hOKT3FabCSA(在图3中的波峰2)、低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA(藉由蛋白质A管柱来纯化)与muromonab-CD3(OKT3),藉由SDS-PAGE在非还原状态(泳道2、3与4)与其中将样本于75℃用50mM的DTT处理10分钟的还原状态(泳道5、6与7)下的纯度分析。将具有等量蛋白质的所有样本用4~12%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,伴随MES为电泳缓冲液。将胶体用InstantBlue蛋白质染色溶液进行染色。M,BenchMarkTM分子量标准品。
图5示出了根据实施例,三聚体hOKT3FabCSA(分离自在图3中的波峰2)、低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA(二聚体)与单体hOKT3FabCSA(分离自在图3中的波峰3)对于经纯化的人类T淋巴球的结合亲和力抗-小鼠CD3抗体–145-2C11与三聚体h145FabCSA(在图2A中的波峰2)对于经纯化的小鼠脾脏T淋巴细胞的亲和力。
图6示出了根据实施例,抗-小鼠CD3抗体–145-2C11与三聚体h145FabCSA(在图2A中的波峰2)对于经纯化的小鼠脾脏T淋巴细胞的结合亲和力。
图7示出了根据实施例的双-独立-竞争取代结合分析(two-independent-competitive displacement binding assays)。将表现CD3(+)T-细胞受体的Jurkat细胞分别以连续稀释的抗-CD3抗体-经纯化的hOKT3FabCSA三聚体(实心圆形)与OKT3(空心圆形),于4℃培养1小时。加入饱和的FITC-结合OKT3并培养额外1小时。清洗细胞且藉由流式细胞分析(flow cytometry)将FITC-结合OKT3进行定量。数值被表现为最大荧光强度的百分比抑制,其被定义为藉由添加FITC-结合OKT3并且无先前抗-CD3抗体的阻碍所获得的平均荧光强度。
图8示出了对经纯化的OKT3、低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA与hOKT3FabCSA三聚体反应的T细胞增生。自三位健康正常提供者收集人类外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)且将其分别以连续log稀释的OKT3(实心圆形)、hOKT3IgG-AA(空心圆形)或hOKT3FabCSA(空心三角形)培养66小时,用10μM的BrdU脉冲(pulsed)额外6-小时。藉由BrdU-ELISA使用化学发光免疫测定法(chemiluminescent immunoassay)来测量细胞增生以将BrdU在DNA合成期间的并入进行定量。各点代表三位提供者的平均值±标准偏差。
图9示出了由OKT3、hOKT3IgG-AA与hOKT3FabCSA三聚体诱导的细胞激素的释放。自三位健康正常提供者收集人类PBMCs,且将其分别以连续log稀释的OKT3(实心圆形)、hOKT3IgG-AA(空心圆形)或hOKT3FabCSA(空心三角形)培养。藉由ELISA,分别在24-与72-小时时间点测定在培养上清液中的IL-2与剩余部分指出的细胞激素的程度。各点代表三位提供者的平均值±标准偏差。
图10示出了藉由经纯化的OKT3、hOKT3IgG-AA与hOKT3FabCSA三聚体的混合淋巴细胞反应的抑制。将与丝裂霉素(mitomycin)C-处理的刺激物(stimulator)PBMCs混合的应答物(responder)PBMCs,在不同浓度的OKT3(实心圆形),hOKT3IgG-AA(空心方形)或hOKT3FabCSA(空心三角形)的存在下,共培养五天,用BrdU脉冲额外16小时。藉由BrdU-ELISA来测量细胞增生。在抗体不存在下,与丝裂霉素C-处理的刺激物PBMCs混合的应答物PBMCs以及应答物PBMCs分别被以一实心方形与一实心三角形显示。在抗体不存在下,未处理的刺激物PBMCs的细胞增生被以一空心圆形显示。
图11示出了藉由经纯化的hOKT3FabCSA(三聚体)、hOKT3IgG-AA(二聚体)与hOKT3FabCSA(单体)的T细胞受体(T cell receptor,TCR)-CD3调节/覆盖(coating)的定量。CD3调节的数据显示,于经处理的CD5-阳性T细胞表面上的TCR-CD3复合物依照在未处理的CD5-阳性T细胞表面上的TCR-CD3复合物的一部分(fraction)的百分比。CD3覆盖被显示为TCR-CD3复合物的部分,其无法被FITC-结合OKT3所侦测。
图12示出了根据实施例,在小鼠中经纯化h145FabCSA三聚体的血液清除率(blood clearance)。将雄性BALB/c小鼠以静脉内注射25μg的h145FabCSA三聚体。于不同时间抽出血液样本。藉由抗-人类Fd涂覆的ELISA盘,使用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)-结合抗-人类kappa轻链为侦测抗体,来测定在血浆中剩余的抗体程度。结果被平均自各时间点的3只动物。
图13示出了根据实施例,不同抗-CD3抗体对实验性自体免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠疾病模型的生物作用。(A)对EAE小鼠的不同生物效力。对于载体(vehicle)(仓鼠控制IgG)、145-2C11(仓鼠IgG)与经纯化的三聚体h145FabCSA群组,小鼠分别以1.0、0.1与1.0μg/小鼠的剂量程度每天被静脉内注射一次,达五个连续天数(以箭号指出)。对于干扰素(interferon)-β1a(正控制)群组,小鼠以10,000单位/小鼠的剂量程度在整个治疗期间每天被腹腔内注射一次。结果被显示为来自两个独立实验的代表性实验的各群组(n=10)的平均值±标准偏差。(B)对于在EAE小鼠上的h145-2C-11IgG与三聚体h145FabCSA处理反应的Treg细胞族群的流式细胞分析。在最后的静脉内注射一天后,准备来自载体(仓鼠控制IgG)、145-2C11IgG与三聚体h145FabCSA群组的三只小鼠各自的脾脏淋巴细胞,并将其用LAP-APC与CD4-FITC染色以进行流式细胞分析。Treg族群的测定被限制(gate)于LAP+细胞。资料来自于三个实验中的一代表性小鼠。
图14A与B示出了145-2C11IgG与h145FabCSA三聚体对SLE小鼠模型的治疗功效。
图15示出了对在静脉内注射单一剂量的50μg的不同抗-CD3抗体之后的小鼠中血清细胞激素程度的时间进程研究。将小鼠分组并静脉内投予50μg经纯化的145-2C11IgG(浅灰方形)、低-Fcγ受器结合抗-小鼠CD3抗体–145IgG-AA(深灰方形)或h145FabCSA三聚体(空心方形)。在0(前采血(pre-bleed))、0.5-、24-与144-小时的时间点收集血液(100μl/小鼠)。使用ELISA来测定细胞激素的程度。各点代表三个孔洞的平均值±标准偏差。PBS(黑色方形)被使用为控制组。
图16示出了源自非单一(A)或单一稳定克隆(clone)(B)的hOKT3FabCSA763scFv分子的结构特性。藉由使用KappaSelect与Superdex200柱子的顺序层析来纯化各培养基。(A)藉由凝胶过滤的源自非单一复制的hOKT3FabCSA763scFv种类的分离。右上区块:藉由SDS-PAGE,在非还原状态下分析不同峰值(编号波峰1至3)。藉由箭号指出对应至双硫连结二聚体(T)、非-双硫-键结二聚体(Mt)与单体(Mm)的结构的带状(band)位置;(B)藉由凝胶过滤的源自一稳定克隆的hOKT3FabCSA763scFv种类的分离。藉由SDS-PAGE,在非还原状态下分析峰值。藉由箭号指出对应至双硫连结二聚体(T)与非-双硫-键结二聚体(Mt)的结构的带状位置被显示。将所有样本以4~12%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,伴随MES为电泳缓冲液。将胶体用InstantBlue蛋白质染色溶液进行染色。
图17示出了EGFR(+)细胞-A431、WiDr与HCT116及CD3(+)Jurkat T细胞与三聚体双特异抗-CD3×EGFR抗体,hOKT3FabCSA763scFv结合的流式细胞分析,hOKT3FabCSA763scFv源自如图16B所示的包含非-双硫-键结与双硫连结三聚体两者的三聚体的峰值。
图18示出了经由人类PBMCs,三聚体双特异抗-CD3×EGFR,抗体hOKT3FabCSA763scFv抵抗EGFR-表现肿瘤细胞的细胞毒性。在三聚体hOKT3FabCSA763scFv的变化浓度下,将经刺激的人类PBMCs以不同的E/T比与A431细胞培养(A);或以固定10:1的比例与WiDr或HCT116细胞培养(B)。
图19示出了经由三聚体双特异hOKT3FabCSA763scFv的EGFR-过度表现肿瘤细胞的复位向裂解(redirected lysis)的延时摄影(time-lapsephotography)。将A431细胞与PKH26-预染(prestained)的人类T淋巴细胞共培养,在1μg/ml的三聚体hOKT3FabCSA763scFv不存在(A),或存在(B)的情况下,达指定时间点(小时:分钟),且分别藉由延时显微镜来记录影像。注意在共培养13小时后观察到藉由T细胞的A431的细胞凋亡的完成。
图20示出了在HCT116大肠结肠癌NOD/SCID小鼠模型中三聚体hOKT3FabCSA763scFv的vivo功效。在第0天,将两群组-763IgG与PBS控制组皮下接种5×106HCT116细胞,在人类PBMC不存在的情况下。剩余的三个群组以皮下接种5×106HCT116细胞与来自健康提供者在第0天的5×106未经刺激的PBMC的混合物,然后以尾静脉注射PBS载体控制物(100μl)、50μg与15μg的hOKT3FabCSA763scFv于第1天达10个连续不断天数。来自各群组的肿瘤生长曲线,以指出动物的n数目被显示。介于hOKT3FabCSA763scFv群组与未经刺激的人类PBMC控制组的剂量给药的统计显著差异(P<0.001)被显示。
具体实施方式
于下方详细说明中,为了说明的目的提及许多特定细节以提供所涉及的实施例的彻底了解。然而,清楚的是,可实施一个或多个实施例而无这些特定细节。在其他例子中,纲要性地显示已知结构与装置简化图式。
本发明包括一种在一真核细胞中产生一多价Fab片段的方法,包括在一真核细胞中共表达之步骤:
(1)一编码出包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列的基因构筑体;以及
(2)一编码出包括一轻链变异区与人类IgG的kappa轻链固定区的一胺基酸序列的基因构筑体。
该(1)的基因构筑体也可包括一IgG的枢纽区和/或一scFv。
于上方的方法中所述多价抗体片段可之后被装配进三聚体的构筑体。
本发明包括编码多价抗体片段的一核酸、一表现该多价抗体片段的表达载体当表现于一宿主细胞中。本发明也包括一宿主细胞,其包括表现该多价抗体片段的一表达载体。
本发明包括用于调节(即,抑制或增加)一配体的生物活性的方法或套组,包括将一包括三个多价抗体片段的三聚体与一配体一起培养。
本发明也提供经由投予多价抗-CD3抗体片段来治疗、避免或改善T细胞居中心地位的免疫疾病的症状的方法,特别是自体免疫疾病。
定义
1.抗体片段
本发明的多价抗体片段包括一或多个“抗体片段”,也描述为“抗体区(region)”、“抗体区域(domain)”或“抗原结合区域”。于此叙述的“抗体片段”包括一完整抗体的一部分,例如,一完整抗体的抗原结合或变异区。抗体片段的例子包括,Fab、Fab’、F(ab’)2与Fv片段;双抗体(diabodies);线性(linear)抗体(参见U.S.Pat.No.5,641,870,Example2;Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])、单链抗体分子与多特异抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化(papain digestion)产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,与一残余“Fc”片段,一反映容易结晶的能力的命名。Fab片段可包括与H链的变异区域(variable region domain,VH)在一起的完整L链及一重链的第一稳定域(the first constant domain of one heavy chain,CH1)。轻链的稳定域可为lambda或kappa形式。各Fab片段有关抗原结合为单价,即其具有单一抗原结合位。
Fd或Fd片段为抗体重链片段,其是由VH与CH1域所组成。
一抗体的木瓜蛋白酶处理产生一单一大的F(ab’)2片段,其大体上对应于具有双价抗原结合能力的两个双硫连结的Fab片段,且仍具有交联(cross-linking)抗原的能力。Fab’片段不同于Fab片段,因具有在CH1域的羧基(carboxy)端的额外少数残基,额外少数残基包括一个或多个来自抗体枢纽区的半胱氨酸(cysteines)。
本发明的多价抗体片段可包括重链的一部分轻链(或其一部份),或一重链的部分与轻链或其部分两者。
抗体片段可包括一单链Fv。“单链(single-chain)Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”,为抗体片段,其包括VH与VL抗体区域连接成一单一多胜肽链。在一实施例中,scFv多胜肽更包括一多胜肽联结子介于VH与VL区域之间,其使scFv能形成所需要的用于抗原结合的结构。关于scFv的复习,参见以下Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrebaeck1995。
“单域(single domain)”抗体(sdAb)为其互补决定区的一单域多胜肽的部分抗体。例子包括重链抗体、自然缺乏轻链的抗体的抗体、源自常见4-链抗体的单域抗体、经设计的(engineered)抗体与除了源自抗体的那些的单域支架。单域抗体可为本技术领域的任何或任何未来的单域抗体。单域抗体可源自任何物种(species),包括,但不限于小鼠、人类、骆驼、羊驼(Ilama)、鲨鱼(shark)、山羊、兔子与牛科动物(bovine)。
“双特异性抗体(bispecific antibodies)”为对于至少两个不同的抗原具有结合特异性的抗体。
在实施例中的Fd-CS为一融合多胜肽链,其是由抗体Fd片段接着一人类IgG1的枢纽区与本发明类胶原蛋白胜肽所组成。
可于此使用用语“单体”以描述具有单一类胶原蛋白胜肽一多价抗体片段的一实施例。在一实施例中,使用“单体”来描述一多价抗体片段,其中一重链与一轻链结合。所述“单体”被与多价抗体片段的“三聚化(trimerized)”结构区别。
在一实施例中,多价抗体片段为双特异的。在一实施例中,本发明的一单体结构可具有不只抗体片段、大于一个抗原结合区,且可结合大于一类型的抗原。例如,本发明多价抗体片段的单一单体结构可包括一Fab区于单体结构的N端,且具有一scFv区于单体结构的C端。
2.枢纽区
本发明实施例的蛋白质是需要而定包括一“枢纽区”。在一实施例中,枢纽区为一大约4-15个胺基酸长的序列。其可为一人类IgG的枢纽区或一甘胺酸(glycine)联结子。在一实施例中,一人类IgG的枢纽区为人类IgG1、IgG2、IgG3或人类IgG4的枢纽区。
如先前Fan,et al.(2008)“Production of multivalent protein binders using aself-trimerizing collagen-like peptide scaffold.”FASEB J22(11):3795-3804所证实,类胶原蛋白胜肽,(GPP)10,藉由其本身可驱动一非共价结合的三聚体融合蛋白质的形成。因此,“枢纽区”为视需要而定,且甚至目前对于所主张的融合胜肽不具有三聚体化功效。
3.类胶原蛋白胜肽
胶原蛋白为哺乳动物中最丰富的蛋白质。其为一细胞外基质(extracellular matrix)蛋白质,其包含一个或多个三重螺旋区(triple-helicalregions)(胶原蛋白区域或胶原蛋白“支架”)具有一重复的Gly-Xaa-Yaa的三连体的序列,其中Xaa与Yaa为任何胺基酸残基,随着脯胺酸(praline)(胺基酸代号,P或Pro)为最频繁被并入的残基。在Yaa位置中,Pro一般被酶修视为4-羟脯胺酸(hydroxyproline)(胺基酸代号,O或Hyp),使得Gly-Pro-Hyp为于胶原蛋白最常见与最稳定中的三重复。此类三重复的存在允许三条胶原蛋白多胜肽链(α-链)折叠成三重螺旋结构。类胶原蛋白胜肽的叙述,可被发现于于此特别引入其全文为引用文献的U.S.Patent Application13/588,752的类胶原蛋白区域的叙述中。本发明的类胶原蛋白多胜肽藉由其本身具有将一Fab片段的重链部分三聚体化成三价结构的能力,不需其他分开的三聚体化区域。本发明一类胶原蛋白多胜肽包括至少5、至少10个Gly-Pro-Pro或Gly-Pro-Hyp三个一组的连续重复的至少一延伸(stretch)。本发明的类胶原蛋白胜肽可包括一Gly-Pro-Pro或Gly-Pro-Hyp基序(motif)和/或其他Gly-Xaa-Yaa基序,其中Xaa与Yaa为任何胺基酸残基。本发明的类胶原蛋白胜肽也可包括被发现于许多天然发生的胶原蛋白与含类胶原蛋白区域的蛋白质中的被一短的瑕疵所中断的一完美重复的Gly-Xaa-Yaa三个一组,于其中第一位置的Gly或第三位置的Yaa残基缺失。
藉由测量此三聚体的熔点温度,可测定胶原蛋白多聚体结构的稳定性。许多研究已检验G-P-X1重复的熔点温度/稳定性。Frank et al.,(2001);Persikov et al.,(2000)Biochemistry39,14960-14967;Persikov et al.,(2004)Protein Sci.13:893-902;and Mohs et al.,(2007)J.Biol.Chem.282:29757-29765。基于这些研究,可预测各种重复结构的稳定性。
4.联结子(Linker)
联结子为一短的胜肽序列,其可视需要而定被置于抗体片段与类胶原蛋白胜肽区之间,或结合区与类胶原蛋白胜肽区之间。scFv多胜肽也包括一多胜肽联结子介于VH与VL区之间,其使scFv能形成对于抗原结合所需的结构。在一些实施例中,在任一例子中,联结子长度介于4与10个胺基酸之间。
本发明多价抗体片段可于结合区与配体结合。一配体为一生物分子,其与本实施例的结合区形成一复合物。配体可在一特定功能性亲和力下,经由分子间作用力(Intermolecular force)与结合区结合。在一实施例中,多价抗体片段对其配体具有大于10-6M的功能性亲和力。在一实施例中,多价抗体片段对其配体具有大于10-8M的功能性亲和力。在一实施例中,多价抗体片段对其配体具有大于10-10M的功能性亲和力。在特定实施例中,可溶三聚体或六聚体融合蛋白质具有对其配体具有介于10-7M与10-12M之间、介于10-8M与10-11M之间、介于10-7M与10-10M之间、介于10-8M与10-10M之间,与介于10-9M与10-10M之间的功能性亲和力(functional affinity(oraffinity))。
在一实施例中,由多价抗体片段所建构的三聚体或六聚体蛋白质为一可溶性蛋白质。一可溶性蛋白质为在生理状态(physiological conditions)下为可溶者。在一实施例中,由多价抗体片段所建构的可溶性三聚体或六聚体为一分泌蛋白质(secreted protein)。一分泌融合蛋白质为被一细胞所分泌者。藉由具有讯息序列或于包含抗体区域的多胜肽上的讯息胜肽,可将一蛋白质的分泌做为目标。
讯息序列可包括:
MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValProGlySerThrGly(序列辨识号:11)。
讯息胜肽可在表达、装配和/或分泌过程期间被裂解。小鼠融合瘤(myeloma)NS0细胞为一对于重组胶原蛋白或类胶原蛋白蛋白质的产生以及对于本发明融合蛋白质的表达的良好表达系统。另外,CHO与CHO-S细胞可被用于重组胶原蛋白或类胶原蛋白蛋白质的产生及用于本发明融合蛋白质的表达。
本发明的实施例的经装配的三聚体包括三个单体;第一、第二与第三多价抗体片段。在一实施例中,上述第一、第二与第三多价抗体片段为大体上相同,彼此具有至少75%(例如,任何介于75%与100%之间的数字,包含,例如75%、76%…95%、96%、97%、98%或99%)的序列相似度。藉由三个相同的多价抗体片段所形成的一复合物为一同源三聚体(homotrimer)。三个多价抗体片段可为功能等同物(functional equivalent)。一"功能等同物"意指一常见多胜肽的一多胜肽衍生物,例如具有一或多个点突变(point mutations)、插入、删除、截断的一蛋白质、一融合蛋白质,或其组合,并实质上维持形成三重螺旋卷曲(triple helix coil)的能力与异源区域(heterologous domain)的活性,例如结合至一配体。在一实施例中,具有第一单体多价抗体片段结构的三个复制(copy)与第二多价抗体片段结构的三个复制。在一实施例中,可具有第一多价抗体片段结构的两个复制、第二多价抗体片段结构的两个复制与第三多胜肽结构的两个复制。
百分比强度可被测定,例如,藉由使用Devereux等人所叙述(Nucl.AcidsRes.12:387,1984)且可获自University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)之GAP计算机程序,版本6.0来比较序列信息。GAP程序利用Smith与Waterman(Adv.Appl.Math2:482,1981)修订的Needleman与Wunsch(J.Mol.Biol.48:443,1970)的校准方法(alignment method)。对于GAP程序的系统默认参数(default parameters)包括:(1)用于核苷酸的一元比较矩阵(unarycomparison matrix)(包含对于相同(identities)的1的值与对于不相同(non-identities)的0的值)与由Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of ProteinSequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358,1979所述的Gribskov and Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986的加权比较矩阵(weighted comparison matrix);(2)对于各差距(gap)的3.0的扣分(penalty)与对于在各差距中的各标记的一额外0.10的扣分;以及(3)对于末端差距(endgaps)没有扣分。
如于此所使用,用语"共有序列(consensus sequence)"意指形成自于相关序列的一家族中最频繁发生的胺基酸(或核苷酸)的序列(参见Winnaker,FromGenes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987;也参见Richards et al.,图9)。在一家族的蛋白质中,于共有序列中的各位置被于此家族中最频繁出现于此位置的胺基酸所占据。若两个胺基酸同样频繁出现,则任一个可被包括于共有序列中。
一异源多胜肽、核酸或基因为一多胜肽、核酸或基因,其与并非自然结合的另一多胜肽、核酸或基因结合。两个融合的区域或序列为彼此异源的,若它们并非于一自然发生的蛋白质或核酸中彼此连接。
一"经分离的"多胜肽(或多价抗体片段)或蛋白质复合物意指一多胜肽或一蛋白质复合物大体上没有缔合分子(associated molecule)掺杂,即根据干重(dry weight),其为至少75%(即包括介于75%与100%之间的任何数字)纯。藉由任何适合的标准方法可测量纯度,例如,藉由柱层析(columnchromatography)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)或HPLC分析。本发明实施例的一经分离的多胜肽或蛋白质复合物可纯化自一天然来源、藉由重组DNA技术产生。
三聚体化以形成三聚体多价抗体片段的三个单体抗体片段可为非连续的(non-contiguous)。在另一实施例中,三聚体化以形成三聚体多价抗体片段的三个单体抗体片段为连续的,即,被转译为一单一转译产物。
另一方面,当二个或多个的六个结合区为彼此相同时,蛋白质复合物可具有特异于一结合伙伴(binding partner)(例如,抗原)的1-3个结合区,相较于一仅具有一个或两个此类区域的一般抗体或受体。换句话说,和对于一抗原仅为单价或双价的一般抗体或受体不同,蛋白质复合物可为双-、三-、四-、五-或六-价。因此,其可被制作为具有高于一般抗体或受体的亲和力。由于较高的亲和力,相较于一般抗体需要较少量的蛋白质复合物与较短的培养期间来达成所需目标,例如,治疗作用,藉此降低治疗成本与使副作用最小化(例如,不想要的免疫反应)。
另一方面,当二个或多个的六个结合区为彼此不同时,本发明的一蛋白质复合物可具有特异于2-6个不同的结合伙伴的2-6个结合区。将不同特异性的多个结合伙伴位置联合成一单元,其具有将多个结合伙伴聚集在一起的能力,且因此在于纳米程度的治疗、组织重建(tissue reconstruction)与活性蛋白质机器(machinery)(例如,一多单元次单位酶)的装配方面,具有所需用途。
本发明实施例的一蛋白质复合物可被结合至一治疗部分(moiety),例如一细胞毒素(cytotoxin)、一治疗试剂或一放射性离子(radioactive ion)。一细胞毒素或细胞毒性试剂包括对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉醇(taxol)、细胞迟缓素B(cytochalasin B)、灭革兰菌素D(gramicidin D)、溴化乙菲锭(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、伊妥普赛(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙素(colchicines)、阿霉素(doxorubicin)、道红链丝菌素(daunorubicin)、二羟炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、双羟恩(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放射菌素D(actinomycin D)、去氢睾丸素(1-dehydrotestosterone)、葡萄糖皮质素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普潘奈(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)、美登类化合物(maytansinoids),例如美登素醇(maytansinol)(参见U.S.Pat.No.5,208,020)、CC-1065(参见U.S.Pat.Nos.5,475,092,5,585,499与5,846,545)与其类似物(analogs)或同源物(homologs)。治疗试剂包括,但不限于,抗代谢物质(antimetabolites)(例如,胺甲基叶酸(methotrexate)、6-硫醇嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、5-氟尿嘧啶达喀尔巴仁(5-fluorouracildecarbazine))、烷化试剂(例如,二氯甲基二乙氨(mechlorethamine)、thioepachlorambucil、CC-1065、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)与环己亚硝(lomustine)(CCNU)、癌德星锭(cyclothosphamide)、硫酸布他卡因(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链佐霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C与顺式二氯二氨合铂(cis-dichlorodiamine platinum(II),DDP)二氯二氨铂(cisplatin)、葱环类化合物(anthracyclines)(例如,道红链丝菌素(daunorubicin)(先前为daunomycin)与阿霉素(doxorubicin))、抗生素(例如,放线菌素(dactinomycin)(先前为actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素与氨茴霉素anthramycin(AMC))与抗有丝分裂试剂(例如,长春新碱、长春花碱、紫衫醇与美登类化合物)。
于本发明实施例中所考虑的放射性离子包括,但不限于,111铟(Indium)、113铟、99铼(Rhenium)、105铼、101铼、99锝(Mtechnetium)、121碲(Mtellurium)、122碲、125碲、165铥(Thulium)、167铥、168铥、123碘(Iodine)、125碘、126碘、131碘、133碘、81氪(Krypton)、33氙(Xenon)、90钇(Yttrium)、213铋(Bismuth)、77溴(Bromine)、18氟(Fluorine)、95钌(Ruthenium)、97钌、103钌、105钌、107汞(Mercury)、203汞、67镓(Gallium)、68镓、35硫(Sulphur)与14碳(Carbon)。
结合物(conjugates)可被用来修饰一产生的免疫反应,藉由将结合物投予至一宿主。药物部分drug moiety不被解释为限制为正统化学治疗试剂。例如,药物部分可为具有一所需生物活性的一蛋白质或多胜肽。此类蛋白质可包括,例如一毒素,如鸡母珠毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A);绿脓杆菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin);一蛋白质,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)、α-干扰素(interferon)、β-干扰素、神经生长因子(nerve growth factor)、血小板衍生生长因子(platelet derived growthfactor)。组织型溶酶原活化因子(tissue plasminogen activator);或生物反应修饰子(biological response modifiers),如,例如,淋巴因子(lymphokines)、介白素(interleukin)-1("IL-1")、介白素-2("IL-2")、介白素-6("IL-6")、颗粒球巨噬细胞聚落刺激因子(granulocyte macrophase colony stimulating factor)("GM-CSF"),颗粒球聚落刺激因子(granulocyte colony stimulatingfactor)("G-CSF")或其他生长因子。
在额外的实施例中,一多价抗体(或其三聚体复合物)可被结合或接合至一标记试剂(labeling agent)(即“一标志试剂(marking agent)”),例如,荧光试剂或放射性试剂。标志蛋白质(marker protein)包括,但不限于发光酶(luciferase)、绿荧光蛋白质(green fluorescent protein)与增强绿荧光蛋白质(enhanced green fluorescent protein)。包括标志蛋白质的目前实施例的多价抗体实施例可被用于诊断与分子造影(imaging)。在本发明实施例中,包括标志蛋白质或放射性离子或其他融合部分的多价抗体片段可被包装于一套组中,其包括多价抗体片段与特定分子的造影所需的其他试剂。这些试剂可包括,但不限于,生物样本的制备的试剂用于与用于标记蛋白质的形象化(visualization)的试剂。
在本发明另外的实施例中,一多价抗体片段(或其三聚体复合物)可被结合至一聚合物。此类聚合物包括,但不限于,聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇(polypropylene glycol)与聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyol)。
本发明的实施例也包括一经分离的核酸,其包含编码出如上所述的多价抗体片段的一序列或此序列的一互补物(complement)。一核酸意指一DNA分子(例如,一cDNA或基因体DNA(genomic DNA))、一RNA分子(例如,一mRNA),或一DNA或RNA类似物。一DNA或RNA类似物可自核苷酸类似物来合成。核酸分子可为单股或双股,但在一实施例中为双股DNA。一"经分离的核酸"为一核酸,其结构并不相同于任何自然存在的核酸的结构或任何自然存在的基因体核酸的任何片段的结构。因此,此用语包含,例如,(a)一DNA其具有一自然存在的基因体DNA分子的部分的序列,但不被位于生物体基因体中自然存在其中的分子的那部分的两侧的编码序列两者所位于两侧;(b)一核酸,其并入一载体后一原核细胞或真核细胞,以使所产生的分子不同于任何自然存在的载体或基因体DNA的方式;(c)一个分离的分子(separate molecule),例如一cDNA、一基因体片段、由聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)所产生的一片段或一限制性片段(restriction fragment);以及(d)一重组核苷酸序列,其为一混合基因(hybridgene)的部分,即编码出一融合蛋白质的一基因。上述核酸可被用来表现本发明的多胜肽。为此目的,可操作性地连结此核酸至适合的调控序列(regulatory sequence)以产生一表达载体。
一载体意指,一核酸分子,其具有运输可连结至其的其他核酸的能力。载体可具有自发复制的能力或可并入一宿主细胞。一载体的例子包括一质粒(plasmid)、粘粒(cosmid)或病毒载体(viral vector)。本发明的载体包括于一适合在宿主细胞中核酸的表达形式的一核酸。载体包括一个或多个调控序列操作性地连结至要被表达的核酸序列。在一实施例中,表达载体为pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。
一"调控序列"包括启动子(promoters)、增强子(enhancers)与其他表达控制要素(例如,多聚腺苷酸化讯息(polyadenylation signals)),调控序列包括直接构成一核苷酸序列的表达的那些与组织特异调控和/或可诱导的序列。表达载体的设计可依据此类因子,例如要被转形(transform)的宿主细胞的选择。所需的蛋白质的表达程度及其类似。表达载体可被引入宿主细胞以产生本发明的多胜肽。也在本发明实施例的范围中的是,包含上述核酸的一宿主细胞。例子包括大肠杆菌(E.coli)细胞、昆虫细胞(例如,使用果蝇(Drosophila)S2细胞或杆状病毒(baculovirus)感染的昆虫细胞)、酵母菌细胞(yeast cell)或哺乳动物细胞(mammalian cell)(例如,小鼠融合瘤NS0细胞)。参见,例如Goeddel,(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,Calif。
编码出本发明单体结构的序列也可包括提供用于确认与纯化的核苷酸或蛋白质序列。此类序列可包括限制性切位点(restriction sites)、(标签tags)、间隔物(spacer),与其他方法以纯化或确认核苷酸或蛋白质序列。通常此类序列被包含于核苷酸中,且用于编码长度4-6个胺基酸的短的胺基酸序列。它们常出现于多价抗体片段的中间区域为人工制品(artifacts),但不实质上影响本发明的基本的与新颖的特性。
为了产生一多价抗体片段,在允许一核酸所编码的多胜肽的表现的状况下,可于一培养基中培养一宿主细胞,自培养的细胞或细胞的培养基纯化此多胜肽。若没有亲和性标签的话,则包含类胶原蛋白胜肽的胜肽可能不易被纯化。在本发明多价抗体片段中,Fab区域协助纯化,或者,本发明的核酸可被in vitro转录与转译,例如,使用T7启动子调控序列与T7聚合酶。
为产生本发明实施例的一蛋白质复合物,可于一培养基中培养包含分别编码出上述第一、第二与第三融合多胜肽的第一、第二与第三核酸的一宿主细胞,在允许藉由此三个核酸所编码的多胜肽表达及在所表达的多胜肽之间的三重螺旋卷区的形成状态下,从培养的细胞或细胞的培养基纯蛋白质复合物。宿主细胞为一真核细胞,其包含羟化(hydroxylates)脯胺酸残基的酶活性。
一宿主细胞可为任何原核或真核细胞。本发明实施例的蛋白质可被表现于细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母菌细胞或哺乳动物细胞(例如,中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)或COS细胞(非洲绿猴肾脏细胞CV-1起源SV40细胞;Gluzman(1981)Cell23:175182))中。其他适合的宿主细胞为本技术领域中具有通常知识者所已知。
经由一般转形(transformation)或转染(transfection)技术,载体DNA可被引入一宿主细胞。如于此使用,用语"转形"与"转染"被打算意指为各种本技术领域认可的用于引入外来核酸(例如,DNA)进入一宿主细胞的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沈淀(co-precipitation)、DEAE-葡聚糖(dextran)-居中心地位的转染、脂质转染(lipofection)或电穿孔(electroporation)。
为了in vivo使用于人类中,本发明实施例的一多价抗体片段为人类源的。例如,其可包一序列,其融合框架内至人类源的类胶原蛋白区域。由于许多具有胶原蛋白区域的类胶原蛋白蛋白质于血液中相当稳定,因此多价抗体片段同样地在血液中可维持结构完整。此外,枢纽区与Fc区域可取自一人类IgG或人源化抗体。
本发明实施例也提供藉由使用抗-CD3抗体片段来治疗、避免或改善T细胞居中心地位的免疫疾病症状的方法,特别是自体免疫疾病。特别是,本发明的方法为了与人类CD3复合物内的epsilon次单元特异结合的抗体的投予作准备。此类抗体与抗体片段调节T细胞受体/同种异体抗原(alloantigen)相互作用,且因此调整与自体免疫失调(autoimmune disorder)相关的T细胞居中心地位的细胞毒性。另外,本发明为了抗-CD3抗体或抗-CD3抗体的片段的修饰作准备,以使它们相较于未修饰的抗-CD3抗体显出经减少或经消除的效用功能(effector function)与T细胞活化。
免疫失调意指于其中免疫系统错误地攻击与破坏健康的身体组织藉此产生组织损伤的疾病。免疫失调包括,但不限于类风湿关节炎(rheumatoidarthritis)、幼年型类风湿性关节炎(juvenile rheumatoid arthritis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、1型糖尿病(type1diabetes mellitus)、发炎性肠道疾病(inflammatory bowel diseases)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、混合型结缔组织病(mixed connectivetissue disease)、进行性全身性硬皮症(progressive systemic scleroderma)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome)、干癣(psoriasis)、硬皮症(scleroderma)、肾丝球肾炎(glomerulonephritis)、皮肌炎(dermatomyositis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)与葛瑞夫兹氏症(Grave's disease)。
效用功能可被证实,藉由,通过补体依赖型细胞毒杀作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)的一抗体覆盖颗粒的吞噬作用(phagocytosis)与瓦解(collapse)、通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)的一抗体覆盖目标细胞的裂解,其起因于交联抗体Fc片段与一经活化的作用细胞(effector cell),例如自然杀伤细胞(natural killer cell)的Fcγ受器、包括IL-1α、IL-1β、IL-6与TNFα的炎症介质(inflammatory mediator)的释放,以及免疫产物的控制。
T细胞活化可被证实,藉由测量关于经由抗原或对于T细胞受体(T cellreceptor,TCR)的竞争抗体(agonistic antibody)的T细胞的刺激T细胞增生。T细胞受体活化可导致讯息传递途径(signaling pathway)的起始,讯息传递途径包括特定蛋白质胺酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)的诱导、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-biphosphate,PIP2)的分解、蛋白质激酶C(protein kinase C,PKC)的活化与细胞内钙离子浓度的提高。这些早期事件被传送至细胞核并导致T细胞的克隆扩增(clonal expansion);于细胞表面上的活化标志的向上调控;分化效应细胞(effector cells);细胞毒性的诱导或细胞激素释放,例如IL-2;细胞凋亡的诱导。
细胞激素释放症候群(cytokine release syndrome)表现为,例如,头痛、
恶心、呕吐、发烧、肌痛、关节痛与发抖,且可由其增加,例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα与IFNγ的血清水平所引起。
上述蛋白质复合物,根据异源结合区的特异性,可被用于治疗各种失调,包括自体免疫失调、发炎疾病、代谢疾病、纤维化疾病(fibrosis diseases)、癌症与心血管疾病(cardiovascular diseases)。疾病的特定表现形式(manifestations)包括头痛、恶心、呕吐、发烧、肌痛、关节痛与发抖,且可由增加之,例如IL-2、IL-6、IL-10、TNFα与IFNγ的血清水平所引起。因此,本发明以治疗此类疾病的方法为特征,例如,藉由投予一需要的个体,一有效量的本发明的蛋白质复合物以治疗失调。被治疗的个体可被确认为具有具备疾病特征的情况,或为处于获得具备疾病特征的情况的风险中。可将此方法单独执行或与其他药物或治疗结合执行。
一实施例为被用来治疗由T细胞受体/同种异体抗原互相作用所引起或加重的疾病,且因此调控T细胞与免疫疾病相关的T细胞居中心地位的细胞毒性。在另一实施例中,本发明被用于在依需要的病患中调节CD3之生物活性、调节CD3讯息传递的程度或调节T受体/同种异体抗原互相作用。在一实施例中,本发明降低未结合的CD3的程度或CD3讯息传递。由于本发明一蛋白质复合物的多特异特征,可使用其来连结通常不彼此结合的分子或细胞。此特征对于细胞疗法(cell-based therapies)特别有用。在一例子中,本发明多价Fab抗体片段具有以一区域结合CD3而另一区域结合EGFR的能力。
经由本发明的一蛋白质复合物与为细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell)表面上的一效用抗原(effector antigen)的CD3抗原结合,可发生细胞毒性T细胞的活化。其他淋巴细胞相关效用抗原包括人类CD16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、CD2抗原、CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原与CD89抗原。结合这些效用抗原导致效用细胞的活化,效用细胞例如单核细胞(monocyte)、嗜中性粒细胞(neutrophilic granulocyte)与树突状细胞(dendritic cell)。这些经活化的细胞之后对目标细胞施加细胞毒性或细胞凋亡作用。
用语"治疗(treating)"被定义为,带有治愈、缓和、减轻、改善、避免或减轻失调、该失调的症状、继发于该失调的疾病状态、一被本发明的配体所加剧的失调或对于该失调的易染病体质的目的,而对一病患投予一组合物。"有效量"为组合物在如上述的经治疗的个体中可产生的医药所需结果的一个量。
在一in vivo方式中,将一治疗组合物(例如一组合物,其包含本发明的一蛋白质复合物)投予至一个体。一般而言,将复合物悬浮于一药学上可接受的载体中(例如,一生理食盐水physiological saline)且将其口服或藉由静脉内注入(intravenous infusion)投药,或将其皮下(subcutaneously)、肌肉内(intramuscularly)、鞘内(intrathecally)、腹腔内(intraperitoneally)、直肠内(intrarectally)、阴道内(intravaginally)、鼻内(intranasally)、胃内(intragastrically)、气管内(intratracheally)或肺内(intrapulmonarily)注射或植入。
剂量要求依据投药途径的选择、配方的本质(the nature of theformulation)、个体的疾病的性质;个体的体型、重量、表面积、年龄与性别、要投予的其他药物、与主治医师的判断。适合的剂量为在0.01-100.0mg/kg的范围中。适合的剂量为在0.01-100.0mg/kg,或更特别是0.1-100、0.1-75、0.1-50、0.1-25、0.1-10、0.5-100、0.5-75、0.5-50、0.5-25、0.5-10、1-100、1-75、1-50或1-25mg/kg的范围中。剂量可包括1-10、10-100、10-75、10-50、10-25、25-50、50-75、25-100、25-50、50-100或75-100mg/kg。或者,剂量可在1-2、3-4、5-6、7-8或9-10mg/kg的范围。
本发明实施例的治疗组合物可每天被投予一次、两次或三次或更多,在介于1至10周之间,例如为介于2至8周之间,或者为介于3至7周之间,且甚至为约4、5或6周的每周。根据可利用的组合物种类与投药途径的不同效力来预计在所需剂量中的变化。例如,相较于藉由静脉内注射的投药,口服投药预期会需要较高的剂量。为了优化,使用标准经验途径可调整于这些剂量程度中的变化,此为本技术领域中所熟知。于一适合的传送载体(delivery vehicle)(例如,聚合微粒(polymeric microparticle)或可植入装置(implantable device))中的组合物封装可增加传送效率,特别是对于口服传送。
药学上适合的载体包括一溶剂、一分散媒介(dispersion medium)、一包衣(coating)、一抗细菌或抗真菌试剂及一等渗透压与吸收延迟。特别是,这些试剂可包括盐溶液(saline solution)、不挥发性油(fixed oil)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、甘油(glycerine)、丙二醇(propylene glycol)或其他合成试剂;抗细菌试剂,例如苯甲醇(benzyl alcohol)或对羟基苯甲酸甲酯(methylparabens);抗氧化剂(antioxidants),例如抗坏血酸(ascorbic acid)或亚硫酸氢钠(sodium bisulfite);螯合试剂(chelating agent),例如乙二胺四醋酸(ethylenediaminetetraacetic acid);缓冲溶液(buffer),例如醋酸盐(acetate)、柠檬酸盐(citrate)或磷酸盐(phosphate);与用于渗透强度(tonicity)调整的试剂,例如氯化钠或葡聚醣。可用酸或碱来调整药学组合物的pH值,例如盐酸(hydrochloric acid)或氢氧化钠(sodium hydroxide)。
也在本发明实施例的范围内的为一药学组合物,其包含药学上可接受的载体与一有效量的本发明实施例的蛋白质复合物。药学组合物可被用来治疗上述的失调。药学尚可接受的载体包括一溶剂、一分散媒介、一包衣、一抗细菌或抗真菌试剂及一等渗透压与吸收延迟。使用一般之方法可将药学组合物配制为用于不同之投药途径的剂量形式。
本发明之实施例的组合物可被评估于in vitro与in vivo两者。对于in vivo研究而言,可将组合物注入一动物(例如,一小鼠模式)并之后存取其治疗功效。根据此结果,可确定一适合的剂量范围与投药途径。
如于此处所使用,用语"针对抵抗(directed against)"与"特异性结合至(specifically binds to)"意指本发明融合蛋白质包括一抗体区域,其中一抗体的抗体或片段对其配体具有至少10-6M的功能性亲和力。
在伴随以下图式与说明中,本发明的一个或多个实施例的细节被提出。由说明书及图式以及由申请专利范围,本发明的其他特征、目的与优点是明确的。
II.实施例之结构
A.抗体片段
根据一实施例的本发明多价抗体片段的单体可具有单一抗体片段(包括结合区域/区或抗原-结合片段)或多于一个抗体片段。一单体呈现多价抗体片段的抗体片段的例子包括,但不限于:(i)一Fab片段,由VL、VH、CL与CH1区域所组成的一单价片段;(ii)一F(ab')2片段,包括两个由双硫键于枢纽区连结的双价片段;(iii)由VH与CH1区域所组成的一Fd片段;(iv)由一抗体的单一手臂之的VL与VH区域所组成的一Fv片段;(v)一dAb片段(Ward etal.,(1989)Nature341:544-546),其由一VH区域所组成;(vi)一经分离的互补决定区(complementarity determining region,CDR);与(vii)VL或VH区域。
在一实施例,抗体片段为一Fab片段。
此外,尽管Fv片段的两个区域,VL与VH为由个别的基因所编码,然使用重组方法,经由一合成联结子可将它们连结,合成联结子能使它们被做成为于其中VL与VH区成对以形成单价分子的单一蛋白质链(已知为单链Fv(scFv);参见,Bird et al.(1988)Science242:423-426;与Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此种单链抗体(scFv)也包含于一抗体的用语"抗原-结合片段"中。藉由使用本技术领域中具有通常知识者所知的一般技术,可获得这些抗体片段,并且,为了效用以与完整抗体相同的方式来筛选此片段。
在一实施例,抗体片段为一scFv。
在一实施例,多价抗体包括两个抗体片段、一Fab与一scFv。
Fd或Fd片段为由VH与CH1区域所组成的抗体重链片段。
一抗体可为一单株抗体。在一实施例中,抗体被重组地产生,例如藉由嗜菌体展示(phage display)或藉由组合的方法。用于产生嗜菌体展示或藉由组合的方法为本技术领域中所已知(参见,例如Ladner et al.U.S.Pat.No.5,223,409;Kang et al.International Publication No.WO92/18619;Dower et al.International Publication No.25WO91/17271;Winter et al.InternationalPublication WO92/20791;Markland et al.International Publication No.WO92/15679;Breitling et al.International Publication WO93/01288;McCafferty etal.International Publication No.WO92/01047;Garrard et al.InternationalPublication No.WO92/09690;Ladner et al.International Publication No.WO90/02809;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85;Huse et al.(1989)Science246:1275-1281;Griffths et al.(1993)EMBO J.12:725-734;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol226:889-896;Clackson et al.(1991)Nature352:624-628;Gram et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:3576-3580;Garrad et al.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res19:41334137;and Barbaset al.(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:7978-7982,其所有内容于此被合并为参考文献)。在一实施例中,抗体为一人类抗体(例如,于一小鼠中制造的一抗体,其已被基因工程建造以产生一来自人类免疫球蛋白序列的一抗体),或一非人类抗体,例如一啮齿目动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(primat)(例如猴子)或骆驼抗体。在一实施例中,非人类抗体一啮齿目动物(小鼠或大鼠抗体)。产生啮齿目动物的抗体的方法为本技术领域所已知。
相较于小鼠系统,使用携带人类免疫球蛋白基因的基因转殖小鼠可产生人类单株抗体。使用以完整抗原免疫的来自基因转殖小鼠的脾细胞来产生融合瘤,其分泌具有对来自一人类蛋白质的抗原决定位特异亲和力的人类mAbs(参见,例如Wood et al.International Application WO91/00906,Kucherlapati et al.PCT15publication WO91/10741;Lonberg et al.International Application WO92/03918;Kay et al.International Application92/03917;Lonberg,et al.(1994)Nature368:856-859;Green,L.L.et al.(1994)Nature Genet.7:13-21;Morrison et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855;Bruggeman et al.(1993)Year Immunol7:33-40;Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3720-3724;Bruggeman et al.(1991)Eur JImmunol21:1323-1326)。
人类单株抗体的一例子为帕尼单抗(panitumumab),先前称为ABX-EGF,为特异于表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)的一完整人类单株抗体。帕尼单抗被用于治疗具有表皮细胞生长因子受体表达,结肠(colon)或直肠(rectum)的转移癌症的病患。
一抗体,可为于其中变化区或其部分,例如CDR's被产生于一非人类生物体,例如一大鼠或小鼠中者。可使用嵌合(chimeric)、CDR接枝(CDR-grafted)与人源化抗体。于一非人类生命体,例如一大鼠或小鼠中产生的抗体,且之后例如于变异骨架(variable framework)或固定区被修饰以降低于一人类中的抗原性(antigenicity)为于本发明中。
藉由本技术领域中已知的重组DNA技术可产生嵌合抗体。例如,以限制酶裂解编码出一鼠科动物(或其他种类)单株抗体分子Fc固定区的一基因以移除编码出鼠科动物的Fc的区域,且以编码出一人类Fc固定区的一基因的等同部分取代(参见,Robinson et al.,International Patent PublicationPCT/US86/02269;Akira,et al.,European Patent Application184,187;Taniguchi,M.,European Patent Application171,496;Morrison et al.,European PatentApplication173,494;Neuberger et al.,International Application WO86/01533;Cabilly et al.U.S.Pat.No.4,816,567;Cabilly et al.,European Patent Application125,023;Better et al.(1988)Science240:1041-1043);Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443;Liu et al.,(1987)J Immunol.139:3521-3526;Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218;Nishimura et al.,(1987)Canc.Res.47:999-1005;Wood et al.et al(1985)Nature314:446-449;and Shaw et al.,(1988)J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。
一人源化或CDR-接枝抗体会具有以一提供者CDR取代的至少一个或二个但通常全部三个(重和/或轻免疫球蛋白链)的接受者(recipient)CDR's。可以至少一非人类CDR的一部分来取代抗体,或仅有CDR's的一些可以非人类CDR's来取代。仅需要取代人源化抗体或一其片段的结合所要求的CDR's的数目。提供者可为一啮齿目动物抗体,例如一大鼠或小鼠抗体,且接受者为一人类骨架或一人类一致骨架(consensus framework)。一般而言,提供CDR's的免疫球蛋白称为"提供者(donor)",而提供骨架的免疫球蛋白称为"接受者(acceptor)"。在一实施例中,提供者免疫球蛋白为一非人类的(例如,啮齿目动物的)。接受者骨架为一自然发生(例如,一人类)骨架或一一致骨架,或一序列约与其85%或更高,为90%、95%、99%或更高相同。
在一实施例中,配体或抗原为CD3。在一实施例中,配体或抗原为EGFR。在一实施例中一双特异结构具有抗-CD3区与抗-EGFR区两者。
在一实施例中,Fab为抗-CD3,且可包括一个或多个下列的结构:
包括于h145FabCSA中的结合区
一抗体片段的结合区可源自一抗-CD3抗体,且可包括重链与轻链两者。例如,源自仓鼠抗-小鼠CD3抗体(145-2C11)的重链变异区为:
AspGluValGlnLeuGlnGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyLysSerLeuLysLeuSerCysGluAlaSerGlyPheThrPheSerGlyTyrGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyArgGlyLeuGluSerValAlaTyrIleThrSerSerSerIleAsnIleLysTyrAlaAspAlaValLysGlyArgPheThrValSerArgAspAsnAlaLysAsnLeuLeuPheLeuGlnMetAsnIleLeuLysSerGluAspThrAlaMetTyrTyrCysAlaArgPheAspTrpAspLysAsnTyrTrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer(序列辨识号:12)。
源自仓鼠抗-小鼠CD3抗体(145-2C11)的轻链变异区为:
AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuProAlaSerLeuGlyAspArgValThrIleAsnCysGlnAlaSerGlnAspIleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrTyrThrAsnLysLeuAlaAspGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyArgAspSerSerPheThrIleSerSerLeuGluSerGluAspIleGlySerTyrTyrCysGlnGlnTyrTyrAsnTyrProTrpThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLys(序列辨识号:13)。
包含于hOKT3FabCSA中的结合区
人源化鼠源单株抗体(muromonab)-CD3(Orthoclone OKT3抗体)的重链变异区为:
AspGlnValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArgSerLeuArgLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrArgTyrThrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGlyTyrIleAsnProSerArgGlyTyrThrAsnTyrAsnGlnLysValLysAspArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrAlaPheLeuGlnMetAspSerLeuArgProGluAspThrGlyValTyrPheCysAlaArgTyrTyrAspAspHisTyrCysLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrProValThrValSerSer(序列辨识号:14)。
人源化鼠源单株抗体(muromonab)-CD3(Orthoclone OKT3抗体)的轻链变异区为:
AspAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnThrProGlyLysAlaProLysArgTrpIleTyrAspThrSerLysLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrThrPheThrIleSerSerLeuGlnProGluAspIleAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTrpSerSerAsnProPheThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGlnIleThr(序列辨识号:15)。
在Fab中,重链可包括人类IgG1的CH1区域与一枢纽区。此序列的一例子为:
AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro(序列辨识号:16)。
在Fab中,IgG1的kappa轻链稳定域可将C端加至轻链变异区。kappa轻链稳定域的一例子为:
ArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGlu
LysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGlu
Cys(序列辨识号:17)。
在一实施例中,多价抗体片段包括一scFv。一此种抗EGFR的scFv(763scFv)的序列显示如下:
AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysGlnAlaSer
GlnAspIleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSer
AsnLeuGluThrGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrIleSerSerLeu
GlnProGluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnHisPheAspHisLeuProLeuAlaPheGlyGlyGlyThrLysVal
GluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuGlnGluSerGly
ProGlyLeuValLysProSerGluThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyGlySerValSerSerGlyAspTyr
TyrTrpThrTrpIleArgGlnSerProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGlyHisIleTyrTyrSerGlyAsnThrAsn
TyrAsnProSerLeuLysSerArgLeuThrIleSerIleAspThrSerLysThrGlnPheSerLeuLysLeuSerSer
ValThrAlaAlaAspThrAlaIleTyrTyrCysValArgAspArgValThrGlyAlaPheAspIleTrpGlyGlnGly
ThrMetValThrValSerSer(序列辨识号:9)。
B.枢纽区
本发明的融合蛋白质可包括一“枢纽区”。在一实施例中,枢纽区为一约4-15个胺基酸长的序列。其可为一人类IgG的枢纽区或一甘胺酸联结子。在一实施例中,人类IgG的枢纽区为人类IgG1或人类IgG2的一枢纽区。
在一实施例中,“枢纽区”具有下列序列之一:
GluProLysSerGlyAspLysThrHisThrCysProProCysPro(序列辨识号:18)或
GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro(序列辨识号:19)下列之一:
在一实施例中,“枢纽区”包括一甘胺酸联结子。
一甘胺酸联结子(G-联结子)的例子可包括下列:
(GGGGS)3(序列辨识号:24)。最常见使用的scFv联结子包含一甘胺酸与丝胺酸(serine)残基的十五个胺基酸的组合。
GGSGGSGGGGSGGGGS(序列辨识号:25),为显示于U.S.Patent5,908,626中:具有以一胜肽联结子联结的干扰素-β与免疫球蛋白Fc的混合物(hybrid)。
RGRGRGRGRGRGGGS:(序列辨识号:26)取自scFv-RG3。
在本发明多价抗体片段中,联结子也可被使用于别处。
C.类胶原蛋白胜肽
类胶原蛋白胜肽的叙述可被发现于于此被明确合并其全文为参考文献的美国专利申请号13/588,752的类胶原蛋白区域的叙述中。本发明的类胶原蛋白胜肽可包括GPP或GPO基序(motif)及/或三聚体化基序或其他结构。例如,一此种类胶原蛋白胜肽可具有一如下之序列:
GlyProPro(序列辨识号:27)。
D.联结子
联结子为一短的胜肽序列,其可视需要而定被置于抗体片段与类胶原蛋白胜肽区之间,或结合区与类胶原蛋白胜肽区之间。scFv多胜肽也包括一多胜肽联结子介于VH与VL区之间,其使scFv能形成对于抗原结合所需的结构。在一些实施例中,在任一例子中,联结子为于长度介于4与10个胺基酸之间,且可具有序列:
Alaalaalaglyglyglyglyser(序列辨识号:28)或glyglyglyglyser(序列辨识号:29)。甘胺酸联结子(G-联结子):(GGGGS)3(序列辨识号:24)。最常见使用的scFv联结子包含一甘胺酸与丝胺酸(serine)残基的十五个胺基酸的组合。
GGSGGSGGGGSGGGGS(序列辨识号:25)发现于于以具有以一胜肽联结子联结的干扰素-β与免疫球蛋白Fc的混合物(hybrid)为题名的藉此明确以参考文献并入的U.S.Patent number5,908,626中。
甘胺酸-丙胺酸(alanine)联结子:GGAGAGAG(序列辨识号:30)。
甘胺酸-精胺酸(arginine)联结子:RGRGRGRGRGRGGGS(序列辨识号:26)。
具体实施例包括形式A-C,显示于图1中为三聚体。形式A:FabCSA,为三聚体抗体片段,其具有一Fab片段于具有自身三聚体化能力的类胶原蛋白胜肽的N端;形式B:FabCSA-scFv,为三聚体双特异的抗体片段,其具有一Fab片段与一单链抗体片段分别于具有自身三聚体化能力的类胶原蛋白胜肽的N端与C端;以及形式C:FabCSA-sdAb,为三聚体双特异性抗体片段,其具有一Fab片段与一单域抗体分别于具有自身三聚体化能力的类胶原蛋白胜肽的N端与C端。值得注意的是,形式A-C包括三个单体,个单体具有一种链与轻链于Fab区。
下方具体实施例被建构为仅是说明,且不限制所涉及的剩余部分以不管任何方式。无更进一步详细阐述,相信本技术领域中具通常知识者可根据于此的说明书利用本发明至其最大程度。于此所列的所有出版物特此经由以其全文引用而合并到本文中。
实施例
实施例1
h145FabCSA、hOKT3FabCSA与hOKT3FabCSA763scFv的建构
下列为h145FabCSA的重链的多胜肽序列(序列辨识号:1)与编码出其的cDNA序列(序列辨识号:2)。h145FabCSA的重链的编码区,从N-至C-端,包括一信息胜肽(底线)(序列辨识号:11)、仓鼠-抗小鼠CD3抗体(145-2C11)(boldface)的重链变异区(序列辨识号:12)、CH1区域与人类IgG1枢纽区(斜体)(序列辨识号:16),接着一(GPP)10类胶原蛋白区域(双底线)(序列辨识号:31)。藉由部份重叠PCR来制备此合成序列(序列辨识号:2)。
序列辨识号:1
MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValProGlySerThrGlyAspGluValGlnLeuGlnGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyLysSerLeuLysLeuSerCysGluAlaSerGlyPheThrPheSerGlyTyrGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyArgGlyLeuGluSerValAlaTyrIleThrSerSerSerIleAsnIleLysTyrAlaAspAlaValLysGlyArgPheThrValSerArgAspAsnAlaLysAsnLeuLeuPheLeuGlnMetAsnIleLeuLysSerGluAspThrAlaMetTyrTyrCysAlaArgPheAspTrpAspLysAsnTyrTrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer ArgSerIlePro GlyIleCysAspProSerLeuCysThrGly
序列辨识号:2
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGATGAAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGAAAGTCCCTGAAACTCTCCTGTGAGGCCTCTGGATTCACCTTCAGCGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGGGGGCTGGAGTCGGTCGCATACATTACTAGTAGTAGTATTAATATCAAATATGCTGACGCTGTGAAAGGCCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTTACTGTTTCTACAAATGAACATTCTCAAGTCTGAGGACACAGCCATGTACTACTGTGCAAGATTCGACTGGGACAAAAATTACTGGGGCCAAGGAACCATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCCCCAGGTCCTCCAGGACCCCCAGGGCCCCCAGGCCCCCCCGGGCCGCCTGGACCCCCAGGGCCACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTACCGGTTAA
下列为h145FabCSA的轻链的多胜肽序列(序列辨识号:3)与编码出其的cDNA序列(序列辨识号:4)。h145FabCSA的轻链的编码区,从N-至C-端,包括一信息胜肽(底线)(序列辨识号:11)、仓鼠-抗小鼠CD3抗体(145-2C11)(粗体)的轻链变异区(序列辨识号:13),接着一人类IgG1的kappa轻稳定域(斜体)(序列辨识号:17)。藉由部份重叠PCR来制备此合成序列(序列辨识号:4)。
序列辨识号:3
序列辨识号:4
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGATGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCACTGCCTGCCTCCCTGGGAGACAGAGTCACTATCAATTGTCAGGCCAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTATACAAATAAATTGGCAGATGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCTGGGAGAGATTCTTCTTTCACTATCAGCAGCCTGGAATCCGAAGATATTGGATCTTATTACTGTCAACAGTATTATAACTATCCGTGGACGTTCGGACCTGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
后来将h145FabCSA的重链与轻链插入子(insert)克隆(clone)进源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的双重表达载体以于哺乳动物细胞中抗体表达。下列为hOKT3FabCSA(序列辨识号:5)的重链的多胜肽序列与编码出其的cDNA序列(序列辨识号:6)。hOKT3FabCSA的重链的编码区,从N-至C-端,包括一信息胜肽(底线)(序列辨识号:11)、人源化鼠源单株抗体-CD3(Orthoclone OKT3)的重链变异区(粗体)(序列辨识号:14)、人类IgG1的CH1区域与枢纽区(斜体)(序列辨识号:16),接着一(GPP)10类胶原蛋白区域(双底线)(序列辨识号:31)。藉由部份重叠PCR来制备此合成序列(序列辨识号:6)。
序列辨识号:5
MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValProGlySerThrGly AlaProGluLeuLeuGly GlyProProGlyIleCysAspProSerLeuCysThrGly
序列辨识号:6
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGATCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCTGGCAGGAGCCTGAGGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGGTACACCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCTAGCAGGGGCTACACCAACTACAACCAGAAGGTGAAGGACAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAATACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGAGGCCTGAGGACACCGGCGTGTACTTCTGCGCCAGGTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCTGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGGCCACCTGGTCCCCCAGGTCCTCCAGGACCCCCAGGGCCCCCAGGCCCCCCCGGGCCGCCTGGACCCCCAGGGCCACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTACCGGTTAA
下列为hOKT3FabCSA(序列辨识号:5)的轻链的多胜肽序列(序列辨识号:7)与编码出其的cDNA序列(序列辨识号:8)。hOKT3FabCSA的轻链的编码区,从N-至C-端,包括一信息胜肽(底线)(序列辨识号:11)、人源化鼠源单株抗体-CD3(Orthoclone OKT3)的轻链变异区(粗体)(序列辨识号:15),接着人类IgG1的kappa轻链稳定域(斜体)(序列辨识号:17)。藉由部份重叠PCR来制备此合成序列(序列辨识号:8)。
序列辨识号:7
序列辨识号:8
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGATGACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGACCCCTGGCAAGGCCCCTAAGAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCTTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGA
CAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
后来将上述hOKT3FabCSA的重链与轻链插入子复制进源自pSecTag2/Hygro (Invitrogen)的一双重表达载体以于哺乳动物细胞中抗体表达。下列为763单链抗体的多胜肽序列(序列辨识号:9)与编码出其的cDNA序列(序列辨识号:10)。使用源自对应于抗-EGFR单株抗体,帕尼单抗(panitumumab)(Amgen,Inc.)的引子组(primer set),根据所公开的核苷酸序列(US patent number6,235,883),将编码出763scFv的VL与VH的cDNAs进行PCR扩增。藉由以一底线显示于序列辨识号:9中的甘胺酸-联结子(GGGGS)3(序列辨识号:24)连结VL与VH链来产生763的scFv PCR融合体。
如下产生一抗-CD3×EGFR双特异性抗体,hOKT3FabCSA763scFv。将用于编码763scFv的cDNA序列框架内(in-frame)复制至hOKT3FabCSA的重链的C-端于AgeI与BamHI位以制造包括hOKT3Fab的重链、人类IgG1的枢纽区、一(GPP)10类胶原蛋白区域(序列辨识号:31)接着763scFv的重链构筑体。之后将上述重构筑体与hOKT3FabCSA的轻链构筑体(序列辨识号:8)复制进一源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的双重表达载体以动物细胞中抗体表达。
序列辨识号:9
AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysGlnAlaSer
GlnAspIleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSer
AsnLeuGluThrGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrIleSerSerLeu
GlnProGluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnHisPheAspHisLeuProLeuAlaPheGlyGlyGlyThrLysVal
GluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuGlnGluSerGly
ProGlyLeuValLysProSerGluThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyGlySerValSerSerGlyAspTyr
TyrTrpThrTrpIleArgGlnSerProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGlyHisIleTyrTyrSerGlyAsnThrAsn
TyrAsnProSerLeuLysSerArgLeuThrIleSerIleAspThrSerLysThrGlnPheSerLeuLysLeuSerSer
ValThrAlaAlaAspThrAlaIleTyrTyrCysValArgAspArgValThrGlyAlaPheAspIleTrpGlyGlnGly
ThrMetValThrValSerSer
序列辨识号:10
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACC
TGGAGACCGGCGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCACTTCGACCACCTGCCTCTGGCCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAA
GGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCGTGAGCAGCGGCGACTACTACTGGACCTGGATCAGGCAGAGCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACATCTACTACAGCGGCAACACCAACTACAACCCTAGCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCAGCATCGACACCAGCAAGACCCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCATCTACTACTGCGTGAGGGACAGGGTGACCGGCGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGC
对于低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA的构筑而言,具有相似于teplizumab(也称为MGA031与hOKT3-γ1(Ala-Ala))的一结构特征,将hOKT3的状链与轻链的变异区复制进一源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的人类IgG1表达载体,于其中在重链固定区的胺基酸234与235的野生型白胺酸(leucine)残基被以两个丙胺酸残基取代。对于低-Fcγ受器结合抗-小鼠CD3抗体–145IgG-AA的构筑而言,将仓鼠抗-小鼠CD3抗体(145-2C11)的重链与轻链的变异区复制进入一小鼠IgG2a表达载体(Invitrogen),于其中在重链固定区的胺基酸234与235的野生型白胺酸残基被以两个丙胺酸残基取代。为了抗人类EGFR抗体-763IgG的建构,其具有相似于帕尼单抗(panitumumab)的结构特征,帕尼单抗的重链与轻链可变区被选殖进入源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的一人类IgG2a表达载体
实施例2
h145FabCSA、145IgG-AA、hOKT3FabCSA,hOKT3IgG-AA、763IgG与hOKT3FabCSA763scFv的表达与纯化
使用Effectene(Qiagen),根据制造商的指南,将h145FabCSA、145IgG-AA与hOKT3IgG-AA的表达构筑体用来转染小鼠融合瘤NS0细胞(EuropeanCollection of Animal Cell Cultures,Wiltshire,UK)。在用潮霉素B(hygromycinB)(400μg/ml)筛选后,将稳定的复制体以5×105细胞/ml的起始接种密度培养于一摇晃的长颈瓶中的化学定义培养基(chemically-defined medium)HyQCDM4NS0(Hyclone)中。将培养物(culture)维持于130rpm达五天于37℃。藉由电穿孔(electroporation)使用Amax Nucleofector device(Amaxa,Inc.,Gaithersburg,Md.),根据制造商指南,分别使用hOKT3FabCSA、hOKT3FabCSA763scFv与763IgG的表现构筑体来转染CHO-S细胞(LifeTechnologies Corporation)。在以潮霉素B(400μg/ml)筛选后,将稳定的复制体以3×105细胞/ml的起始接种密度培养于一摇晃的长颈瓶中的化学定义培养基(chemically-defined medium)CD OptiCHOTM(Life Technology)中。将培养物维持于130rpm达12天于37℃。藉由添加一30mg/ml的葡萄糖溶液,将葡萄糖控制于2mg/L。
对于h145FabCSA、hOKT3FabCSA与hOKT3FabCSA763scFv的纯化而言,将约1L各个经过滤培养基以60ml/小时的一流速提供至以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS),pH7.4(0.01M磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer)、0.0027M KCl、0.14M NaCl)平衡的一KappaSelect柱子(5-ml于柱床体积(bed volume)中,GE Healthcare)。在用相同缓冲溶液清洗之后,将重组抗体用50mM的磷酸钠(sodium phosphate)缓冲溶液,pH2.5洗脱。于280nm监测UV吸收并收集峰值(peak fraction),用1.0M的碳酸氢钠(sodium bicarbonate)将其中和至pH7.5。之后藉由使用具有Ultracel-30膜(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)的Amicon Ultra-15CentrifugalFilter Unit超过滤(ultrafiltration)来将经中和的样本浓缩。将五毫升的浓缩物提供至用磷酸缓冲溶液(PBS),pH7.4平衡的一HiLoad16/600Superdex200柱子(GE Healthcare),以1.5ml/分钟的一线性流速(linear flow rate)。
对于145IgG-AA、hOKT3IgG-AA与763IgG的纯化,将约1L各个经过滤培养基提供至以磷酸盐缓冲溶液(PBS),pH7.4(0.01M磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer)、0.0027M KCl、0.14M NaCl)平衡的一HiTrap Protein A HP柱子(5-ml于柱床体积(bed volume)中,GE Healthcare)。在以相同缓冲溶液清洗之后,将重组抗体用50mM之磷酸钠缓冲溶液,pH2.5来洗脱。于280nm监测UV吸收并收集峰值,用1.0M的碳酸氢钠将其中和至pH7.5。将经中和的样本对着磷酸缓冲溶液(PBS),pH7.4进行透析。
使用4~12%NuPAGE bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)的任一以MES为电泳缓冲溶液(running buffer)(Invitrogen,San Diego,CA)来执行SDS-PAGE。用InstantBlue(Expedeon,Cambridgeshire,UK)来将蛋白质进行染色。使用Bench Mark(Invitrogen,San Diego,CA)为分子大小标准品(molecular size standards)。
结果:h145FabCSA的层析(chromatography)与结构特性
图2显示,根据实施例,藉由使用KappaSelect与Superdex200管柱的顺序层析(sequential chromatographies),自培养基纯化的h145FabCSA分子的结构特性。(A)藉由凝胶过滤(gel filtration)的h145FabCSA种类(species)的分离。将洗脱自一KappaSelect柱子的样本浓缩且载至以PBS(pH7.4)平衡的一Superdex200凝胶过滤柱;(B)藉由SDS-PAGE,将不同峰值(peak fraction)(于A中编号为波峰1至3)与所加载的样本在非还原状态(泳道(lane)2、4、6与8)与其中将样本于75℃以50mM之DTT处理10分钟的还原状态(泳道3、5、7与9)下进行分析。(C)对应于以显示于B中的SDS-PAGE所解析的种类的结构的概要图式。
结果显示本发明的类胶原蛋白胜肽具有将一抗-小鼠CD3Fd片段三聚体化之能力,且一完整的Fab片段可被装配于一真核细胞中且被分泌为一稳定的三聚体。
结果:hOKT3FabCSA的层析与结构特性
图3显示,根据实施例藉由Superdex200层析分离的hOKT3FabCSA分子的结构特性。将洗脱自KappaSelect柱子的样本浓缩且载至以PBS(pH7.4)平衡的一Superdex200凝胶过滤柱。右上区块(panel):藉由SDS-PAGE在非还原状态下分析不同峰值(编号波峰1至3)。波峰2为主要片段,其包含hOKT3FabCSA三聚体,而波峰3片段包含单体。显示于波峰1中的主要下方条带似乎为三聚体的一链间(interchain)双硫键。
再次,结果显示本发明的类胶原蛋白胜肽具有将一抗-小鼠CD3Fd片段三聚体化的能力,且一完整的Fab片段可被装配于一真核细胞中且被分泌为一稳定的三聚体。
结果:藉由SDS-PAGE之hOKT3FabCSA三聚体、hOKT3IgG-AA与OKT3的纯度分析。
第4图显示源自于第3图中之波峰2片段的hOKT3FabCSA、低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA与OKT3抗体的纯度分析,藉由SDS-PAGE于非还原(泳道(lane)2、3与4)与其中将样本于75℃以50mM之DTT处理10分钟之还原状态(泳道5、6与7)下的分离。将具有等量蛋白质的所有样本以4~12%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,伴随MES为电泳缓冲溶液。将胶体用InstantBlue蛋白质染色溶液进行染色。M,BenchMarkTM分子量标准品。
在非还原状态下,hOKT3FabCSA的主要条带呈现为双硫连结Fab三聚体(泳道2),而在变性状态下将非双硫连结的Fd-CS与轻链进行解析(泳道5)。hOKT3IgG-AA与OKT3抗体为在一般IgG1形式,其包含两个重链与两个轻链(泳道3与4,在非还原状态下,及泳道6与7,在非还原状态下)。
实施例3
CD3结合活性的测定
藉由用于负向选择(negative selection)的一泛T细胞分离套组(pan T cellisolation kit)(Miltenyi Biotec,CA),根据制造商指南,将人类T细胞(1×106/ml)自PBMC分离。将细胞以Fc blocker(2μg/ml,eBioscience,CA)于4℃处理30分钟且之后以一连续稀释的经纯化的低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA、hOKT3FabCSA三聚体与单体培养于4℃培养30分钟。在清洗后,将细胞以山羊抗-人类IgG(H+L)-Alexa Fluor647(Invitrogen)于4℃染色30分钟,且藉由流式细胞分析(flow cytometry)来侦测抗体对T细胞的结合并将其呈现为平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。如于图5中所示,相较于二价对应物(counterpart),hOKT3IgG-AA(具有经计算之KD=0.15nM),三聚体的hOKT3FabCSA(具有经计算的KD=0.02nM)显示7.5倍的对于人类T淋巴球较大的结合强度。单价形式的hOKT3FabCSA对于CD3+人类T细胞显示一弱的、非显著的结合亲和力。
也执行此实验以测定相较于仓鼠145-2C11IgG,经纯化的h145FabCSA(三聚体)对小鼠脾脏T淋巴球的结合亲和力(第6图)。再次,相较于二价对应物(counterpart)亲代的仓鼠IgG,145-2C11(具有一经计算之KD=15nM),三聚体的hOKT3FabCSA(具有一经计算的KD=4nM)显示一3.75倍的对于小鼠T淋巴球较大的结合亲和力。
实施例4
竞争置换结合分析(competitive displacement binding assay)
由于OKT3与hOKT3FabCSA辨认于CD3ε链上的相同抗原决定位,所以hOKT3FabCSA可竞争地抑制OKT3对T细胞的结合。藉由流式细胞分析,使用以一饱和浓度的荧光-结合OKT3为一竞争物的抗体置换分析,可比较hOKT3FabCSA与OKT3对于与人类T-细胞的细胞表面上的CD3分子结合的亲和力。于4℃执行所有下列步骤。将CD3(+)Jurkat T细胞,Clone E6-1(ATCC number TIB-152)以1x106细胞的总数悬浮于0.1ml的染色缓冲溶液(2%胎牛血清与与0.1%叠氮化钠(sodium azide)的磷酸缓冲溶液)。将细胞以一连续稀释的hOKT3FabCSA或OKT3IgG培养1小时。直接添加一固定、饱和量(0.25μg/ml,藉由流式细胞分析测定)的FITC-结合OKT3(eBioscience,San Diego,CA)。在培养1小时后,将细胞用染色缓冲溶液清洗,并藉由使用FACSCalibur(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)系统的流式细胞分析来将其对于免疫荧光进行分析。数据被表现为最大荧光强度的百分比抑制,其被定义为,在阻碍mAb不存在的情况下,藉由将T细胞以OKT3-FITC染色所获得的平均荧光强度。计算各mAb所需抑制一半最大荧光强度的浓度(IC50)。
IC50值的比较指出使用Jurkat T细胞,OKT3需要比hOKT3FabCSA的IC50值约2-倍高的浓度来达成相同的抑制功效(图7,两个独立的实验显示)。结果指出,由于亲合作用,人源化三价hOKT3FabCSA具有高于其亲代鼠源IgG形式,OKT3的结合强度。
实施例5
T细胞增生
藉由细胞增生分析来执行比较OKT3、hOKT3IgG-AA与hOKT3FabCSA在T细胞活化方面的研究。将从三位健康正常提供者收集的人类外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)以2x105细胞/孔于100μl具有10%FBS的RPMI-1640培养基中置于一黑色96-孔平底组织培养盘中于37℃,在10-倍连续稀释的OKT3(eBioscience,Inc.)、hOKT3IgG-AA与hOKT3FabCSA存在下达66小时。将细胞以10μM的BrdU脉冲额外6小时。在移除培养基之后,以FixDenat(Roche Applied Science,Indianapolis IN)将细胞固定且将DNA变性于一步骤中。之后将细胞以一过氧化物标记的抗-BrdU抗体(抗-BrdU POD,Fab片段)于室温培养1.5小时。使用一微孔盘发光仪(microplate-luminometer)(Hidex,CHAMELEON detection platform,Finland)来执行化学发光(chemiluminescence)侦测与定量。显示于途8中的各点代表三个提供者的平均值±标准偏差。
于图8中的结果显示,即便是在非常低的浓度,显著地OKT3诱导T细胞增生。低Fcγ受器结合的hOKT3IgG-AA在较高的抗体浓度也诱导T细胞增生,即使诱导为较少的效力。这些结果与由Li、Li等人较早发表的成果(Li,J.,J.Davis,et al.(2006)."Modulation of antigen-specific T cell response by anon-mitogenic anti-CD3antibody."Int Immunopharmacol6(6):880-891.)一致。相对地,没有可侦测的T细胞增生被hOKT3FabCSA所诱导。因此,非Fc版本的hOKT3FabCSA三聚体为在不同的抗CD3抗体形式中的T细胞增殖的最少的诱导者。
实施例6
细胞激素测量
将来自三位健康正常的提供者的人类PBMCs于37℃以2×105细胞/孔置于具有10%FBS的0.1ml RPMI-1640培养基中,在10-倍连续稀释的OKT3、hOKT3IgG-AA与hOKT3FabCSA存在的情况下。使用一人类细胞激素免疫分析套组(human cytokine immunoassay kit)(eBioscience,Inc.),于24-与72-小时的时间点分别测定培养上清液中的IL-2与其余的细胞激素(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10与IFN-γ)的水平。
鼠源OKT3的有丝分裂活性(mitogenic activity)为由经由对于Fcγ受器-阳性细胞结合的大量T细胞受体(TCR)-CD3交联所引起。因此,藉由改变对Fcγ受器的结合,最近已对发展非有丝分裂形式的抗-CD3做出努力。测量OKT3、hOKT3IgG-AA与三聚体hOKT3FabCSA诱导细胞激素(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10与IFN-γ)的能力。如所预期,OKT3IgG于一非常低的剂量引人注目地诱导细胞激素产生。低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA,具有与teplizumab(也称为MGA031与hOKT3-γ1(Ala-Ala))相似特征,也在一较高抗体浓度诱导细胞激素产生,即使较低的效力。这些结果与由Li较早发表的成果(Li,Davis et al.2006)一致。相对地,三聚体hOKT3FabCSA于一上至100μg/ml的浓度并没有诱导可侦测的IL-2与IFN-γ。相较于hOKT3IgG-AA,在一高于10μg/ml的浓度,hOKT3FabCSA具有一IL-1β、IL-6与IL-10的较低诱导水平。结果显示,hOKT3FabCSA在不同的抗-CD3抗体形式中为最不有丝分裂的版本(图9)。
实施例7
混合的淋巴细胞(Mixed lymphocyte reaction,MLR)
如下评估于单向(one-way)混合的淋巴细胞反应中的免疫抑制。自两个健康提供者获得的人类PBMCs(刺激者(stimulator)与应答者(responder))。将刺激者与应答者细胞以在一完全培养基(补充10%人类AB血清、2mM麸酰胺酸glutamine、50nM2-硫氢乙醇(2-mercaptoethanol)与盘尼西林与链霉素penicillin and streptomycin各100单位/ml的RPMI1640)中的25μg/ml的丝裂霉素C(mitomycin C)(Sigma-Aldrich)于含5%CO2的潮湿空气在37℃处理30分钟,接着于RPMI1640培养基中清洗三次。将反应者细胞单独或以1:1比例混合以丝裂霉素C处理刺激者或应答者细胞以2×105细胞/孔于200μl的完全培养基中培养。在反应者细胞贴附(planting)后,立即将经纯化的hOKT3FabCSA三聚体、hOKT3IgG-AA或OKT3以不同的浓度添加至培养物。5天后,将经培养的细胞以10μM的BrdU脉冲并于24小时后收获。执行5-溴-2'-脱氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)细胞增生分析。在移除培养基之后,以FixDenat于一步骤中将细胞固定与DNA变性。之后,将细胞以过氧化物标记的抗-BrdU抗体(抗-BrdU POD,Fab片段)于室温培养1.5小时。使用一微孔盘发光仪(Hidex,CHAMELEON detection platform,Finland)来执行化学发光侦测与定量。
为了测定,依据增加的对于CD3(+)T-细胞的结合亲和力,三聚体的hOKT3FabCSA是否可展现优于亲代(parental)OKT3抗体与低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA的免疫抑制活性,针对T-细胞有丝活化,将抗体测试于一单向混合的淋巴细胞反应中(mixed lymphocyte reaction,MLR)。在无抗体处理培养5天的混合的PBMC培养物(丝裂霉素C处理的刺激者+应答者)中,一混合的淋巴细胞反应(MLR)发展,由于异体刺激(allogeneic stimulation)的T细胞活化(图10,实心方形)。以OKT3处理混合的PBMC培养物导致于低浓度程度,从0.1至1.0ng/ml的范围,刺激T细胞增生(图10,实心圆形)。当抗体浓度高于10ng/ml时,OKT3的免疫抑制是显著的。低-Fcγ受器结合的抗人类CD3抗体-hOKT3IgG-AA不显示显著的T细胞活化的抑制(图10,空心方形)。相对的,于MLR中,hOKT3FabCSA三聚体的效力是显著的,在0.1ng/ml的浓度达到背景程度(backgroundlevel)(图10,空心三角形)。这些结果指出,当in vitro显示减少的有丝分裂(mitogenicity)时,三聚体的hOKT3FabCSA为T细胞增生的强有力的免疫抑制剂(immunosuppressant)。
实施例8
T细胞受体(TCR)调节
将来自一健康提供者的PBMC以2x106细胞/孔贴附(plated)于一24-孔盘(Nunc)中且培养于RPMI1640加上10%FCS中伴随不同量的hOKT3FabCSA(三聚体)、hOKT3IgG-AA(二聚体)与hOKT3FabCSA(单体)。在24小时的培养后,收取细胞并将其以FITC-结合OKT3或抗-TCRα/βmAbIP26(eBioscience)染色。将经染色的细胞以对于T细胞藻红蛋白(phycoerythrin)-结合抗-CD5mAb UCHT2(eBioscience)复染(counterstain)并以流式细胞分析来分析。如先前所述(Cole,M.S.,C.Anasetti,et al.(1997)."Human IgG2variants of chimeric anti-CD3are non-mitogenic to T cells."JImmunol159(7):3613-3621.)来执行CD3调节与覆盖的计算:
其中F代表经染色细胞的平均荧光。
在图11中,在从0.1ng/ml至10μg/ml的范围的抗体浓度,藉由三价hOKT3FabCSA达成的TCR-CD3复合物的结合的调节与覆盖大于低-Fcγ受器结合抗-人类CD3抗体–hOKT3IgG-AA。由于对于TCR的低-交联的活性,单价hOKT3FabCSA在各对应浓度显示低很多的TCR覆盖与调节。此结果显示在三聚体hOKT3FabCSA的结合强度中的改善导致一经增强的TCR调节程度。
实施例9
药物代谢动力学分析(pharmacokinetic assays)
为了评估h145FabCSA血液清除(blood clearance),将15只雄性BALB/c小鼠(随机分成五组)静脉投与经纯化的h145FabCSA三聚体,以25μg/小鼠的一单一剂量程度,随着0.1ml/小鼠的一剂量体积。在下列时间点:0、2、5、15、30分钟,与1、2、4、6、8、24、48、72与96小时,连续地从小鼠收集血液(100μl/小鼠),且将其转移至一EDTA-覆盖试管。使用ELISA,藉由于连续稀释的h145FabCSA标准品的一标准曲线中的插值(interpolation),将在来自各时间点的血浆样本(plasma sample)中剩余的h145FabCSA进行定量。分别将抗-人类Fd与山葵过氧化酶(peroxidase)-结合抗-人类kappa轻链使用为捕捉与侦测抗体。将3,3’,5,5’,-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine)使用为过氧化酶受质。于小鼠中的h145FabCSA的药物代谢动力学图谱(profile)显示于图12中。
测定非分室体模式(non-compartment model)的动力学。免疫反应性(immunoreactivity)的血浆水平双向性地(biphasically)下降,随着8.85小时的末端排除相半衰期(terminal elimination phase half-life)(t1/2)。
实施例10
生物分布(biodistribution)
将经纯化的h145FabCSA三聚体以碘-131放射性标记且于评估于30只雄性BALB/c小鼠中的131I-h145FabCSA三聚体的生物分布。将五组小鼠静脉投予h145FabCSA(特异活性:1.2μCi/μg;30μCi/小鼠)。h145FabCSA的分析的时间点为0.5、1、2、6、24与48小时。在所选择的时间点,安乐死(euthanized)并测定每克组织的注射剂量的百分比(%ID/g)。在48小时,131I-h145FabCSA展现一快速的具有大部分清洁的血液清除(表1)。然而,131I-h145FabCSA于脾脏中显示局部化(localization),对应在0.5小时为33.76±1.56%ID/g,且于24小时达到最大值42.09±1.64%ID/g。
表1:131I-h145FabCSA三聚体于BALB/c小鼠中之生物分布
注:器官摄入被表现为每克百分比注射剂量(percent injected dose pergram)(%IDg)。标准偏差以插入被呈现。
实施例11
实验性自体免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis)小鼠疾病模型
实验性自体免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)为一广泛使用的多发性硬化症(multiple sclerosis)的小鼠模型。在此研究中,使用髓鞘磷脂寡树突醣蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)-诱导鼠源EAE来研究h145FabCSA对瘫痪(paralysis)的调节的治疗功效。将雌性6-至8-周大的C57BL/6小鼠(国家实验动物中心,台湾)以在使用含500μg结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA的弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant)的200μL乳剂(emulsion)中的200μg MOG(35-55)进行皮下免疫。在免疫后当下,小鼠腹腔接受500ng百日咳毒素(pertussis toxin)且于48小时后再次接受。使用下列尺度来评估临床EAE分数:0=无症状、0.5=末稍部衰弱或尾部抽筋、1=完全跛行的尾部、1.5=跛行的尾部与后部(hindlimb)衰弱(足部失足穿过笼架)、2.0=单边局部之后部瘫痪、2.5=双边局部之后部瘫痪、3.0=完全双边之后部瘫痪、3.5=完全后部与单边部分前肢瘫痪、4.0=垂死的以及5=死亡。四组(载体(vehicle):仓鼠IgG同型(isotype)控制组;处理:145-2C11IgG与h145FabCSA(三聚体);以及正控制组:干扰素-β1a)的每个分配到十只小鼠总计40只小鼠。处理被起始于EAE的第一个临床症状的开始以测试不同的对象对于瘫痪的调节的影响。对于载体、145-2C11IgG与h145FabCSA组而言,将小鼠分别以1.0、0.1与1.0μg/小鼠的一剂量程度进行每天一次静脉内注射,达五个连续不断的天数。对于干扰素-β1a组而言,将小鼠以10,000单位/小鼠的一剂量程度,在整个处理期间进行每天一次腹腔内注射。
最初,以超过0.2μg/小鼠的剂量程度的145-2C-11IgG处理的EAE小鼠,在处理一天后导致50%致命。粗略的尸体检验观察显示所有死亡的小鼠具有扩大的脾脏,暗示一主要全身性不受控制的发炎反应(systemic uncontrolledinflammatory response)或细胞激素风暴(cytokine storm)。因此将145-2C-11组的实验剂量程度降低至每只小鼠0.1μg。对于三聚体的h145FabCSA组而言,在处理方面,实施一剂量程度1.0μg/小鼠。结果显示,在免疫的所有阶段,三聚体h145FabCSA产生一较低程度的瘫痪(参见第13A图)。特别是,以h145FabCSA处理的小鼠,相较于以145-2C11IgG处理的小鼠或控制处理组显示较少的瘫痪,伴随介于h145FabCSA处理组与145-2C11IgG处理组之间的统计上较低的瘫痪。最后,由h145FabCSA处理组所显示的最大程度的瘫痪,不如单边后部瘫痪(即,临床尺度2)来得严重,而未处理组显示的症状则如同完全双边后部瘫痪严重。
调控的T(Treg)细胞的诱导为对于自体免疫疾病的免疫治疗的主要目标之一。关于口服投予CD3-特异抗体的先前研究显示CD4+CD25-LAP+Treg细胞被诱导(Ochi et.al(2006)“Oral CD3-specific antibody suppressesautoimmune encephalomyelitis by inducing CD4+CD25–LAP+T cells.”NatMed12(6):627-635)。在h145-2C-11IgG与三聚体h145FabCSA处理之后,执行在EAE小鼠中的Treg族群的比较。在最后一次静脉内注射之后,分别制备来自载体(仓鼠控制组IgG)、145-2C11IgG与三聚体h145FabCSA组的三只小鼠各个的脾脏淋巴细胞,且之后为了流式细胞分析将其以LAP-APC与CD4-FITC进行染色。Treg族群的测定为对于LAP+细胞进行限制。
结果指出,在h145FabCSA处理之后,相较于同型IgG control and the145-2C-11组,CD4+LAP+T细胞族群增加(参见的13B图)。值得注意的是,可代表CD8+LAP+T细胞的CD4-LAP+T细胞族群,也于h145FabCSA处理组中被增加。
实施例12
于小鼠模型中的全身性红斑性狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)
研究抗-CD3抗体的145-2C11IgG与h145FabCSA三聚体对于具有自发性发展为狼疮的NZB/W F1小鼠的治疗功效。在12-周的周期期间,藉由静脉内注射,以5μg的同型IgG控制组、145-2C11IgG或h145FabCSA(三聚体)的六个5-天的过程,每隔周来对已发展自发性狼疮的约6个月大雌性的NZB/W F1小鼠进行处理。如于图14A中所示,以h145FabCSA处理的小鼠存活地比以同型IgG控制组处理的小鼠来得长,其指出三聚体h145FabCSA相较于145-2C11与同型IgG控制组在治疗SLE小鼠模型方面更有效。
实施例13
对于双股DNA(double-stranded DNA,dsDNA)的小鼠血清抗体的测量
当狼疮为活跃时,存在高量的血清抗-dsDNA抗体。因此,使用抗-dsDNA自身抗体测试来测量于SLE小鼠模型中的疾病进程(disease progression)。对于抗-dsDNA自身抗体的侦测,测定来自上述处理组的小鼠血清的ELISA如下:将96孔聚苯乙烯(polystyrene)ELISA盘以50μl的来自牛血清的甲基化牛白蛋白(Sigma)(50μg/ml于蒸馏水中)涂覆并于37℃培养1小时。然后在添加50μl的于磷酸缓冲溶液(phosphate buffered saline)中的dsDNA(10μg/ml)之前,以磷酸缓冲溶液清洗各个孔洞三次。藉由于37℃以1U/mg S1核酸(Sigma)处理小牛胸腺DNA(calf thymus DNA)(Sigma)30分钟来制备dsDNA。在于4℃隔夜培养之后,将盘以PBS清洗四次。之后以100μl的于PBS中的2%BSA(Sigma)来处理这些以避免非特异结合,于37℃培养1小时,且然后以含0.05%的Tween-20(PBS-T)(Sigma)的PBS清洗五次。将血清样本于PBS-T中稀释800-倍且以二重复将50μl等分(aliquots)加至孔洞。在于37℃培养1小时之后,将盘以PBS-T清洗六次。为了侦测总IgG抗体,加入以5000-倍稀释的50μl/孔的HRP-结合大鼠抗-小鼠抗体(BD Bioscieces)并于37℃培养一小时。在以PBS-T清洗七次之后,使用100μl/孔的以1mg/ml在柠檬酸磷酸盐缓冲液(citrate phosphate buffer)中的四甲基苯(tetramethylbenzene)(Sigma-Aldrich)来发展反应,并将其藉由添加50μl/孔的1N HCl来终止。以一ELISA测读仪于450nm来取得吸收值。
如于图14B中所示,于h145FabCSA处理小鼠中的抗-dsDNA自身抗体的程度显著地低于控制同型IgG组的抗-dsDNA自身抗体的程度,且似乎也低于以145-2C11IgG处理的动物的大部分。此结果指出,三聚体h145FabCSA在治疗SLE小鼠模型方面是有效的,且在处理时间进程期间没有疾病的发展。
实施例14
In vivo前发炎细胞激素(pro-inflammatory cytokine)分析
抗小鼠CD3抗体,145-2C11的投予,先前已被与T细胞增殖与包括IL-2、IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10与IL17A的一特异细胞激素诱导联想在一起。执行对于在一单一剂量的50μg的不同的抗CD3抗体的静脉内注射后的小鼠中的血清前发炎细胞激素程度的时间进程研究,以评估是否非Fc版本的h145FabCSA(三聚体)对于以非有丝分裂(non-mitogenicity)的治疗价值是否有益。将小鼠分群且静脉内投予50μg的经纯化的145-2C11IgG(浅灰方形)、低-Fcγ受器结合抗小鼠CD3抗体–145IgG-AA(深灰方形)或h145FabCSA三聚体(空心方形)。0(前采血)、0.5-、24-与144-小时时间点收集血液(100μl/小鼠)。各点代表三个孔洞的平均值±标准偏差。使用PBS(黑色方形)为控制组。
结果如图15所示。如所预期,于145-2C11组中显著地产生最多细胞激素。低-Fcγ受器结合版本的145IgG-AA导致中度短暂的IL-2、TNFα、IL-6与IL-10的诱导。非Fc版本的h145FabCSA(三聚体)的投予显示微不足道的细胞激素诱导程度。这些结果显示,在第一注射之后三聚体的h145FabCSA于in vivo不诱导细胞激素产生。
实施例15
三价双特异的抗CD3×EGFR抗体,hOKT3FabCSA763scFv的层析与结构特性
本发明多价抗体片段对于藉由具有一胶原蛋白支架于任一端的两个不同的抗体片段的融合来制作双专一抗体特别可行。发展以CD3与GFR两者为目标之一三价双特异抗-CD3×EGFR抗体,hOKT3FabCSA763scFv,以显示此种方式的使用。图16显示,源自非单一(A)或单一稳定复制(clone)(B)的hOKT3FabCSA763scFv分子的结构特性。藉由使用KappaSelect与Superdex200柱子的顺序层析来纯化各培养基。(A)藉由凝胶过滤的源自一非单一复制的hOKT3FabCSA763scFv种类的分离。右上区块:藉由SDS-PAGE,在非还原状态下分析不同峰值(编号波峰1至3)。双硫连结二聚体(T)、非-双硫-键结二聚体(Mt)与单体(Mm)的结构被显示;(B)藉由凝胶过滤的源自一稳定复制的hOKT3FabCSA763scFv种类的分离。藉由SDS-PAGE,在非还原状态下分析峰值。双硫连结二聚体(T)与非-双硫-键结二聚体(Mt)的结构被显示。
结果显示于真核细胞系统中,本发明的类胶原蛋白胜肽具有同时将一N端Fd片段与一C端scFv片段三聚体化的能力。此外,轻链可与经三聚体化的多胜肽链的Fd部份组装已形成具有如于图1B中所示的一结构形式的完整的Fab三聚体。
实施例16
三聚体双特异抗体-hOKT3FabCSA763scFv对于EGFR(+)与CD3(+)细胞的结合特异性
藉由流式细胞分析来确认hOKT3FabCSA763scFv对各抗原的结合。对应A431、WiDr与HCT116细胞(EGFR阳性)与Jurkat T细胞(CD3阳性;图17)观察到强的反应性。
实施例17
细胞毒性分析
使用一荧光-基础Eu TDA非放射性细胞毒性分析(Perkin Elmer,Boston,MA)来比较三聚体hOKT3FabCSA763scFv对于使用经刺激的人类PBMCs为效应者的不同的EGFR-携带肿瘤细胞株的细胞活性。藉由于一OKT3-涂覆(2μg/ml)盘中,在含50单位/ml(或0.2ng/ml)的IL-2之RPMI+10%FBS中生长细胞,来刺激自一健康提供者的人类PBMCs72小时。根据制造商指南,以DELFIA BATDA Reagent来标记约1×106的目标细胞。将细胞以PBS清洗三次,且之后以5×104细胞/ml的浓度重新悬浮Eu3+-标记目标细胞于完全培养基(complete culture medium,CM)中。等分100μl(5×104细胞)的目标细胞置于96-孔V-底无菌微效价盘之孔洞中。添加一等体积的效应PBMCs至各孔洞以分别提供对于A431细胞的从50:1至2.5:1与对于WiDr与HCT116细胞一固定的10:1的效应/目标比(effector/target(E/T)ratio)。于5%CO2的潮湿状态中于37℃培养微量盘2小时。执行所有分析于三重复中。在培养后,将培养盘再次离心,且收取上清液以测量释放的Eu3+。为了侦测释放的Eu3+,将20-μl等分的上清液转移至一平底96-孔微培养,且将一200-μl等分的增强溶液(enhancement solution)添加至各孔洞。
在室温于旋转震荡器(rotatory shaker)上混合15分钟之后,于一时差性荧光仪(time-resolved fluorometer)(Hidex,CHAMELEON detection platform,Finland)中测量荧光。特定细胞毒性的百分比被计算为(实验性释放-自发性释放)/(最大释放-自发性释放)×100。藉由以100μl的CM取代效应细胞(effector cells)来培养目标细胞以测定自发性释放,而藉由以100μl的裂解缓冲溶液(lysis buffer)(0.5%Triton-X100)来培养目标细胞以测定最大释放。
藉由人类PBMCs来评估T三聚体双特异hOKT3FabCSA763scFv引导包括A43、WiDr与HCT116细胞株的不同EGFR-表现肿瘤细胞的裂解的能力。图18显示,对于A431细胞以不同的E/T比(A);与对于WiDr或HCT116细胞以一固定10:1的E/T比(B)的不同浓度的三聚体hOKT3FabCSA763scFv的特异细胞毒杀性。藉由于一剂量中的三聚体双特异hOKT3FabCSA763scFv与E/T比-依赖方式,在经刺激的人类PMBCs存在下,特别引起EGFR-过度表现的A431肿瘤细胞的裂解(图18A)。此导致伴随一20:1的E/T比,在0.05μg/ml的hOKT3FabCSA763scFv浓度程度下,一最大的~80%的特定杀死(实心方形)。在hOKT3FabCSA763scFv不存在的情况下,经刺激的人类PMBCs无法单独有效杀死A431细胞。藉由将WiDr或HCT116细胞株的任一以三聚体hOKT3FabCSA763scFv于一固定的10:1的E/T比来进行培养而获得相似的结果(图18B)。这些结果显示,三聚体hOKT3FabCSA763scFv可有效引导藉由人类PBMCs(想必细胞毒性T细胞(presumably cytotoxic T cells))的EGFR-携带之肿瘤的裂解。
实施例18
延时显微镜(Time lapse microscopy)
在图19中之的延时显微镜摄影更证实,藉由三聚体hOKT3FabCSA763scFv的用于肿瘤细胞裂解的人类细胞毒性T淋巴球的改向。三价hOKT3FabCSA763scFv可瞬间连结一T细胞与一肿瘤细胞藉由同时分别结合CD3与一目标抗原–EGFR。此引发T-细胞活化,接着攻击交联的肿瘤细胞。附着的肿瘤细胞遭受程序细胞死亡(programmed cell death)(细胞凋亡(apoptosis))。自由的可获得的T-细胞藉由与另一hOKT3FabCSA763scFv交联可改向至另一肿瘤细胞且从事杀死事件。在hOKT3FabCSA763scFv不存在的情况下,人类T淋巴细胞不影响肿瘤细胞A431生长。在图19B中,在三聚体hOKT3FabCSA763scFv存在的情况下,人类T淋巴细胞与A431细胞交联。T淋巴细胞被活化且开始攻击肿瘤细胞。在13小时的培养时间中,大多数的细胞经由细胞凋亡途径被裂解。在hOKT3FabCSA763scFv不存在的情况下,即使在24小时的共培养时间之后,也没有观察到介于A431细胞与T淋巴细胞之间的交联(图19A)。
实施例19
肿瘤异种移植(xenograft)小鼠模型
对于评估抗肿瘤活性的in vivo研究被执行于8至10周大、雌性的NOD/SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/JNarl,国家实验动物中心,台湾)。于第0天,来自一健康提供者的未经刺激的人类PBMCs(效应)(effector)与预先与HTC116肿瘤细胞(目标)(target)混合,接着皮下注射细胞混合物至NOD/SCID小鼠。使用1:1的低的细胞(效应-比-目标)比(effector-to-target)。经由尾静脉注射(tail vein injection)于第1天开始每天投予指定剂量的hOKT3FabCSA763scFv或PBS载体控制组,达10个连续的天数。藉由外部卡尺测量(external caliper measurement)每周两次测定肿瘤的发展,且使用标准半椭面公式(standard hemiellipsoid formula):(长度×宽度2)/2来计算肿瘤体积。
结果如于图20中所示。图20显示,于HCT116结肠癌NOD/SCID小鼠模型中三聚体hOKT3FabCSA763scFv的抗肿瘤功效。将两组的NOD/SCID小鼠在人类PBMC(抗-EGFR763IgG与PBS控制组)不存在的情况下,以皮下接种5×106HCT116细胞。将剩余的三组以5×106HCT116细胞与5×106来自一健康提供者的未经刺激的人类PBMCs的混合物进行皮下注射。在于第0天的HCT116细胞接种之后,经由尾部静脉注射于第1天投予PBS载体控制组(100μl)、50μg与15μg的三聚体hOKT3FabCSA763scFv达10个连续不断的天数。具有指出数目的来自各组的肿瘤生长曲线被显示。
介于给予三聚体hOKT3FabCSA763scFv组与未经刺激的人类PBMC控制组之间的统计上显著差异(P<0.001)被显示出。此结果指出双特异抗-CD3×EGFR抗体的hOKT3FabCSA763scFv在人类可PBMC的存在下可有效减少肿瘤生长。
对于本技术领域中具有通常知识者而言,可对涉及的实施例做出各种修饰与变化是明显的。说明书与实施例仅被视为示范的意图,对应着涉及的真实范围是被下列申请专利范围与其等同物所指出。
Claims (25)
1.一种产生一多价Fab片段的方法,包括在一宿主细胞中共表达之步骤:
(1)一编码出包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列的基因构筑体;以及
(2)一编码出包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列的基因构筑体。
2.权利要求1所述的方法,其中所述(1)的基因构筑体更包括编码出一来自人类IgG的枢纽区的一序列。
3.权利要求2所述的方法,其中所述人类IgG选自IgG1、IgG2、IgG3与IgG4所组成的群组。
4.权利要求2所述的方法,其中编码出所述枢纽区的序列于所述基因构筑体中座落于所述Fab片段与所述类胶原蛋白胜肽之间。
5.权利要求1所述的方法,其中所述(1)的基因构筑体更包括编码出一单链Fv的一序列。
6.权利要求1所述的方法,其中所述(2)的基因构筑体包括一人类IgG1的kappa轻链。
7.一种多价Fab片段,藉由权利要求1所述的方法来产生。
8.一种三聚的多价Fab片段,包括三个权利要求7所述的多价Fab片段,藉由至少它们的类胶原蛋白区来结合在一起。
9.一种多价抗体片段,包括:
(1)包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列;以及
(2)包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列。
10.一种三聚的多价抗体片段,包括三个权利要求9所述的多价抗体片段的一复合物。
11.权利要求9所述的多价抗体片段,其中(1)的所述胺基酸序列包括一来自人类IgG的枢纽区的一胺基酸序列。
12.权利要求11所述的多价抗体片段,其中所述人类IgG选自IgG1、IgG2、IgG3与IgG4所组成的群组。
13.权利要求11所述的多价抗体片段,其中所述枢纽区于该基因构筑体中座落于所述Fab片段与该类胶原蛋白胜肽之间。
14.权利要求9所述的多价抗体片段,其中所述(1)的胺基酸序列更包括一单链Fv的一序列。
15.权利要求9所述的多价抗体片段,其中所述(2)的胺基酸序列包括一人类IgG1的kappa轻链。
16.权利要求14所述的多价抗体片段,其中所述抗体片段为双特异性。
17.权利要求9所述的多价抗体片段,其中所述多价抗体片段的一配体为人类CD3。
18.权利要求16所述的多价抗体片段,其中该多价抗体片段的配体为人类CD3与人类表皮生长因子受体。
19.一种核酸序列,其编码如权利要求9所述的多价抗体片段。
20.一种表达载体,当引入一宿主细胞时,其表达权利要求9所述的多价抗体片段。
21.一种宿主细胞,包括权利要求20所述的表达载体。
22.一种调节一配体的生物活性的方法,包括:
将一多价抗体片段与所述配体一起培养,该多价抗体片段包括:
(1)包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列;以及
(2)包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列。
23.一种治疗于一个体中的自体免疫疾病的方法,包括:
投予一有效量的一多价抗体片段至一需要的个体,该多价抗体片段包括:
(1)包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列;以及
(2)包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列。
24.权利要求23所述的方法,其中所述多价抗体片段的一配体为人类CD3。
25.一种侦测一配体的方法,包括:
将三聚的多价抗体片段复合物与该配体一起培养,该三聚的多价抗体片段复合物包括:
(1)包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列;以及
(2)包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列;
(3)一标记;
侦测该多价抗体片段复合物的结合。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW101150029 | 2012-12-26 | ||
TW101150029 | 2012-12-26 | ||
US13/761,569 US10329350B2 (en) | 2012-12-26 | 2013-02-07 | Method for producing a multivalent fab fragment with collagen-like peptide |
US13/761,569 | 2013-02-07 | ||
TW102136456A TWI629284B (zh) | 2012-12-26 | 2013-10-09 | 多價抗體片段與其三聚複合物 |
TW102136456 | 2013-10-09 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103897057A true CN103897057A (zh) | 2014-07-02 |
CN103897057B CN103897057B (zh) | 2018-07-13 |
Family
ID=50988666
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310731249.5A Active CN103897057B (zh) | 2012-12-26 | 2013-12-26 | 多价抗体片段与其三聚复合物 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2014124186A (zh) |
CN (1) | CN103897057B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107847591A (zh) * | 2015-04-17 | 2018-03-27 | Igm生物科学股份有限公司 | 多价人免疫缺陷病毒抗原结合分子及其应用 |
CN111417404A (zh) * | 2017-09-28 | 2020-07-14 | 格尔托公司 | 重组胶原蛋白和弹性蛋白分子及其用途 |
US11168126B2 (en) | 2019-04-12 | 2021-11-09 | Geltor, Inc. | Recombinant elastin and production thereof |
WO2021249009A1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Rsv vaccine compositions, methods, and uses thereof |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3387014B1 (en) * | 2015-12-11 | 2022-01-19 | Leadartis, S.L. | Single chain fusionconstructs comprising multimeric antibody fragments fused to collagen trimerization domains |
WO2021030680A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-02-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multispecific antigen-binding molecules for cell targeting and uses thereof |
WO2023227018A1 (zh) * | 2022-05-25 | 2023-11-30 | 羿尊生物医药(浙江)有限公司 | 靶向细胞膜受体蛋白的融合蛋白及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1495193A (zh) * | 2002-07-19 | 2004-05-12 | 余宙耀 | 一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)Fab抗体及其制取方法 |
CN1602358A (zh) * | 2001-05-08 | 2005-03-30 | 阿波克西斯公司 | 重组融合蛋白及其三聚体 |
CN101445559A (zh) * | 2007-11-30 | 2009-06-03 | 财团法人工业技术研究院 | 三聚体可溶抗体与其产生及使用的方法 |
-
2013
- 2013-12-25 JP JP2013268028A patent/JP2014124186A/ja active Pending
- 2013-12-26 CN CN201310731249.5A patent/CN103897057B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1602358A (zh) * | 2001-05-08 | 2005-03-30 | 阿波克西斯公司 | 重组融合蛋白及其三聚体 |
CN1495193A (zh) * | 2002-07-19 | 2004-05-12 | 余宙耀 | 一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)Fab抗体及其制取方法 |
CN101445559A (zh) * | 2007-11-30 | 2009-06-03 | 财团法人工业技术研究院 | 三聚体可溶抗体与其产生及使用的方法 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107847591A (zh) * | 2015-04-17 | 2018-03-27 | Igm生物科学股份有限公司 | 多价人免疫缺陷病毒抗原结合分子及其应用 |
CN111417404A (zh) * | 2017-09-28 | 2020-07-14 | 格尔托公司 | 重组胶原蛋白和弹性蛋白分子及其用途 |
US11214609B2 (en) | 2017-09-28 | 2022-01-04 | Geltor, Inc. | Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof |
CN111417404B (zh) * | 2017-09-28 | 2023-03-10 | 格尔托公司 | 重组胶原蛋白和弹性蛋白分子及其用途 |
US11168126B2 (en) | 2019-04-12 | 2021-11-09 | Geltor, Inc. | Recombinant elastin and production thereof |
WO2021249009A1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Rsv vaccine compositions, methods, and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2014124186A (ja) | 2014-07-07 |
CN103897057B (zh) | 2018-07-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6700354B2 (ja) | ヘテロ二量体性二重特異性抗体 | |
JP6793655B2 (ja) | Cd20結合分子およびその使用方法 | |
CN105051066B (zh) | 作为T细胞衔接器的双特异性IgG抗体 | |
CN103897057B (zh) | 多价抗体片段与其三聚复合物 | |
JP2022185021A (ja) | 多価多重特異性ox40結合融合タンパク質 | |
CN104114578B (zh) | Bcma和cd3的结合分子 | |
CN113597433A (zh) | Gprc5d嵌合抗原受体以及表达这些受体的细胞 | |
CN109476734A (zh) | Cd70和cd3的抗体构建体 | |
CN109476747A (zh) | 结合免疫调节性蛋白和肿瘤抗原的双特异性结合蛋白 | |
CN110352070A (zh) | 双特异性检查点抑制剂抗体 | |
US20140308285A1 (en) | Heterodimeric bispecific antibodies | |
CN109219617A (zh) | Bcma和cd3双特异性t细胞接合抗体构建体 | |
CN108271376A (zh) | 结合dll3和cd3的双特异性抗体构建体 | |
CN109715663A (zh) | 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体 | |
CN107922495A (zh) | 结合egfrviii和cd3的双特异性抗体构建体 | |
CN107709367A (zh) | 新型多肽 | |
CN105980406A (zh) | Bcma和cd3的结合分子 | |
TW201708257A (zh) | Flt3及cd3抗體構築體 | |
CN106574246A (zh) | 用于细胞免疫治疗的方法和组合物 | |
CN107406512A (zh) | 结合cd3和cd38的异二聚体抗体 | |
TWI629284B (zh) | 多價抗體片段與其三聚複合物 | |
CN104520323B (zh) | 用于治疗b细胞介导的炎性疾病的方法 | |
CN107750255A (zh) | 用于cdh3和cd3的双特异性抗体构建体 | |
CN104918957A (zh) | 抗-cd40抗体及其使用方法 | |
JP2022521937A (ja) | NKp30に結合する抗体分子およびその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |